JPS6244197A - ビタミンｂ↓１↓２の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細菌菌体の製造法に関し、さらに詳細にはユウ
バクテリウム属またはブチリバクテリウム属に属するビ
タミンＢＩ２生産菌の菌体製造法に係わる。ビタミンＢ
１２は種々の生合成反応の必須因子として関与しており
飼料添加剤としての用途の他、悪性貧血、慢性の神経疾
患等に優ｎた薬効があることが見い出されてお鯵、近年
需要が増大している。

〔従来技術１発明が解決しようとする問題点〕ビタミン
Ｂ　は、その構造の複雑さのため化学合成では多段にわ
たる複雑な合成工程が必要であることから実用的ではな
い。

また、牛の肝臓などの動物臓器から抽出するという方法
もちるが、この方法では動物臓器のビタミンＢ　の含有
率が低く、しかも動物臓器の供給量が少なく、かつ、供
給量も不安定であるので工業的な製造法として好ましい
方法とはいえない。

これに対して、歳生物によるビタミンＢ　の生産につい
てはプロピオニバクテリウム属、シいる方法が検討され
ているが、こｎらの方法も実用上満足すべきものではな
い。

メタノールは近年大量に安価に製造されることから、微
生物工業における安価な原料とじて近時各方面から注目
さ江ている。最近、メタノール資化性を有する偏性嫌気
性細菌のブチリバクテリウム　メチロトロフイカム（Ｂ
ａｔｙｒｉ　−ｂａｃ　ｔｅｒ　ｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ
ｏｔｒｏｐｈｙｃｕｍ　）のビタミンＢ　含有殖が数ｍ
ｉｉ’／ｇｃｅｌｌと高いことが知らｎている（たとえ
ばＵＳＰ　　４４，４５０，４２９）。

本発明者らは、ブチリバクテリウム　メチｐトロフイカ
ムを、メタノールを炭素源として嫌気条件下で培養を試
λたところ、本ω株の培養中に増殖が停止してしまう現
象があり、従ってビタミンＢ１２の生産量は充分といえ
るものではなかった。

本発明者らはその原因について種々検討したところ、培
養中に副生された酪酸および酢酸などが培養液中に逐次
蓄積増加することにより菌株の増殖が停止するに至り、
その結果、ビタミンＢ　の生産が阻害されることを見い
出した。

また、同じくビタミンＢ　生産菌であるユウバクテリウ
ム属に属する細菌を使用する方法もある。この方法でも
菌体あたりのビタミン含有該は、メタノールを炭素源と
して培養した場合には糖を炭素υとした場合に比して著
しく高くはなるが、ｎｉｌ記のブチリバクテリウム）ｔ
Ａ　Ｋ　ａする細菌を使用したときと同様に、酪酸およ
び酢酸などの有機酸が出生され、こ牡らの副生有機酸が
培養液中に多ｉ３にＩＣ蓄渣さｎて微生物の増殖が抑制
さｎるに至り、その結果、ビタミンＢ１２の生ｉ！ｌ：
ｍも十分に高くはならないことが判明した。

〔問題を屏決するだめの手段、作用〕

本発明者らは、灰ハ源としてメタノールを使用し、ビタ
ミンＢ１２生産を走を有する偏性嫌気性細菌によるビタ
ミンＢ　の製造法について、醒体中のビタミン含付ｔを
低下さぎないで、しかも則閑の増殖が抑制さルることな
く活発に増殖し、以ってビタミンＢ　の生ｄ；　ｔ：　
’ｃさらに向上させるべく鋭な研究を重ねた結果、炭素
源としてメタノールとともに糖を併用することにより、
前記の目的が達せらｎ、ビタミンＢ１２の生産量を向上
させうろことを発見し、この発見にもとづいて本発すｊ
に到達した。

すなわち、本発明はユウバクテリウム（Ｅｕ−ｂａｃ　
Ｃｅｒｉｕｍ　）　　、１２またはブチリバクテリウム
（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）属に属し、炭素
源として少なくともメタノールと糖とを資化することが
でき、かつ、ビタミンＢ　生産能を有する細菌を、炭素
源として糖とメタノールとを併用して嫌気条件下で培養
し、ビタミンＢ　を該細菌のトｉ体内に生成蓄積させる
ことを特徴とする細菌菌体の製造法である。

本発明で使用される細菌は偏性嫌気性細菌であるユウバ
クテリウム属またはブチリバクテリウム属に属し、炭素
源として少なくともメタノールと糖とを資化することが
でき、かつ、ビタミンＢ　生産能を有する細菌であれば
よく、特に制限はないが代表的々菌種として、たとえば
ユウバクテリウム　リそスム（Ｅｕｂａｃｔｅｒ　ｉｕ
ｍｌ　ｉｍｏｓｕｍ　）　　およびブチリバクテリウム
　メチロトロフイカム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　　ｍｅｔｈｙ−１ｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ　）などが
ある。また、これらの菌種の代表的な菌株としてたとえ
ばＥｕｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ　ｌｉｍｏｓｕｍ　　ＡＴ
ＣＣ８４８６，同ＡＴＣＣ１０８２５，同ＤＳＭ　　２
５９３およびＤＳＭ　　２５９４ならびにＢｕｔｙｒｉ
ｂａｃ　−ｔｅｒｉｕｍ　　ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈ
ｉｃｕｍ　　ＡＴＣＣ３５２６６などを挙げることがで
きる。これらの菌は公知であり、たとえば、ユウバクテ
リウムリモスムはＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ第８
版に、またブチリバクテリウム　メチロトロフイカム　
はＣｕｒｒｅｎｔ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏ
ｌ、３　　　ｐ　３８　　＋〜３８６１９８０　　にそ
れぞｎ記載されている。

本発明の培養において使用さｎる培地は、偏性嫌気性細
菌を培養するための通常の培地であって、すなわち、炭
素源、窒素源、ミネラル類、アミノ酸類、ビタミン類、
さらに所望に応じてビタミンＢ　の前駆体および培養液
の還元状態を知るための検知剤などを含有した培地が使
用される。なお、培養に際してこのような培地中に２価
のクロムおよびスチールウールなどの酸累吸収能を有す
る物質を存在させてもよい。

炭素源としてはメタノールとともに、使用さｎる細菌が
資化しうる糖が併用さｎる。糖としては、たとえば、ユ
ウバクテリウム　リモスムおよびブチリバクテリウム　
メチロトロフイカムにおいてはグルコースおよび／−ま
たけフラクトースが使用される。窒素源としては、たと
えばアンモニウム塩類、ペプトン、酵母エキス、肉エキ
ス、コーンステイープリカーおよび尿素などの含窒素化
合物がある。ミネラル類としては、たとえば、りん酸塩
類、マグ木シウム塩類、カリウム塩類、カルシウム塩類
、マンガン塩類、コバルト塩類、鉄塩類などを挙げるこ
とができる。ビタミンＢ　の前駆体としての、５．６−
ジメチルベンズイミダゾール、コリンおよびベタイン等
のそｎぞれの添加はビタミンＢ　の生産量を向上させる
ため好ましい。

培養方式としては、特に制限はなく、たとえば静置培養
方式および窒累や炭酸ガスの通気による撹拌培養方式な
どを採用しうる。

培養温度および培養液のｐＨなどの培養条件は使用され
る細菌が増殖しうるような条件であればよく、細菌によ
って異なるので一概には特定しえないが、培養温度は２
０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃とされ、また培養
液のｐＨは５．５〜８．０、好ましくは６〜７．５とさ
れる。培養液のｐＨは一般に時間の経過に伴って徐々に
変化するので、培養液のｐＨを前記のイ曳 範囲に維持するために、苛静ンーダ、炭酸ノーズ、およ
びアンモニア水などのアルカリ性物質や硫酸、塩酸、硝
酸などの酸性物質が添加される。

本発明において培養は２段階で行なわｎる。

すなわち、糖のみまたは糖と少量のメタノールとを炭素
源として細菌を培養し、細菌の増殖を主とする前段と、
これに引続きメタノールのみを炭素源として培養し、細
菌萌体中にビタミンＢ　を生成蓄積させることを主とす
る後段である。なお、前段においては細菌菌体中で僅か
ではあるがビタミンＢ　の生成蓄積も併行し、ま１ま た後段においては細菌の増殖も若干併行する。

本発明におけるビタミンＢ　生産菌は、炭素諒として、
糖およびメタノールの両者を資化することができるが、
培養液中に両者が共存している場合には、糖のみを優先
的に資化し、使用さｎた糖の実質的全量を消費しつくし
たのちに、ついでメタノールを資化しはじめる。

本発明において、メタノールは前段の初期から糖と共存
させてもよく、また前段で使用された糖の全量が実質的
に完全に消費されたのちに添加してもよい。前者の場合
には一般にメタノールを資化するまでの誘導期間が短縮
されるので好ましい。

糖の使用量は培地量に対して通常は２重量％以２ヒ、好
ましくは２〜１０重量％、特に好ましくは３〜６瓜量％
とされる。糖質はその使用量の全１を培養初期に培地に
添加してもよく、また培養期間中に培養液中に逐次添加
することもできる。

メタノールの使用量はメタノール消費量を若干上層る址
とされるが、メタノール消費量は、糖の使用量に対して
一般に０．２重量倍以上、好ましくは０．５重量倍以上
、特に好ましくは０．５〜５重債倍とされる。メタノー
ル消費量＊　ｌ”ｔは、たとえばガスクロマトグラフィ
ーなどにより培ｉｔ液のメタノール濃度を測定し、この
メタノール濃度から知ることができる。

メタノールの使用量はこのメタノールの消費量よりも多
ければよく、通常はメタノールの消Ｑｆｆｉに対して１
０〜２０％程度過剰とされる。

メタノールを前段から使用するときには培地量に対して
０．１〜１重量％とされ、残部のメタノールが後段で使
用される。

なお、メタノールの添加に際しては培地または培養液の
メタノール濃度がビタミン生産看の増殖を抑制しない濃
度−たとえば通常は５容量％以下、好ましくは３容量％
以下−に保たれなけｎばならない。

前段および後段における培養条件は互いに同一であって
もよく、また、互いに異なってもよい。

培養液からのビタミンＢ１２の回収はそｎ自体公知の方
法によって行なうことができる。すなわち、ビタミンＢ
　は本質的に菌体内に生成蓄積されるので、培養液から
遠心分離および一過などの固液分離手段により回収され
た菌体から分離される。ビタミンＢ　をシアノ型ビタミ
ンＢ　として分離回収する場合には、菌体を水に懸濁さ
せた液（Ｍ体懸濁液）を硫酸などの酸によりｐＨを酸性
、好ましくはｐＨ４〜５に調整し、シアン化カリなどの
シアン化合物を約５０〜２００ｐｐｍ添加した後、８５
〜１２０℃に加熱することにより抽出分離が可能である
。また、ビタミンＢ　をメチル型または補酵素型として
得る場合には、常法により菌体から暗所でメタノール、
エタノール、アセトンなどの溶媒を用いて抽出する。菌
体から抽出分離されたビタミンＢ　は必要に応じてさら
に精製される。

この精製はフェノール抽出、イオン交換樹脂またセルロ
ースなどを用いたカラムクロマトグラフィーによる方法
など、また、さらにこれらの方法を併用して行なわｎる
。

〔実施例〕

実施例により本発明をさらに具体的に説明する。実施例
、比較例に用いた基本培地の組成は第１表に示すとおり
である。

第１表 ＫＨ２ＰＯ４３＆ Ｎａｚ）ＩＰＯ４２ｆｉ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，ａｊｉ Ｎａ２Ｃｏ３１．０ｇ （ＮＨ４）　２ＳＯ４０，５，！ｉ＋ ＣＨ３ＣＯＯＮａ・３Ｈ２０Ｌ　Ｏ，！；１システィン
・塩酸塩　　　　　　　　０．５ｇＣａＣ１ｚ−２Ｈ２
０ｏ、１ｇ 酵母エキス　　　　　　　　　　　１０　　ｇレサズリ
ン（２９６溶液）　　　　　　　Ｏ，１ｍｊクエン酸鉄
・ｘＨｚｏ　　　　　　　　６０　　　ダＺｎＳＯ４−
７ＨｚＯ＋Ｏｒｔｗｐ ＭｎＣｌｍ−４ＨｚＱ　　　　　　　　　　　１０　　
　ｑＣＬＪＳＯ４・５ＨｚＯ００５９ ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
　　　■（ＮＨ４）　６Ｍｏｙｏ　　・４Ｈ２０１ＱＣ
ｏＣ１ｚ　・６ＨｚＯ１０Ｗ Ｈ３ＢＯ３＋　　　１１９ ＮｉＳＯ４・６Ｈ２０１■ ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　　５０　　μ
ｍ葉酸　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　μ
ｇチアミン・塩酸塩　　　　　　　　　　　１０　　■
リボフラビン　　　　　　　　　　　　１００　　μｇ
ナイアシン　　　　　　　　　　　　　１００　　μｇ
パントテン酸カルシウム　　　　　　　　　５　　ダｐ
−７ミノ安息香酸　　　　　　　　　１００　　μＩチ
オクト酸　　　　　　　　　　　　　１００　　μｍ水
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１１また、比
較例および実施例において、ビタミンＢ１２の定量は、
佐藤らの方法（ビタミン第５７巻第１１号第６０９〜６
１９頁　１９６３）に準拠し、ビタミンＢ　要求変異株
のラクトハチルス　ライヒマニ（Ｉ　ＦＯ−３５７６）
を用いる微生物法で行なった。

さらに実施列、比較例において培養は、検知剤として加
えらルたレサズリンが無色を保つような嫌気状態で行な
われた。

実施例　１ 第１表に示した基本培地に、炭素源としてフ養槽にナナ
十−張りこみ１２０℃で２０分間高圧滅両画、窒素気流
下で冷却した。

この培地に、メタノールを炭素源として静置培すして得
られたブチリバクテリウム　メチロトロフイカム　ＡＴ
ＣＣ３３２６６の種母液約ｓｏｍｔを植菌し、培養温度
３５℃、１５０ｒｐｍ　　でゆっくり攪拌し、７ンモニ
７水でｐＨ７，３にコントロールしなから窒素気流下で
前段は気培養を行なった。

培養開始後約２ａ時間経過した時点での培養液中の７ラ
クト一ス濃度は実質的にゼロとなり、こ＼で前段嫌気培
養を終了し、その後はメタノールを適時添加しながら培
養液のメタノール濃度をＯ０１〜０．８容量％に保ち、
後段嫌気培養を行なった。培養開始後約７０時間で菌体
濃度は１２，９／Ｊ、ビタミン８１２生産量は３６η／
ｊであった。培養の前段、後段を通じてのメタノール消
費量は２０　、！ｉＩ／ｌであ抄、メタノール添加量は
２５ｇ／ｌであった。

実り例　２ 実施例１における培地においてフラクトースのかわりに
グルコースを４０９／ｌとなるように添加した培地　７
５０−を１ｊ培養槽に張りこみ、１２０℃で２０分間高
圧滅菌した。この培地に１メタノールを炭素源として静
置培養しテ得らｎたニーバクテリウム　リモスム　ＡＴ
ＣＣ８４８６の種母液約３０−を植菌し、培養温度３５
℃、１５０　ｒｐｍ　でゆっくり攪拌シ、アンそニア水
でｐＨ７，３にコントロールしながら窒素気流下で前段
嫌気培養を行なった。

培養開始後約２０時間を経過した時点で培養液中のグル
コースの濃度は実質的にゼロとな９、こ＼で前段嫌気培
養を終了し、と＼でメタノールを１０ｎｌ／ｌ添加し、
その後は培養液中のメラフイーにより分析しながら添加
した。

培養開始後約７０時間経過した時点で菌体濃度は１２．
５ｇ／ｌ、ビタミン生産蓋は約４２ｍ９／ｌであった。

全培養期間中のメタノール消費量は２５ｇ／ｌであり、
メタノール添加量は３ａｇ７ｇであった。

比較例　１ 第１表で示された培地にメタノールを＋５１Ｌｌ／ｌ添
加した培地　７５０１１ｔｌを１１容培養槽に入れ１２
０℃で２０分間高圧滅菌した。この培地に、メタノール
を炭素源として培養して得られたニーバクテリウム　リ
モスム　ＡＴＣＣ８４８６の種母液約３０ｍ／を植菌し
、培養温度３５℃、１５０ｒｐｍ　　でゆつくし攪拌し
アンモニア水でｐＨ７，３にコントロールしながら窒素
気流下で嫌気培養を行なった。培養液中のメタノール濃
度が０．１〜０．８％になるように適時添加した。培養
開始後約５０時間の時点でビタミンＢ　生産量を測定し
たところ沼体濃度７　ｇ／ｌ　、ビタミンＢ　生産量は
２７Ｂ９／ｌであった。さらに培養を継続し、培養経過
７０時間の時点でも菌体濃度は増加せず、ビタミンＢ１
２生産量は２７■／ｌのま＼であった。

比較例　２ りこみ、１２０℃で２０分間高圧滅菌した。グルコース
を炭素源として培養して得らｎたニーバクテリウム　リ
モス＾　ＡＴＣＣ８４８６の種母液約３０ｍ／を植菌し
、培養温度３５℃、１５０　ｒｐｍでゆっくり攪拌しア
ンモニア水でｐＨ７，５にコントロールしながら窒素気
流下で嫌気培養を行なった。

培貢開始後約２０時間経過および４０時間経過時点で滅
菌済のグルコースをそれぞれ２５ｇずつ培養槽に添加し
た。培養開始後約４０時間でビタミンＢ１２の生産量は
約６■／ｌであった。

さらに培養を継続し、培養時間７０時間経過時点でビタ
ミンＢ１２生産量を測定したところ約６９／！のま＼で
あった。

〔発明の効果〕

ビタミンＢ１２生産菌をグルコースおよび／またはフラ
クトースなどの糖とメタノールとを併用することにより
、ビタミンＢ１２の高含量を維持したま＼ビタミンＢ１
２生産菌を充分に増殖させて医薬品として価値の高いビ
タミンＢ１２の生産量を向上することが可能となる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ユウバクテリウム属またはブチリバクテリウム属に属し
   、炭素源として少なくともメタノールと糖とを資化する
   ことができ、かつ、ビタミンＢ＿１＿２生産能を有する
   細菌を、炭素源として糖とメタノールとを併用して嫌気
   条件下で培養し、ビタミンＢ＿１＿２を該細菌の菌体内
   に生成・蓄積させることを特徴とするビタミンＢ＿１＿
   ２の製造法。