JPS6230718A - ヒト上皮細胞成長因子の製造法 - Google Patents
ヒト上皮細胞成長因子の製造法Info
- Publication number
- JPS6230718A JPS6230718A JP60170394A JP17039485A JPS6230718A JP S6230718 A JPS6230718 A JP S6230718A JP 60170394 A JP60170394 A JP 60170394A JP 17039485 A JP17039485 A JP 17039485A JP S6230718 A JPS6230718 A JP S6230718A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- egf
- growth factor
- acid
- epidermal growth
- resin
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- Pending
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、精製されたヒト上皮細胞成長因子(h−EG
F)の製造法に関する。
F)の製造法に関する。
h−EGFは唾液、血液、尿などの体液の他、願下線や
消化管中にその存在が知られている。比較的多いとされ
る尿中でもその含量は極めて少なく、50〜100μg
/を程度にすぎない。
消化管中にその存在が知られている。比較的多いとされ
る尿中でもその含量は極めて少なく、50〜100μg
/を程度にすぎない。
尿からh−EGF’を精製する方法としては、酸性床を
たん白沈澱剤で処理する方法が知られている。
たん白沈澱剤で処理する方法が知られている。
この場合、沈澱剤としては、安息香酸のアセトン溶液〔
エンドクリノロジー(Endocrinology)3
0巻129頁(1942年〕〕、タンニン酸〔ホッペー
ゼイラーズ・ゼット(Hoppe −5eylers
Z )著;フィジオロジカル・ケミストリー(Phy
s i −ological Chemistry)
356巻、17 e 5 (1975年)〕等が用いら
れる。
エンドクリノロジー(Endocrinology)3
0巻129頁(1942年〕〕、タンニン酸〔ホッペー
ゼイラーズ・ゼット(Hoppe −5eylers
Z )著;フィジオロジカル・ケミストリー(Phy
s i −ological Chemistry)
356巻、17 e 5 (1975年)〕等が用いら
れる。
その他、h−EGFの精製法としては、イオン交換樹脂
による吸着法〔ジャーナル・オプ・クリニカル・エンド
クリノロジー・アンド・メタボリズム(Journal
of clinical Endocrinolog
yand Metabol ism) 48巻667頁
(1979年)〕が知られている。
による吸着法〔ジャーナル・オプ・クリニカル・エンド
クリノロジー・アンド・メタボリズム(Journal
of clinical Endocrinolog
yand Metabol ism) 48巻667頁
(1979年)〕が知られている。
尿中のh−EGF含有量は極めて少ないため、よシ多く
のh−EGFを得るためには、大量の尿を使用する必要
があるので、h−EGFの精製には、種々の問題が生じ
る。
のh−EGFを得るためには、大量の尿を使用する必要
があるので、h−EGFの精製には、種々の問題が生じ
る。
例えば、上記したタンニン酸を用いる方法では、尿1ト
ンから、7.7 m gの粗h−EGFが得られるのみ
である。安息香酸のアセトン溶液を用いる方法では、尿
1トンを処理するとアセトンを含んだ廃尿が1トン発生
し、その廃棄処理が煩雑になる。イオン交換樹脂を用い
る方法では、尿のpH調整のだめに、尿1トン当pso
t以上の酢酸を使用する必要があり、しかもこれを回収
することが困難である。
ンから、7.7 m gの粗h−EGFが得られるのみ
である。安息香酸のアセトン溶液を用いる方法では、尿
1トンを処理するとアセトンを含んだ廃尿が1トン発生
し、その廃棄処理が煩雑になる。イオン交換樹脂を用い
る方法では、尿のpH調整のだめに、尿1トン当pso
t以上の酢酸を使用する必要があり、しかもこれを回収
することが困難である。
このように、上記した精製法は、いずれも、精製効率が
低い。
低い。
また、h−EGFを含む溶液を凍結乾燥、減圧蒸留等の
方法で濃縮し、精製に適した容積にする方法が知られ、
その必要性もあるが、これらの方法は、水の除去に多大
なエネルギーが必要となり、大容量の溶液に対し、工業
的規模の生産工程には不適当である。従って、これらと
は異なる簡便な濃縮法又は凍結乾燥等に適した容量への
濃縮を可能にする方法が要望される。
方法で濃縮し、精製に適した容積にする方法が知られ、
その必要性もあるが、これらの方法は、水の除去に多大
なエネルギーが必要となり、大容量の溶液に対し、工業
的規模の生産工程には不適当である。従って、これらと
は異なる簡便な濃縮法又は凍結乾燥等に適した容量への
濃縮を可能にする方法が要望される。
本発明は、ヒト尿またはヒト尿を部分精製したh−EG
Fを含有する溶液を架橋アクリルエステル系吸着剤及び
/又は架橋メタクリルエステル系吸着剤と接触させて、
h−EGF’を該吸着剤に吸着させ、ついで、該吸着樹
脂からh−EGFを溶出することを特徴とするh−EG
Fの製造法に関する。
Fを含有する溶液を架橋アクリルエステル系吸着剤及び
/又は架橋メタクリルエステル系吸着剤と接触させて、
h−EGF’を該吸着剤に吸着させ、ついで、該吸着樹
脂からh−EGFを溶出することを特徴とするh−EG
Fの製造法に関する。
本発明において、ヒト尿は、予め、それに含まれる不溶
物をろ過等により除去しておくのが好ましい。
物をろ過等により除去しておくのが好ましい。
ヒト尿を部分精製する方法としては、次の方法がある。
(1)尿をセライトろ過する方法
(2)ポリアクリル酸系イオン交換樹脂等の弱酸性イオ
ン交換樹脂への吸着と溶出を行なう方法 (3)架橋デキストランゲル、架橋ポリアクリルアミド
ゲル等の親水性ゲルを用いたゲル濾過法 (4) ジエチルアミノエチルセルロース等の塩基性
イオン交換樹脂への吸着と溶出を行なう方法 上記架橋アクリル酸エステル系吸着樹脂及び架橋メタク
リル酸エステル系樹脂とは、アクリル酸及び/又はメタ
クリル酸の重合体を主要骨格とし、これらの重合体がジ
アルコールによって該重合体のカルボキシル基とエステ
ル結合して架橋化されたものであり、架橋化に関与しな
いカルボキシル基は、アルキルエステル化されている。
ン交換樹脂への吸着と溶出を行なう方法 (3)架橋デキストランゲル、架橋ポリアクリルアミド
ゲル等の親水性ゲルを用いたゲル濾過法 (4) ジエチルアミノエチルセルロース等の塩基性
イオン交換樹脂への吸着と溶出を行なう方法 上記架橋アクリル酸エステル系吸着樹脂及び架橋メタク
リル酸エステル系樹脂とは、アクリル酸及び/又はメタ
クリル酸の重合体を主要骨格とし、これらの重合体がジ
アルコールによって該重合体のカルボキシル基とエステ
ル結合して架橋化されたものであり、架橋化に関与しな
いカルボキシル基は、アルキルエステル化されている。
これらの吸着樹脂は、比表面積100〜1,0OOrr
?/gのものが好ましい。
?/gのものが好ましい。
ヒト尿又はその部分精製されたh−EGF含有液は、前
記吸着樹脂とpH3〜11の下に接触させられる。pH
が3未満ではh−EGFの純度(比活性)が小さくなシ
、pHが11を超えると収率が悪くなる傾向がある。I
)Hの調整は、酢酸等の有機酸、塩酸、硫酸等の無機酸
を使用して行なうことができ、リン酸緩衝液等の緩衝液
でもよい。またヒト尿又はその部分精製されたh−EG
F含有液には、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫
酸す) IJウム等の無機塩を2重量%以上溶解させて
おくのが、h−EGFの吸着樹脂への吸着能を高める上
で好ましい。無機塩は多すぎても吸着能向上効果に影響
しないので、また、精製上から10重量%以下が好まし
い。なお、ヒト尿中にはすでに相当量の塩が溶解してい
るので、無機塩を新たに添加する必要はない。また、無
機塩の存在は、h−EGF吸着後の吸着樹脂を洗浄する
場合に、その脱着防ぐ上で好ましい。
記吸着樹脂とpH3〜11の下に接触させられる。pH
が3未満ではh−EGFの純度(比活性)が小さくなシ
、pHが11を超えると収率が悪くなる傾向がある。I
)Hの調整は、酢酸等の有機酸、塩酸、硫酸等の無機酸
を使用して行なうことができ、リン酸緩衝液等の緩衝液
でもよい。またヒト尿又はその部分精製されたh−EG
F含有液には、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫
酸す) IJウム等の無機塩を2重量%以上溶解させて
おくのが、h−EGFの吸着樹脂への吸着能を高める上
で好ましい。無機塩は多すぎても吸着能向上効果に影響
しないので、また、精製上から10重量%以下が好まし
い。なお、ヒト尿中にはすでに相当量の塩が溶解してい
るので、無機塩を新たに添加する必要はない。また、無
機塩の存在は、h−EGF吸着後の吸着樹脂を洗浄する
場合に、その脱着防ぐ上で好ましい。
h−BGF吸着後の吸着樹脂は、溶出前に、水、アンモ
ニア水等のアルカリ水溶液(pH9以上)、酸水溶液で
洗浄してもよい。この洗浄によって精製度を高めること
ができる。
ニア水等のアルカリ水溶液(pH9以上)、酸水溶液で
洗浄してもよい。この洗浄によって精製度を高めること
ができる。
溶出は、メタノール、エタノール、プロパノー1Nの濃
度で含むのが好ましい。0.0IN未満では溶出が困難
になる傾向があり、INを超えると1l−EGFが分解
しやすくなる傾向がある。溶出液には、酸の代わりにア
ンモニア等のアルカリ物質を含ませておくことも同様に
好ましい。例えば、アンモニアは0.01〜1容量%で
含ませるのが好このようにして得られた溶出液は、その
ままで又は適宜濃縮することにより容積の小さいもので
あり、ついで、ゲル濾過、イオン交換、クロマトグラフ
ィー、凍結乾燥等の処理に供するのに好ましい。なお、
上記溶出液は、水溶性有機溶剤を多量に含むため蒸留等
による濃縮が容易であシ、特にカラムを使用して溶出す
る場合はh−EGFのみを含む分画のみを捕集すること
によりかなり容積を小さくすることができる。
度で含むのが好ましい。0.0IN未満では溶出が困難
になる傾向があり、INを超えると1l−EGFが分解
しやすくなる傾向がある。溶出液には、酸の代わりにア
ンモニア等のアルカリ物質を含ませておくことも同様に
好ましい。例えば、アンモニアは0.01〜1容量%で
含ませるのが好このようにして得られた溶出液は、その
ままで又は適宜濃縮することにより容積の小さいもので
あり、ついで、ゲル濾過、イオン交換、クロマトグラフ
ィー、凍結乾燥等の処理に供するのに好ましい。なお、
上記溶出液は、水溶性有機溶剤を多量に含むため蒸留等
による濃縮が容易であシ、特にカラムを使用して溶出す
る場合はh−EGFのみを含む分画のみを捕集すること
によりかなり容積を小さくすることができる。
次に1本発明の実施例を示す。
実施例−1
男子床200tに塩酸を加えてI)Hを、8に調整した
。そこ知ダイヤイオンHP2MG(三菱化成工業(株)
商品名、架橋メタクリルエステル系吸着樹脂)200−
を加え室温で2時間激しく攪拌した。樹脂を分離してカ
ラムに充填し、水107ついで1%アンモニア水10t
を流して洗浄した。
。そこ知ダイヤイオンHP2MG(三菱化成工業(株)
商品名、架橋メタクリルエステル系吸着樹脂)200−
を加え室温で2時間激しく攪拌した。樹脂を分離してカ
ラムに充填し、水107ついで1%アンモニア水10t
を流して洗浄した。
つぎに25%アンモニア水を1vot%含むアセトニト
リルを流してh−EGFを溶出したところ溶出液4tか
ら6tにかけての2tの分画にh−EGFが溶出した。
リルを流してh−EGFを溶出したところ溶出液4tか
ら6tにかけての2tの分画にh−EGFが溶出した。
この2tのh−EGF溶出液を酢酸で中和後口−タリー
エバポレータで濃縮してh−EGF水溶液150−を得
た。ラジオレセプターアッセイ法(RRA法)で分析し
たところ5、3 m gのh=−EGFが含まれておシ
尿からの回収率は90%であった。まだ比活性は43X
10−3(A g / 280 n m )であシ尿の
比活性3.5X10−3よシ約12倍向上した。
エバポレータで濃縮してh−EGF水溶液150−を得
た。ラジオレセプターアッセイ法(RRA法)で分析し
たところ5、3 m gのh=−EGFが含まれておシ
尿からの回収率は90%であった。まだ比活性は43X
10−3(A g / 280 n m )であシ尿の
比活性3.5X10−3よシ約12倍向上した。
実施例−2′
男子床5klに希硫酸を加えpHを4に調整した。
100tステンレス製カラムにXAD7(オルガノ、ラ
ンド社、架橋メタクリルエステル系樹脂)75tを充填
したカラムKpH調整した尿を約300t/hrの流速
で流した。全ての尿を流し終ったら水200tで洗浄後
25%アンモニア水をl vo7%含むメタノールでh
−EGF’を溶出した。得られだh−EGFメタノール
溶液100tを塩酸で中和後フラッシュエバポレータで
濃縮してh−EGF水溶液18tを得た。これVCh
−EGF250mgが含まれており(回収率80%)、
比活性は35X10−3であった。
ンド社、架橋メタクリルエステル系樹脂)75tを充填
したカラムKpH調整した尿を約300t/hrの流速
で流した。全ての尿を流し終ったら水200tで洗浄後
25%アンモニア水をl vo7%含むメタノールでh
−EGF’を溶出した。得られだh−EGFメタノール
溶液100tを塩酸で中和後フラッシュエバポレータで
濃縮してh−EGF水溶液18tを得た。これVCh
−EGF250mgが含まれており(回収率80%)、
比活性は35X10−3であった。
実施例−3
新鮮ヒト男子床200tに塩酸を加え、pH3,5に調
整した。これを、前もって酢酸にて上清のpHが3.5
になるように処理したアクリル酸系イオン交換樹脂(バ
イオラッド社、パイオンツクスフ0)2tに加え、24
時間攪拌を続けた後、該イオン交換樹脂を炉別しだ。樹
脂を水洗したのち、1M酢酸アンモニウムを含むアンモ
ニア水(pH9,5)で抽出し、抽出液(EGF含有液
)10tを得た。この抽出液のRRAによるEGF濃度
は1,080μg/l、 280 nmの吸光度ユニッ
トは5X10’であった。
整した。これを、前もって酢酸にて上清のpHが3.5
になるように処理したアクリル酸系イオン交換樹脂(バ
イオラッド社、パイオンツクスフ0)2tに加え、24
時間攪拌を続けた後、該イオン交換樹脂を炉別しだ。樹
脂を水洗したのち、1M酢酸アンモニウムを含むアンモ
ニア水(pH9,5)で抽出し、抽出液(EGF含有液
)10tを得た。この抽出液のRRAによるEGF濃度
は1,080μg/l、 280 nmの吸光度ユニッ
トは5X10’であった。
この抽出液に力性ソーダを加えてp H8,5に調整し
た。これを200−の吸着樹脂XAD7を充てんし九カ
ラムに500m1/hrの流速で流した。
た。これを200−の吸着樹脂XAD7を充てんし九カ
ラムに500m1/hrの流速で流した。
この操作が終了した後、水500m/で洗浄し、ついで
、濃塩酸を0.5容量%含むメタノール40〇−でEG
Fを溶出した。溶出液をアンモニア水で中和後、ロータ
リーエバポレータで濃縮して、EGF水溶液50−を得
だ。このEGF水溶液には、EGF8.16mg(回収
率85%;上記抽出液に対して)含まれておシ、このE
GFO比活性は上記抽出液に対し、4倍上昇した。液量
は1/200になった。
、濃塩酸を0.5容量%含むメタノール40〇−でEG
Fを溶出した。溶出液をアンモニア水で中和後、ロータ
リーエバポレータで濃縮して、EGF水溶液50−を得
だ。このEGF水溶液には、EGF8.16mg(回収
率85%;上記抽出液に対して)含まれておシ、このE
GFO比活性は上記抽出液に対し、4倍上昇した。液量
は1/200になった。
上記吸着樹脂は、IN力性ソーダ水溶液60〇−1IN
塩酸600−で順次洗浄し、最後に水洗して再生した。
塩酸600−で順次洗浄し、最後に水洗して再生した。
再生吸着樹脂を用い、上記と同様の操作による抽出液の
精製を吸着樹脂の再生と共に、20回繰り返したが、抽
出液に対するEGFの回収率及び比活性の向上率につい
て低下はなかった。
精製を吸着樹脂の再生と共に、20回繰り返したが、抽
出液に対するEGFの回収率及び比活性の向上率につい
て低下はなかった。
実施例−4
実施例3において、抽出液のpHを4に調整した以外は
、実施例4に準じて行なった。その結果、EGF’の回
収率は80%、比活性の上昇は2.5倍、液量は1/2
00となった。
、実施例4に準じて行なった。その結果、EGF’の回
収率は80%、比活性の上昇は2.5倍、液量は1/2
00となった。
参考例
実施例3において吸着樹脂XAD7の代わりに吸着樹脂
XAD2(ジビニルベンゼン系共重合体、オルガノラッ
ド社)を用いて実施例3に準じて行なったところ、EG
Fの回収率は65%であったが、抽出液の精製を吸着樹
脂の再生と共に5@繰り返したときのEGF回収率は5
%以下に低下した。
XAD2(ジビニルベンゼン系共重合体、オルガノラッ
ド社)を用いて実施例3に準じて行なったところ、EG
Fの回収率は65%であったが、抽出液の精製を吸着樹
脂の再生と共に5@繰り返したときのEGF回収率は5
%以下に低下した。
Claims (1)
- 1、ヒト尿またはヒト尿を部分精製したヒト上皮細胞成
長因子を含有する溶液を架橋アクリルエステル系吸着樹
脂及び/又は架橋メタクリルエステル系吸着樹脂と接触
させて、ヒト上皮細胞成長因子を該吸着樹脂に吸着させ
、ついで、該吸着樹脂からヒト上皮細胞成長因子を溶出
することを特徴とするヒト上皮細胞成長因子の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60170394A JPS6230718A (ja) | 1985-08-01 | 1985-08-01 | ヒト上皮細胞成長因子の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60170394A JPS6230718A (ja) | 1985-08-01 | 1985-08-01 | ヒト上皮細胞成長因子の製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6230718A true JPS6230718A (ja) | 1987-02-09 |
Family
ID=15904112
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60170394A Pending JPS6230718A (ja) | 1985-08-01 | 1985-08-01 | ヒト上皮細胞成長因子の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6230718A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100488287B1 (ko) * | 2003-03-06 | 2005-05-10 | 주식회사 대웅 | 재조합 인간 상피세포 성장인자의 정제방법 |
-
1985
- 1985-08-01 JP JP60170394A patent/JPS6230718A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100488287B1 (ko) * | 2003-03-06 | 2005-05-10 | 주식회사 대웅 | 재조합 인간 상피세포 성장인자의 정제방법 |
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