JPS6230718A - ヒト上皮細胞成長因子の製造法 - Google Patents
ヒト上皮細胞成長因子の製造法Info
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- JPS6230718A JPS6230718A JP60170394A JP17039485A JPS6230718A JP S6230718 A JPS6230718 A JP S6230718A JP 60170394 A JP60170394 A JP 60170394A JP 17039485 A JP17039485 A JP 17039485A JP S6230718 A JPS6230718 A JP S6230718A
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- Japan
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- egf
- growth factor
- acid
- epidermal growth
- resin
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- Pending
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、精製されたヒト上皮細胞成長因子（ｈ−ＥＧ
Ｆ）の製造法に関する。
Ｆ）の製造法に関する。
ｈ−ＥＧＦは唾液、血液、尿などの体液の他、願下線や
消化管中にその存在が知られている。比較的多いとされ
る尿中でもその含量は極めて少なく、５０〜１００μｇ
／を程度にすぎない。
消化管中にその存在が知られている。比較的多いとされ
る尿中でもその含量は極めて少なく、５０〜１００μｇ
／を程度にすぎない。
尿からｈ−ＥＧＦ’を精製する方法としては、酸性床を
たん白沈澱剤で処理する方法が知られている。
たん白沈澱剤で処理する方法が知られている。
この場合、沈澱剤としては、安息香酸のアセトン溶液〔
エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）３
０巻１２９頁（１９４２年〕〕、タンニン酸〔ホッペー
ゼイラーズ・ゼット（Ｈｏｐｐｅ −５ｅｙｌｅｒｓ
Ｚ ）著；フィジオロジカル・ケミストリー（Ｐｈｙ
ｓ ｉ −ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
３５６巻、１７ ｅ ５ （１９７５年）〕等が用いら
れる。
エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）３
０巻１２９頁（１９４２年〕〕、タンニン酸〔ホッペー
ゼイラーズ・ゼット（Ｈｏｐｐｅ −５ｅｙｌｅｒｓ
Ｚ ）著；フィジオロジカル・ケミストリー（Ｐｈｙ
ｓ ｉ −ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
３５６巻、１７ ｅ ５ （１９７５年）〕等が用いら
れる。
その他、ｈ−ＥＧＦの精製法としては、イオン交換樹脂
による吸着法〔ジャーナル・オプ・クリニカル・エンド
クリノロジー・アンド・メタボリズム（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌ ｉｓｍ） ４８巻６６７頁
（１９７９年）〕が知られている。
による吸着法〔ジャーナル・オプ・クリニカル・エンド
クリノロジー・アンド・メタボリズム（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌ ｉｓｍ） ４８巻６６７頁
（１９７９年）〕が知られている。
尿中のｈ−ＥＧＦ含有量は極めて少ないため、よシ多く
のｈ−ＥＧＦを得るためには、大量の尿を使用する必要
があるので、ｈ−ＥＧＦの精製には、種々の問題が生じ
る。
のｈ−ＥＧＦを得るためには、大量の尿を使用する必要
があるので、ｈ−ＥＧＦの精製には、種々の問題が生じ
る。
例えば、上記したタンニン酸を用いる方法では、尿１ト
ンから、７．７ ｍ ｇの粗ｈ−ＥＧＦが得られるのみ
である。安息香酸のアセトン溶液を用いる方法では、尿
１トンを処理するとアセトンを含んだ廃尿が１トン発生
し、その廃棄処理が煩雑になる。イオン交換樹脂を用い
る方法では、尿のｐＨ調整のだめに、尿１トン当ｐｓｏ
ｔ以上の酢酸を使用する必要があり、しかもこれを回収
することが困難である。
ンから、７．７ ｍ ｇの粗ｈ−ＥＧＦが得られるのみ
である。安息香酸のアセトン溶液を用いる方法では、尿
１トンを処理するとアセトンを含んだ廃尿が１トン発生
し、その廃棄処理が煩雑になる。イオン交換樹脂を用い
る方法では、尿のｐＨ調整のだめに、尿１トン当ｐｓｏ
ｔ以上の酢酸を使用する必要があり、しかもこれを回収
することが困難である。
このように、上記した精製法は、いずれも、精製効率が
低い。
低い。
また、ｈ−ＥＧＦを含む溶液を凍結乾燥、減圧蒸留等の
方法で濃縮し、精製に適した容積にする方法が知られ、
その必要性もあるが、これらの方法は、水の除去に多大
なエネルギーが必要となり、大容量の溶液に対し、工業
的規模の生産工程には不適当である。従って、これらと
は異なる簡便な濃縮法又は凍結乾燥等に適した容量への
濃縮を可能にする方法が要望される。
方法で濃縮し、精製に適した容積にする方法が知られ、
その必要性もあるが、これらの方法は、水の除去に多大
なエネルギーが必要となり、大容量の溶液に対し、工業
的規模の生産工程には不適当である。従って、これらと
は異なる簡便な濃縮法又は凍結乾燥等に適した容量への
濃縮を可能にする方法が要望される。
本発明は、ヒト尿またはヒト尿を部分精製したｈ−ＥＧ
Ｆを含有する溶液を架橋アクリルエステル系吸着剤及び
／又は架橋メタクリルエステル系吸着剤と接触させて、
ｈ−ＥＧＦ’を該吸着剤に吸着させ、ついで、該吸着樹
脂からｈ−ＥＧＦを溶出することを特徴とするｈ−ＥＧ
Ｆの製造法に関する。
Ｆを含有する溶液を架橋アクリルエステル系吸着剤及び
／又は架橋メタクリルエステル系吸着剤と接触させて、
ｈ−ＥＧＦ’を該吸着剤に吸着させ、ついで、該吸着樹
脂からｈ−ＥＧＦを溶出することを特徴とするｈ−ＥＧ
Ｆの製造法に関する。
本発明において、ヒト尿は、予め、それに含まれる不溶
物をろ過等により除去しておくのが好ましい。
物をろ過等により除去しておくのが好ましい。
ヒト尿を部分精製する方法としては、次の方法がある。
（１）尿をセライトろ過する方法
（２）ポリアクリル酸系イオン交換樹脂等の弱酸性イオ
ン交換樹脂への吸着と溶出を行なう方法 （３）架橋デキストランゲル、架橋ポリアクリルアミド
ゲル等の親水性ゲルを用いたゲル濾過法 （４） ジエチルアミノエチルセルロース等の塩基性
イオン交換樹脂への吸着と溶出を行なう方法 上記架橋アクリル酸エステル系吸着樹脂及び架橋メタク
リル酸エステル系樹脂とは、アクリル酸及び／又はメタ
クリル酸の重合体を主要骨格とし、これらの重合体がジ
アルコールによって該重合体のカルボキシル基とエステ
ル結合して架橋化されたものであり、架橋化に関与しな
いカルボキシル基は、アルキルエステル化されている。
ン交換樹脂への吸着と溶出を行なう方法 （３）架橋デキストランゲル、架橋ポリアクリルアミド
ゲル等の親水性ゲルを用いたゲル濾過法 （４） ジエチルアミノエチルセルロース等の塩基性
イオン交換樹脂への吸着と溶出を行なう方法 上記架橋アクリル酸エステル系吸着樹脂及び架橋メタク
リル酸エステル系樹脂とは、アクリル酸及び／又はメタ
クリル酸の重合体を主要骨格とし、これらの重合体がジ
アルコールによって該重合体のカルボキシル基とエステ
ル結合して架橋化されたものであり、架橋化に関与しな
いカルボキシル基は、アルキルエステル化されている。
これらの吸着樹脂は、比表面積１００〜１，０ＯＯｒｒ
？／ｇのものが好ましい。
？／ｇのものが好ましい。
ヒト尿又はその部分精製されたｈ−ＥＧＦ含有液は、前
記吸着樹脂とｐＨ３〜１１の下に接触させられる。ｐＨ
が３未満ではｈ−ＥＧＦの純度（比活性）が小さくなシ
、ｐＨが１１を超えると収率が悪くなる傾向がある。Ｉ
）Ｈの調整は、酢酸等の有機酸、塩酸、硫酸等の無機酸
を使用して行なうことができ、リン酸緩衝液等の緩衝液
でもよい。またヒト尿又はその部分精製されたｈ−ＥＧ
Ｆ含有液には、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫
酸す） ＩＪウム等の無機塩を２重量％以上溶解させて
おくのが、ｈ−ＥＧＦの吸着樹脂への吸着能を高める上
で好ましい。無機塩は多すぎても吸着能向上効果に影響
しないので、また、精製上から１０重量％以下が好まし
い。なお、ヒト尿中にはすでに相当量の塩が溶解してい
るので、無機塩を新たに添加する必要はない。また、無
機塩の存在は、ｈ−ＥＧＦ吸着後の吸着樹脂を洗浄する
場合に、その脱着防ぐ上で好ましい。
記吸着樹脂とｐＨ３〜１１の下に接触させられる。ｐＨ
が３未満ではｈ−ＥＧＦの純度（比活性）が小さくなシ
、ｐＨが１１を超えると収率が悪くなる傾向がある。Ｉ
）Ｈの調整は、酢酸等の有機酸、塩酸、硫酸等の無機酸
を使用して行なうことができ、リン酸緩衝液等の緩衝液
でもよい。またヒト尿又はその部分精製されたｈ−ＥＧ
Ｆ含有液には、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫
酸す） ＩＪウム等の無機塩を２重量％以上溶解させて
おくのが、ｈ−ＥＧＦの吸着樹脂への吸着能を高める上
で好ましい。無機塩は多すぎても吸着能向上効果に影響
しないので、また、精製上から１０重量％以下が好まし
い。なお、ヒト尿中にはすでに相当量の塩が溶解してい
るので、無機塩を新たに添加する必要はない。また、無
機塩の存在は、ｈ−ＥＧＦ吸着後の吸着樹脂を洗浄する
場合に、その脱着防ぐ上で好ましい。
ｈ−ＢＧＦ吸着後の吸着樹脂は、溶出前に、水、アンモ
ニア水等のアルカリ水溶液（ｐＨ９以上）、酸水溶液で
洗浄してもよい。この洗浄によって精製度を高めること
ができる。
ニア水等のアルカリ水溶液（ｐＨ９以上）、酸水溶液で
洗浄してもよい。この洗浄によって精製度を高めること
ができる。
溶出は、メタノール、エタノール、プロパノー１Ｎの濃
度で含むのが好ましい。０．０ＩＮ未満では溶出が困難
になる傾向があり、ＩＮを超えると１ｌ−ＥＧＦが分解
しやすくなる傾向がある。溶出液には、酸の代わりにア
ンモニア等のアルカリ物質を含ませておくことも同様に
好ましい。例えば、アンモニアは０．０１〜１容量％で
含ませるのが好このようにして得られた溶出液は、その
ままで又は適宜濃縮することにより容積の小さいもので
あり、ついで、ゲル濾過、イオン交換、クロマトグラフ
ィー、凍結乾燥等の処理に供するのに好ましい。なお、
上記溶出液は、水溶性有機溶剤を多量に含むため蒸留等
による濃縮が容易であシ、特にカラムを使用して溶出す
る場合はｈ−ＥＧＦのみを含む分画のみを捕集すること
によりかなり容積を小さくすることができる。
度で含むのが好ましい。０．０ＩＮ未満では溶出が困難
になる傾向があり、ＩＮを超えると１ｌ−ＥＧＦが分解
しやすくなる傾向がある。溶出液には、酸の代わりにア
ンモニア等のアルカリ物質を含ませておくことも同様に
好ましい。例えば、アンモニアは０．０１〜１容量％で
含ませるのが好このようにして得られた溶出液は、その
ままで又は適宜濃縮することにより容積の小さいもので
あり、ついで、ゲル濾過、イオン交換、クロマトグラフ
ィー、凍結乾燥等の処理に供するのに好ましい。なお、
上記溶出液は、水溶性有機溶剤を多量に含むため蒸留等
による濃縮が容易であシ、特にカラムを使用して溶出す
る場合はｈ−ＥＧＦのみを含む分画のみを捕集すること
によりかなり容積を小さくすることができる。
次に１本発明の実施例を示す。
実施例−１
男子床２００ｔに塩酸を加えてＩ）Ｈを、８に調整した
。そこ知ダイヤイオンＨＰ２ＭＧ（三菱化成工業（株）
商品名、架橋メタクリルエステル系吸着樹脂）２００−
を加え室温で２時間激しく攪拌した。樹脂を分離してカ
ラムに充填し、水１０７ついで１％アンモニア水１０ｔ
を流して洗浄した。
。そこ知ダイヤイオンＨＰ２ＭＧ（三菱化成工業（株）
商品名、架橋メタクリルエステル系吸着樹脂）２００−
を加え室温で２時間激しく攪拌した。樹脂を分離してカ
ラムに充填し、水１０７ついで１％アンモニア水１０ｔ
を流して洗浄した。
つぎに２５％アンモニア水を１ｖｏｔ％含むアセトニト
リルを流してｈ−ＥＧＦを溶出したところ溶出液４ｔか
ら６ｔにかけての２ｔの分画にｈ−ＥＧＦが溶出した。
リルを流してｈ−ＥＧＦを溶出したところ溶出液４ｔか
ら６ｔにかけての２ｔの分画にｈ−ＥＧＦが溶出した。
この２ｔのｈ−ＥＧＦ溶出液を酢酸で中和後口−タリー
エバポレータで濃縮してｈ−ＥＧＦ水溶液１５０−を得
た。ラジオレセプターアッセイ法（ＲＲＡ法）で分析し
たところ５、３ ｍ ｇのｈ＝−ＥＧＦが含まれておシ
尿からの回収率は９０％であった。まだ比活性は４３Ｘ
１０−３（Ａ ｇ ／ ２８０ ｎ ｍ ）であシ尿の
比活性３．５Ｘ１０−３よシ約１２倍向上した。
エバポレータで濃縮してｈ−ＥＧＦ水溶液１５０−を得
た。ラジオレセプターアッセイ法（ＲＲＡ法）で分析し
たところ５、３ ｍ ｇのｈ＝−ＥＧＦが含まれておシ
尿からの回収率は９０％であった。まだ比活性は４３Ｘ
１０−３（Ａ ｇ ／ ２８０ ｎ ｍ ）であシ尿の
比活性３．５Ｘ１０−３よシ約１２倍向上した。
実施例−２′
男子床５ｋｌに希硫酸を加えｐＨを４に調整した。
１００ｔステンレス製カラムにＸＡＤ７（オルガノ、ラ
ンド社、架橋メタクリルエステル系樹脂）７５ｔを充填
したカラムＫｐＨ調整した尿を約３００ｔ／ｈｒの流速
で流した。全ての尿を流し終ったら水２００ｔで洗浄後
２５％アンモニア水をｌ ｖｏ７％含むメタノールでｈ
−ＥＧＦ’を溶出した。得られだｈ−ＥＧＦメタノール
溶液１００ｔを塩酸で中和後フラッシュエバポレータで
濃縮してｈ−ＥＧＦ水溶液１８ｔを得た。これＶＣｈ
−ＥＧＦ２５０ｍｇが含まれており（回収率８０％）、
比活性は３５Ｘ１０−３であった。
ンド社、架橋メタクリルエステル系樹脂）７５ｔを充填
したカラムＫｐＨ調整した尿を約３００ｔ／ｈｒの流速
で流した。全ての尿を流し終ったら水２００ｔで洗浄後
２５％アンモニア水をｌ ｖｏ７％含むメタノールでｈ
−ＥＧＦ’を溶出した。得られだｈ−ＥＧＦメタノール
溶液１００ｔを塩酸で中和後フラッシュエバポレータで
濃縮してｈ−ＥＧＦ水溶液１８ｔを得た。これＶＣｈ
−ＥＧＦ２５０ｍｇが含まれており（回収率８０％）、
比活性は３５Ｘ１０−３であった。
実施例−３
新鮮ヒト男子床２００ｔに塩酸を加え、ｐＨ３，５に調
整した。これを、前もって酢酸にて上清のｐＨが３．５
になるように処理したアクリル酸系イオン交換樹脂（バ
イオラッド社、パイオンツクスフ０）２ｔに加え、２４
時間攪拌を続けた後、該イオン交換樹脂を炉別しだ。樹
脂を水洗したのち、１Ｍ酢酸アンモニウムを含むアンモ
ニア水（ｐＨ９，５）で抽出し、抽出液（ＥＧＦ含有液
）１０ｔを得た。この抽出液のＲＲＡによるＥＧＦ濃度
は１，０８０μｇ／ｌ、 ２８０ ｎｍの吸光度ユニッ
トは５Ｘ１０’であった。
整した。これを、前もって酢酸にて上清のｐＨが３．５
になるように処理したアクリル酸系イオン交換樹脂（バ
イオラッド社、パイオンツクスフ０）２ｔに加え、２４
時間攪拌を続けた後、該イオン交換樹脂を炉別しだ。樹
脂を水洗したのち、１Ｍ酢酸アンモニウムを含むアンモ
ニア水（ｐＨ９，５）で抽出し、抽出液（ＥＧＦ含有液
）１０ｔを得た。この抽出液のＲＲＡによるＥＧＦ濃度
は１，０８０μｇ／ｌ、 ２８０ ｎｍの吸光度ユニッ
トは５Ｘ１０’であった。
この抽出液に力性ソーダを加えてｐ Ｈ８，５に調整し
た。これを２００−の吸着樹脂ＸＡＤ７を充てんし九カ
ラムに５００ｍ１／ｈｒの流速で流した。
た。これを２００−の吸着樹脂ＸＡＤ７を充てんし九カ
ラムに５００ｍ１／ｈｒの流速で流した。
この操作が終了した後、水５００ｍ／で洗浄し、ついで
、濃塩酸を０．５容量％含むメタノール４０〇−でＥＧ
Ｆを溶出した。溶出液をアンモニア水で中和後、ロータ
リーエバポレータで濃縮して、ＥＧＦ水溶液５０−を得
だ。このＥＧＦ水溶液には、ＥＧＦ８．１６ｍｇ（回収
率８５％；上記抽出液に対して）含まれておシ、このＥ
ＧＦＯ比活性は上記抽出液に対し、４倍上昇した。液量
は１／２００になった。
、濃塩酸を０．５容量％含むメタノール４０〇−でＥＧ
Ｆを溶出した。溶出液をアンモニア水で中和後、ロータ
リーエバポレータで濃縮して、ＥＧＦ水溶液５０−を得
だ。このＥＧＦ水溶液には、ＥＧＦ８．１６ｍｇ（回収
率８５％；上記抽出液に対して）含まれておシ、このＥ
ＧＦＯ比活性は上記抽出液に対し、４倍上昇した。液量
は１／２００になった。
上記吸着樹脂は、ＩＮ力性ソーダ水溶液６０〇−１ＩＮ
塩酸６００−で順次洗浄し、最後に水洗して再生した。
塩酸６００−で順次洗浄し、最後に水洗して再生した。
再生吸着樹脂を用い、上記と同様の操作による抽出液の
精製を吸着樹脂の再生と共に、２０回繰り返したが、抽
出液に対するＥＧＦの回収率及び比活性の向上率につい
て低下はなかった。
精製を吸着樹脂の再生と共に、２０回繰り返したが、抽
出液に対するＥＧＦの回収率及び比活性の向上率につい
て低下はなかった。
実施例−４
実施例３において、抽出液のｐＨを４に調整した以外は
、実施例４に準じて行なった。その結果、ＥＧＦ’の回
収率は８０％、比活性の上昇は２．５倍、液量は１／２
００となった。
、実施例４に準じて行なった。その結果、ＥＧＦ’の回
収率は８０％、比活性の上昇は２．５倍、液量は１／２
００となった。
参考例
実施例３において吸着樹脂ＸＡＤ７の代わりに吸着樹脂
ＸＡＤ２（ジビニルベンゼン系共重合体、オルガノラッ
ド社）を用いて実施例３に準じて行なったところ、ＥＧ
Ｆの回収率は６５％であったが、抽出液の精製を吸着樹
脂の再生と共に５＠繰り返したときのＥＧＦ回収率は５
％以下に低下した。
ＸＡＤ２（ジビニルベンゼン系共重合体、オルガノラッ
ド社）を用いて実施例３に準じて行なったところ、ＥＧ
Ｆの回収率は６５％であったが、抽出液の精製を吸着樹
脂の再生と共に５＠繰り返したときのＥＧＦ回収率は５
％以下に低下した。
Claims (1)
- １、ヒト尿またはヒト尿を部分精製したヒト上皮細胞成
長因子を含有する溶液を架橋アクリルエステル系吸着樹
脂及び／又は架橋メタクリルエステル系吸着樹脂と接触
させて、ヒト上皮細胞成長因子を該吸着樹脂に吸着させ
、ついで、該吸着樹脂からヒト上皮細胞成長因子を溶出
することを特徴とするヒト上皮細胞成長因子の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60170394A JPS6230718A (ja) | 1985-08-01 | 1985-08-01 | ヒト上皮細胞成長因子の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60170394A JPS6230718A (ja) | 1985-08-01 | 1985-08-01 | ヒト上皮細胞成長因子の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6230718A true JPS6230718A (ja) | 1987-02-09 |
Family
ID=15904112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60170394A Pending JPS6230718A (ja) | 1985-08-01 | 1985-08-01 | ヒト上皮細胞成長因子の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6230718A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100488287B1 (ko) * | 2003-03-06 | 2005-05-10 | 주식회사 대웅 | 재조합 인간 상피세포 성장인자의 정제방법 |
-
1985
- 1985-08-01 JP JP60170394A patent/JPS6230718A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100488287B1 (ko) * | 2003-03-06 | 2005-05-10 | 주식회사 대웅 | 재조합 인간 상피세포 성장인자의 정제방법 |
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