JPS62276462A - ヒト血清中の抗体の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔利用分野〕 本発明は各種疾患その池に際してヒト血清中に出現する
抗体の定量法に関する。更に詳しくは、特に感染症等に
際して出現する各種ウィルス、細菌に対する抗体、自己
免疫疾患において出現する自己生体成分に対する抗体（
自己抗体）の定量に関する。かかる抗体の中には臨床的
意義の明確になっているものあるいは未だ研究段階のも
のが含まれており、従って本発明法は臨床医学のみなら
ず各種基礎研究に応用しうるものである。

〔従来技術〕

ヒト血清中の抗体の測定法としては従来より種々の方法
が実施されている。例えば蛍光抗体法においては固定化
された抗原とヒト血清中の抗体を結合させ、更にこの結
合した抗体を蛍光物質で標識した抗ヒトＴ−グロブリン
抗体で検出する（臨床検査技術全書第４巻・免疫血清検
査、河合忠編。

３７７頁）。また抗原と抗体をゲル内で反応させる方法
（沈降反応）、タンニン酸処理し抗原を感作した血球を
用いて凝集反応を見る方法などもある。

（同上３９８頁、３９９頁）。更に、新しい技術として
は抗イムノグロブリン抗体結合固相と酵素標識抗原ある
いは抗原結合固相と酵素標識抗イムノグロブリン抗体を
用いる酵素免疫測定法も知られている（酵素免疫測定法
、石川栄治　他編、２０２頁）。しかし、これらの方法
はいずれも、抗体量の測定値としては一１±、＋、＋＋
というような半定量的な結果で表示されたり、希釈倍率
をもとにして抗体価という数値で示されたり、あるいは
標準となる血清の容量として示されるなど抗体そのもの
の絶対量が把握できないという問題がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

このようにヒト血清中の抗体の測定法における測定値が
半定量的あるいは相対的な数値でしか示されないのは標
準となる抗体が入手できないか、あるいは入手が極めて
困難である為である。即ち、ヒト血清中の抗体を測定す
るのであるから本来ヒト由来の抗体を標準物質とすべき
であるが、対象がヒトである為、人為的に且つ安定して
標準となるヒト抗体を作成することができないのであっ
た。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、以上の事情を考慮して鋭意検討した結果
、正常ヒトイムノグロブリンに抗体としての性質を付与
したものを用いることによりヒト血清中の抗体の絶対量
を把握することができると考え、鋭意検討の結果本発明
を完成したものである。

叩ち本発明は、正常ヒトイムノグロブリンと抗原Ａに対
する動物由来の抗体との結合物（以下「合成抗体」とい
う。）を標準物質として用いてヒト血清中の抗原Ａに対
する抗体を測定することを特徴とするヒト血清中の抗体
を測定する方法に関する。

ここで正常ヒトイムノグロブリンとは、正常ヒト血清よ
り分離されたイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグ
ロブリンＭ（ｔｇＭ）、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）
、イムノグロブリンＡ（１ｇＡ）、イムノグロブリンＤ
（ＩｇＤ）などのことであり、これらの中には精製した
標品として市販されているものもある。

一方、抗原Ａとはヒト血清中の抗体に結合し得る物質を
示し、ヒト体内で異物として認識される各種ウィルス、
細菌等の微生物およびそれらの成分、花粉などの植物由
来成分、ダニなどの生物およびその成分などあらゆるも
のが含まれる。更に本来ヒト生体内に存在する物質では
あるが、各種疾患等で抗体が出現する各種ホルモン、臓
器成分なども含まれる。また、疾病に際して体内に投与
される各種薬剤も抗原Ａに含まれる。

合成抗体の作成に用いられる動物由来の抗体とは、抗原
Ａを各種動物の体内に投与して得られる抗血清由来のも
のであり、勿論モノクローナル抗体も含まれる。抗体の
作成の為に用いられる動物としては何でも良いが、ウサ
ギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスター、ラット、
ウマ、ニワトリなどが一般的である。

さて、合成抗体の作成に際しては、正常ヒトイムノグロ
ブリンと抗原Ａに対する動物由来の抗体（以下単に「抗
体」という。）を結合させる必要がある。こσ為には各
種蛋白質架橋試薬が用いらレル。例えばカルボジイミド
誘導体、シマレイミド誘導体、サクシニイミド誘導体、
グルタルアルデヒドなどがあり、更に具体的には１−シ
クロへキシル−３−（２−モルフォリノエチル）カルボ
ジイミド・メト−ｐ−トルエンスルホン酸、Ｎ、　Ｎ’
−０−フェニレンジマレイミド、４−（マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボン酸サクシニルイミド
エステルなどが用いられる。

ここで用いられる正常ヒトイムノグロブリンとしては、
精製されたＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭが
用いられ、イムノグロブリンそのものでも良いが、それ
らの分解物を用いても良い。

例えばＩｇＧではペプシンで限定分解して得られるＦ　
（ａｂ’）ｚ、Ｆａｂ’、Ｆｃ’などのフラグメント、
パパインで限定分解して得られるＦａｂ、　Ｆｃなどの
フラグメントの他１ｇＧを還元して得られるＨ鎖、Ｌ鎮
あるいはそれらの結合物でも良い。またＩｇＡ、ＩｇＭ
などのオリゴマーとして存在するイムノグロブリンでは
それらを構成する七ツマ−を用いても良い。

一方、抗体としては抗原Ａに対する結合性があれば良く
、例えばＩｇＧ抗体であれば、ＩｇＧそのものの他、上
記と同様にＦ　（ａｂ’）ｚ、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの
フラグメントが用いられる。この抗体はポリクロール抗
体であれば、イムノグロブリン分画そのものを用いるこ
ともできるが、抗原Ａを用いたアフィニティークロマト
グラフィーによって分離し得る精製抗体を用いる方がよ
り好ましい。

勿論モノクローナル抗体では精製抗体にする必要はない
。

このようにして得られた合成抗体はあらゆる測定方法に
応用できるが、例えば以下のようなものがある。

ゲル内沈降反応、免疫比濁法、赤血球凝集法、ラテック
ス凝集法などの凝集法、放射免疫測定法（以下ｒＲＩＡ
Ｊという。）、酵素免疫測定法（以下ｒＥ　ＩＡＪとい
う。）、蛍光免疫測定法（以下ｒＦＩＡＪという。）、
その他色疫学的測定法。

これらの中で特にＲＩＡＳＥＩＡＸＦＩＡは高感度であ
り、ヒト血清中に微量存在する抗体を検出し得る。これ
らの手法の測定原理としては以下のようなものがある。

■検出可能な基Ｃで標識された抗原Ａと検体を反応させ
、次いで得られた免疫複合体を抗ヒトイムノグロブリン
抗体で沈降分離する方法。

■検出可能な基Ｃで標識された抗原Ａ、水不溶性担体Ｂ
に結合された抗ヒトイムノグロブリン抗体および検体を
反応させる方法。

■検出可能な基Ｃで標識された抗ヒトイムノグロブリン
抗体、水不溶性担体Ｂに結合された抗原Ａおよび検体を
反応させる方法。

勿論、本発明法の応用範囲は以上の方法に限定されるも
のではない。

このように本発明法はヒト血清中の抗体の測定に広く応
用し得るものであるが、以下実施例にてこのことを説明
する。

実施例１ （１）サイロキシンに対する合成抗体の作成精製された
ヒトＩｇＧと４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボン酸すクシニイミドエステルを３０℃で９
０分間反応させてマレイミド化ヒトＩｇＧを調製した。

一方ウサギより得られた抗サイロキシン抗体をペプシン
で限定分解して得られたＦ　（ａｂ’）２を２−メルカ
プトエチルアミンで還元しＦａｂ”フラグメントを得た
。

マレイミド化ヒトＩｇＧ１００■とＦａｂ”フラグメン
ト　２００■を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中で３
０℃、６０分間反応させた。この反応液をセファクリル
Ｓ　−３００（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製
）のカラムに流し、ヒトＩｇＧと抗サイロキシン抗体の
結合物、即ちサイロキシンに対する合成抗体１４０■を
得た。

得られた合成抗体をサイロキシン不溶化セファロースの
カラムに流したところ１．８％が吸着された。一方、合
成抗体を抗ヒト■ｇＧ抗体不溶化セファロースのカラム
に流したところ、はぼ１００％吸着された。

合成抗体５０■を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）　１
０−に熔かしサイロキシンに対する合成抗体標準液を調
製した。この標準液の力価は抗サイロキシン抗体として
９０ｐｇ　／　ｍｆ’である。

（２）ヒト血清中の抗サイロキシン抗体の測定ヒト血清
中の抗サイロキシン抗体を測定する為に下記の試薬を調
製した。

標識抗原ａ：酵素標識サイロキシン （Ｒ，Ｙａｍａｍｏｔｏら＋　　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｙ２７巻、　１７２１頁（１９８１）の方
法で調製したもの〕。

緩衝液ｂ：９．５％ゼラチンと０．１％牛血清アルブミ
ンおよび０．３Ｍ　ＮａＣ１を含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７＞。

カラムＣ：抗ヒトＩｇＧ抗体不溶化セファロースを０．
１−のポリスチレンカラム に充填したもの。

基質ｃｔ：　　３３ｍＭｏ−二トロフェニルーβ−ロ〜
ガラクトシド溶液 発色剤ｅ　　：８０ｍＭ炭酸ソーダ溶液（１）で調製し
たサイロキシンに対する合成抗体を緩衝液すで希釈し抗
サイロキシン抗体として０゜１０、３３．１００．３３
０．１１０００ｎ／薇の標準液を調製した。一方、甲状
腺機能亢進症の患者血清を緩衝液すで１００倍希釈した
。これら希釈した標準液と希釈血清の各々　１００ｉに
標識抗原ａ　　５０ｈｊ！を加え、３７℃で２時間反応
させた。この反応液をカラムＣに流し、カラムＣを緩衝
液ｂ２−で洗浄した。洗浄したカラムＣに基質ｄ　　５
００ｍを流しカラムＣを２５℃で９０分間装いた。次に
カラムＣを発色剤８２−で洗浄し、得られた洗浄液の４
２Ｏｒ＋ｎ＋における吸光度を測定した。

標準液の測定値より図１に示す標準曲線を作成し患者血
清中の抗サイロキシン抗体量を求め表１の結果を得た。

表１：患者血清中の抗サイロキシン抗体実施例２ （１）インスリンに対する合成抗体の作成精製されたヒ
）ｒｆＧをペプシンで限定分解しＦｃ’フラグメントを
得た。これとモルモットより得られた抗インスリン抗体
を用いて実施例１に準じてインスリンに対する合成抗体
を得た。なお、抗インスリン抗体としてはアフィニティ
ー精製抗体を用いた。この合成抗体を実施例１に準じて
検定したところインスリン不溶化セファロースのカラム
に９１％が吸着した。

合成抗体１■を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）　　１
ｍｌに溶解し抗インスリン抗体として９ＬＯｐｇ／―の
標準液を得た。

（２）ヒト血清中の抗インスリン抗体の測定ヒト血清中
の抗インスリン抗体を測定する為に下記の試薬を調製し
た。

標識抗体ａ　：酵素標識抗ヒ）ＩｇＧ抗体（５０ｍ［Ｉ
／　−、Ｋ、Ｋａｔｏら、　　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　ｕｓ＠、　　１５５４頁（１９
７６）の方法で調製し活性測定 したもの）。

緩衝液　ｂ：実施例１（２）の緩衝液すと同じ。

感作ビーズＣ：ポリスチレンビーズ（直径１／４インチ
）に牛血清アルブミンを 吸着させ、これにグルタルアル デヒドを用いてインスリンを結 合させたもの。

基　質　ｄ　：実施例１（２）の基質ｄと同じもの。

発色剤　ｅ：実施例１（２）の発色剤ｅと同じもの。

ｔｌ）で調製したインスリンに対する合成抗体を緩衝液
すで希釈し０．　１．３．３．１０．３３．１１００ｎ
／ｍｅの標準液を調製した。同時にインスリンを投与を
行っている糖尿病患者血清を緩衝液すで１０倍希釈した
。上記標準液と希釈した血清の各々　ｔｏａｐｌに緩衝
液ｂ　　５ｏｏｐｌと感作ビーズＣｌケを加え３７℃で
１時間反応させた。次に感作ビーズＣを水洗した後、標
識抗体ａ　　５００ｐ！に入れ３７°Ｃで１時間反応さ
せた。感作ビーズＣを水洗後、基質ｄ　　５００ｎに入
れ３７℃で２時間反応させ最後に発色剤ｅ１−を加え、
この液の４２０ｉｍにおける吸光度を測定した。

実施例１（２）と同様に標準曲線を作成し、患者血清中
の抗インスリン抗体量を求めた（表２）。

表２：患者血清中の抗インスリン抗体 実施例３ （１）サイログロブリンに対する合成抗体の作成精製さ
れたヒトＩｇＧ１００■とサイログロブリンに対するモ
ノクローナル抗体２００■を各々別々に２−メルカプト
エチルアミンで還元した。還元したヒトＩｇＧとＮ、Ｎ
’−０−フェニレンジマレイミドを３０℃で４０分間反
応させ、次にこのマレイミド化ヒトＩｇＣと還元したモ
ノクローナル抗体を３０℃で６０分間反応させた後、セ
ファクリルＳ　−３００のカラムに流し、サイログロブ
リンに対する合成抗体１００■を得た。

得られた合成抗体をサイログロブリンネ溶化セファロー
スのカラムに流したところ９５％が吸着された。

合成抗体１■を０．１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７）　　
１−に熔解し抗サイログロブリン抗体として９５０ｐｇ
／ｍβの標準液を得た。

（２）ヒト血清中の抗サイログロブリン抗体の測定ヒト
血清中の抗サイログロブリン抗体を測定する為に下記試
薬を調製した。

標識抗原ａ：常法により１２５Ｉで標識したサイログロ
ブリン（０，１μＣｉ／−）。

緩衝液ｂ　：実施例１（２）の緩衝液すと同じ。

カラムＣ：実施例１（２）のカラムＣと同じ。

（１１で調製したサイログロブリンに対する合成抗体を
緩衝液すで希釈し、抗サイログロブリン抗体として０．
　１．３．３．１０．３３．１１００ｎ／−の標準液を
調製した。一方バセドウ病患者血清を緩衝液すで１００
倍希釈した。標準液および希釈血清の各々１ｏｏｐ！に
標識抗原ａ　　１００ＩＪ！を加え３７°Ｃで２時間反
応させた。この反応液をカラムＣに流し、カラムＣを緩
衝液ｂ２−で洗浄した。カラムＣに結合した放射活性を
ガンマ−カウンターで計測し、標準曲線より患者血清の
抗サイログロブリン抗体量を求めた（表３）。

表３：患者血清中の抗サイログロブリン抗体〔発明の効
果〕 以上の如く本発明法によれば、ヒト血清中の抗体量を＋
、−あるいは希釈倍数、抗体価というようなあいまいな
表現ではなく絶対量として把握できる。また、従来法で
は、抗体の測定手法が異なれば相互に測定値を比較する
ことはできなかったが、本発明法では合成抗体を標準物
質としてヒト血清中の抗体量を絶対値として表示できる
ので、測定手法が異なっても合成抗体を標準物質とする
限り同じ測定値が得られるという大きな特徴がある。こ
れは臨床医学、基礎研究に寄与すること大である。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１（２）における抗サイロキシン抗体の標
準曲線を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　正常ヒトイムノグロブリンと抗原Ａに対する動物由
   来の抗体との結合物を標準物質として用い、ヒト血清中
   の抗原Ａに対する抗体の絶対量を求めることを特徴とす
   るヒト血清中の抗体の定量法。 ２　ヒト血清中の抗原Ａに対する抗体の絶対量が検出可
   能な基Ｃで標識された抗原Ａ、水不溶性担体Ｂに結合さ
   れた抗ヒトイムノグロブリン抗体および検体を反応させ
   て得られる免疫複合体中の標識活性を測定することによ
   り求められるところの特許請求の範囲第１項記載のヒト
   血清中の抗体の定量法。 ３　ヒト血清中の抗原Ａに対する抗体の絶対量が検出可
   能な基Ｃで標識された抗ヒトイムノグロブリン抗体、水
   不溶性担体Ｂに結合された抗原Ａおよび検体を反応させ
   て得られる免疫複合体の標識活性を測定することにより
   求められるところの特許請求の範囲第１項記載のヒト血
   清中の抗体の定量法。 ４　水不溶性担体Ｂが水不溶性合成ポリマーまたは水不
   溶性多糖の成型物である特許請求の範囲第２項または第
   ３項記載のヒト血清中の抗体の定量法。 ５　検出可能な基Ｃが酵素または放射性同位元素である
   特許請求の範囲第２項または第３項記載のヒト血清中の
   抗体の定量法。