JPS62248487A - グルカナーゼを固定化したアパタイトおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はグルカナーゼ等を固定化したアパタイト及びア
パタイトにグルカナーゼ等を固定化する方法に関するも
のである。グルカナーゼはグルカンな分解する酵素の総
称であり、各棟の酵素が含まれるが、本願発明に云うグ
ルカナーゼとはレバンを分解するレバナーゼ、デキスト
ランを分解するデキストラナーゼ、ムタンを分解するム
タナーゼを指し、またアパタイトとはハイドロキシアパ
タイトとフルオロアパタイトを意味している。但し酵素
がデキストラナーゼの場合はアパタイトとしてフルオロ
アパタイトのみを指している。

虫歯が、口腔に存在する種々の細菌の生成する多糖類、
例えばレバン、デキストラン、ムタン、などにより、歯
垢を形成するため発生することは周知の事実である。従
って、虫歯の予防にこれら細菌の生成する多糖類を除去
し、歯垢の形成を妨げることが考えられている。本願発
明は、これら虫歯の発生に関係する多糖類の分解酵素乞
固定化したアパタイト及びその＃遺失に関するものであ
る。

（従来の技術） 従来から虫歯予防として、歯垢を除去する方法が種々実
施されている。例えばゼオライト、炭酸カルシウム、ア
ルミナ、シリカ、その他の研磨剤で＃垢を削り取る方法
、デキストラナーゼを安定化剤と共に使用する方法など
が存在するが、本願発明のように、レバナーゼ、ムタナ
ーゼ、デキストラナーゼのような虫歯の原因とびそれら
酵素を固定化したアパタイトはいまま”パで存在しなか
った。

（発明が解決しようとする問題点） グルカナーゼは酵素であるから比較的不安定であり、ｍ
膀きにそのま＼混合すると、時間とともにその活性を低
下し、遂には活性を示さな（なる。現在デキストラナー
ゼは歯若きに使用されているが、その失活を妨けるため
各徳の安定化剤が提案されている。例えば、特開昭５６
−６３９１５号公報はデキストラナーゼと酸化アルミニ
ウムとの配合を、特開昭５６−１１０６０９号公報はデ
キストラナーゼとカルボン、ｔ−メントールとの混合を
、特公昭５２−４９０５５号明ａ書はデキストラナーゼ
とゼラチンまたはベフトンとの配合を提案している。

然るに、ｍｅきは口腔内で使用するため、人体に対する
影響を考慮する必要があり、また使用後の清涼感を要求
されるなど、禎々の制約をうけている。安定化剤も当然
かかる制約下におかれるため、安定化剤の選択は困難な
問題を含んでいる。デキストラナーゼ以外の酵素を使用
する場合にもデキストラナーゼ使用の場合と全（同じ問
題を生じる。そこでグルカナーゼの安定化法について禎
々検討した結果、研磨剤として使用されるアパタイトに
グルカナーゼを固定化することにより、安定剤を心安と
せず、長期間安定に活性を示すグルカナーインえる方法
を開発することができた。本願発明はグルカナーゼを固
定化したアパタイト及びその製造法を提供するものであ
る。

（問題を解決するための手段） ハイドロキシアパタイト、活性炭、カオリナイト、白土
などに酵素を物理的に吸着させて固定化させる酵素固定
化法が存在することは周知の事実であり、又固定化され
た酵素は安定化し、酵素単体より経時活性の変、化が少
く、取扱いが便利であることも一般に知られている。こ
のようにアパタイトがある櫨の蛋白質を強固に吸着結合
することが古（から知られているので、グルカナーゼを
固定化してその経時活性の変化を少（するとの考えにも
とすき、歯磨きで研磨剤として使用されているアパタイ
トに物理的吸着法によりグルカナーゼを固定化すること
ができれば、簡単な操作で固定化酵素かえられ、それを
＃ｉ腫きに使用すれば研磨性と多糖質分解性の両件用を
有することに加え、酵素の安定化剤の選択を必要とせず
、好ましい歯磨素材になるであろうと考え、グルカナー
ゼのアパタイトによる固定化を検討した゛。その結果グ
ルカナーゼの７パタイトへの吸着力が極めて弱いため、
直接グルカナーゼを７パタイトに吸着固定化することは
無理があると認めた。そこで、我々はアパタイトに強固
に吸着結合する蛋白質を介してグルカナーゼを固定化し
たアパタイトをえることができた。本願発明はグルカナ
ーゼを固定化したアパタイト、及びアパタイトに強く吸
着するある樵の蛋白質とともにグルカナーゼを７パタイ
トに固定化させる方法を提供するものである。

本願発明にいうグルカナーゼとは前記のように、デキス
トラナーゼ、レバナーゼ、ムタナーゼを含み、アパタイ
トとはハイドロキシアパタイト、フルオロアパタイトと
を意味しているが酵素がデキストラナーゼの場合はアパ
タイトとしてフルオロアパタイトを意味している。

アパタイトに強く吸着し、かつ人体に悪影響を及ぼさな
い蛋白質、及びグルカナーゼを溶解した水溶液、又は０
゜０１から０．０５モル磯度のリン酸塩緩衝溶液にアパ
タイトを懸濁させ、激しく攪拌しなから２官能性アルデ
ヒドを滴下する。使用する蛋白質としては、アルブミン
、カゼイン、リゾチーム、チトクロムＣ１プロタミンな
どより選択される。蛋白質の種類により生成する固定化
酵素の力価、ア六タイトへの結合力に差を生じるが、そ
れらのなかでリゾチーム、チトクロムＣなどが好適であ
る。グルカナーゼは前記したように、レバナーゼ、デキ
ストラナーゼ、ムタナーゼより任意にえらぶことができ
、場合によってはこれら酵素の混合物を用いることがで
きる。アパタイトとしてはハイドロキシアパタイト、フ
ルオロアパタイトより選択する。

反応はアパタイトを分解しないｐＨ１即ちｐＭｓ、　６
以上のｐＨで行なわれるがｐｉｔが高（なると吸着に急
影響を及ばずのでｐｊｌ　９．０以上は好ましくな（，
９１１７、０付近が好ましい。使用するアパタイトの粒
度は出来るだけ均一であることが望まれるが、一般に１
１１きに研磨剤として使用されている粒子で充分使用可
能であり、粒径２μから２００μのものが使用し易く、
蛋白／ＸＫ対しｌＯから１００倍量を使用する。攪拌が
効率よ（行なわれるように、使用アパタイト菫に対し、
多量の水又は緩衝溶液を使用することが望まれ、反応相
固形分が４から２０パーセン）Ｋなルヨウ水量を調整す
る。使用する蛋白質とグルカナーゼは等量程度が好まし
く、両者の極端な相違、特にグルカナーゼが蛋白質に対
し少量であることは生成する固定化酵素の力価を下げる
ので避けるべきである。使用する２官能性アルデヒドと
しては一般に使用されているグルタルアルデヒドが好ま
しい。この使用量は固定化酵素の力価に最も影響を及ぼ
す因子である。一般にグルタルアルデヒドの添加量が少
なすぎるとえられた固定化酵素のアパタイトへの結合力
が弱（、経時失活が著しい。又添加量が多いと、えられ
る固定化酵素の力価を低下させ、史に添加量を増加さす
と遂には活性を示さなくなる。使用するグルタルアルデ
ヒド量は酵素、蛋白質の禎沖により幾分異なるが、使用
蛋白質を当り３から６０岬の範囲にあり、好ましくは６
から２０１１Ｑの範囲にある。反応は室温以下、好まし
くは５℃付近で行われる。

蛋白質、グルカナーゼ、アパタイトの共存スる懸濁液を
室温以下、好ましくは５℃付近に冷却し、激しく攪拌し
ながらこの液にグルタルアルデヒド水溶液な徐々に滴下
し、滴下終了後同温で攪拌を数時間行って反応を終了す
る。反応終了後濾過してえられたアパタイトは水又は使
用した緩衝溶液で充分洗浄して随伴している蛋白質、酵
素を除いたのち、そのま＼低温に保持するか、凍結乾燥
して固体となし室温に保持する。

本願発明の固定化酵素は又以下のようにしても生成させ
ることができる。まず蛋白質を浴かした水浴液又は緩衝
溶液にアパタイトを添加して充分攪拌してアパタイトに
蛋白質を吸着飽和させ、しかる後吸着アパタイトを採取
し、グルカナーゼを溶かした水又は緩衝溶液に吸着アパ
タイトを添加し、激しく攪拌しながらグルタルアルデヒ
ド水浴液を徐々に滴下し、滴下終了後攪拌をつづける。

この場合反応温度、その他の条件は前記の条件に準ずれ
ばよい。

（作用） アパタイト類がある種の蛋白質をよ（吸着することはす
でに明らかにされており、酵素の固定化に架橋剤として
グルタルアルデヒドが使用されていることも公知である
。本願方法によるグルカナーゼのアパタイトへの固定化
が、如何なる機構により生成しているか明らかでないが
、アパタイトに吸着し易い蛋白質のアパタイトへの吸着
、蛋白質、グルカナーゼの架橋が同時に生じ、固定化酵
素をえているものと推定される。

以下に実施例をあげて具体的に本願発明を説明する。

例１．　レバナーゼのハイドロキシアパタイトへの固定
化 リゾチーム１００′ｑ、レバナーゼ１ｏ０１１１ｉ。

を純水５０ｍにとかし、この浴猷に研磨剤ハイドロキシ
アパタイト２ｔを硝加し４℃に冷却する。４℃を検電ち
激しく攪拌しながらグルメルアルデヒド水浴液（グルタ
ルアルデヒド２８で３回攪拌洗浄して固体を採取し、未
乾燥固定化ハイドロキシアパタイトをえた（場合によっ
てはこのま＼使用してもよい）。これを凍結乾燥して粉
体約２．０５９をえた。この粉体１ｆを秤量し、ｐＨ６
，８，１モル濃度のリン酸カリ緩衝溶液１０−を添加し
、室温で１時間攪拌後遠心分離して戸液を採取し、残量
に同じ操作を２回繰返し、ｐ液を合せてローリ−法によ
り蛋白質量を測定し、残量は水洗後乾燥して重量を測定
した。その結果ハイドロキシアパタイトを尚たり、蛋白
質１１．７ａＦを結合していることを確認した。未乾燥
固定化ハイドロキシアパタイトを以下に述べる方法によ
り、そのレバナーゼ活性を測定したところ、ハイドロキ
シアパタイト結合蛋白ｆｘ？当り０．４７ｔのレバンな
分解することを認めた。

例２．　　レバナーゼのフルオロアパタイトへの固定化 実施例１のハイドロキシアパタイトの代りにフルオロア
パタイトを用いた以外は実施例１と全く同じ条件で操作
し、凍結乾燥品２．０５Ｆをえた。例１と同様に結合蛋
白を測定し、フルオロアパタイト２当り１３．４ＷＩの
蛋白質を結合していることを確認した。例１と同様にレ
バナーゼ活性測定結果は結合蛋白１当り、０．５４　ｆ
のレバンな分解することを知った。

例３．　　ムタナーゼのハイドロキシアパタイトへの固
定化 例１のレバナーゼの代りにムタナーゼを用いた以外は例
１と同じ条件で実験し、固定化ハイドロキシアパタイト
をえた。例１と同僚に試験した結果、ハイドロキシアパ
タイトｆ当り蛋白Ｊ１５．０■を結合していることを絡
めた。又ムタナーゼ活性を測定した結果、ノ・イドロキ
シアバタイト結合蛋白５Ｉｔｔｓす０，４８９のムタン
を分解することを確めた。

例４．　　ムタナーゼのフルオロアパタイトヘノ固定化 例３におけるハイドロキシアパタイトの代りにフルオロ
アパタイトを用いた以外は、例３と全く同じ条件で操作
し、固定化７０オロアバタイトをえた。例３と同様に分
析、その力価を測定した結果、フルオロアパタイトを当
り蛋白質１７１１ｑを結合し、結合蛋白質ｆ轟り０．４
５ｆのムタンを分解することを認めた。

例５．　デキストラナーゼのフルオロアパタイトへの固
定化 リゾチーム５０ｗｙ、デキストラナーゼ５０４を混合し
、これにフルオロアパタイト５　ｆ。

０．０５モル濃度、ｐｉ　６．８のリン酸カリ緩衝溶液
５０−を添加し、４℃に冷却し敏しく攪拌する。

この温度を保ちながら、さらにグルタルアルデヒド０．
２％水′＃Ｉ液１２５μＬを攪拌下に滴下し、滴下後５
時間攪拌を続行した。反応物を−堆し、上記緩衝浴液１
００−で３回洗浄後水洗し未乾燥固定化フルオロアパタ
イトをえた。凍結乾燥によりデキストラナーゼ固定化フ
ルオロアパタイトｓ、ｏｓｔをえた。未乾燥固定化フル
オロアパタイト１−を遠心分離してえた沈殿物に１モル
濃度９１１６．８のリン酸カリ緩衝浴液２−を加えて３
時間攪拌して結合蛋白質を脱着し、遠心分離し、沈殿は
同じ操作を繰返し、Ｆ液は合せてローリ−法により蛋白
質を測定し、沈殿は水洗後乾燥して重量を秤量した。そ
の結果フルオロアパタイトを当り１５．２４Ｗの蛋白を
結合していた。デキストラナーゼ活性測定結果は結合蛋
白を当り０．４３？のデキストランを分解した。

各８［実験結果を表−１に示した処理条件は実施例と同
一である。

各酵素力価の測定 各１チ基質溶液１０　ｒｄ　Ｋ実験でえられた未乾燥固
定化酵素１　ｔｄを加え、３７Ｃ，２時間攪拌後溶液に
生成した単量体を夫々定瀘し、一方未乾燥固定化酵素１
ｄＫ結合している蛋白質を前記した方法により測定し、
アパタイトに結合した蛋白質を当りが分解した単重体の
菫を、各固泥化酵素の力価とした。

基質としてデキストラナーゼはデキストラン、ムタナー
ゼはムタン、レバナーゼはレバンヲ使用し、デキストラ
ナーゼとムタナーゼは分解シて生成したグルコースをグ
ルコースオキシターゼ法により、レバナーゼは分解生成
したフルクトースを常法により高感度液体クロマトグラ
フィ（カラム：シュガーパツク１．１１４ＨＩＦ：水）
により定量した。

固定化酵素の経時活性 本方法によりえられた固定化酵菓の数ａＫついて、その
活性の経時変化を検した。使用した試料は何れも未乾燥
固定化酵素で、夫々の活性は前記の方法で測定した。

得られた固定化酵素は時間とともに活性を増加し、ある
期間後最高の活性を示すとともに以後徐々に活性を低下
することを知った。

（発明の効果） 本願方法によれば、極めて簡単な操作でグルカナーゼを
アパタイトに固定化できるとともに得られた固定化酵素
は取扱いが容易な上、安定で経時変化もすくなく、多糖
類を分解する能力と、アパタイトの研磨性を有するため
、その歯磨への使用は虫爾予防に好ましく、口腔衛生上
極めて有用である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グルカナーゼ等を固定化したアパタイト。 こゝでグルカナーゼとはレバナーゼ、ムタ ナーゼ及びデキストラナーゼを、アパタイトとはハイド
   ロキシアパタイト及びフルオロアパタイトを意味する。 但し、デキストラナーーゼはフルオロアパタイトのみに
   固定化する。 ２、グルカナーゼ、蛋白質、アパタイトを混在させた溶
   液にグルタルアルデヒドを滴下することよりなる特許請
   求の範囲第１項記載の固定化されたアパタイトの製造法
   。 ３、蛋白質としてリゾチームを使用する特許請求の範囲
   第２項記載の製造法。