(54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ верхности носител потенциальноактив ные группы за счет наличи в этом агенте ацетальной группировки. Кроме того, ДЭПТЭС - вещество легкодоступное , устойчивое, и дл присоединени носителю не требует предваеительных химических преобразований. Использование ДЭПТЭС позвол ет легко мен ть плотность активных групп на поверхности носител путем варьировани ко личества агента, вносимого в реакиию . Указанное количество ДЭПТЭС, вводимое в реакцию, определ етс тем, что данное вещество склонно к образованию полимерных.структур, которые при. их избытке могут закупорить поры носител . Обработка пористого силикатного носител после модифицированной обработки его поверхности с помощью ДЭПТЭС 1 н. сол ной кислотой необходима дл окислени ацетальной группы что приводит к возникновению собственно активных групп пропионового ал дегида, взаимодействующих в дальнейшем с аминогруппами белков. Результаты титровани альдегидных .групп на пористом стекле, обработанном СЗ,З-диэтоксипропил)-триэтоксисиланом , до и после его обработки 1 н. сол йой кислотой показывают, чт в выбранных услови х модификации носител альдегидные группы на его поверхности возникают только после обработки модифицированного носител 1 н. сол ной кислотой. Это означает, что ацетальна группировка в процесс взаимодействи ДЭПТЭС с поверхностью носител не вовлекаетс ни в какие химические превращени . Следовательно , на поверхности носител образуют с алифатические альдегиды точно известного строени . Конечным продуктом вл етс силикатный носитель, имеющий на поверхности ацетальные группы, которые в кислой среде 1 н. сол ной кислоты пе реход т в пропионовый альдегид, способный взаимодействовать с аминогруп пами белковых молекул с образованием шиффовых оснований. Присоединение бе ковых молекул к поверхности активированного носител провод т введерживанием носител в растворе белка с последующей обработкой носител боргидридом натри дл восстановлени образовавшихс лобильных шиффовых ос нований в устойчивый замещенный альдимин . Пример 1. 40г широкопористого стекла (ШПС со средним диаметром пор 2000 , пористостью 0,69 см/г , поверхностью 14 и содержащем гидроксильные группы .в количестве 100 моль/г помещают в круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой и обратным холодильником, зал ивают 150 мл , концентрированной сол ной кислоты и 15 мл 30% перекиси водорода. Колбу греют 1 ч при с интенсивным перемешиванием содержимого . Затем пористое стекло промывают на стекл нном пористом фильтре последовательно трем литрами дистиллированной воды и 200 мл ацетона. Далее пористое стекло сушат над вакуумом при 150 С в течение 5 ч. Сухое ШПС помещают в ампулу и заливают смесью, содержащей, мл: (3,3-диэтоксипропил } триэтоксисилана, 3,5; Н-О 0,7; 2 н. НС1 0,2 и абсолютного тетрагидрофурана 60. Ампулу запаивают и оставл ют при на 12 ч. Затем ампулу вскрывают и сушат содержимое под вакуумом в течение 3 ч при 100-120 С. Высушенное ШПС заливают 100 мл 1 н. сол ной кислоты и выдерживают 2 ч при комнатной температуре при интенсивном перемешивании на роторной мешалке. Затем ШПС промывают последовательно 3 л дистиллированной воды и 150 мл этанола и сушат под вакуумом при 80-100 С. Приготовленное таким образом активированное ШПС по данным титровани сол нокислым гидроксиламином содержит 80 мкмоль альдегидных групп на 1 г ШПС. 1 г активированного ШПС промывают на стекл нном фильтре 10 мл 0,1 М глицерофосфатного буфера (рН 7). Затем активированное ШПС заливают тем же буфером так, чтобы буфер только покрывал ШПС, р дезаэрируют под вакуумом. К подготовленному таким образом носителю добавл ют 0,2 мл раствора фермента полинуклеотидфосфорилазы (к.Ф. 2.7.7.8) с концентрацией белка 1 мг/мл и удельной активностью 600 ед/мг, предварительно отдиализованного против 0,1 М глицерофосфатного буфера (рН 7J. Реакционную смесь перемешивают 12 ч на роторной мешалке при . После завершени реакции жидкую фазу удал ют и добавл ют 2 мп раствора боргидрида натри Cl мг/мл.) в глицерофосфатном буфере С рН 7). Через 1 ч перемешивани при 4°С ШПС с иммобилизованным ферментом промывают последовательно 10 мл глицерофосфатного буфера , содержащего 1 М. NaCI и 0,1 М трис-НСД буфером, рН 8,2. Во всех промывных растворах н в препарате иммобилизованного на пористом стекле фермента определ ют ферментативную активность. За ферментативной реакцией след т по накоплению неорганического фосфата, выдел ющегос при синтезе полиадениловой кислоты из аденозиндифосфорной кислоты. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое обеспечивает выделение 1 микромоль неорганического фосфата за 15 мин. Ферментативную активность во всех случа х определ ли при в реакционной смеси, содержащей в 1 мл: трис-НС1 100 мкм.
аденоэиндифосфорной кислоты 10мкм, MgClg 5 мкм, рН 8,2. ; в промывных водах ферментативной активности не обнаружено. Препарат ШПС с иммобилизованным ферментом содержит 100 ед. активности, или 80% от внесенной в реакцию. Фермент, иммобилизованный на пористом стекле, активированном СЗ,3-диэтоксипропил)триэтоксисиланом сохран ет практическ без уменьшени свою активность при хранении при 4 С в течение 3-х мес цев .
Пример 2. 2г активированного ШПС, приготовленного, как описано в примере 1, промывают 0,1 М, натрийацетатным буфером (рН 5) с концентрацией 13,2 мг/мл, заливают 10 мл раствора ичного альбумина в том же буфере , дезаэрируют и оставл ют на роторной мешалке при на 12 ч. Жидкую фазу удал ют и заливают ШПС 10 мл раствора боргидрида натри (1 мг/мл) в натрий ацетатном буфере и перемешивают еще 1 ч. Затем пористое стекло промывают последовательно растворами: 10 мл натрий-ацетатного буфера рН 5; 10 мл того же буфера с 1 М NaCl; 10 мл 0,01 н. НС1 и 20 мл 0,1 М натрий-ацетатного буфера. В исходном растворе белка и в промывных растворах содержание белка определ ют по поглощению .растворов при 280 нм счита , что весова экстинци ичного альбумина составл ет 0,66 ед. оптической плотности на 1 мг белка.
Обнаружено, что жидка фаза удаленна изреакционной смеси после инкубации ШПС с раствором белка, и первые два промывных, раствора содержат 102 мг ичного альбумина. Таким образом , к 1 г активированного с помо- щью ДЭПТЭС пористого стекла кова ентно присоединилось 15 мг ичного альбумина .
Использование предлагаемого способа иммобилизации белков на поверхности силикатных носителей обеспечива , ет, по сравнению с существующим способом следующие преимущ,ества: улучшаетс качество активированной поверхности носител , несущей альдегидные группы, что выражаетс в сохранении существенно большей активности иммобилизованных ферментов 80% в известном способе)/упрощение способа за счет исключени дополнительных операций дл создани активных групп на поЁерхности носител .
5