JPS62228296A - ペプチド又はペプチド誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ペプチド又はペプチド誘導体の製造方法に関
するものである。

（従来の技術） 近年、ペプチドに種々の生理活性が存在することが相つ
いで知られ、治療１診断などの医薬品としての重要性並
びに呈味物質としての重要性がますます増大しつつある
。それに伴いペプチド合成法の開発も活発である。現在
までに知られているペプチド合成法の主なものとしては
１例えばファルマシア、レビュー、３号、２７〜４７頁
（１９８０年）にまとめられているように、化学合成法
と酵素法の二つに大別することができる。その化学合成
法としては、アジド法、混合酸無水物法、活性エステル
法、カルボジイミド法でアミノ酸を逐次的に縮合する方
法とフラグメントで縮合させる方法などが代表的なもの
であるが、これらどの化学合成法においても、ラセミ化
及び副反応が起きやすく２反応時間が長く、末端アミノ
基を保護基にて反応前にあらかじめ保護しておく必要が
あるなど種々の問題がある。フラグメント縮合法の場合
。

特にラセミ化が起こりやすいという重大な欠点を有する
ものである。

一方、ラセミ化の生起を極力避ける方法として。

プロテアーゼを用いる酵素法が提案されているが。

この方法においてもやはり反応時間が長く、末端アミノ
基を保護基にて保護しておく必要があるなど、操作の煩
雑さを改良するには至らなかった。

さらに、このプロテアーゼを用いる酵素法では。

用いる酵素が本来ペプチド分解活性を有し、ているため
、生じたペプチドが合成と併行して分解され。

しばしば目的のペプチドが得られないという重大な欠点
を示すものであった。特に、オリゴペプチドの合成を適
用した場合には、一部のアミノ酸が欠落した目的外のペ
プチドが得られる重大な欠点が指摘されている〔ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌、２５６
巻、１３０１頁（１９８１年）〕。また、酵素法による
ペプチド合成法としては、プロテアーゼ法の他に、特定
なアミノ酸配列を有する単一ペプチドの合成のみを司る
特殊な酵素を用いる方法が知られている。この種の酵素
としては１例えば、グルタミン酸／システィン／グリシ
ンの配列であるトリペプチドを合成するグルタチオン合
成酵素（特開昭５４−１２２７９３公報）や、デカペプ
チドであるグラミシジンＳを合成するグラミシジンＳ合
成酵素（現代化学　１９７４年１２月号１２頁）などが
報告されている。しかし、これらの酵素は特殊な酵素で
あって。

この酵素によって合成しうるペプチドは、限定された一
種のみのペプチドであり、目的とする任意なペプチドを
合成することができない。このため。

この方法は一般的なペプチド合成法とはなり得ないのが
現状である。

本発明者らは、ペプチドの有用性に鑑み、上記のような
欠点、特にラセミ化、副反応の生起２反応の煩雑さなど
の原因となり、同時に経済性を損なう保護基の必要性を
解決し、汎用性のある新規なペプチド合成法を提供する
ことを目的として鋭意研究を重ねた結果、アミノ酸を核
酸の一種であるｔＲＮＡに結合させる作用を存する酵素
で、従来まったくペプチド結合を形成する作用が知られ
ていなかったアミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼに
、驚くべきことにペプチド合成能があることを見い出し
、この酵素を縮合剤として用いると前記の目的がすべて
達成されることを見い出し、先に特許出願した（特開昭
５８−１４６５３９号公報や特開昭５９−１０６２９８
号公報参照）。

（発明が解決しようとする問題点） この特開昭５８−１４６５３９号公報や特開昭５９−１
０６２９８号公報に記載されている方法は、縮合剤とし
て用いるアミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼの至適
ｐＨが８乃至９にあるため。

反応のｐＨを９以上にすると、アミノアシル−ＬＲＮＡ
シンテターゼの触媒活性の低下が起り、また逆にｐＨを
８より低くすると、同じように触媒活性の低下が起こり
、単位時間当りのペプチド又はペプチド誘導体の生成量
が低くなる傾向があった。

（問題点を解決するための手段） そこで２本発明者らは上記の点を改良するためにさらに
鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことにアミノアシル−
ｔＲＮＡシンテターゼを水不溶性担体に固定化すると、
アミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼの触媒能が高ま
り、特に高ｐＨ領域で反応速度が顕著に上界することを
見い出し２本発明を完成した。

すなわち２本発明は、α−アミノ酸と、アミノ酸又はア
ミノ酸から誘導されるアミノ酸誘導体とをアミノアシル
−ｔＲＮＡシンテターゼの存在下で反応させてペプチド
又はペプチド誘導体を製造するに際し、アミノアシル−
ｔＲＮＡシンテターゼとして水不溶性担体に固定化した
アミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼを用いることを
特徴とするペプチド又はペプチド誘導体の製造方法であ
る。

本発明に使用されるアミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテタ
ーゼは、酵素分類６．１．１に属し１次式アミノ酸＋Ａ
ＴＰ＋ｔＲＮＡ− アミノアシル−ｔ　ＲＮＡ＋ＡＭＰ＋ビロリン酸の反応
を触媒する酵素であり１例えば、ウサギ。

ウマ、ウシ、ラット、ニワトリ、ヘビなどの動物組織よ
り得られるもの、イネ、イモ、トマトなどの植物組織よ
り得られるもの、カビ、酵母、キノコ、細菌、放線菌な
どの微生物及び藻類より得られるものなどがあげられる
。なかでも、酵素の取得が容易であることから、微生物
より得られるものが好ましく、さらに酵素の安定性から
バチルス・ステアロサーモフィルス、サーマス・サーモ
フィルス、サーマス・フラバス、りｄストリジウム・サ
ーモアセチカム、サーマス・アクアティカスなどの耐熱
性細菌より得られるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテター
ゼが最適である。

これら各種のアミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼは
１種々のα−アミノ酸に特異性のあるものが用いられ２
例えば、チロシンに特異性のあるものとしてはチロシル
−ｔＲＮＡシンテターゼが。

また、ロイシンに特異性のあるものとしてはロイシル−
ｔ　ＲＮＡシンテターゼが、さらにバリンに特異性のあ
るものとしてはバリル−ｔＲＮＡシンテターゼ、その他
、イソフタル酸ｔ　ＲＮＡシンテターゼ、フェニルアラ
ニル−ｔＲＮＡシンテターゼ、アラニル−ｔＲＮＡシン
テターゼ、グルタミニルーｔＲＮＡシンテターゼ、アス
パラギニル−１ＲＮＡシンテターゼ、メチオニル−ｔＲ
ＮＡシンテターゼ、ヒスチジル−ｔ　ＲＮＡシンテター
ゼ。

リジル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ、トレオニルーｔ１？
ＮＡシンテターゼ、セリル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ、
アスパラチル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ、グルタミル−
ｔＲＮＡシンテターゼ、システイニル−ｔＲＮＡシンテ
ターゼ、プロリル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ、グリシル
−ｔＲＮＡシンテターゼ。

アルギニル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ、トリプトファニ
ル−ｔＲＮＡシンテターゼなどが具体例としてあげられ
る。

これらの各種アミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼは
、上記組織又は細胞をホモジナイザーやダイノミルなと
で破砕したのち１例えば、バイオケミストリー誌、１３
巻、２３０７頁（１９７４年）に記載されているように
、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィー、ヒ
ドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーなどのク
ロマトグラフィー及び硫酸アンモニウムによる分別沈澱
法など。

通常の酵素精製法を用いて精製することによって得るこ
とができる。

本発明では、これらアミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテタ
ーゼは、水不溶性担体に固定化することが必要である。

本発明にいう水不溶性担体とは１本質的に、水に不溶性
の代合物をいい、そのような化合物としては、たとえば
セルロース、デキストラン、アガロース、デンプンなど
の多ｔＪＭ類の誘導体、ポリ酢酸セルロース、ポリビニ
ルアルコール誘導体、ポリスチレン、ポリプロピレン、
ポリエチレン、ポリビニルクロライド、ポリ　（メチル
メタクリル酸）エステル、ポリブテン、ポリビニリデン
クロライド、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸
。

ポリアクリル酸、ポリアミノスチレン、ポリブタジェン
、ポリイソプレン、ポリマレイン酸モノエステル、架橋
ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニ
ルアミン、ポリ　（ジアルキルアミンエチルメタクリル
酸エステル）、ポリ　（ジアルキルアミノメチルスチレ
ン）、ポリ　（ビニルピリジン）、ポリ　（ビニルピロ
リドン）、ポリアクリル酸無水物、ポリメタクリル酸無
水物、ポリマレイン酸無水物、ポリメタクリ口ニトリル
、ポリ（トリフルオロエチレン）、ポリ　（テトラフル
オロエチレン）、ポリ　（ジビニルベンゼン）、ポリ　
（α−メチルスチレン）、ポリ−（Ｎ−ビニルアミン）
、ポリ　（テトラメチレングリコールジビニルエーテル
）、ポリビニルスルホン、ポリビニルスルホオキシド、
ポリアクロレイン、ポリメチルビニルケトンなどの不飽
和炭素を含む単量体からなる重合体、ポリフェニレンオ
キシド、ポリメチレンオキシド、ポリエチレンオキシド
、ポリテトラメチレンオキシドなどのポリエーテル類、
ポリアラニン、ポリフェニルアラニンなどのポリペプチ
ド類、ナイロン−３，ナイロン−４，ナイロン−５，ナ
イロン−６、ナイロン−７、ナイロン−１），ナイロン
−１２，ナイロン−６，６，ナイロン−６，１０，ポリ
（…−フェニレンーイソフタラミド）、ポリ　（Ｐ−フ
ェニレンテレフタラミド）などのポリアミド、テレフタ
ル酸、イソフタル酸。

アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、トリメリット酸な
どのポリカルボン酸と、エチレングリコール、プロピレ
ングリコール、ブチレングリコール。

ペンタエリスリトール、ビスフェノール−Ａなどのポリ
オールとから誘導されるポリエステル類。

グリコール酸、乳酸、ヒドロキシヒバリン酸などから誘
導されるポリエステル、ジメチルポリシロキサン、メチ
ルフェニルポリシロキサン、メチルビニルポリシロキサ
ン、シアノアルキルメチルポリシロキサン、フルオロア
ルキルメチルポリシロキサンなどのシリコンゴム、トル
エンジイソアナート、キシレンジイソシアナート、フェ
ニレンジイソシアナート、エチレンジイソシアナート、
ジフェニルメタンジイソシアナート、トルエントリイソ
シアナートなどのポリイソシアナートと、ポリエチレン
グリコール、ポリプロピレングリコール、両端にＯＨを
有するポリエステルなどのポリオールとから誘導される
ポリウレタン類２　フェノール−ホルムアルデヒド樹脂
、キシレン−ホルムアルデヒド樹脂、尿素−ホルムアル
デヒド樹脂。

メラミン−ホルムアルデヒド樹脂などのホルムアルデヒ
ド樹脂、ポリイミド、ポリベンツイミダゾール、ポリチ
アゾールなどの４員環を含むポリマー、ポリカーボネー
ト、ポリスルホンなどの合成ポリマー類、ガラス、アス
ベスト、クレイ３マイカ、ヒドロキシアパタイト、活性
炭、シリカゲル。

アルミナなどの無機物の誘導体及びポリフォスフアゼン
のような合成無機ポリマーなどがあげられる。

本発明において、固定化アミノアシル−ｔＲＮＡシンテ
ターゼを得るには、前記のアミノアシル−ｔ　ＲＮＡシ
ンテターゼを水不溶性担体に結合させるか、又は吸着さ
せればよい。アミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼを
水不溶性担体に結合させるには、たとえば千畑一部著「
固定化酵素」講談社（１９７５）に記載されているよう
な従来より公知の共有結合法や１．イオン結合法を採用
することができる。また、吸着させるには、同じく物理
的吸着法や包括法を採用することができる。

共有結合法としては、たとえばカルボキシル基を含む担
体をアジド、クロリド、カルボジイミド。

イソシアナートなどの誘導体にしたのち、アミノアシル
−ｔＲＮＡシンテターゼと結合する方法。

ハロゲンのような活性な脱離基を有する水不溶性の担体
にアシノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼを結合する方
法、水酸基を有する水不溶性担体をハロゲン化シアンで
処理したのち、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを
結合させる方法、芳香族アミノ基を有する水不溶性担体
をジアゾニウム塩とし、これとアミノアシル−ｔ　ＲＮ
Ａシンテターゼとジアゾカップリングさせる方法、トル
エンジイソシアナート、エピクロルヒドリン、グルタル
アルデヒド、２−アミノ４．６−ジクロロ−８−トリア
ジンなどの少くとも２官能性の試薬を用いて、水不溶性
担体とアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを結合させ
る方法などがあげられる。

イオン結合法としては、たとえば、カルボキシメチルセ
ルロース、ジエチルアミノエチルセファデックス（ファ
ルマシア社）、ダウエックス−５０（ダウケミカル社）
などのイオン交換体にアミノアシル−ｔＲＮＡシンテタ
ーゼをイオン的に結合させる方法があげられる。

また、物理的吸着法としては、たとえば、活性炭、アル
ミナ、シリカゲルなどにアミノアシル−ｔＲＮＡシンテ
ターゼを吸着させる方法があげられる。

さらに包括法としては、たとえば、架橋ポリアクリルア
ミドゲル、ポリビニルアルコールなどの高分子ゲルの格
子の中又はナイロン、ポリエステル、ポリスチレン、コ
ロジオンなどの皮膜中にアミノアシル−ｔＲＮＡシンテ
ターゼを包括する方法があげられる。

これらの固定化方法は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテ
ターゼの水不溶液と水不溶性担体又はその前駆体とを必
要な、らば重合開始前に混合処理する公知の方法によっ
ても行うことができる。

本発明に用いられる固定化アミノアシル−ｔＲＮＡシン
テターゼは、前記したごとく２種々の方法によって製造
しうるが、アミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼと水
不溶性担体との結合力が大きく、シたがって活性の持続
性がすぐれており、たとえば、長期間にわたって安定し
てペプチド又はペプチド誘導体の合成反応を実施しうる
などの点で共有結合法によって製造することが特に望ま
しい。

本発明に用いられるα−アミノ酸としては９例えば、チ
ロシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニル
アラニン、メチオニン、リジン。

セリン９バリン、アスパラギン、アスパラギン酸。

グリシン、グルタミン、グルタミン酸、システィン、ト
レオニン、トリプトファン、ヒスチジン。

プロリン、アルギニンなどのアミノ酸があげられ。

Ｌ体、Ｄ体のいずれでもよい。また、α−アミノ酸と反
応させるアミノ酸又はアミノ酸誘導体としては１例えば
、グリシン、アラニン、ロイシン。

イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン。

システィン、チロシン、アルギニン、バリン、リジン、
ヒスチジン、アスパラギン酸、メチオニン。

トリプトファン、トレオニンなどのα−アミノ酸。

β−アラニン、β−アミノイソ醋酸などのβ−アミノ酸
、クレアチンなどの含窒素γ−アミノ酸。

ピペリジン酸などのＴ−アミノ酸、ε−アミノカプロン
酸なとのε−アミノ酸などの各種アミノ酸又はこれら各
種アミノ酸のエステル、チオエステル、アミド、ヒドロ
キサミドなどがあげられるが。

アミノ基が遊離の形であるアミノ酸誘導体であれば、上
記例示化合物に限定されるものではない。

そのエステルとしては１例えば、メチル、エチル。

プロピル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジルなどの
単純な炭化水素系のエステルから、ｔＲＮＡの３’　−
ＯＨで上記アミノ酸がエステル化したものまで２種々の
エステルを用いることができる。

また、アミドとしては、遊離のアミドの他１例えば、異
種あるいは同種のアミノ酸がアミド結合したオリゴペプ
チドやポリペプチドを用いることもできる。このオリゴ
ペプチドやポリペプチドがさらにエステル、チオエステ
ル、ヒドロキサミド。

エーテル化したものを用いることも可能である。

本発明によれば、α−アミノ酸、アミノ酸又はアミノ酸
誘導体、水不溶性担体に固定化したアミノアシル−ｔＲ
ＮＡシンテターゼ（以下固定化アミノアシル−ｔＲＮＡ
シンテターゼという。）及びヌクレオシド三リン酸を混
合して液相媒体中で反応させることによってペプチド又
はペプチド誘導体を製造することができる。このヌクレ
オシド三リン酸は２反応を進めるうえでのエネルギー源
となる化合物であり、そのような具体例としては。

アデノシン三リン酸、　２′−デオキシアデノシン三リ
ン酸、２’、３’−ジデオキシアデノシン三リン酸、３
′−デオキシアデノシン三すン酸、アデノシン三リン酸
のβ又はＴ−チオ類縁体、あるいはアデニン環に置換基
の入ったアデノシン三リン酸があげられる。このとき、
これら原料の添加順序はいかなる順序であってもよく、
α−アミノ酸。

アミノ酸又はアミノ酸誘導体及びヌクレオシド三リン酸
を含む水性媒体中に固定化アミノアシル−ｔＲＮＡシン
テターゼを添加してもよく、あるいは固定化アミノアシ
ル−ｔＲＮＡシンテターゼを含有する溶液にα−アミノ
酸、アミノ酸又はアミ□　ノＭＨＭ４体及びヌクレオシ
ド三リン酸を添加してもよい。また、これら原料の濃度
としては、特に限定されるものではないが、α−アミノ
酸の濃度としては０．１ｍＭ以上が適当で、１ｍＭ以上
が好ましい。そして、ヌクレオシド三リン酸をα−アミ
ノ酸に対して１ないし１５当量添加し、固定化アミノア
シル−ＬＲＮＡシンテターゼを、α−アミノ酸に対し１
／１ないしｌ／１０ｇ当量、好ましくはｌ／１０”ない
し１／１０ｇ当量の？震度で。

アミノ酸又はアミノ酸誘導体を２通常１０ｍＭないしＩ
ＯＭの範囲で添加することが好ましい。

このときに反応に用いる媒体としては２本法が酵素を触
媒とする反応であるため、主成分として水を含有する溶
媒が選ばれる。また、酵素の活性が維持できる限度で水
溶性の有機溶媒を添加してもよい。水溶性の有機溶媒と
しては１例えば、メタノール、エタノール、アセトニト
リル、ジオキサン、テトラハイドロフラン、Ｎ、Ｎ−ジ
メチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチル
スルホキシドなどがあげられる。このような有機溶媒の
添加は、原料の一部が水に難溶性である場合、特に有効
である。このときに１反応を円滑に進行させること１あ
るいは酵素の失活を防ぐことを主目的として３反応系に
マグネシウム、マンガンなどの二価カチオン、メルカプ
トエタノール。

ジチオスレイトールなどのスルフヒドリル剤、ピロホス
ファターゼを、単独又は混合して添加してもよい。各添
加剤の好適な濃度しては、二価カチオン０．０１ｍＭ〜
５００ｍＭ、スルフヒドリル剤０．００１ｍＭ〜１００
ｍＭ、　ピロホスファターゼ０、ＯＯｌ　ｌニフト／ｍ
　１〜　ｌ　ＯＯユニフト／ｍ　１　であり。

最適な濃度としては、それぞれ二価カチオン０．１ｍＭ
〜１０ｍＭ、　スルフヒドリル剤０．０１ｍＭ〜１ｍＭ
、　ピロホスファターゼ１）ニフト／　ｍ　（１〜１０
１二・−）　）　／　ｍ　１である。また、酵素の活性
を維持するため、溶媒に緩衝液を添加することが好まし
い。

その緩衝液のン農度としては１００ｍＭ以下が好ましい
。この緩衝液としては、α−アミノ酸、アミノ酸又はア
ミノ酸誘導体、固定化アミノアシル−ｔＲＮＡシンテタ
ーゼ及びヌクレオシド三リン酸が溶解し、しかも酵素活
性を維持し、所望のｐ　ＩＩが得られ、かつ、副反応を
起こさないものであれば、いかなるものを使用してもよ
い。そのような具体例としては、ヘペス緩新液、トリエ
タノールアミン緩衝液、マレート緩衝液、リン酸緩衝液
。

ビシン緩新液、エツプス緩新液、ホウ酸緩衝液。

炭酸ナトリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホ
ウ酸ナトリウム緩新液、水酸化ナトリウム緩衝液などが
あげられる。

また、ペプチド又はペプチド誘導体を製造する際の反応
液のｐＨは、触媒として使用されるアミノアシル−ｔ　
ＲＮＡシンテターゼが、水不溶性担体に固定化されてい
ない場合には通常その反応の至適ｐＨを８ないし９付近
に持つが、固定化アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ
では９以上のアルカリ側で触媒活性が大幅に改良される
ため、前述の緩衝液で９以上好ましくはりないし１２に
保つことができる。また１反応の温度としては、固定化
アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの触媒活性が維持
できる限り特に限定されないが２通常０〜７０℃が好ま
しく、最適には２０〜６０“Ｃで行うことが好ましい。

上記条件でペプチド化反応は数秒から数日で完結し、目
的のペプチド又はペプチド誘導体を得ることができる。

（実施例） 以下１本発明を実施例により具体的に説明する。

なお、実施例中のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ
活性は次のようにして求めたものである。

すなわち、１６７ｍＭ−ヘペス緩衝ン夜、１７ｍＭ−ア
デノシン三リン酸・ニナトリウム、１７ｍＭ＝塩化マグ
ネシウム、５ｍＭ−ジチオスレイトール、１Ｍ−ヒドロ
キシルアミン及び５ｍＭ−α−アミノ酸の存在下に４０
℃で１０分間反応させたとき、ｌｎｍｄｅのα−アミノ
酸ヒドロキサメートを形成する能力を１ユニツトとした
。

参考例１ バチルス・ステアロサーモフィルスＵＫ７８８（微工研
寄　第５１４１号）の菌体６　ｋｇを、２倍量の１００
ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁し、ダイ
ノミルを用いて細胞を破砕後、遠心分離により不溶物を
除去し、チロシンに特異的なチロシル−１ＲＮＡシンテ
ターゼを含む粗抽出液を得た。あらかじめ５ｍＭメルカ
プトエタノール、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリ
ウム及び０．１ｍＭホスホフェニルスルホニルフルオリ
ドを含む５０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化
したマードレックスゲルブルーＡ（アミコン社製）を充
填したカラムに、上記の粗抽出液を通し。

塩化カリウムを上記緩衝液に加えた溶液で、線速度６０
ｃｍ・ト１で溶出せしめると、チロシル−ｔＲＮＡシン
テターゼが溶出した。この区分を集め。

濃縮、脱塩を行った結果、約７０％の収率でチロシンに
特異的なチロシル−ｔＲＮＡＲＮＡシンテターゼ粗酵素
液１．４００，０００ユニツトを得た。上記１２作をす
べて４℃で行った。

参考例２ サツカロミセス・セルビシアエαＳ２８８Ｃ１０００ｋ
ｇをダイノミルで細胞破砕後、得られた粗抽出液を硫酸
アンモニウム分画、ＤＥＡＥ−−＆ルロースクロマトグ
ラフィー、リン酸セルロース（ワットマン社製）クロマ
トグラフィー、ＤＥＡＥ−セファセル（ファルマシア社
製）クロマトグラフィー、ウルトロゲルＡＣＡ３４クロ
マトグラフイー及びＣＭ−セルロース（ワットマン社製
）クロマトグラフィーで、ロイシンに特異的なロイシル
−ｔ　ＲＮＡシンテターゼを３．２ｇ　　（５，０００
，０００ユニツト）を得た。

実施例１ 参考例１で得た比活性６，６００１．−フ）　／　ｍｅ
であるチロシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼの５０ｍＭ−
リン酸カリウム緩衝ン夜３０ｍ１に、２ｇのフ゛ロムシ
アン活性化セファローズ４Ｂ（ファルマシア社製）を加
え、室温で４時間、４゛Ｃ・で−夜攪拌して比活性１）
，０００１：フト／？Ｗ重Ｎ　（ｇ）を示す固定化チロ
シル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ（以下固定化酵素という
。）を得た。

この固定化酵素、又は固定化していないフリーの酵素（
以下フリーの酵素という。）　４０，０００ユニツトに
Ｌ−チロシン１８ｍｇ、塩化マグネシウム六水和物８１
ｍｇ、アデノシン三リン酸二ナトリウム２２０ｍｇ、Ｌ
−アルギン・塩酸塩４２１ｍｇを加え、第１表記載の緩
衝液（５０ｍＭ）で全容量を２０ｍ１とし、４５℃で２
日間攪拌した。

得られた反応液を、ツバパックＣＬＳカラム（ウォータ
ーズ社製）を用いて、高速液体クロマトグラフィーで分
析したところ、チロシルアルギンの生成量は、第−表の
ようになり、チロシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼを固定
化することにより。

高ｐ　Ｈ領域で顕著な収率の増大が見られた。

また、得られた反応液をカルボキシメチル・セルロース
・カラムで炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐ　Ｈ７，９
）の５ｍＭから１００ｍＭのグラジェントで溶出させて
生成物を精製した。得られた生成物が、チロシルアルギ
ンであることをＮＭＲ。

Ｕｖ及びＩＲ・吸収スペクトルにより確認した。

第　　１　　表 実施例２ 参考例２で得た比活性１４．０００１：ッ）／ｎ＋ｊ２
のロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼの５０ｍＭ−リン酸
カリウム溶液１０＋ｙｊ！とアクリルアミドモノマー７
．５ｇ、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド４０ｍ
ｇと水とを混合して全量を３０＋ｙｊ２とした。ここに
β−ジメチルアミノプロピオニトリル２５０ｍｇ、過硫
酸アンモニウム５０ｍｇに水を加えて、５０ｍ／とじた
溶液を加え、よく混合した後、０℃で１０分間反応させ
て比活性１８００１ニフ）／ｍ（ｌを示す固定化ロイシ
ル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ（以下固定化酵素という。

）を得た。

次にＬ−ロイシン１３ｍｇ、アデノシン三リン酸二ナト
リウム１）０ｍｇ、塩化マグネシウム六水和物４０ｍｇ
、Ｌ−フェニルアラニン１６４ｍｇ及び上記の固定化酵
素又はフリーの酵素１０，０００ユニツトを加え、第２
表に記載の緩衝’ｌ（１（５００ｍ　Ｍ　）で全容量を
１０ｍ１とし、４５℃で２日間反応させた。

得られた反応液を実施例１と同様に高速液体クロマトグ
ラフィーにより、ロイシルフェニルアラニンの生成量を
測定した。

その結果を第２表に示す。

第　　２　　表 実施例３ ３２−６０メツシユのヤシガラ炭を用い、バイオテクノ
ロジー・アンド・バイオエンジニアリング誌第２４巻１
６５３頁（１９８２年）記載の方法に卓し、水素化リチ
ウム・アルミニウムで還元させた後、塩化シアヌルと反
応させて表面に塩化シアヌルを活性基として含有する粒
状ヤシガラ炭を得た。

このヤシガラ炭５０ｍｇに対し１８０００　ｘニフト／
ｍ６の活性をもつチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ溶液
５００μｌを加え２４℃で一夜放置して比活性１２，０
００　ｘ＝７）　／　ｍｌを示す固定化チロシル−ｔＲ
ＮＡシンテターゼ（以下固定化酵素という。）を得た。

この固定化酵素又はフリーの酵素２，０００ユニツトに
、Ｌ−チク９フ１ 水和物４ｍｇ，アデノシン三リン酸二ナトリウム１）ｍ
ｇ，ｌ，−バリン１　３ｍｇを加え，５０ｍＭ−炭酸ナ
トリウム緩衝液でｐ　ｆ（を９５．全容量を１ｍｌとし
．４５℃で２日間反応させた。

得られた反応液を実施例１と同様に高速液体クロマトグ
ラフィーでチロシルバリンアミドの生成量を測定したと
ころ，固定化酵素を用いた場合。

チロシルバリンアミドが０．８７ｍｇ生成していたが，
フリーの酵素を用いた場合のチロシルバリンアミドの生
成量は０．３０ｍｇであった。

（発明の効果） 本発明によれば．アミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテター
ゼの触媒能が高まり，特に高ｐＨ領域で反応速度が顕著
に向上するため，単位時間当りの収量を大幅に向上させ
ることができる。

本発明によって得られるペプチド又はペプチド８３　”
１体は１例えば、血圧降下作用等のあるプラジキニンや
，内・外分泌抑制作用等のあるソフトスタチンなどの各
種ホルモン及び抗生物質ペプチド。

呈味ペプチドのような他の生物学的活性物質として有用
である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）α−アミノ酸と、アミノ酸又はアミノ酸から誘導
   されるアミノ酸誘導体とをアミノアシル−ｔＲＮＡシン
   テターゼの存在下で反応させてペプチド又はペプチド誘
   導体を製造するに際し、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテ
   ターゼとして水不溶性担体に固定化したアミノアシル−
   ｔＲＮＡシンテターゼを用いることを特徴とするペプチ
   ド又はペプチド誘導体の製造方法。