KR100392779B1 - 고정화 아미노펩티다제를 이용한천연형 재조합단백질의 제조방법 - Google Patents

고정화 아미노펩티다제를 이용한천연형 재조합단백질의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고정화 아미노펩티다제를 이용한 천연형 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로즈(CNBr-activated Sepharose) 및 유퍼지트 C(Eupergit C)로 구성된 군으로부터 선택되는 수불용성 담체에 아미노펩티다제를 고정화시키고, 상기 고정화된 아미노펩티다제에 재조합 메티오닐 단백질을 반응시켜 N-말단 메티오닐기를 제거하여 천연형 재조합 단백질을 제조하는 방법에 의하면, 천연형과 동일한 서열의 단백질을 보다 효율적으로 제조할 수 있다.

Description

고정화 아미노펩티다제를 이용한 천연형 재조합 단백질의 제조방법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF AUTHENTIC PROTEIN BY USE OF IMMOBILIZED AMINOPEPTIDASE}
본 발명은 고정화된 아미노펩티다제를 이용하여 천연형 재조합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로즈(CNBr-activated Sepharose) 및 유퍼지트C(Eupergit C)로 구성된 군으로부터 선택되는 수불용성 담체에 아미노펩티다제를 고정한 것을 사용하여 재조합 단백질의 N-말단 메티오닐기를 선택적으로 절단함으로써, 천연형과 동일한 서열의 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
아미노펩티다제[EC. 3.4.11.10]는 여러 종류의 동물세포 및 미생물에서 다양한 형태로 발견되는 효소로서, 대체적으로 활성유지를 위해 칼슘 또는 아연 이온 등을 필요로 하는 메탈로프로테아제(metallo-protease)이다. 이들 아미노펩티다제는 엑소펩티다제(exopeptidase)에 속하는 것으로 기질 단백질의 N-말단으로부터 순차적으로 아미노산을 유리시키는 성질을 가지고 있다. 이들 효소는 일반적으로 50 내지 70℃의 온도에서도 활성을 유지한다는 공통점이 있는 반면, 기질 단백질의 N-말단에 위치하는 아미노산의 종류 및 서열에 따라 서로 다른 기질 특이성을 나타낸다. 예를 들어 대한민국 특허출원 제 93-11107 호의 방법으로 정제된 아미노펩티다제는 X-Pro, Met-Ala, Met-Gly, Met-Lys 및 Met-Arg의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제외한 재조합 N-메티오닐 단백질의 N-말단 메티오닌을 제거하는 특성이 있는데, 인성장 호르몬과 같은 재조합 N-메티오닐 단백질로부터 천연형 재조합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다(대한민국 특허출원 제 94-10266 호). 이와 같이 아미노펩티다제를 사용하여 N-말단 아미노산을 제거시키는 반응은 반응 용액내에 효소와 기질이 혼재되어 일어나기 때문에, 효소와 반응산물을 분리하기 위한 별도의과정이 필요하게 되는데, 효소를 회수하기 위한 조작이 복잡하고 그 효율이 낮다는 문제가 있다. 이들 효소 반응이 갖는 산업적 중요성과 분리회수에 대한 어려움 때문에 상기 효소를 고정화하기 위한 연구가 자행되어 왔다. 예를 들어, 로이어(Royer) 등은 다공성 아릴아민 유리비드(porous arylamine glass bead)에 아미노펩티다제 M(aminopeptidase M, E.C. 3.4.11.2)과 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase)를 고정화하는 방법을 고안하였는데, 고정화된 아미노펩티다제의 Kcat, pH 및 온도에 따른 활성 변화가 수용액 상태와 거의 동일하다는 것과, 이를 이용하여 펩티드를 가수분해함으로써 아미노산 서열 분석에 유용하게 사용될 수 있음을 보고한 바 있다(J.Biol. Cherm 243,1807-1812(1973)) 상기 아미노펩티다제 M 등은 프롤린에 대한 활성이 비교적 낮아 프롤린을 함유한 펩티드의 서열 분석에는 효과적이지 않지만, 고정화된 클로스트리디알 아미노펩티다제(Clostridial aminopeptidase, E.C. 3.4.11)와 아미노펩티다제P(aminopeptidase P, E.C 3.4.11.9)를 이용하여 프롤린기를 함유한 펩티드의 서열 분석이 가능하게 되었다(Biochemica et Biophysica Acta, 743, 437-446(1983)).
또한. 상기 고정화 방법을 변형시킨 것으로, 아미노펩티다제 M을 셀루파인 포밀(cellufine formayl)에 고정화시키고, 이를 이용하여 재조합 인성장 호르몬의 N-말단 메티오닐기를 제거하는 방법이 보고된 바있다(한국생물공학회지 10, 283-291(1995)). 그러나, 이 방법에서는 반응과 함께 생성되는 인성장 호르몬 변이체를 제거하기 위한 별도의 과정이 추가되어야 하는데, 그 과정이 복잡할 뿐 아니라 정제효율을 떨어뜨린다는 단점이 있다. 게다가, 고정화 아미노펩티다제 M 칼럼은2mg/㎖ 이상 고농도의 인성장 호르몬을 사용하거나 5㎝/h 이상의 유속으로 운전할 경우 천연형 인성장 호르몬의 생성율이 현저히 떨어진다는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위해 연구를 계속 진행하면서, 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로즈(CNBr-activated sepharose, Pharmacia사), 활성화 CH 세파로즈(activated CH-sepharose, Sigmra사), 어피겔 15(AffiGel 15, BioRad사), 에폭시-활성화 세파로즈(epoxy-activated sepharose, Sigma사), 셀루파인 포밀(Cellufine formyl, Amicon사), 디아미노디프로필아민 아가로즈(diaminodipropy-amine agarose, Pierce사), 유퍼지트 C(Eupergit C, Sigma사) 등 겔 형태의 고정화 담체와 비닐알콜/비닐부틸알콜 중합체와 같은 박막 형태의 고정화 담체에 아미노펩티다제 고정화를 시도한 결과, 특히 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로즈 또는 유퍼지트 C 담체를 이용할 경우, 열에 안정하고 고활성을 갖는 아미노펩티다제 고정화 시스템을 제조할 수 있음을 발견하여 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
본 발명의 목적은 고정화된 아미노펩티다제를 이용하여 천연형 재조합 단백질을 보다 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로즈 및 유퍼지트 C로 구성된 군으로부터 선택되는 수불용성 담체에 아미노펩티다제를 고정화시키고, 상기 고정화된 아미노펩티다제에 메티오닐 단백질을 반응시켜 N-말단 메티오닐 잔기를 제거하는 것을 포함하는, 천연형 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에 따르면, 아미노펩티다제를 활성이 유지된 상태로 수불용성 담체에 안정하게 고정화시키는 것에 의해, 장기간에 걸쳐 연속 효소반응이 가능한 고정화 아미노펩티다제를 얻을 수 있다. 즉, 수불용성 담체인 시안노겐 브로마이드-활성화 세파로즈 또는 유퍼지트 C에 아미노펩티다제를 고정하고, 여기에 재조합 메티오닐 단백질을 처리하여 N-말단 메티오닐기를 선택적으로 제거함으로써 천연형과 동일한 서열의 인성장 호르몬을 보다 효율적으로 제조할 수 있다.
본 발명에서 고정화 담체로 사용한 유퍼지트 C와 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로즈는 주로 친화성 크로마토그래피(affinity chromatograpy)에 이용되어 항체(Clin. Chem. 23, 234-236(1977)), 트랜스페린(transferrin) 등과 같은 특수한 단백질(J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 14, 475-478(1976)) 또는 DNA(Eur J. Biochem. 54, 411-418(1975))의 정제에 사용되고 있다. 친화성 크로마토그래피는 단백질 또는 DNA 등 분리하려는 물질과 가역적, 특이적으로 결합하는 리간드를 수불용성 지지제에 고정화하여 시료와 결합시킨 후, 완충용액의 pH 또는 염농도를 변화시킴으로써 리간드와 친화력을 가진 성분만을 순수하게 분리하는 방법이다. 그러나, 본 발명에서와 같이 고정화된 효소의 효소반응을 이용하여 비교적 분자량이 큰 기질을 반응산물로 전환시키는 예는 드물다.
본 발명에서 상기 담체에 고정화시켜 사용할 수 있는 아미노펩티다제로서는 예를 들어 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스 배양액으로부터 대한민국 특허출원 제 93-11107 호의 방법으로 정제한 아미노펩티다제가 있다. 이 효소는 X-Pro, Met-Ala, Met-Cly, Met-Lys 및 Met-Arg의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제외한 재조합 N-메티오닐 단백질의 N-말단 메티오닌을 제거하는 기질 특이성을 갖는다.
상기와 같이 담체에 고정화시킨 아미노펩티다제는 칼럼에 충진 또는 배치(batch) 형태로 사용할 수 있다. 칼럼상태로 조작할 경우 유속은 5 내지 15cm/h가 바람직하고, 배치 형태로 사용할 경우 적절한 한외여과장치를 부착함으로써 아미노펩티다제 반응 효율을 증가시킬 수 있다.
반응 완충용액의 pH는 7.0 내지 9.0이 바람직하며, 염화 나트륨의 최종농도가 100 내지 200 mM이 되도록 첨가하는 것이 바람직하다. 이어서 본 발명에 의한 고정화 아미노펩티다제는 아미노펩티다제 M의 경우와는 달리 최적 pH 8보다 넓은 구간인 pH 7 내지 10까지 안정하므로, 연속 사용시 반응액의 pH가 변화할 경우에도 효율을 유지할 수 있다.
본 발명의 방법이 적용될 수 있는 단백질은 N-말단 메티오닐기를 갖는 어떠한 재조합 메티오닐 단백질이라도 가능하나, 특히 메티오닐 인성장 호르몬(Met-hGH)이 바람직하게 적용될 수 있다. 상기 메티오닐 인성장 호르몬은 통상의 정제방법으로 얻어진 모든 메티오닐 인성장 호르몬을 사용할 수 있으며 메티오닐 인성장 호르몬 1mg당 1 내지 20 단위(unit)의 고정화 아미노펩티다제를 처리하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면 예를 들어 인성장 호르몬을 기질로 할 경우, 그 농도가 20mg/㎖까지, 유속은 20cm/h까지 천연형 인성장 호르몬의 제조 효율은 크게 변화하지 않는다.
본 발명의 방법에 따라 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로즈 또는 유퍼지트 C 담체에 아미노펩티다제를 고정화시켜 사용할 경우 효소를 기질이나 반응산물과 쉽게 분리할 수 있으며 장기간에 걸쳐 반복 사용할 수 있으므로 사용량을 절감시킬 수 있을 뿐 아니라 반응산물의 순도도 증가시킬 수 있다. 이 외에도 반응의 조작이 용이하며, 반응산물에 의한 효소활성의 저하(product inhibition)를 방지할 수 있고, 수용액 상태에 비해 광범위한 구간의 pH 및 온도에 대하여 안정성이 증가된다는 장점을 갖는다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
하기 실시예에서 사용되는 메티오닐 인성장 호르몬으로는 대한민국 특허출원 제 90-3465 호의 방법으로 정제한 것이 사용되고, 아미노펩티다제로는 대한민국 특허출원 제 93-11107 호에 명시된 것을 사용하였다. 상기 고정화 담체에 대해 효소의 양, 고정화 반응 완충 용액의 pH 및 염농도, 반응온도, 가교제의 길이, 아연이온 농도 및 작용기 농도 등의 영향 등을 시험하였다.
실 시 예 1 : 유퍼지트 C애 대한 아미노펩티다제의 고정화
아미노펩티다제를 포함한 고정화 반응용액(1.0M 인산칼륨, pH7.4, 0.5mg/㎖ p-히드록시벤조산 에틸 에스테르) 4ml을 유퍼지트 C 담체 1g과 실온에서 40 시간 동안 반응시켜 고정화 한 후 100㎖의 증류수, 200㎖의 1.0M 염화나트륨 용액과 100㎖의 고정화 반응용액으로 순차적으로 세척하여 고정화 아미노펩티다제를 얻었다.
실 시 예 2 : 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로즈에 대한 아미노펩티다제의 고정화
아미노펩티다제를 포함한 고정화 반응용액(0.1M 탄산수소나트륨, pH 8.3, 0.5M 염화나트륨) 7㎖을 시아노겐 브로마이드로 활성화된 세파로즈 담체 3.5㎖과 실온에서 2 시간 동안 접촉시켜 고정화한 후 0.1M 트리스 완충용액(pH 8.0)으로 고정화 반응을 중단시키고, 과잉의 효소를 제거하기 위해 50㎖의 세정용액 1(0.1 초산완충용액(pH 4.0), 0.5M 염화나트륨)과 50㎖의 세정용액 2(0.1M 트리스 완충용액(pH 8.0), 0.5M 염화나트륨)로 4 내지 5회 반복 세척하여 고정화 아미노펩티다제를 얻었다.
실 시 예 3 : 고정화된 아미노펩티다제의 열안정성
실시예 1 및 2의 방법으로 고정화된 아미노펩티다제를 37℃에서 장기 노출시키고 시간의 경과에 따른 잔존 활성의 변화를 플레이더러(Pfleiderer,Method in enzymology 19, 514-521(1970))의 방법에 따라 측정하였다. 1mM 류신-p-니트로아닐리드(leucine-p-nitroanilide)를 기질로 한 완충용액(0.1M 트리스 완충용액(pH 8.0), 0.5% DMSO(dimethylsulfoxide)) 1㎖에 고정화 아미노펩티다제를 넣고 37℃에서 반응시킨 후 405nm에서의 흡광증가를 측정하여 1 분간 1.0의 흡광변화를 나타내는 효소원을 1 단위로 정의하였다.
제 1 도는 본 발명의 방법에 사용된 고정화 아미노펩티다제의 열안정성을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보면 고정화된 아미노펩티다제는 37℃에서 100일 경과시까지 활성이 저하하지 않았음을 알 수 있다. 즉 본 발명에 따라 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로즈 또는 유퍼지트 C 담체에 아미노펩티다제를 고정화시킴으로써 활성을 유지한 채 효소를 장기간 보존할 수 있음을 알 수 있다.
실 시 예 4 : 고정화된 아미노펩티다제의 pH에 대한 안정성
실시예 1 및 2의 방법에 따라 고정화된 아미노펩티다제를 pH 6.0내지 11.0 구간의 완충용액에 1, 2, 6 및 24시간 동안 노출시킨 후 잔존하는 효소의 활성을 실시예 3에서와 동일한 방법으로 측정하였다.
사용된 완충용액은 50mM 인산 나트륨, 50mM 트리스, 50mM 탄산수소나트륨으로 각 pH는 5N 수산화 나트륨으로 조정하였다.
제 2 도는 고정화 아미노펩티다제와 수용액상의 아미노펩티다제의 pH 안정성을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보면 수용액상의 효소에 비해 고정화된 아미노펩티다제는 비교적 광범위한 pH 구간에서 우수한 안정성을 가지고 있음을 알 수 있으며, 노출 시간에 따른 활성의 차이는 거의 없었다.
실 시 애 5 : 고정화 아미노펩티다제를 이용한 천연형 재조합 인성장 호르몬의 제조 및 반복 사용에 따른 고정화 아미노펩티다제의 활성변화
실시예 1의 방법으로 고정화된 150 단위의 고정화 아미노펩티다제를 칼럼에 충진시키고 8cm/h의 유속으로 아미노펩티다제 반응 완충용액(0.1M 트리스, pH 8.0, 0.1M 염화나트륨)을 흘려주어 평형화시켰다. 동일 완충용액으로 투석한 재조합 인성장 호르몬 10mg을 동일 유속으로 흘러주면서 칼럼을 2회 통과시켜 인성장 호르몬의 N-말단 메티오닐기를 제거하였다. 상기 반응액을 10mM 트리스 완충용액(pH 8.0)으로 투석시킨 후 N-말단 서열 분석기(Applied Biosystems 471A 단백질 서열 분석기)를 사용하여 메티오닐 잔기가 제거된 정도를 확인하였다.
이상의 과정을 20회 반복 시험하였고, 그 결과를 제 3 도에 나타내었다. 여기에서 보면, 고정화 아미노펩티다제는 반복 사용하여도 활성의 저하없이 동일한 효율로 메티오닐 단백질의 N-말단 메티오닐 잔기를 제거하는 것을 알 수 있었다.
실 시 예 6 : 천연형 인성장 호르몬의 특성 조사
고정화 아미노펩티다제에 의해 N-말단 메티오닐기가 제거된 인성장 호르몬의 N-말단 서열을 실시예 5와 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과 페닐알라닌-프롤린-트레오닌으로서 천연형 인성장 호르몬과 동일한 서열임을 알 수 있었다. 제 4(A)및 (B)도는 각각 고정화 아미노펩티다제로 처리되기 전, 후의 인성장 호르몬의 N-말단 서열 분석결과를 나타낸 것이다. 여기에서 보면, 고정화 아미노펩티다제로 처리된 인성장 호르몬은 첫번째 아미노산이 페닐알라닌으로 나타났으며, 프롤린 위치에서는 피크가 나타나지 않았음을 알 수 있었다.
실시예 5의 처리에 의해 N-말단 메티오닌이 제거된 천연형 재조합 인성장 호르몬의 순도측정을 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 수행하였으며, 그 결과를 제 5 도에 나타내었다. 제 1 열은 표준 분자량 표지로 위로부터 97.4, 66.2, 42.7, 31.0, 21.5 및 14.4 kD을 나타내며, 제 2 열 및 제 3 열은 실시예 5에서 얻어진 인성장 호르몬을 나타내는 것이다. 여기에서 보면, 상기 고정화 아미노펩티다제를 통과한 후에도 인성장 호르몬은 분해산물이 검출되지 않았고 순도를 유지하고 있음을 알 수 있다.
상기의 천연형 재조합 인성장 호르몬의 생리활성을 측정하기 위해 방사 수용체 분석법(radio receptor assay)을 수행한 결과, 세계 보건기구(WHO)에서 공급하는 뇌하수체 유래 인성장 호르몬의 역가인 2.5 IU/mg에 준하는 2.7 IU/mg의 활성을 나타내었다.
이상의 결과로부터 본 발명의 방법에 따라 수불용성 담체인 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로즈 또는 유퍼지트 C에 아미노펩티다제를 고정화시켜 재조합 메티오닐 단백질을 처리할 경우 재조합 단백질의 N-말단 메티오닐기가 선택적으로 절단되고 더 이상의 아미노산은 절단되지 않으며, 생리적 활성의 차이가 없음을 알 수 있었다.
제 1 도는 본 발명의 방법에 사용된 고정화 아미노펩티다제의 열안정성을 나타낸 그래프이고,
제 2 도는 고정화 아미노펩티다제와 수용액상의 아미노펩티다제의 pH 안정성을 나타낸 그래프이고,
제 3 도는 고정화 아미노펩티다제에 의한 인성장 호르몬의 탈아미노산 반응을 나타낸 그래프이고,
제 4(A)도 및 제 4(B)도는 각각 고정화 아미노펩티다제로 처리되기 전, 후의 인성장 호르몬(human growth hormone)의 N-말단 서열 분석결과를 나타낸 것이며,
제 5 도는 본 발명의 방법에 따라 고정화 아미노펩티다제 처리로 제조된 천연형 재조합 인성장 호르몬의 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 결과를 나타낸 것이다.

Claims (6)

  1. 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로즈 및 유퍼지트 C로 구성되는 군으로부터 산택되는 수불용성 담체에 아미노펩티다제를 고정화시키고, 상기 고정화된 아미노펩티다제에 메티오닐 단백질을 반응시켜 N-말단 메티오닐 잔기를 제거하는 것을 포함하는, 천연형 재조합 단백질의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 아미노펩티다제가 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스 배양액으로부터 얻어진 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    메티오닐 단백질 1mg당 1 내지 20 단위의 고정화 아미노펩티다제와 반응시키는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 고정화된 아미노펩티다제를 칼럼에 충진시킨 후 메티오닐 단백질 및 반응 완충용액을 주입하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 반응 완충용액이 pH가 7.0 내지 9.0이며, 염화 나트륨 농도가 100 내지 200 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 메티오닐 단백질 및 반응 완충용액을 5 내지 15cm/h의 유속으로 칼럼에 주입하는 것을 특징으로 하는 방법.
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KR1019950034208A KR100392779B1 (ko) 1995-10-06 1995-10-06 고정화 아미노펩티다제를 이용한천연형 재조합단백질의 제조방법

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