JPS62201815A

JPS62201815A - Liposome preparation

Info

Publication number: JPS62201815A
Application number: JP27610786A
Authority: JP
Inventors: Sunao Hamaguchi; 直濱口; Katsumi Iga; 伊賀　勝美; Tairyo Ogawa; 泰亮小川
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-11-22
Filing date: 1986-11-19
Publication date: 1987-09-05
Anticipated expiration: 2010-07-12
Also published as: JPH0764721B2

Abstract

PURPOSE:To keep a drug in liposome stably and to obtain a liposome preparation having long acting medicinal effects, by removing a solvent from a drug- containing W/O type emulsion to give liposome and dispersing the liposome into an aqueous solution having specific osmotic pressure. CONSTITUTION:A solvent (e.g. chloroform, alcohol, etc.) is removed from a drug (e.g. anti-inflammatory analgesic, anti-cancer drug, antibiotic, etc.)- containing W/O type emulsion by a conventional procedure to give REV liposome. Then the liposome is dispersed into an aqueous solution having at least >=20%, preferably >=50% higher osmotic pressure than a mounting solution does to give a liposome preparation. In the case of a liposome preparation to be administered into an organism, preferably the osmotic pressure of the dispersion is made approximately isotonic to that of an organism solution. The drug is stably retained in liposome and duration of medicinal effect and targeting effect on a specific organ are more readily developed.

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はリボソーム製剤に関する。さらに詳しくは、本
発明は薬物がリボソーム内部に安定に保持され、薬物の
治療効果の持続化あるいは特定の臓器へのターゲット効
果をより発揮しやすくされたリボソーム製剤に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Field of the Invention The present invention relates to ribosomal preparations. More specifically, the present invention relates to a ribosomal preparation in which a drug is stably retained inside ribosomes, making it easier to maintain the therapeutic effect of the drug or to target a specific organ.

峻超然人肛リボソームを薬物のキャリアとして利用する際に、薬物
ができるだけリボソーム内部に安定に保持されることが
治療効果を高める上において必要である。従来、リボソ
ームの安定性については多くの研究がなされているが、
リボソームの安定性と調製時の浸透圧の関係については
あまり考慮されていない。従来は例えば、細胞工学２．
１１３６（１９８３）に示されているように、「調製時
の溶液とその後に用いる溶液が等張であることが原則と
して必須である」と主張されている。リボソーム調製時
の溶液がその後に用いる分散液の浸透圧より低い場合に
ついては考慮が払われていない。When using anal ribosomes as drug carriers, it is necessary to maintain the drug as stably as possible inside the ribosomes in order to enhance the therapeutic effect. Many studies have been conducted on the stability of ribosomes, but
Little consideration has been given to the relationship between ribosome stability and osmotic pressure during preparation. Conventionally, for example, cell engineering 2.
1136 (1983), it is asserted that ``it is essential in principle that the solution at the time of preparation and the solution used thereafter be isotonic.'' No consideration is given to the case where the osmotic pressure of the solution during ribosome preparation is lower than the osmotic pressure of the dispersion liquid used thereafter.

発明が１違うとず−（四弧秩リボソーム製剤の安定化については、種々の試みがなさ
れているものの、簡便でかつ効果の高い実用的な方法は
まだ開発されていない。Although various attempts have been made to stabilize ribosome preparations, a simple and highly effective practical method has not yet been developed.

問題黒鉛解決する姪Δ濡ト関上記の状況に鑑み、本発明者らは薬物をリボソーム中に
安定にｒＹ在させるための方法を、特に浸透圧との関係
について種々検討した結果、本発明を完成した。士なわ
ら、本発明は薬物を含むＷ／Ｏエマルジョンから、溶媒
を除去して得られ、るすポソームを、その封入液よりも
少なくとも２０％以上高い浸透圧を有する水溶液に分散
させてなるリボソーム製剤である。In view of the above-mentioned situation, the present inventors have investigated various methods for stably disposing drugs in ribosomes, particularly regarding the relationship with osmotic pressure, and have developed the present invention. completed. However, the present invention provides ribosomes obtained by removing the solvent from a drug-containing W/O emulsion and dispersing rusposomes in an aqueous solution having an osmotic pressure at least 20% higher than that of the encapsulating liquid. It is a formulation.

本発明のリボソーム製剤は次の方法によって製造できる
。The ribosome preparation of the present invention can be produced by the following method.

薬物を含むＷ／Ｏ型エマルジョンは、薬物封入液及びリ
ン脂質を溶解した有機溶媒を常法により乳化することに
よって得られる。A W/O emulsion containing a drug can be obtained by emulsifying a drug-encapsulating liquid and an organic solvent in which a phospholipid is dissolved by a conventional method.

本発明において使用し得るリン脂質は、通常、リボソー
ムの調製に使用するものであればよい。The phospholipid that can be used in the present invention may be any phospholipid that is normally used for preparing ribosomes.

たとえば、ホスファデジルコリン、ホスファチジルエタ
ノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリ
ン、ホスファチジルイノシトール、ホスファデジルグリ
セロール、スフィンゴミエリンなどの卵黄、大豆やその
他の動植物組織に由来するもの、またはこれらの混合物
である卵黄リン脂質。For example, egg yolks such as phosphadecylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidic acid, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphadecylglycerol, sphingomyelin, those derived from soybeans and other animal and plant tissues, or mixtures thereof. lipids.

大豆リン脂質や、それらの水素添加物、あるいはジパル
ミトイルホスファデジルコリン、ジステアロイルホスフ
ァチジルコリンなどの合成により得られるものがあげら
れる。これらは１種でもよく、２種以上を混合して用い
てしよい。また、リボソームの安定化等を目的として、
たとえばコレステロール、α−トコフェロール、ジャチ
ルフォスフェート。ステアリルアミン等を加えてもよい
。Examples include soybean phospholipids, hydrogenated products thereof, and those obtained by synthesis of dipalmitoylphosphadecylcholine, distearoylphosphatidylcholine, and the like. These may be used alone or in combination of two or more. In addition, for the purpose of stabilizing ribosomes,
For example, cholesterol, alpha-tocopherol, jacyl phosphate. Stearylamine etc. may be added.

次に、封入液は水を媒体とし、これに浸透圧の調整上、
適宜の水溶性物質を溶解した水溶液が用いられるが、場
合によっては単に水に薬物を溶解したものであってもよ
い。水溶性物質としては、種々の緩衝液（例、リン酸緩
衝液、クエン酸緩衝液）、各種塩類（例、塩化ナトリウ
ム、リン酸−ナトリウム、リン酸ニナトリウム）、糖類
（例、グルコース、ガラクトース、マルトース、マルト
トリオース、マンノース、ソルビトール）、アミノ酸類
（例、グリシン）などを単独または混合して用いること
ができる。この封入液中には、必要に応じて、保存剤（
例、パラベン）等を加えておいてらよい。水溶性物質の
溶解量は、一般に封入液の浸透圧が約５０〜５００　ｍ
ｏｓｎ＋になるように、適宜に調整される。Next, the filling liquid uses water as a medium, and in order to adjust the osmotic pressure,
An aqueous solution containing an appropriate water-soluble substance is used, but in some cases, a drug simply dissolved in water may be used. Water-soluble substances include various buffers (e.g. phosphate buffer, citrate buffer), various salts (e.g. sodium chloride, sodium phosphate, disodium phosphate), sugars (e.g. glucose, galactose). , maltose, maltotriose, mannose, sorbitol), amino acids (eg, glycine), etc. can be used alone or in combination. If necessary, a preservative (
For example, parabens) etc. may be added. The amount of water-soluble substances dissolved is generally determined by the osmotic pressure of the enclosed liquid being approximately 50 to 500 m
It is adjusted appropriately so that it becomes osn+.

具体的にどの程度の浸透圧にするかは、リボソーム製剤
の使用目的等に応じて適宜に選択される。The specific osmotic pressure is appropriately selected depending on the intended use of the ribosome preparation.

たとえば、注射薬１点眼薬１点鼻薬等として投与する場
合は、浸透圧は約５０〜２４０　ｍｏｓｍに調整するの
が好ましく、一方診断薬として利用する場合には特に限
定されない。For example, when administering as an injection, one eye drop, one nasal drop, etc., the osmotic pressure is preferably adjusted to about 50 to 240 mosm, whereas when used as a diagnostic agent, it is not particularly limited.

本発明に使用される薬物としては親水性薬物と親油性薬
物のいずれかあるいは両者の混合物を用いることができ
る。親水性薬物の例としては、各種の消炎鎮痛剤、リン
ホカイン、抗ガン剤、免疫賦古剤、生理活性ペプチド剤
、抗生物質、抗原虫薬、酵素剤、抗アレルギー剤などが
あげられる。As the drug used in the present invention, either a hydrophilic drug or a lipophilic drug, or a mixture of both can be used. Examples of hydrophilic drugs include various anti-inflammatory and analgesic drugs, lymphokines, anticancer drugs, immunostimulants, physiologically active peptide drugs, antibiotics, antiprotozoal drugs, enzyme drugs, and antiallergic drugs.

消炎鎮痛剤の例としては、マンガンースーパーオキザイ
ドディスムターゼ（ＳＯＤ）あるいはその誘導体である
スーパーオキサイドディスムターゼ−ＰＥＧ（ＳＯＤ−
ＰＥＧ、ＰＥＧ分子ｆｉ５０００Ｘ特開昭５８−１６８
８５）　、リポモジュリンなどが挙げられる。リンホカ
インの例としては天然型あるいは遺伝子組換型インター
フェロン（α、β、γ）や天然型あるいは遺伝子組換型
インターロイキン■が挙げられる。抗ガン剤の例として
は、アドリアマイシン、アクヂノマイシン、ｌ−β−ア
ラビノフラノシルシトシン、ブレオマイシン、ンスブラ
チン等が挙げられる。免疫賦活剤としてはムラミルジペ
プチド、ムラミルジペプチドが挙げられる。生理活性ベ
プヂドとしてはタイロイドリリージングホルモン（Ｔ［
（）、リコウプロライド、インスリン、ＤＮ　−１４１
７（特開昭５９−２１６１３）などがあげられる。Examples of anti-inflammatory analgesics include manganese-superoxide dismutase (SOD) or its derivative superoxide dismutase-PEG (SOD-
PEG, PEG molecule fi5000X JP 58-168
85), lipomodulin, and the like. Examples of lymphokines include natural or recombinant interferon (α, β, γ) and natural or recombinant interleukin (2). Examples of anticancer agents include adriamycin, acudinomycin, l-β-arabinofuranosylcytosine, bleomycin, and sublatin. Examples of the immunostimulant include muramyl dipeptide and muramyl dipeptide. As a physiologically active peptide, tyroid releasing hormone (T[
(), licouprolide, insulin, DN-141
7 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 59-21613).

抗生物質としては、スルペニシリン、セフォチアム、セ
フメツキシム、スルフアゼシン等のβ−ラクタム系抗生
物質、ゲッタミシン。ストレプトマイシン、カナマイシ
ンなどのアミノ配糖体系抗生物質が含まれる。抗原虫薬
の例としては、アンヂモン酸メグルミンなどのアンヂモ
ン系駆虫薬が含まれる。酵素剤の例としてはアルカリホ
スファターゼが、また抗アレルギー剤の例としてはアモ
キサノクスがあげられる。Examples of antibiotics include β-lactam antibiotics such as sulpenicillin, cefotiam, cefmetuxime, and sulfazesin, and gettamicin. Includes aminoglycoside antibiotics such as streptomycin and kanamycin. Examples of antiprotozoal drugs include andimone-based anthelmintics such as meglumine anddimonate. An example of an enzyme agent is alkaline phosphatase, and an example of an antiallergic agent is amoxanox.

親油性薬物の例としては、アンサマイトシンのような抗
ガン剤や、ＴＭＤ−６６（Ｇａｎｎ　７４（２）　１９
２−１９５（１９８３））、Ｍ　Ｔ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ　（
特開昭５９−１６３３８９）のような免疫賦活剤、リン
脂質誘導体（特開昭５９−１６３：（８９）があげられ
る。Examples of lipophilic drugs include anticancer drugs such as ansamitocin and TMD-66 (Gann 74(2) 19
2-195 (1983)), M T P -P E (
Examples include immunostimulants such as JP-A-59-163389) and phospholipid derivatives (JP-A-59-163: (89)).

一般にエマルジョン調製に際し親水性薬物の場合は、上
記の封入液中に含有せしめ、また洩λ（１性薬物の場合
は有機溶媒中に溶解しておくのが好ましい。Generally, when preparing an emulsion, it is preferable that a hydrophilic drug is contained in the above-mentioned fill liquid, and that a monovalent drug is dissolved in an organic solvent.

有機溶媒としては、リン脂質を溶解するしのであれば特
に限定なく用いられるが、たとえばクロロホルム、エー
テル類（例、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル
）、アルコール類（例、メタノール、エタノール）など
の１種または２種以上の混合溶媒があげられる。The organic solvent may be used without particular limitation as long as it dissolves the phospholipid, but for example, one or more of chloroform, ethers (e.g. diethyl ether, isopropyl ether), alcohols (e.g. methanol, ethanol), etc. A mixed solvent of two or more types may be mentioned.

本発明においてＷ／Ｏ型エマルジョンからリボソームの
調製は、ブロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・ザ・ユナイテッドーステーツーオブ
・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。In the present invention, the preparation of ribosomes from a W/O emulsion is described in Bros.
Academy of the United States of America (Proc, Natl, Acad.

Ｓｃ　ｉ　、　ＵＳＡ）田、　４１９４（１９７ｇ）あ
るいは特開昭５５−１１８４１５に記載の方法に準じて
実施できる。エマルジョン調製において使用される有機
溶媒は封入液量に対して、一般に２〜／Ｏ倍程度が用い
られる。リン脂質の量は封入液１ｍｌに対し約／Ｏ〜／
Ｏ０μｍｏ１程度か用いられ、一般に有機溶媒に予じめ
溶解しておく方が好まｊ２い。一方、薬物の使用ｍは、
薬効を発現するのに必要な量と投与容量等を考慮（７て
適宜に選択される。It can be carried out according to the method described in 4194 (197 g) or Japanese Patent Application Laid-Open No. 118415/1983. The organic solvent used in emulsion preparation is generally about 2 to 10 times the amount of the sealed liquid. The amount of phospholipid is approximately /O~// for 1 ml of sealing liquid.
About 0 μmol is used, and it is generally preferable to dissolve it in an organic solvent in advance. On the other hand, drug use m
The amount and administration volume required to exhibit medicinal efficacy are considered (7) and selected as appropriate.

Ｗ／Ｏ型エマルジョンを得るための乳化方法は、従来の
方法、たとえば１ａ拌法、圧力法、超音波照射法が採用
できる。超音波照射の場合２０Ｋｌ（Ｚｐｒｏｂｅ型で
約１分〜２０分程度の超音波照射により均一な乳化物が
得られる。As the emulsification method for obtaining the W/O emulsion, conventional methods such as the 1a stirring method, pressure method, and ultrasonic irradiation method can be employed. In the case of ultrasonic irradiation, a uniform emulsion can be obtained by ultrasonic irradiation of 20 Kl (Zprobe type) for about 1 to 20 minutes.

かくして得られたＷ／Ｏ型エマルジョンから溶媒を常法
により除去する。例えばロータリーニア（ボレータを用
い、エマルジジンをその中に含有する封入液量の約／Ｏ
〜／Ｏ０倍容量のナス型コルベンに入れ、溶媒を留去さ
せればよい。このときの温度は、リン脂質の相転移温度
より約（０℃以上高くすることが望ましく、また留去の
初期においては約／Ｏ０〜４００　ｍｍ１１ｇの減圧下
で行ない、内容物がゲルを形成した後は約６０〜７００
ｍｍｔ１ｇ程度の減圧下とするのが好ましい。さらに留
去を続は溶媒を除去するとＲＥ　Ｖ　（Ｒｅｖｅｒｓｅ
−ｐｈａｓｅ　Ｅｖａｐｏ−ｒａｔｉｏｎ　Ｖｅｓｉｃ
ｌｅ）リボソームが得られる。本リボソームはユニラメ
ラ−またはオリゴラメラ−（通常、約／Ｏ層以下の脂質
二重膜よりなる）の形態を有し、その内部に薬物が封入
されている。The solvent is removed from the W/O emulsion thus obtained by a conventional method. For example, using a rotary linear (volator), approximately /O
The solution may be placed in an eggplant-shaped colben with a volume of ~/O0 times, and the solvent may be distilled off. The temperature at this time is desirably about (0°C or higher) higher than the phase transition temperature of phospholipids, and at the beginning of the distillation, the distillation is carried out under a reduced pressure of about 0 to 400 mm and 11 g, so that the contents form a gel. Approximately 60-700 left
It is preferable to use a reduced pressure of about 1 g mmt. Further distillation continues and the solvent is removed, RE V (Reverse
-phase Evaporation Vesic
le) Ribosomes are obtained. The present ribosome has a unilamellar or oligolamellar form (usually composed of a lipid bilayer membrane of about 0 to 0 layers), and a drug is encapsulated inside the ribosome.

上記の調製工程をへて得られるリボソームを、封入液よ
りも少なくとも２０％以上高い浸透圧を有する水溶液に
分散させて、本発明のリボソーム製剤を得る。この分散
液の浸透圧は、封入液の浸透圧よりも約５０％以上高く
するのがより好ましく、約／Ｏ０％以上高くするとさら
に好ましい。本分散液は封入液の調製に用いた各水溶性
物質から適宜に選択し調製できるが、封入液と同一の溶
解物質であってもよいし異種のものであってもよい。The ribosomes obtained through the above preparation steps are dispersed in an aqueous solution having an osmotic pressure at least 20% higher than that of the encapsulating liquid to obtain the ribosome preparation of the present invention. The osmotic pressure of this dispersion is more preferably about 50% or more higher than the osmotic pressure of the encapsulating liquid, and even more preferably about 0% or more. This dispersion can be prepared by appropriately selecting from the various water-soluble substances used in preparing the encapsulating liquid, but it may be the same dissolved substance as the encapsulating liquid or a different kind.

要は、上記に示したように封入液よりも高い浸透圧に調
整したものであればよい。生体に投与する目的のリボソ
ーム製剤の場合は、分散液の浸透圧は生体液とほぼ等張
にするのが好ましく、従ってこのとき前述の封入液は生
体液の約８０％以下の浸透圧を有するものが用いられる
。In short, as shown above, it is sufficient that the osmotic pressure is adjusted to be higher than that of the sealed liquid. In the case of ribosome preparations intended for administration to living organisms, it is preferable that the osmotic pressure of the dispersion liquid be approximately isotonic with the biological fluid, and therefore, in this case, the aforementioned encapsulated liquid has an osmotic pressure that is approximately 80% or less of that of the biological fluid. things are used.

上記の方法で調製されたリボソーム液はそのまま未封入
の薬物を含んだ状態で上記の分散液に加えてらよいし、
また、予じめ調製したより高濃度の分散液や、前述の分
散液を構成ずろ水溶性物質自体を加えて、リボソームを
含んだ分散液の最終の浸透圧が前述の範囲となるように
調整してもよい。The ribosome solution prepared by the above method may be added to the above dispersion as it is, containing unencapsulated drug, or
In addition, the final osmotic pressure of the ribosome-containing dispersion can be adjusted to be within the range described above by adding a pre-prepared higher concentration dispersion or the water-soluble substance itself to the above-mentioned dispersion. You may.

一方、リボソーム内部に封入されなかった薬物を除去し
たい場合には、この除去と、本発明でいう特定の浸透圧
を有する分散液への分散を同時に行なうことができる。On the other hand, if it is desired to remove the drug that is not encapsulated inside the ribosome, this removal and dispersion into a dispersion having a specific osmotic pressure as used in the present invention can be performed simultaneously.

この除去の方法としては、透析法、ろ過法（例、ゲルろ
過法）、４心分雛法等が挙げられる。透析法の場合には
、調製されたリボソーム液を透析膜内に入れ」二足の分
散液に浸漬（−で薬物を透析除去する操作をくり返１こ
とにより本発明のリボソーム製剤が得られる。ゲルろ過
の場合には溶離液として」二足の分散液を用いてリボソ
ーム調製液をろ過に付し、未封入薬物含有画分とリボソ
ーム含ａ画分とに分別すればよい。遠心分離の場合には
、調製されたリボソーム液を遠心分離し、得られる沈澱
部分を上記の分散液に再分散すればよく、必要に応じて
遠心分離と再分散を数回＜す返してもよい、なお、未封
入薬物の除去に際しては、封入液と一旦等張下で未封入
薬物を上記のような手段で除去した後、得られるリボソ
ームを直ちに本発明で特定された浸透圧を有する分散液
中に加える方法を採用してもよい。Examples of methods for this removal include dialysis, filtration (eg, gel filtration), and 4-core chick method. In the case of the dialysis method, the ribosome preparation of the present invention can be obtained by placing the prepared ribosome solution into a dialysis membrane and repeating the steps of immersing it in two dispersions (-) to remove the drug by dialysis. In the case of gel filtration, the ribosome preparation solution may be filtered using a bipedal dispersion liquid as the eluent and separated into a fraction containing unencapsulated drug and a fraction containing ribosomes.In the case of centrifugation For this purpose, the prepared ribosome solution may be centrifuged and the resulting precipitate portion may be redispersed in the above-mentioned dispersion liquid, and if necessary, centrifugation and redispersion may be repeated several times. When removing the unencapsulated drug, once the unencapsulated drug is removed by the above-mentioned method under isotonic conditions with the encapsulating solution, the obtained ribosomes are immediately added to a dispersion having an osmotic pressure specified in the present invention. method may be adopted.

分散液とリボソームのｍ比はたとえば薬物の封入ｍおよ
び薬効の発現に必要な量などを考慮して適宜に決められ
る。The m ratio of the dispersion liquid to the ribosome is determined as appropriate, taking into consideration, for example, the encapsulation m of the drug and the amount necessary for the expression of drug efficacy.

実施例以下に実験例、試験例および実施例を挙げて本発明をさ
らに具体的に説明する。なお、以下における浸透圧の測
定は、浸透圧測定器０８゜・【■（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ製）を用いた。EXAMPLES The present invention will be explained in more detail with reference to Experimental Examples, Test Examples, and Examples below. In addition, the measurement of osmotic pressure in the following is performed using an osmotic pressure measuring device 08°/[■(Precision
Systems Inc.) was used.

実験例１１）　　０．０５Ｍ　６−カルポキシフルオロスセイン
（イーストマンコダック社製、６ＣＦと略称）を０．０
２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に食塩を加えて浸透圧
２８９ｍｏｓｍに調整した水溶液を得た。この液５１に
蒸留水５ｍｌを混合し封入水溶液（１４５ｍｏｓｍ）を
調製した。Experimental Example 1 1) 0.05M 6-carpoxyfluoroscein (manufactured by Eastman Kodak Company, abbreviated as 6CF)
Salt was added to 2M phosphate buffer (pH 7.2) to obtain an aqueous solution whose osmotic pressure was adjusted to 289 mosm. This liquid 51 was mixed with 5 ml of distilled water to prepare an encapsulated aqueous solution (145 mosm).

この水溶液を、ジパルミトイルホスファチジルコリン（
ＤＰＰＣ）　２／Ｏｍｇよ５よびジステアロイルホスフ
ァチジルコリン（ＤＳＰＣ）９０ｍｇ含有のクロロホル
ム−イソプロピルエーテル（２０ｍｌ／２０ｍ１）溶液
に加え、超音波ホモジナイザー（入店製作所製、２０Ｋ
Ｈｚ）で室温下５０Ｗ、　３０秒間、６回超音波照射を
行ない、Ｗ／Ｏ型エマルジョンを得た。このエマルジョ
ンを水浴上（５５°Ｃ）でロータリーエバポレーターを
用いて溶媒を留去させ、ＲＥＶリボソームを調製した。This aqueous solution was mixed with dipalmitoylphosphatidylcholine (
In addition to a solution of chloroform-isopropyl ether (20 ml/20 ml) containing 90 mg of distearoyl phosphatidylcholine (DPPC) 2/Omg 5 and distearoyl phosphatidylcholine (DSPC), add an ultrasonic homogenizer (manufactured by Iriten Seisakusho, 20K
Ultrasonic irradiation was performed six times for 30 seconds at 50 W at room temperature to obtain a W/O emulsion. The solvent was distilled off from this emulsion using a rotary evaporator on a water bath (55°C) to prepare REV ribosomes.

次に、リボソームに封入されなかった６ＣＦは透析膜（
Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ　”　、分画分子ｆｆ１８０００
〜８０００゜Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉｅｓ社）を用いて生理食塩水（２８７ｍｏ
ｓｍ）中で透析により除去した後、５ｐ　ｍ−ｙ　イｔ
ｖ？−（Ａ。ｒｏｄｉｓｃＯ，Ｇｅｌｍａｎ社）を通し
、大粒子のリボソームを除去した。かくして６ＣＦを取
込んだリボソームを生理食塩水に分散させた製剤を得た
。Next, the 6CF that was not encapsulated in the ribosome was removed from the dialysis membrane (
Spectrapor”, fractionated molecules ff18000
~8000°Spectrum Medical In
Physiological saline (287mo
After removal by dialysis in sm), 5 p m-y it
v? - (A.rodiscO, Gelman) to remove large particles of ribosomes. In this way, a preparation in which ribosomes incorporating 6CF were dispersed in physiological saline was obtained.

２）　　０．０５Ｍ　６０Ｆ−０，０２Ｍリン酸緩衝液
（ｐｆｌ　７．２）５ｍｌに食塩を加えて浸透圧をｌ！
Ｈｍｏｓｍに調整した水溶液に蒸留水５ｎ＋Ｒを混合し
て得た封入水溶液（９７ｍｏｓｍ）を用いた以外は、上
記１）と同様の方法によりリボソーム製剤を調製した。2) Add salt to 5ml of 0.05M 60F-0.02M phosphate buffer (pfl 7.2) to bring the osmotic pressure to l!
A ribosome preparation was prepared in the same manner as in 1) above, except that an encapsulated aqueous solution (97mosm) obtained by mixing 5n+R of distilled water with an aqueous solution adjusted to Hmosm was used.

３）　　０．０５Ｍ　６ＣＦ−０，０２Ｍリン酸緩衝液
（ｐｉｔ　７．２）に食塩を加えて浸透圧を１９３　ｍ
ｏｓｎ＋に調整した液／Ｏｍ１を封入水溶液として用い
た以外は、上記１）と同様の方法によりリボソーム製剤
を調製した。3) Add salt to 0.05M 6CF-0.02M phosphate buffer (pit 7.2) to adjust the osmotic pressure to 193 m
A ribosome preparation was prepared in the same manner as in 1) above, except that the solution adjusted to osn+/Om1 was used as the encapsulated aqueous solution.

４）　　０．０５λｌ　６　ＣＦ’−０，０２Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，２）に食塩を加えて浸透圧を２８９　
ｍｏｓｍに調整した液／Ｏｍ１を封入水溶液として用い
た以外は、上記１）と同様の方法によりリボソーム製剤
を調製した。4) Add salt to 0.05λl 6 CF'-0.02M phosphate buffer (pH 7.2) to adjust the osmotic pressure to 289.
A ribosome preparation was prepared in the same manner as in 1) above, except that the solution adjusted to mosm/Om1 was used as the encapsulated aqueous solution.

試験例Ｉ実験例Ｉで得た各リボソーム製剤について次・の方法に
より６０Ｆの保持力を試験した。Test Example I Each of the ribosome preparations obtained in Experiment I was tested for 60F retention by the following method.

試験法（１） ■　リボソーム製剤０．１ｍｌに０．０６７Ｍリン酸緩
衝食塩液（ｐＨ７，２，２８４ｍｏｓｍ）９．９ｍｌを
加えて希釈後、静かに攪拌する（Ａ液）。Test method (1) ■ Add 9.9 ml of 0.067 M phosphate buffered saline (pH 7,2,284 mosm) to 0.1 ml of the ribosome preparation, dilute, and stir gently (solution A).

■　上記の希釈液０．２ｍｌを更に種々の浸透圧を持つ
０．０６７Ｍリン酸緩衝食塩液（分散液）９，８ｍｌに
加えて希釈後、静かに攪拌する（Ｂ液）。この時の６Ｃ
Ｆ蛍光強度（日立Ｆ　３０００蛍光スペクトロメータ使
用：励起波長４９４ｎｍ、測定波長５１５ｎｍ）をＦＢ
とした。(2) Add 0.2 ml of the above diluted solution to 9.8 ml of 0.067M phosphate buffered saline (dispersion) having various osmotic pressures, dilute, and stir gently (solution B). 6C at this time
FB fluorescence intensity (using Hitachi F 3000 fluorescence spectrometer: excitation wavelength 494 nm, measurement wavelength 515 nm)
And so.

■　次いで、Ｂ液５ｍｌをポリスチレン製丸底スピッツ
ロールに入れ、３分間振とう（イワキ振とう機■−８型
）後の６ＣＦ蛍光強度をＦＣとした。(2) Next, 5 ml of Solution B was placed in a polystyrene round-bottom spitz roll, and the 6CF fluorescence intensity after shaking for 3 minutes (Iwaki shaker model (1)-8) was defined as FC.

■　Ａ液の０．１ｍｌに０．０２％トリトンＸ　−／Ｏ
００，１ｍｌを加え、４５℃水浴上で／Ｏ分間加温して
リボソームを破壊した後、４．８ｍｌの０．０６７Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，２）を加え、混合する（Ｔ液）。■ 0.02% Triton X -/O in 0.1ml of solution A
After adding 1 ml of 0.00 and heating on a 45° C. water bath for 0 minutes to destroy ribosomes, add 4.8 ml of 0.067 M phosphate buffer (pH 7.2) and mix (T solution).

この時の６ＣＦ蛍光強度をＦＴとした。The 6CF fluorescence intensity at this time was defined as FT.

上記の試験で、３分間振とう後のリボソームからの６Ｃ
Ｆ放出量は（Ｆ　Ｃ−Ｆ　Ｂ）／　Ｆ’　ＴＸ　／Ｏ０
（％）で表わされる。In the above test, 6C from ribosomes after 3 minutes of shaking
The amount of F released is (F C - F B) / F' TX /O0
(%)

第１図は、各種浸透圧を有する分散液中で、３分間振と
うしたときの各リボソームからの６ＣＦ’放出１を示す
。この図から明らかなように、リボソーム調製時の封入
液浸透圧を分散液の浸透圧より小さくすることによって
、６ＣＦの放出量が少なくなり、安定性か向上すること
がわかった。FIG. 1 shows 6CF' release 1 from each ribosome upon shaking for 3 minutes in dispersions with various osmotic pressures. As is clear from this figure, it was found that by making the osmotic pressure of the encapsulated liquid during ribosome preparation lower than the osmotic pressure of the dispersion, the amount of 6CF released was reduced and the stability was improved.

第２図は生体液等張下でリボソームを３分間振とうした
時の６ＣＦの放出量と調製時の浸透圧との関係について
示す。この結果、リボソーム調製の際の封入液浸透圧か
分散液のそれよりも低いと過酷な振とう下においても内
封薬物の保持力が増加することが認められた。FIG. 2 shows the relationship between the amount of 6CF released when ribosomes are shaken for 3 minutes under isotonic biological fluid and the osmotic pressure at the time of preparation. As a result, it was found that when the osmotic pressure of the encapsulated liquid during ribosome preparation was lower than that of the dispersion, the retention of the encapsulated drug increased even under severe shaking.

試験法（２）」二足の溶液およびＴ液の各リボソーム調製液をポリス
チレン製の丸底スピッツロールに入れアルミ箔で遮光し
て、室温で４日間静置した。その後の６ＣＦの蛍光強度
をＦ　Ｂ’　、　Ｆ　Ｔ’とするとこの４日間にお（」
る６ＣＦ放出量（％）は、（Ｆ　Ｂ／Ｆ　Ｔ−Ｆ　Ｂ’
／Ｆ　Ｔ’）　Ｘ　／Ｏ０（％）で求められる。Test method (2) The ribosome preparations of the two-legged solution and the T solution were placed in a polystyrene round-bottom spitz roll, shielded from light with aluminum foil, and allowed to stand at room temperature for 4 days. If the subsequent fluorescence intensities of 6CF are F B' and F T', then during these four days (
The amount of 6CF released (%) is (FB/FT-FB'
/F T') X /O0 (%).

上記の試験結果を、第３図に示す。この図から明らかな
ように、４日間室温静置の場合にもリボソームはその調
製時の封入液浸透圧が分散液の浸透圧よりも低い程、６
０Ｆの放出量が少なくなり安定に保持されることを示し
ている。The above test results are shown in FIG. As is clear from this figure, even when left at room temperature for 4 days, the lower the osmotic pressure of the encapsulated liquid at the time of preparation, the higher the 6.
This shows that the amount of 0F released decreases and is stably maintained.

実験例２１）　　０．０５Ｍ　６ＣＦ−０，０２Ｍリン酸緩衝食
塩液（ｐＨ７，２，２８９ｍｏｓｍ）５ｍｌと蒸留水５
ｍｌとの混合液（１５０ｍｏｓｍ）を封入水溶酸点して
、卵黄製ホスファチジルコリン（ングマ社、　Ｐ　２７
７２）３００ｍｇのクロロホルム−イソプロピルエーテ
ル（２０ｍｌ／２０ｍ１）溶液を用いて実験例１の１）
に記載と同様の方法によりＲＥＶリボソームを調製した
。Experimental Example 2 1) 0.05M 6CF-0.02M phosphate buffered saline (pH 7,2,289mosm) 5ml and distilled water 5ml
ml (150 mosm) was encapsulated and subjected to water-soluble acid point, and phosphatidylcholine made from egg yolk (Nguma Co., Ltd., P 27
72) 1) of Experimental Example 1 using 300 mg of chloroform-isopropyl ether (20 ml/20 ml) solution
REV ribosomes were prepared by a method similar to that described in .

２）　　０．０５Ｍ　６ＣＦ−０，０２Ｍリン酸緩衝食
塩液（ｐｌ！７、２，２８９　ｍｏｓｍ）５ｍｌと０　
、０６７Ｍリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，２，２８４ｍｏ
ｓ＋＋＋）　５　ｍｌの混合水浴液２８７　ｍ０５ｍを
用いて上記１）と同様にリボソーム製剤（対照試料）を
得た。2) 5ml of 0.05M 6CF-0.02M phosphate buffered saline (pl!7, 2,289 mosm) and 0
, 067M phosphate buffered saline (pH 7,2,284mo
A ribosome preparation (control sample) was obtained in the same manner as in 1) above using 5 ml of 287 m05m of the mixed water bath solution.

上記Ｉ）および２）で得たリボソーム製剤につき次の試
験を行なった。すなわち、各リボソーム調製液０．１ｍ
ｌを９．９ｍｌのリン酸緩衝食塩液（ｐｉ（７，２，２
８４ｍｏｓｌ）に加え、静かに混合したのちこの２＋ｎ
ｌをとりザルトリウス社の透析器具セントリザルトＩ（
分画分子ｆｆ１２０，０００）に入れ３０００ｒｐｍ１
５分間（日立０５ＰＲ−２２型遠心分離機）遠心して、
リボソームを含まない液を得、この０．１ｍｌをポリス
チレン製丸底スピッツロール中の４．９ｍｌ　０．０６
７Ｍリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，２）上に加えて静かに
混合し、蛍光強度ＦＯを測定した。別に（Ａ）液０．１
ｍｌを、４．９ｍｌ　Ｏ，０６７Ｍリン酸緩衝食塩液（
ｐＨ７，２）上に加えて３回／Ｏｍ１容量のスピッツロ
ールを倒置させて内容物を混合した（溶液）。The following tests were conducted on the ribosome preparations obtained in I) and 2) above. That is, 0.1 m of each ribosome preparation
l to 9.9 ml of phosphate buffered saline (pi(7,2,2
84mosl), mix gently and then add this 2+n
1 and Sartorius's dialysis device Centresult I (
Place in fractionated molecules ff120,000) at 3000 rpm1
Centrifuge for 5 minutes (Hitachi 05PR-22 type centrifuge),
Obtain a ribosome-free solution and transfer 0.1 ml of this to 4.9 ml in a polystyrene round-bottom spitz roll.
It was added onto 7M phosphate buffered saline (pH 7.2) and mixed gently, and the fluorescence intensity FO was measured. Separately, (A) liquid 0.1
ml to 4.9ml O,067M phosphate buffered saline (
pH 7,2) and the contents were mixed by inverting the spitz roll 3 times/Om1 volume (solution).

この時の測定した蛍光強度をＦＢとする。一方（Ａ）液
０．１ｍｌについて前述のトリトンＸ　−／Ｏ０処理を
行ない、この時の蛍光強度をＦＴとした。（Ｂ）液の希
釈による６ＣＦの放出量％は（Ｆ　Ｂ−Ｆ　Ｏ）／Ｆ　
ＴＸｌ、００（％）で表わされる。The fluorescence intensity measured at this time is defined as FB. On the other hand, 0.1 ml of solution (A) was subjected to the above-mentioned Triton X-/O0 treatment, and the fluorescence intensity at this time was defined as FT. (B) The % release amount of 6CF due to dilution of the solution is (F B - F O)/F
TXl, expressed as 00 (%).

上記１）および２）のリボソーム製剤の希釈の際に放出
されたＧＣＦの量はそれぞれ７．７％および２４．５％
であった。The amount of GCF released upon dilution of the ribosomal preparations in 1) and 2) above was 7.7% and 24.5%, respectively.
Met.

実施例　１１）？：／ガン５ＯＤ−ＰＥＧ（５０００）２５ｍｇを
含む０．０６７Ｍリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，２２８７
ｍＯｓｍ）溶液６ｍＱおよび蒸留水５ｍＱの混合水溶液
（１４，８ｍＯｓｍ）、ＤＳＰＣ３０ｍｇおよびＤＰＰ
Ｃ２７０ｍｇのクロロホルム／イソプロピルエーテル（
３０ｍＱ／　３０　ｍＱ）溶液を混合し、超音波ホモジ
ナイザーで５０Ｗ−３０秒間、６回超音波照射を行いエ
マルジョンをＲ製した。次いで５５℃の水浴上でローク
リエバポレークにより溶媒を留去してＲＥＶリボソーム
を得た。これを高速遠心分離（５０，０００ｇ、２０分
、　’；　ｏｒｖａｌ）後、０．０６７Ｍリン酸緩衝食
塩液（ｐＩ［７，２，２８７ｎ＋Ｏｓｍ）を加えて分散
した。　この遠心分離を２回繰返しノ。のち、５ｕｍＯ
Ａ。ｒｏｄｉｓｃ■ｙＢＬ＝’ｙ−Ｍ大粒子のリボソー
ムを除去し精製した。このようにして５ＯＤ−ｒ’ＥＣ
（５０００）が安定に封入されたＲＥＶリボソーム製剤
を得た。Example 1 1)? :/0.067M phosphate buffered saline (pH 7, 2287) containing 25mg of Gun 5OD-PEG (5000)
Mixed aqueous solution (14,8 mOsm) of 6 mQ of solution (14.8 mOsm) and 5 mQ of distilled water, 30 mg of DSPC and DPP
C270mg chloroform/isopropyl ether (
30 mQ/30 mQ) solutions were mixed and subjected to ultrasonic irradiation 6 times at 50 W for 30 seconds using an ultrasonic homogenizer to prepare an emulsion R. Then, the solvent was distilled off using a low evaporator on a water bath at 55°C to obtain REV ribosomes. After high-speed centrifugation (50,000g, 20 minutes, '; oval), 0.067M phosphate buffered saline (pI [7,2,287n+Osm)] was added to disperse the mixture. Repeat this centrifugation twice. Later, 5umO
A. rodisc■yBL='y-M Large particle ribosomes were removed and purified. In this way, 5OD-r'EC
A REV ribosome preparation in which (5000) was stably encapsulated was obtained.

２）一方、マンガン５ｏｌ）−ＰＥＧ（５ＱＯＯ）２５
ｍｇを含む０．０６７Ｍリン酸緩衝食塩液／Ｏ＃ｌ１２
溶液（ｐｌ（７、２，２８８ｍＯｓ＋ａ）を用いて上記
と同様の方法でリボソームを調製し、同様の分散液に分
散しリボソーム製剤（対照試料）を調製した。2) On the other hand, manganese 5ol)-PEG(5QOO)25
0.067M phosphate buffered saline containing mg/O#l12
Ribosomes were prepared in the same manner as above using a solution (pl (7, 2,288 mOs+a)) and dispersed in the same dispersion to prepare a ribosome preparation (control sample).

−に記で得た各リボソーム製剤１）おｊ；び２）を用い
て次の試験を行なった。The following tests were conducted using each of the ribosome preparations 1) and 2) obtained in -.

ポリスチレン製の丸底スピッツロールに上記リボソーム
製剤各０：ＩｍＮ！に０．０２％トリトンＸ−／Ｏ００
，２ｍ（！を加え、５０°Ｃの水浴中に／Ｏ分装置した
後４．７ｍｇの２．６％ホウ酸ナナトリウム水溶液加え
混合した（Ｔ液）。　別に各リボソーム製剤０．２ｍ（
２をとり、９．８ｍＱの２．６％ホウ酸ナナトリウム水
溶液加え、静かに混合した。Add each of the above ribosome preparations to a round-bottom spitz roll made of polystyrene: 0: ImN! 0.02% Triton X-/O00
, 2 m (!) was placed in a water bath at 50°C for 10 minutes, and then 4.7 mg of a 2.6% sodium borate aqueous solution was added and mixed (T solution). Separately, 0.2 m (!) of each ribosome preparation was added.
2 was taken, 9.8 mQ of 2.6% sodium borate aqueous solution was added thereto, and the mixture was gently mixed.

この混合液を二分しポリスチレン製丸底スピッツロール
に入れ一方は室温下におき（Ｂ液）、他方は５０℃の水
浴中に５分間放置した（Ｗ液）。Ｔ、Ｂ。This mixed solution was divided into two parts, placed in a polystyrene round-bottom Spitz roll, and one part was kept at room temperature (solution B), and the other part was left in a water bath at 50° C. for 5 minutes (solution W). T.B.

Ｗの６液およびブランク用２．６％ホウ酸ナナトリウム
水溶液ＢＬ液）についてそれぞれパイレックスガラス製
／Ｏｍ１２遠沈管に移し、充分攪拌しながらフルオレス
カミンアセトン溶液（ロツシュ社。The 6 solutions of W and the blank 2.6% sodium borate aqueous solution BL solution) were each transferred to a Pyrex glass/Om12 centrifuge tube, and the fluorescamine acetone solution (Rotzhu Co., Ltd.) was thoroughly stirred.

フルラム「・シー」■ｌ。ｇ／。ρ）を０．１ｍＣ加え
、励起波長３９０　ｎｍ、測定波長４７５ｎｍにおける
蛍光強度（Ｆ）を測定した。５分間５０℃下に浸漬した
ことによるマンガン５ＯＤ−ＰＥＧ（５０００）の放出
量（％）は次の式で算出した。Furram "・shi"■l. g/. ρ) was added at 0.1 mC, and the fluorescence intensity (F) was measured at an excitation wavelength of 390 nm and a measurement wavelength of 475 nm. The amount (%) of manganese 5OD-PEG (5000) released by immersion at 50° C. for 5 minutes was calculated using the following formula.

マンガン−３ＯＤ−ＰＥＧ（５０００）放出量＝この結
果上記の１）および２）の各方法で得たリボン−ム分散
液を５０℃の水浴で５分間加温したことによるＳｏ＋）
−ＰＥＧ（５０００）の放出量は、それぞれ２．７％お
よび２５．４％と算出され、本発明のリボソーム製剤は
安定性に優れていることがわかった。Amount of manganese-3OD-PEG (5000) released = So+) as a result of heating the ribbon-me dispersions obtained by each of methods 1) and 2) above in a 50°C water bath for 5 minutes.
The released amounts of -PEG (5000) were calculated to be 2.7% and 25.4%, respectively, indicating that the ribosome preparation of the present invention has excellent stability.

実施例　２りマンガン−ＳＯＤ３０ｍｇを含む０．０６７Ｍリン酸
緩衝食塩液（ｐＨ７，２，２８９ｍ０ｓｎ＋）５ｍ１２
と蒸留水５ｍ１２の混合水溶液（１４７ｍＯｓｍ）を用
いて、実施例Ｉの１）に記載と同様の方法によりリボソ
ーム製剤を調製した。Example 2 0.067M phosphate buffered saline (pH 7,2,289m0sn+) containing 30mg of manganese-SOD 5m12
A ribosome preparation was prepared in the same manner as described in Example I, 1) using a mixed aqueous solution (147 mOsm) of 5 ml of distilled water and 5 ml of distilled water.

２）マンガン−ＳＯＤ３０ｍｇを含む０．０６７Ｍリン
酸緩衝食塩液（ｐＨ７、２、２８，９ｍＯｓｍ）／ＯＩ
ＩＩＱ、を用いてリボソームを調製した以外は、上記ｌ
）と同様の方法によりリボソーム製剤（対照試料）を調
製した。2) Manganese-0.067M phosphate buffered saline (pH 7, 2, 28, 9 mOsm) containing 30 mg of SOD/OI
IIQ, except that ribosomes were prepared using
) A ribosomal preparation (control sample) was prepared in the same manner as in (1).

上記の各リボソーム製剤ｌ）および２）について、実施
例１に記載と同様の方法により５０℃の水浴に５分間浸
漬することによるリボソームからのＳＯＤの放出量は、
それぞれ９．６％および８６．０％であった。For each of the above ribosome preparations 1) and 2), the amount of SOD released from the ribosomes when immersed in a 50°C water bath for 5 minutes in the same manner as described in Example 1 is as follows:
They were 9.6% and 86.0%, respectively.

実施例　３１）ＣＤＤＰ（シスプラチン）２．５ｍｇ含有の注射剤
（日本化薬製うンダ注）５ｍ１２と、蒸留水５ｍ１２の
混合液をリン指質溶液（ＤＳＰＣ／ＤＰＰＣ＝３０ｍｇ
／２７０ｍｇ、クロロポルム／イソプロピルエーテル−
３０ｍ１２／　３０　ｍＱ）を用いて実施例１の１）と
同様にしてリボソーム製剤を得た。Example 3 1) A mixture of 5 ml of an injection containing 2.5 mg of CDDP (cisplatin) (Nippon Kayaku Unda Injection) and 5 ml of distilled water was added to a phosphorus solution (DSPC/DPPC = 30 mg)
/270mg, chloroporum/isopropyl ether-
A ribosome preparation was obtained in the same manner as in 1) of Example 1 using 30 m12/30 mQ).

２）ＣＤＤＰ注射剤５　ｍ＋２（２、５ｍｇ、日本化薬
製うンダ注）と、注射用生理的食塩水（人尿製薬製、２
８４ｍＯｓｍ）５ｍ１２の混合液を用いて、実施例１の
１）と同様にしてリボソーム製剤（対照試料）を得たｄ
上記各リボソーム調製液１）および２）の各０．５ｍρ
を生理食塩水９　、５ｍ＆（２８７ｍＯｓｍ）に加え静
かに混合した（Ａ液）。Ａ液の０．２ｍ（をとり生理食
塩水９．８ｍρ（２８７ｍＯｓｍ）に加えて静かに混合
した。これを二分しそれぞれポリスチレン製丸底スピッ
ツロール中に入れ、一方は室温で静置しくＢ液）、他方
は室温で３分間振とうした（Ｃ液）。2) CDDP injection 5 m+2 (2.5 mg, Nippon Kayaku Unda Injection) and physiological saline for injection (Human Urine Pharmaceutical Co., Ltd., 2
A ribosome preparation (control sample) was obtained in the same manner as in 1) of Example 1 using a mixed solution of 5 ml (84 mOsm).
0.5 mρ each of the above ribosome preparation solutions 1) and 2)
was added to physiological saline 9.5 mOsm (287 mOsm) and mixed gently (solution A). 0.2 m of Solution A was added to 9.8 mρ (287 mOsm) of physiological saline and mixed gently. This was divided into two parts, each placed in a polystyrene round-bottom Spitz roll, and one half was left to stand at room temperature. ), and the other was shaken at room temperature for 3 minutes (solution C).

一方別にＡ液のＯ、Ｉ　ｍＱをとり０．０２％トリトン
Ｘ−／Ｏ０水溶液０　、１　ｍＱを加え混合、加温（４
５’Ｃ，／Ｏ分）し、４．８１の生理食塩水を加えて混
合し、リボソームを破壊した液を調製した（Ｔ液）。Ｂ
、ＣおよびＴ液のリボソームから放出されたＣＤＤＰは
ジエチルジチオカルバメートとの３ｄｄｕｃｔ形成後Ｈ
Ｐ　Ｌ　Ｃ（カラムＺｏｒｂａｘ　ＣＮ　　、溶離液；
ｎ−ヘキサン／イソプロピルアルコール＝８／２ＵＵ・
２５４　ｎｍ）で測定した。この時の定量値を■」とす
れば３分間振とうにおけるＣＤＤＰのリボソームからの
放出量はＨｃ　　Ｉｌｂ　Ｘ　／Ｏ０（％）で１１を算出される。この結果上記ｌ）および２）のリボソーム
の３分間振とう時のＣＤＤＰの放出量はそれぞれ６．４
％および８２．７％であった。すなわち、封入液の浸透
圧を分散液より低くすることでリボソームが安定化され
ることがわかった。Separately, take O and I mQ of solution A, add 0.02% Triton X-/O0 aqueous solution 0.1 mQ, mix, and heat (4
5'C,/O min) and mixed with 4.81% physiological saline to prepare a solution in which ribosomes were destroyed (T solution). B
, CDDP released from the ribosomes of C and T fluids becomes H after forming a 3dduct with diethyldithiocarbamate.
PLC (column Zorbax CN, eluent;
n-hexane/isopropyl alcohol = 8/2UU・
254 nm). If the quantitative value at this time is "■", then the amount of CDDP released from the ribosome after shaking for 3 minutes is calculated as 11 by Hc Ilb X /O0 (%). As a result, the amount of CDDP released when the ribosomes in 1) and 2) above were shaken for 3 minutes was 6.4, respectively.
% and 82.7%. In other words, it was found that ribosomes were stabilized by lowering the osmotic pressure of the encapsulated liquid compared to the dispersion liquid.

実施例　４ α−インターフェロン水溶液に水および塩化ナトリウム
を用いて２００μｇプロティン／ｍＬＩ４３ｍＯｓｍの
水溶液／ＯｍＱ得た。実施例１の１）と同様な方法でＷ
／Ｏエマルジョンを得、溶媒留去したのち、ｆｌＥＶリ
ボソームを得た。このムのを９゜、。３□８ｏＯヮイ）
Ｉｙ９−５７ｚｍｌ：よ９．大粒子。Example 4 An aqueous solution of 200 μg protein/mLI of 43 mOsm/OmQ was obtained by adding water and sodium chloride to an α-interferon aqueous solution. W in the same manner as 1) of Example 1
/O emulsion was obtained, and after evaporation of the solvent, flEV ribosomes were obtained. This is 9 degrees. 3□8oOwai)
Iy9-57zml: Yo9. Large particles.

■ リボソームを除去した後、透析膜（Ｓ　ｐｅｃｔｒｏｐ
ｏｒ分画分子ｉ２５０００）を用いて、生理的食塩水中
で透析し、未封入の薬物を除去し、封入液が低張で安定
なα−インターフェロン含有リボソーム製剤を得た。■ After removing ribosomes, use a dialysis membrane (Spectrop
or fractionated molecule i25000) in physiological saline to remove unencapsulated drug to obtain a stable α-interferon-containing ribosome preparation with a hypotonic encapsulated solution.

実施例　５インターロイキン２水溶液に水および塩化ナトリウムを
加えて３０８μｇプロティン／ｍＱで１４３ｍ０５ｍの
水溶液を調製し、その５ｍＣを／Ｏ０ｍ１２容量ナス型
コルベン中の卵黄製ホスファチジルコリン１５０ｍｇ含
有の有機溶媒液（クロロホルム１５亀Ｑ＋イソプロピル
エーテル１５ｍρ）に加え、実施例１の１）と同様な方
法でＷ／Ｏエマルジョンを得、溶媒留去したのちＲＥＶ
リボソームを得た。Example 5 Water and sodium chloride were added to an interleukin-2 aqueous solution to prepare an aqueous solution of 143 m05m at 308 μg protein/mQ, and 5 mC was added to an organic solvent solution containing 150 mg of egg yolk phosphatidylcholine (chloroform 15 In addition to Kame Q + isopropyl ether 15 mρ), a W/O emulsion was obtained in the same manner as in 1) of Example 1, and after the solvent was distilled off, REV
I got ribosomes.

得られたリボソームは遠心分離（５００００ｇ、２０分
）を行い、次いで生理食塩水５ｍρに再分散した。さら
に、遠心分離、再分散を繰返した後に５ｕｍＯ）Ｓｐ。The obtained ribosomes were centrifuged (50,000 g, 20 minutes) and then redispersed in physiological saline at 5 mρ. Furthermore, after repeating centrifugation and redispersion, 5umO) Sp.

。５、。、。、■フイ７１．−を７．い、、Ｃ濾過０、
インターロイキン２が安定に封入されたリボソーム製剤
を得た。. 5. ,. ,■Fui71. -7. ,,C filtration 0,
A ribosome preparation in which interleukin 2 was stably encapsulated was obtained.

発明の効果一本発明によると、薬物がリボソーム内部に安定に保持さ
れ、保存や振とう下においてら放出量が低減されるので
、リボソームを薬物のキャリアとして実用的汀利に利用
することかできる。本発明のリボソーム製剤は、治療を
目的に種々の薬効を有する薬物を生体に投与するに際し
、注射薬９点眼薬１点鼻薬等の形態で１１１用でき、薬
物の安定化、効果の持続化および特定の臓器へのターゲ
ッチングなどによって治療効果等をたかめるために何円
である。さらに、たとえば扉片抗体反応等をｆ’ｌｌ用
するりボソーム診断薬の場合にも、保存安定性の高い製
剤が得られる。Effect of the invention 1 According to the present invention, the drug is stably retained inside the ribosome, and the amount released during storage or shaking is reduced, so that the ribosome can be used to practical advantage as a drug carrier. . The ribosome preparation of the present invention can be used in the form of an injection, 9 eye drops, 1 nasal drop, etc. when administering drugs with various medicinal effects to living bodies for the purpose of treatment, and can stabilize the drug, prolong its effect, and The cost is to increase the therapeutic effect by targeting specific organs. Furthermore, for example, in the case of a bosomal diagnostic agent using a door-piece antibody reaction, etc., a preparation with high storage stability can be obtained.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図は６ＣＦ封入リポソ一ム調製時の封入水溶液と分
散液との浸透圧の比が６ＣＦ放出量に及ぼす影響を示す
。　第２図は、種々の浸透圧の封入水溶液を用いて６Ｃ
Ｆリボソームを調製し、これを生理食塩水中に分散させ
たときの振とう下におけるｆ３ｃＦの放出量を示し、同
じく第３図は室温放置下における６０Ｆの放出量を示す
。＄１閃 →−２８９＋ｎ　Ｏ９＋ｎ　　（ソＩドソー瓜調４，１
ｐｑＩｌ　シヴｊ４！石ヒ）−嘉一　＋９３ｍ０９＋ｎ
（１ −Ｏ−１４５＋ｎ　Ｏ９ｍ　Ｉ　　　　　　　　　　　
　　　　）ソ１）ζゾームゴｐｌβＪチの環１距圧−に
分４１Ｊの班＄３図FIG. 1 shows the influence of the osmotic pressure ratio between the encapsulated aqueous solution and the dispersion on the amount of 6CF released during the preparation of 6CF-encapsulated liposomes. Figure 2 shows how 6C
FIG. 3 shows the amount of f3cF released when F ribosomes were prepared and dispersed in physiological saline under shaking, and similarly, FIG. 3 shows the amount of 60F released when left at room temperature. $1 flash → -289+n O9+n (So I do so melon style 4,1
pqIl shivj4! Ishihi) - Kaichi +93m09+n
(1 -O-145+n O9m I
) So 1) Ring 1 distance pressure of ζ zome go plβJ Chi - 41J group $3 figure

Claims

【特許請求の範囲】１）薬物を含むＷ／Ｏ型エマルジョンから、溶媒を除去
して得られるリボソームを、その封入液よりも少なくと
も２０％以上高い浸透圧を有する水溶液に分散させてな
るリボソーム製剤。２）分散する水溶液の浸透圧が生体液とほぼ等張である
特許請求の範囲第１項記載の製剤。[Scope of Claims] 1) A ribosome preparation obtained by dispersing ribosomes obtained by removing the solvent from a W/O emulsion containing a drug in an aqueous solution having an osmotic pressure at least 20% higher than that of the encapsulating liquid. . 2) The preparation according to claim 1, wherein the osmotic pressure of the aqueous solution to be dispersed is approximately isotonic with that of the biological fluid.