JPS62186786A - 形質転換によるl−トリプトフアン生産性微生物及びl−トリプトフアン製造法 - Google Patents
形質転換によるl−トリプトフアン生産性微生物及びl−トリプトフアン製造法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は形質転換によシ、L −) IJブトファン生
産能が高められた微生物及びこれを用いたし−トリプト
ファンの製造法に関する。
産能が高められた微生物及びこれを用いたし−トリプト
ファンの製造法に関する。
〔従来技術゛及び発明刈解決しようとする問題点〕L−
トリプトファンは必須アミノ酸の一種として重要な化合
物であり特に栄養学的に不足し易い物質であるためその
経済的な製造法の開発が強く望まれており、そのため従
来より種々の方法が提案されているが、就中発酵法によ
る方法が注目を集め、その際特にその基礎となるL −
) IJブトファン生産性微生物の改良は重要な課題と
なっている。
トリプトファンは必須アミノ酸の一種として重要な化合
物であり特に栄養学的に不足し易い物質であるためその
経済的な製造法の開発が強く望まれており、そのため従
来より種々の方法が提案されているが、就中発酵法によ
る方法が注目を集め、その際特にその基礎となるL −
) IJブトファン生産性微生物の改良は重要な課題と
なっている。
有効な改良法として、Trp遺伝子を宿主菌の染色体D
NAに挿入(インテグレーション)することによシ遺伝
子増幅する方法があるが、この方法では遺伝子増幅の効
率が低い。そこで発明者らは、広い範囲にわたる宿主菌
を用いることができ、宿主菌内で導入遺伝子が安定に存
在し得るというインテグレーション法の長所を生かしさ
らに遺伝子増幅の効率を上げるべく研究を重ねた結果、
本発明をなすに至った。
NAに挿入(インテグレーション)することによシ遺伝
子増幅する方法があるが、この方法では遺伝子増幅の効
率が低い。そこで発明者らは、広い範囲にわたる宿主菌
を用いることができ、宿主菌内で導入遺伝子が安定に存
在し得るというインテグレーション法の長所を生かしさ
らに遺伝子増幅の効率を上げるべく研究を重ねた結果、
本発明をなすに至った。
本発明によれば、L−トリプトファンの生合成に関する
遺伝情報を有するDNA断片を複数個連結させた部分を
有するDNA分子を、バチルス属に属する微生物から選
ばれる宿主菌の染色体DNAに挿入することによシ、L
−)リットファン高生産性微生物が提供される。
遺伝情報を有するDNA断片を複数個連結させた部分を
有するDNA分子を、バチルス属に属する微生物から選
ばれる宿主菌の染色体DNAに挿入することによシ、L
−)リットファン高生産性微生物が提供される。
本発明によれば、更にこれらのL−1リプトフアン高生
産性微生物を培地に培養して培養物中にL−トリプトフ
ァンを生成せしめ、これを採取すること全特徴とするL
−トリプトファンが経済的に得られる製造法が提供され
る。
産性微生物を培地に培養して培養物中にL−トリプトフ
ァンを生成せしめ、これを採取すること全特徴とするL
−トリプトファンが経済的に得られる製造法が提供され
る。
以下に本発明の微生物とその取得方法及びこれ全周いた
L −トIJブトファンの製造法について更に詳細に説
明する。
L −トIJブトファンの製造法について更に詳細に説
明する。
本発明におけるL −トIJブトファンの生合成に関す
る遺伝情報を有するDNA断片は、適当な微生物の染色
体DNAから適当な制限酵素によって切シ出されたもの
が用いられるが、原則としてその由来については制限は
ない。一般には、L −) IJブトファン生産能を有
する微生物を用いるが、L−トリプトファン生合成系の
一部酵素の欠損等の理由によ、9.L−トリプトファン
生産能を有しない微生物を用いることも何らさしつかえ
ない。例えば、土壌や他の天然物から分離されるL −
トリプトファン生産能を有する野性法は勿論のこと、そ
れらを紫外線照射や化学物質による処理をして得られる
突然変異株或いは遺伝子組換え技術を用いて得られる組
み換えDNA等いずれでもよい。尚、この場合、DNA
断片は、L −トリプトファンの生合成に関する遺伝情
報以外のDNA部分を含むこともあり得るが、その部分
が、L−トリプトファンの生合成に悪影響を及ぼさない
限り用いることができる。また、DNA断片は、L−ト
リプトファンの生合成に関する遺伝情報のすべてを有す
る必要はなく、その一部分のみを有しているものでもか
まわない。
る遺伝情報を有するDNA断片は、適当な微生物の染色
体DNAから適当な制限酵素によって切シ出されたもの
が用いられるが、原則としてその由来については制限は
ない。一般には、L −) IJブトファン生産能を有
する微生物を用いるが、L−トリプトファン生合成系の
一部酵素の欠損等の理由によ、9.L−トリプトファン
生産能を有しない微生物を用いることも何らさしつかえ
ない。例えば、土壌や他の天然物から分離されるL −
トリプトファン生産能を有する野性法は勿論のこと、そ
れらを紫外線照射や化学物質による処理をして得られる
突然変異株或いは遺伝子組換え技術を用いて得られる組
み換えDNA等いずれでもよい。尚、この場合、DNA
断片は、L −トリプトファンの生合成に関する遺伝情
報以外のDNA部分を含むこともあり得るが、その部分
が、L−トリプトファンの生合成に悪影響を及ぼさない
限り用いることができる。また、DNA断片は、L−ト
リプトファンの生合成に関する遺伝情報のすべてを有す
る必要はなく、その一部分のみを有しているものでもか
まわない。
また、DNA断片は宿主菌の染色体DNAと相同性が高
いほうが望ましいが、DNA分子の他の部分と宿主菌の
染色体DNAの相同性が高い場合は、特に相同性が高い
必要はない。
いほうが望ましいが、DNA分子の他の部分と宿主菌の
染色体DNAの相同性が高い場合は、特に相同性が高い
必要はない。
このようなL−トリプトファンの生合成に関する遺伝情
報を有する染色体DNA断片中有する微生物としては、
例えば、バチルス・アミロリクイファシェンス、バチル
ス・アミロリティカス、バチルス・アルカロフィラス、
バチルス・コアギユランス、バチルス・ライケニホルミ
ス、バチルス・ナラトウ、バチルス・スフチルス、バチ
ルス・ステアロサーモフィラス等のバチルス属に属する
微生物や、それらの変異株など、およびそれらを親株と
して遺伝子組み換えによって育種した株等が掲げられる
。
報を有する染色体DNA断片中有する微生物としては、
例えば、バチルス・アミロリクイファシェンス、バチル
ス・アミロリティカス、バチルス・アルカロフィラス、
バチルス・コアギユランス、バチルス・ライケニホルミ
ス、バチルス・ナラトウ、バチルス・スフチルス、バチ
ルス・ステアロサーモフィラス等のバチルス属に属する
微生物や、それらの変異株など、およびそれらを親株と
して遺伝子組み換えによって育種した株等が掲げられる
。
また、これらDNAよりDNA断片を切出すのに用いら
れる制限酵素としては特に制限はないが、目的のDNA
断片中に切断部位が少ないほうが望ましく、例えば、E
coRl 、 BamHi 、 5alI、5acl
。
れる制限酵素としては特に制限はないが、目的のDNA
断片中に切断部位が少ないほうが望ましく、例えば、E
coRl 、 BamHi 、 5alI、5acl
。
pvull、XhoI 1XbaI、Mbol 、 M
luI等があげられる。
luI等があげられる。
本発明において、宿主菌内で自己複製しないベクターと
しては所謂宿主−村りター系として成り立つものであれ
ばいずれでもよく、例えば、Co IEI、psclo
l、pBR325及びpBR328等の大腸菌由来のプ
ラスミドがあげられる。形質転換菌の取得を容易にする
ため、宿主菌としてTrp遺伝子の一部が変異してトリ
プトファン要求性になった株、例えばバチルス5D−5
3(特開昭59−170047)。
しては所謂宿主−村りター系として成り立つものであれ
ばいずれでもよく、例えば、Co IEI、psclo
l、pBR325及びpBR328等の大腸菌由来のプ
ラスミドがあげられる。形質転換菌の取得を容易にする
ため、宿主菌としてTrp遺伝子の一部が変異してトリ
プトファン要求性になった株、例えばバチルス5D−5
3(特開昭59−170047)。
VOTO531(東京大学応用微生物研究所)等を用い
ることができる。あるいは、導入するDNA分子に選択
可能な遺伝子マーカーを組み込むことによっても形質転
換菌を容易に選択できる。ただし、これらはあくまで選
択を容易にする方法であり、本発明においては必ずしも
必須の要件ではない。
ることができる。あるいは、導入するDNA分子に選択
可能な遺伝子マーカーを組み込むことによっても形質転
換菌を容易に選択できる。ただし、これらはあくまで選
択を容易にする方法であり、本発明においては必ずしも
必須の要件ではない。
本発明の方法において用いる選択可能な遺伝子マーカー
とは、宿主菌内で発現するものであればいずれもよく、
−例をあげると次のようなものがある。薬剤耐性遺伝子
、アミノ酸生合成遺伝子、核酸生合成遺伝子、ビタミン
生合成遺伝子、その他の生体内物質の生合成遺伝子など
、薬剤耐性遺伝子の例としては、クロラムフェニコール
耐性、テトラサイクリン耐性、エリスロマイシン耐性、
カナマイシン耐性、ネオマイシン耐性、ストレプトマイ
シン耐性、ペニシリン耐性、リンコマイシン耐性などが
ある。
とは、宿主菌内で発現するものであればいずれもよく、
−例をあげると次のようなものがある。薬剤耐性遺伝子
、アミノ酸生合成遺伝子、核酸生合成遺伝子、ビタミン
生合成遺伝子、その他の生体内物質の生合成遺伝子など
、薬剤耐性遺伝子の例としては、クロラムフェニコール
耐性、テトラサイクリン耐性、エリスロマイシン耐性、
カナマイシン耐性、ネオマイシン耐性、ストレプトマイ
シン耐性、ペニシリン耐性、リンコマイシン耐性などが
ある。
DNA分子を導入すべき宿主菌としては、その染色体D
NAが導入するDNA分子と相同性を有するものであれ
ば原則として如何なるものでも良いが、実際上は本発明
の本来の目的である醗酵法によるL −トIJブトファ
ンの製造に適した微生物であることが必要であり、かか
る観点から病原菌及び工業的使用の際管理が繁雑なもの
や使用不能なものは除外される。実用的には培養が容易
で、工業的に実際に使用の実績もあるバチルス属に属す
る微生物が用いられる。好ましくは、トリプトファンの
生成蓄積により微生物固有のトリプトファン生合成のフ
ィードバック抑制機構の解除された菌、例工ば、トリプ
トファンアナログ(5−フルオロトリプトファン、5−
メチルトリプトファン等)耐性菌であり、代表的なもの
を例示すれば、例えば、特開昭48−18828、同4
9−2’0391、同49−85289、同51−64
921、同53−1358、同53−39517、同5
6−92796、同58−94391、同58−107
190、同58−107193、同58−107194
、同58−107195、同58−138389、同5
8−220693、同59−120091、同59−1
30181等に記載の菌が掲げられる。
NAが導入するDNA分子と相同性を有するものであれ
ば原則として如何なるものでも良いが、実際上は本発明
の本来の目的である醗酵法によるL −トIJブトファ
ンの製造に適した微生物であることが必要であり、かか
る観点から病原菌及び工業的使用の際管理が繁雑なもの
や使用不能なものは除外される。実用的には培養が容易
で、工業的に実際に使用の実績もあるバチルス属に属す
る微生物が用いられる。好ましくは、トリプトファンの
生成蓄積により微生物固有のトリプトファン生合成のフ
ィードバック抑制機構の解除された菌、例工ば、トリプ
トファンアナログ(5−フルオロトリプトファン、5−
メチルトリプトファン等)耐性菌であり、代表的なもの
を例示すれば、例えば、特開昭48−18828、同4
9−2’0391、同49−85289、同51−64
921、同53−1358、同53−39517、同5
6−92796、同58−94391、同58−107
190、同58−107193、同58−107194
、同58−107195、同58−138389、同5
8−220693、同59−120091、同59−1
30181等に記載の菌が掲げられる。
上記宿主菌の形質転換は、公知の方法、例えば、コンピ
ーテントセル法[J、Bacteria181,741
(1961)]或いはプロトプラスト法1: Mo1e
c、gen * Genet 。
ーテントセル法[J、Bacteria181,741
(1961)]或いはプロトプラスト法1: Mo1e
c、gen * Genet 。
168.111(1979)E等によって行なわれる。
以下に本発明のL −) IJブトファン高生産性微生
物について、代表的な例を示し、更に具体的に説明する
。但しこれらは単なる例示であシ、本発明はこれらのみ
に限られない。
物について、代表的な例を示し、更に具体的に説明する
。但しこれらは単なる例示であシ、本発明はこれらのみ
に限られない。
プラスミドpsD2961 (特願昭59−20704
5号参照)を制限酵素Hindllrで部分切断し、T
4ファージリガーゼを用いて再結合させる。このDNA
を用い、塩化カルシウム処理した大腸菌C600を常法
により形質転換し、トリプトファン非要求性でアンピシ
リン耐性、テトラサイクリン感受性の形質転換株を選択
した。これらの形質転換株よりプラスミドを常法により
分離精製し、第1図に示すようなプラスミドpsD31
71 ’に得た。このプラスミドを用いて各種トリプト
ファン要求株(trpA、trpB 、 trpC、t
rpDまたはtrpE等の突然変異株)を形質転換した
ところ、全てにトリプトファン非要求性の形質転換菌が
高頻度に出現することからこの短小化されたDNAもト
リプトファンの生合成を調整する遺伝情報を有すると考
えられる。
5号参照)を制限酵素Hindllrで部分切断し、T
4ファージリガーゼを用いて再結合させる。このDNA
を用い、塩化カルシウム処理した大腸菌C600を常法
により形質転換し、トリプトファン非要求性でアンピシ
リン耐性、テトラサイクリン感受性の形質転換株を選択
した。これらの形質転換株よりプラスミドを常法により
分離精製し、第1図に示すようなプラスミドpsD31
71 ’に得た。このプラスミドを用いて各種トリプト
ファン要求株(trpA、trpB 、 trpC、t
rpDまたはtrpE等の突然変異株)を形質転換した
ところ、全てにトリプトファン非要求性の形質転換菌が
高頻度に出現することからこの短小化されたDNAもト
リプトファンの生合成を調整する遺伝情報を有すると考
えられる。
一方、psD3051 (特願昭60−3158号参照
)をgcoRIで部分切断、5allで完全切断し、E
coRISaIIで切断したpsD3171と混合し、
T47フージリガーゼを用いて結合させる。このDNA
を用いてバチルスズプチルスBD224 (trpC2
thr−5recE4)をコンピテントセル法により形
質転換し、クロラムフェニコール耐性でかつTrp非要
求性を示す形質転換菌を取得する。該形質転換菌から組
換えプラスミドを常法により分離精製し、制限酵素地図
を作成したところ、第2図のような制限酵素地図を持つ
プラスミドが得られた。このプラスミド(psD365
1と称する)にはpsD3051の5al(切断点とE
coRI切断点のうちの一方の間に約4.6メガダレト
ンのDNAが挿入されていた。この挿入DNAは各種、
トリプトファン要求株(t′rpA 、 trpB 5
trpc 、 trpD 、またばtrpE等の突然変
異株)を受容菌としてpsD3651を供与体DNAと
した時、全てにTrp非要求性の形質転換菌が高頻度に
出現せしめる。ことがらTrp遺伝子を含むと考えられ
る。次に、psD3171をEcoRIで切断し、同じ
(EeoRIで切断したpsD3651と混合し、T4
ファージリガーゼを用いて結合させる。このDNA i
用い、塩化カルシウム処理した大腸菌C600株を常法
により形質転換し、クロラムフェニコール耐性、アンピ
シリン耐性でかつTrp非要求性を示す株を取得した。
)をgcoRIで部分切断、5allで完全切断し、E
coRISaIIで切断したpsD3171と混合し、
T47フージリガーゼを用いて結合させる。このDNA
を用いてバチルスズプチルスBD224 (trpC2
thr−5recE4)をコンピテントセル法により形
質転換し、クロラムフェニコール耐性でかつTrp非要
求性を示す形質転換菌を取得する。該形質転換菌から組
換えプラスミドを常法により分離精製し、制限酵素地図
を作成したところ、第2図のような制限酵素地図を持つ
プラスミドが得られた。このプラスミド(psD365
1と称する)にはpsD3051の5al(切断点とE
coRI切断点のうちの一方の間に約4.6メガダレト
ンのDNAが挿入されていた。この挿入DNAは各種、
トリプトファン要求株(t′rpA 、 trpB 5
trpc 、 trpD 、またばtrpE等の突然変
異株)を受容菌としてpsD3651を供与体DNAと
した時、全てにTrp非要求性の形質転換菌が高頻度に
出現せしめる。ことがらTrp遺伝子を含むと考えられ
る。次に、psD3171をEcoRIで切断し、同じ
(EeoRIで切断したpsD3651と混合し、T4
ファージリガーゼを用いて結合させる。このDNA i
用い、塩化カルシウム処理した大腸菌C600株を常法
により形質転換し、クロラムフェニコール耐性、アンピ
シリン耐性でかつTrp非要求性を示す株を取得した。
該形質転換菌からi換えプラスミドを常法により分離精
製し、制限酵素地図を作成したところ、第3図のような
制限酵素地図を持つプラスミドpsDT391が得られ
た。
製し、制限酵素地図を作成したところ、第3図のような
制限酵素地図を持つプラスミドpsDT391が得られ
た。
次にpsDT391を用いて、IAM1521株由来の
5〜フルオロトリプトフアン耐性株バチルスアミロリク
イファシェンス5D30 (特開昭59−130181
号参照)を形質転換し、クロラムフェニコール耐性の形
質転換株を選択する。これらのクロラムフェニコール耐
性の形質転換株をアントラニル酸を含む液体培地中で培
養し、L −トIJブトファン生産性の向上した菌株を
選択し、バチルス5D1012を得た。この菌は工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第8622号と
して寄託されている。
5〜フルオロトリプトフアン耐性株バチルスアミロリク
イファシェンス5D30 (特開昭59−130181
号参照)を形質転換し、クロラムフェニコール耐性の形
質転換株を選択する。これらのクロラムフェニコール耐
性の形質転換株をアントラニル酸を含む液体培地中で培
養し、L −トIJブトファン生産性の向上した菌株を
選択し、バチルス5D1012を得た。この菌は工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第8622号と
して寄託されている。
この菌株の菌学的性質は原株バチルス・アミロリクイフ
ァシェンス5D30とクロラムフェニコール耐性である
こと及びL−トリプトファンの生産能力が高いことを除
いて実質的には同じである。
ァシェンス5D30とクロラムフェニコール耐性である
こと及びL−トリプトファンの生産能力が高いことを除
いて実質的には同じである。
得られた形質転換菌バチルス5D1012のL−)+7
プトフアンシンセターゼ活性の測定結果を示すと次のと
うりである。
プトフアンシンセターゼ活性の測定結果を示すと次のと
うりである。
菌 L−トリプトファンシンセター
ゼ活性5D30 100S
D1012 210これらの
菌に関してアントラニル酸(80ppm )存在下にお
けるスビディゼン最小培地で培養(37℃、1.5時間
)した時のL−トリプトファン蓄積結果を示す。
ゼ活性5D30 100S
D1012 210これらの
菌に関してアントラニル酸(80ppm )存在下にお
けるスビディゼン最小培地で培養(37℃、1.5時間
)した時のL−トリプトファン蓄積結果を示す。
菌 株 L−トリプトファン蓄積
(μg/−) バチルス嗜 アミロリクイ ファシェンス 5D−3034 バチルス 5D1012 73本発明方法に従
えば、バチルス5D1012 ’にアントラニル酸又は
その塩を含む培地で培養することにaすL−トリプトフ
ァンを生成せしめることができる。栄養培地中のアント
ラニル酸又はその塩の濃度には特に限定はないが目的L
−トIJブトファンの収量、培養条件及び経済的観点
から一般には0.1〜3000mg/l、好ましくは1
00〜100100O/ Lの濃度とする。
(μg/−) バチルス嗜 アミロリクイ ファシェンス 5D−3034 バチルス 5D1012 73本発明方法に従
えば、バチルス5D1012 ’にアントラニル酸又は
その塩を含む培地で培養することにaすL−トリプトフ
ァンを生成せしめることができる。栄養培地中のアント
ラニル酸又はその塩の濃度には特に限定はないが目的L
−トIJブトファンの収量、培養条件及び経済的観点
から一般には0.1〜3000mg/l、好ましくは1
00〜100100O/ Lの濃度とする。
本発明方法において使用することのできる培地としては
、前記微生物が培養によシ増殖し得るものであれば任意
のものでよく、例えば、炭素源としては、ブドウ糖、糖
蜜、蔗糖、澱粉、澱粉糖化液、セルロース分解物等の糖
類、酢酸、エチルアルコール、グリセリンなど、窒素源
としては、アンモニア、硫安、塩安、硝安、燐安なとの
アンモニウム塩や尿素、硝酸塩等が適宜使用される。無
機塩としては燐酸、カリウム、マグネシウム、マンガン
等の塩類、例えば燐酸アンモニウム、燐酸カリウム、燐
酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マ
ンガン、苛性カリ等の工業的薬品で良く、他に微量元素
としてカルシウム、亜鉛、硼素、銅、コバルト、モリブ
デン等の塩類を添加してもよく、また微量有機栄養素と
してビタミン、アミノ酸、核酸関連物質等は菌の成育上
特に必要ではないが、これらを添加したり、肉エキス、
酵母エキス、コーンステイープリカー、ヘフトン等の有
機物を添加してもよい。アントラニル酸はナトリウム塩
、カリウム塩、アンモニウム塩等の水溶液や遊離酸のエ
タノール又はメタノール溶液として添加すれば良い。
、前記微生物が培養によシ増殖し得るものであれば任意
のものでよく、例えば、炭素源としては、ブドウ糖、糖
蜜、蔗糖、澱粉、澱粉糖化液、セルロース分解物等の糖
類、酢酸、エチルアルコール、グリセリンなど、窒素源
としては、アンモニア、硫安、塩安、硝安、燐安なとの
アンモニウム塩や尿素、硝酸塩等が適宜使用される。無
機塩としては燐酸、カリウム、マグネシウム、マンガン
等の塩類、例えば燐酸アンモニウム、燐酸カリウム、燐
酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マ
ンガン、苛性カリ等の工業的薬品で良く、他に微量元素
としてカルシウム、亜鉛、硼素、銅、コバルト、モリブ
デン等の塩類を添加してもよく、また微量有機栄養素と
してビタミン、アミノ酸、核酸関連物質等は菌の成育上
特に必要ではないが、これらを添加したり、肉エキス、
酵母エキス、コーンステイープリカー、ヘフトン等の有
機物を添加してもよい。アントラニル酸はナトリウム塩
、カリウム塩、アンモニウム塩等の水溶液や遊離酸のエ
タノール又はメタノール溶液として添加すれば良い。
本発明方法における培養は好気的条件下に、例えば通気
攪拌や往復振盪方法によって培養することができる。あ
るいは固定化菌体法なども用いることができるのはいう
までもない。培養条件は、特に限定はないが、一般的に
言えば、温度30〜45℃、PI(6,0〜8.0及び
15〜60時間程度の条件で実施する。
攪拌や往復振盪方法によって培養することができる。あ
るいは固定化菌体法なども用いることができるのはいう
までもない。培養条件は、特に限定はないが、一般的に
言えば、温度30〜45℃、PI(6,0〜8.0及び
15〜60時間程度の条件で実施する。
培養液又は培養物からの目的のL −) IJブトファ
ンの採取方法は慣用方法に従って行うことができる。例
えば、培養液を遠心分離し、その上清からイオン交換樹
脂処理法、活性炭処理法などの操作を適宜組み合せてL
−ト17プトフアンを単離することができる。
ンの採取方法は慣用方法に従って行うことができる。例
えば、培養液を遠心分離し、その上清からイオン交換樹
脂処理法、活性炭処理法などの操作を適宜組み合せてL
−ト17プトフアンを単離することができる。
実施例
以下に本発明の詳細な説明するが、本発明の範囲をこれ
らの実施例に限定するものでないことはいうまでもない
。
らの実施例に限定するものでないことはいうまでもない
。
例 1
グルコース5%、硫安0.2%、K2HPO41゜4%
、KI(2PO40,6%、クエン酸ナトリウム・2H
2o1g、MgSO4・7H2o0.02%、FeSO
4・77H2O1pp及びMnSO41Ppm’含む液
体借地(、H7,0)2Aにアントラニル酸800 p
pm f添加し、これに上で得たバチルス5D1012
を植菌し、35℃で5tのジャーファーメンタ−で通気
攪拌培養した。
、KI(2PO40,6%、クエン酸ナトリウム・2H
2o1g、MgSO4・7H2o0.02%、FeSO
4・77H2O1pp及びMnSO41Ppm’含む液
体借地(、H7,0)2Aにアントラニル酸800 p
pm f添加し、これに上で得たバチルス5D1012
を植菌し、35℃で5tのジャーファーメンタ−で通気
攪拌培養した。
培養中、アントラニル酸濃度が50 ppmまで減少し
た時点でアントラニル酸濃度が約1000 ppmにな
るように適宜追加添加し、また培養途中グルコースを1
00g追加し、更にアンモニア水の添加により、借地の
、Hを7.0±0.4に保ちながら15時間培養した。
た時点でアントラニル酸濃度が約1000 ppmにな
るように適宜追加添加し、また培養途中グルコースを1
00g追加し、更にアンモニア水の添加により、借地の
、Hを7.0±0.4に保ちながら15時間培養した。
L −ト!Jブトファンの蓄積は9.99/lで平行運
転したバチルスアミロリクイファシェンス5D30株の
2.11倍を示した。
転したバチルスアミロリクイファシェンス5D30株の
2.11倍を示した。
第1図はpsD3171 、第2図はpsD3651及
び第3図はpsDT391のそれぞれ制限酵素地図を示
す。
び第3図はpsDT391のそれぞれ制限酵素地図を示
す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)L−トリプトファンの生合成に関する遺伝情報を有
するDNA断片を複数個連結させた部分を有するDNA
分子を用い、該DNA分子をバチルス属に属する微生物
から選ばれる宿主菌の染色体DNAに挿入してなるL−
トリプトファン生産性形質転換菌。 2)宿主菌がトリプトファンアナログ耐性を有すること
を特徴とする特許請求の範囲第1項に記載のL−トリプ
トファン生産性形質転換菌。 3)特許請求の範囲第1項に記載の形質転換菌を培地に
培養して培養物中にL−トリプトファンを生成せしめこ
れを採取することを特徴とするL−トリプトファンの製
造法。 4)培地がアントラニル酸またはその塩を含むことを特
徴とする特許請求の範囲第3項に記載のL−トリプトフ
ァンの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2802886A JPS62186786A (ja) | 1986-02-13 | 1986-02-13 | 形質転換によるl−トリプトフアン生産性微生物及びl−トリプトフアン製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2802886A JPS62186786A (ja) | 1986-02-13 | 1986-02-13 | 形質転換によるl−トリプトフアン生産性微生物及びl−トリプトフアン製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62186786A true JPS62186786A (ja) | 1987-08-15 |
Family
ID=12237289
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2802886A Pending JPS62186786A (ja) | 1986-02-13 | 1986-02-13 | 形質転換によるl−トリプトフアン生産性微生物及びl−トリプトフアン製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS62186786A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003010334A1 (de) * | 2001-07-10 | 2003-02-06 | Apogene Biotechnologie Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur identifizierung von leserastermutationen |
-
1986
- 1986-02-13 JP JP2802886A patent/JPS62186786A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003010334A1 (de) * | 2001-07-10 | 2003-02-06 | Apogene Biotechnologie Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur identifizierung von leserastermutationen |
US7368235B2 (en) | 2001-07-10 | 2008-05-06 | Apogene Biotechnologie Gmbh & Co. Kg | Method for identifying reading frame mutations |
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