JPS62186786A - 形質転換によるｌ−トリプトフアン生産性微生物及びｌ−トリプトフアン製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は形質転換によシ、Ｌ　−）　ＩＪブトファン生
産能が高められた微生物及びこれを用いたし−トリプト
ファンの製造法に関する。

〔従来技術゛及び発明刈解決しようとする問題点〕Ｌ−
トリプトファンは必須アミノ酸の一種として重要な化合
物であり特に栄養学的に不足し易い物質であるためその
経済的な製造法の開発が強く望まれており、そのため従
来より種々の方法が提案されているが、就中発酵法によ
る方法が注目を集め、その際特にその基礎となるＬ　−
）　ＩＪブトファン生産性微生物の改良は重要な課題と
なっている。

有効な改良法として、Ｔｒｐ遺伝子を宿主菌の染色体Ｄ
ＮＡに挿入（インテグレーション）することによシ遺伝
子増幅する方法があるが、この方法では遺伝子増幅の効
率が低い。そこで発明者らは、広い範囲にわたる宿主菌
を用いることができ、宿主菌内で導入遺伝子が安定に存
在し得るというインテグレーション法の長所を生かしさ
らに遺伝子増幅の効率を上げるべく研究を重ねた結果、
本発明をなすに至った。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明によれば、Ｌ−トリプトファンの生合成に関する
遺伝情報を有するＤＮＡ断片を複数個連結させた部分を
有するＤＮＡ分子を、バチルス属に属する微生物から選
ばれる宿主菌の染色体ＤＮＡに挿入することによシ、Ｌ
−）リットファン高生産性微生物が提供される。

本発明によれば、更にこれらのＬ−１リプトフアン高生
産性微生物を培地に培養して培養物中にＬ−トリプトフ
ァンを生成せしめ、これを採取すること全特徴とするＬ
−トリプトファンが経済的に得られる製造法が提供され
る。

以下に本発明の微生物とその取得方法及びこれ全周いた
Ｌ　−トＩＪブトファンの製造法について更に詳細に説
明する。

本発明におけるＬ　−トＩＪブトファンの生合成に関す
る遺伝情報を有するＤＮＡ断片は、適当な微生物の染色
体ＤＮＡから適当な制限酵素によって切シ出されたもの
が用いられるが、原則としてその由来については制限は
ない。一般には、Ｌ　−）　ＩＪブトファン生産能を有
する微生物を用いるが、Ｌ−トリプトファン生合成系の
一部酵素の欠損等の理由によ、９．Ｌ−トリプトファン
生産能を有しない微生物を用いることも何らさしつかえ
ない。例えば、土壌や他の天然物から分離されるＬ　−
トリプトファン生産能を有する野性法は勿論のこと、そ
れらを紫外線照射や化学物質による処理をして得られる
突然変異株或いは遺伝子組換え技術を用いて得られる組
み換えＤＮＡ等いずれでもよい。尚、この場合、ＤＮＡ
断片は、Ｌ　−トリプトファンの生合成に関する遺伝情
報以外のＤＮＡ部分を含むこともあり得るが、その部分
が、Ｌ−トリプトファンの生合成に悪影響を及ぼさない
限り用いることができる。また、ＤＮＡ断片は、Ｌ−ト
リプトファンの生合成に関する遺伝情報のすべてを有す
る必要はなく、その一部分のみを有しているものでもか
まわない。

また、ＤＮＡ断片は宿主菌の染色体ＤＮＡと相同性が高
いほうが望ましいが、ＤＮＡ分子の他の部分と宿主菌の
染色体ＤＮＡの相同性が高い場合は、特に相同性が高い
必要はない。

このようなＬ−トリプトファンの生合成に関する遺伝情
報を有する染色体ＤＮＡ断片中有する微生物としては、
例えば、バチルス・アミロリクイファシェンス、バチル
ス・アミロリティカス、バチルス・アルカロフィラス、
バチルス・コアギユランス、バチルス・ライケニホルミ
ス、バチルス・ナラトウ、バチルス・スフチルス、バチ
ルス・ステアロサーモフィラス等のバチルス属に属する
微生物や、それらの変異株など、およびそれらを親株と
して遺伝子組み換えによって育種した株等が掲げられる
。

また、これらＤＮＡよりＤＮＡ断片を切出すのに用いら
れる制限酵素としては特に制限はないが、目的のＤＮＡ
断片中に切断部位が少ないほうが望ましく、例えば、Ｅ
ｃｏＲｌ　、　ＢａｍＨｉ　、　　５ａｌＩ、５ａｃｌ
。

ｐｖｕｌｌ、ＸｈｏＩ　１ＸｂａＩ、Ｍｂｏｌ　、　Ｍ
ｌｕＩ等があげられる。

本発明において、宿主菌内で自己複製しないベクターと
しては所謂宿主−村りター系として成り立つものであれ
ばいずれでもよく、例えば、Ｃｏ　ＩＥＩ、ｐｓｃｌｏ
ｌ、ｐＢＲ３２５及びｐＢＲ３２８等の大腸菌由来のプ
ラスミドがあげられる。形質転換菌の取得を容易にする
ため、宿主菌としてＴｒｐ遺伝子の一部が変異してトリ
プトファン要求性になった株、例えばバチルス５Ｄ−５
３（特開昭５９−１７００４７）。

ＶＯＴＯ５３１（東京大学応用微生物研究所）等を用い
ることができる。あるいは、導入するＤＮＡ分子に選択
可能な遺伝子マーカーを組み込むことによっても形質転
換菌を容易に選択できる。ただし、これらはあくまで選
択を容易にする方法であり、本発明においては必ずしも
必須の要件ではない。

本発明の方法において用いる選択可能な遺伝子マーカー
とは、宿主菌内で発現するものであればいずれもよく、
−例をあげると次のようなものがある。薬剤耐性遺伝子
、アミノ酸生合成遺伝子、核酸生合成遺伝子、ビタミン
生合成遺伝子、その他の生体内物質の生合成遺伝子など
、薬剤耐性遺伝子の例としては、クロラムフェニコール
耐性、テトラサイクリン耐性、エリスロマイシン耐性、
カナマイシン耐性、ネオマイシン耐性、ストレプトマイ
シン耐性、ペニシリン耐性、リンコマイシン耐性などが
ある。

ＤＮＡ分子を導入すべき宿主菌としては、その染色体Ｄ
ＮＡが導入するＤＮＡ分子と相同性を有するものであれ
ば原則として如何なるものでも良いが、実際上は本発明
の本来の目的である醗酵法によるＬ　−トＩＪブトファ
ンの製造に適した微生物であることが必要であり、かか
る観点から病原菌及び工業的使用の際管理が繁雑なもの
や使用不能なものは除外される。実用的には培養が容易
で、工業的に実際に使用の実績もあるバチルス属に属す
る微生物が用いられる。好ましくは、トリプトファンの
生成蓄積により微生物固有のトリプトファン生合成のフ
ィードバック抑制機構の解除された菌、例工ば、トリプ
トファンアナログ（５−フルオロトリプトファン、５−
メチルトリプトファン等）耐性菌であり、代表的なもの
を例示すれば、例えば、特開昭４８−１８８２８、同４
９−２’０３９１、同４９−８５２８９、同５１−６４
９２１、同５３−１３５８、同５３−３９５１７、同５
６−９２７９６、同５８−９４３９１、同５８−１０７
１９０、同５８−１０７１９３、同５８−１０７１９４
、同５８−１０７１９５、同５８−１３８３８９、同５
８−２２０６９３、同５９−１２００９１、同５９−１
３０１８１等に記載の菌が掲げられる。

上記宿主菌の形質転換は、公知の方法、例えば、コンピ
ーテントセル法［Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉａ１８１，７４１
（１９６１）］或いはプロトプラスト法１：　Ｍｏ１ｅ
ｃ、ｇｅｎ　＊　Ｇｅｎｅｔ　。

１６８．１１１（１９７９）Ｅ等によって行なわれる。

以下に本発明のＬ　−）　ＩＪブトファン高生産性微生
物について、代表的な例を示し、更に具体的に説明する
。但しこれらは単なる例示であシ、本発明はこれらのみ
に限られない。

プラスミドｐｓＤ２９６１　（特願昭５９−２０７０４
５号参照）を制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｒで部分切断し、Ｔ
４ファージリガーゼを用いて再結合させる。このＤＮＡ
を用い、塩化カルシウム処理した大腸菌Ｃ６００を常法
により形質転換し、トリプトファン非要求性でアンピシ
リン耐性、テトラサイクリン感受性の形質転換株を選択
した。これらの形質転換株よりプラスミドを常法により
分離精製し、第１図に示すようなプラスミドｐｓＤ３１
７１　’に得た。このプラスミドを用いて各種トリプト
ファン要求株（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ　、　ｔｒｐＣ、ｔ
ｒｐＤまたはｔｒｐＥ等の突然変異株）を形質転換した
ところ、全てにトリプトファン非要求性の形質転換菌が
高頻度に出現することからこの短小化されたＤＮＡもト
リプトファンの生合成を調整する遺伝情報を有すると考
えられる。

一方、ｐｓＤ３０５１　（特願昭６０−３１５８号参照
）をｇｃｏＲＩで部分切断、５ａｌｌで完全切断し、Ｅ
ｃｏＲＩＳａＩＩで切断したｐｓＤ３１７１と混合し、
Ｔ４７フージリガーゼを用いて結合させる。このＤＮＡ
を用いてバチルスズプチルスＢＤ２２４　（ｔｒｐＣ２
ｔｈｒ−５ｒｅｃＥ４）をコンピテントセル法により形
質転換し、クロラムフェニコール耐性でかつＴｒｐ非要
求性を示す形質転換菌を取得する。該形質転換菌から組
換えプラスミドを常法により分離精製し、制限酵素地図
を作成したところ、第２図のような制限酵素地図を持つ
プラスミドが得られた。このプラスミド（ｐｓＤ３６５
１と称する）にはｐｓＤ３０５１の５ａｌ（切断点とＥ
ｃｏＲＩ切断点のうちの一方の間に約４．６メガダレト
ンのＤＮＡが挿入されていた。この挿入ＤＮＡは各種、
トリプトファン要求株（ｔ′ｒｐＡ　、　ｔｒｐＢ　５
ｔｒｐｃ　、　ｔｒｐＤ　、またばｔｒｐＥ等の突然変
異株）を受容菌としてｐｓＤ３６５１を供与体ＤＮＡと
した時、全てにＴｒｐ非要求性の形質転換菌が高頻度に
出現せしめる。ことがらＴｒｐ遺伝子を含むと考えられ
る。次に、ｐｓＤ３１７１をＥｃｏＲＩで切断し、同じ
（ＥｅｏＲＩで切断したｐｓＤ３６５１と混合し、Ｔ４
ファージリガーゼを用いて結合させる。このＤＮＡ　ｉ
用い、塩化カルシウム処理した大腸菌Ｃ６００株を常法
により形質転換し、クロラムフェニコール耐性、アンピ
シリン耐性でかつＴｒｐ非要求性を示す株を取得した。

該形質転換菌からｉ換えプラスミドを常法により分離精
製し、制限酵素地図を作成したところ、第３図のような
制限酵素地図を持つプラスミドｐｓＤＴ３９１が得られ
た。

次にｐｓＤＴ３９１を用いて、ＩＡＭ１５２１株由来の
５〜フルオロトリプトフアン耐性株バチルスアミロリク
イファシェンス５Ｄ３０　（特開昭５９−１３０１８１
号参照）を形質転換し、クロラムフェニコール耐性の形
質転換株を選択する。これらのクロラムフェニコール耐
性の形質転換株をアントラニル酸を含む液体培地中で培
養し、Ｌ　−トＩＪブトファン生産性の向上した菌株を
選択し、バチルス５Ｄ１０１２を得た。この菌は工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８６２２号と
して寄託されている。

この菌株の菌学的性質は原株バチルス・アミロリクイフ
ァシェンス５Ｄ３０とクロラムフェニコール耐性である
こと及びＬ−トリプトファンの生産能力が高いことを除
いて実質的には同じである。

得られた形質転換菌バチルス５Ｄ１０１２のＬ−）＋７
プトフアンシンセターゼ活性の測定結果を示すと次のと
うりである。

菌　　　　　　　　　　Ｌ−トリプトファンシンセター
ゼ活性５Ｄ３０　　　　　　　　　　　　　　１００Ｓ
Ｄ１０１２　　　　　　　　　　　　　２１０これらの
菌に関してアントラニル酸（８０ｐｐｍ　）存在下にお
けるスビディゼン最小培地で培養（３７℃、１．５時間
）した時のＬ−トリプトファン蓄積結果を示す。

菌　　　株　　　　　　　　　Ｌ−トリプトファン蓄積
（μｇ／−） バチルス嗜 アミロリクイ ファシェンス ５Ｄ−３０３４ バチルス ５Ｄ１０１２　　　　　　　　　　７３本発明方法に従
えば、バチルス５Ｄ１０１２　’にアントラニル酸又は
その塩を含む培地で培養することにａすＬ−トリプトフ
ァンを生成せしめることができる。栄養培地中のアント
ラニル酸又はその塩の濃度には特に限定はないが目的Ｌ
　−トＩＪブトファンの収量、培養条件及び経済的観点
から一般には０．１〜３０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１
００〜１００１００Ｏ／　Ｌの濃度とする。

本発明方法において使用することのできる培地としては
、前記微生物が培養によシ増殖し得るものであれば任意
のものでよく、例えば、炭素源としては、ブドウ糖、糖
蜜、蔗糖、澱粉、澱粉糖化液、セルロース分解物等の糖
類、酢酸、エチルアルコール、グリセリンなど、窒素源
としては、アンモニア、硫安、塩安、硝安、燐安なとの
アンモニウム塩や尿素、硝酸塩等が適宜使用される。無
機塩としては燐酸、カリウム、マグネシウム、マンガン
等の塩類、例えば燐酸アンモニウム、燐酸カリウム、燐
酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マ
ンガン、苛性カリ等の工業的薬品で良く、他に微量元素
としてカルシウム、亜鉛、硼素、銅、コバルト、モリブ
デン等の塩類を添加してもよく、また微量有機栄養素と
してビタミン、アミノ酸、核酸関連物質等は菌の成育上
特に必要ではないが、これらを添加したり、肉エキス、
酵母エキス、コーンステイープリカー、ヘフトン等の有
機物を添加してもよい。アントラニル酸はナトリウム塩
、カリウム塩、アンモニウム塩等の水溶液や遊離酸のエ
タノール又はメタノール溶液として添加すれば良い。

本発明方法における培養は好気的条件下に、例えば通気
攪拌や往復振盪方法によって培養することができる。あ
るいは固定化菌体法なども用いることができるのはいう
までもない。培養条件は、特に限定はないが、一般的に
言えば、温度３０〜４５℃、ＰＩ（６，０〜８．０及び
１５〜６０時間程度の条件で実施する。

培養液又は培養物からの目的のＬ　−）　ＩＪブトファ
ンの採取方法は慣用方法に従って行うことができる。例
えば、培養液を遠心分離し、その上清からイオン交換樹
脂処理法、活性炭処理法などの操作を適宜組み合せてＬ
　−ト１７プトフアンを単離することができる。

実施例 以下に本発明の詳細な説明するが、本発明の範囲をこれ
らの実施例に限定するものでないことはいうまでもない
。

例　　１ グルコース５％、硫安０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４１゜４％
、ＫＩ（２ＰＯ４０，６％、クエン酸ナトリウム・２Ｈ
２ｏ１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ｏ０．０２％、ＦｅＳＯ
４・７７Ｈ２Ｏ１ｐｐ及びＭｎＳＯ４１Ｐｐｍ’含む液
体借地（、Ｈ７，０）２Ａにアントラニル酸８００　ｐ
ｐｍ　ｆ添加し、これに上で得たバチルス５Ｄ１０１２
を植菌し、３５℃で５ｔのジャーファーメンタ−で通気
攪拌培養した。

培養中、アントラニル酸濃度が５０　ｐｐｍまで減少し
た時点でアントラニル酸濃度が約１０００　ｐｐｍにな
るように適宜追加添加し、また培養途中グルコースを１
００ｇ追加し、更にアンモニア水の添加により、借地の
、Ｈを７．０±０．４に保ちながら１５時間培養した。

Ｌ　−ト！Ｊブトファンの蓄積は９．９９／ｌで平行運
転したバチルスアミロリクイファシェンス５Ｄ３０株の
２．１１倍を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｓＤ３１７１　、第２図はｐｓＤ３６５１及
び第３図はｐｓＤＴ３９１のそれぞれ制限酵素地図を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）Ｌ−トリプトファンの生合成に関する遺伝情報を有
   するＤＮＡ断片を複数個連結させた部分を有するＤＮＡ
   分子を用い、該ＤＮＡ分子をバチルス属に属する微生物
   から選ばれる宿主菌の染色体ＤＮＡに挿入してなるＬ−
   トリプトファン生産性形質転換菌。 ２）宿主菌がトリプトファンアナログ耐性を有すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のＬ−トリプ
   トファン生産性形質転換菌。 ３）特許請求の範囲第１項に記載の形質転換菌を培地に
   培養して培養物中にＬ−トリプトファンを生成せしめこ
   れを採取することを特徴とするＬ−トリプトファンの製
   造法。 ４）培地がアントラニル酸またはその塩を含むことを特
   徴とする特許請求の範囲第３項に記載のＬ−トリプトフ
   ァンの製造法。