JPS6216499A - 抗リウマチ特異蛋白質モノクロ−ナル抗体および細胞株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、リウマチ特異蛋白質に対するモノクローナル
抗体、すなわち、抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル
抗体および抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体を
産生ずる細胞株に関するものである。

（従来の技術とその問題点） 慢性関節リウマチの診断は、現在アメリカリウマチ協会
の診断基準にしたがって行われているが、この診断基準
は医師の所見や患者主訴に負うところが多く、客観性、
定量性において満足できるものとはいえない。そのため
客観性、定量性に優れた診断法の開発に対する期待は非
常に大である。

ところで、リウマチ特異蛋白質は、小円ら（昭和５８年
９月第５６回日本生化学会）によって初めて報告された
、分子量１５０，０００〜１７０．０００の新規蛋白質
であり、蛋白変性剤を用いない２次元電気泳動法により
、等電点（蛋白の泳動位置に相当するｐＨをその蛋白の
等電点として）７．３〜７．８、移動度（アルブミンの
最先端部の移動度を１．０として）　０．３０〜０．４
５の範囲にスポットとして検出できる蛋白質であり、本
発明者らは、すでにリウマチ特異蛋白質を単離すること
に成功している（特願昭５９−１９１７５４）。このリ
ウマチ特異蛋白質は、慢性関節リウマチ患者血漿中に非
常に高頻度に認められるにもかかわらず、健常人や他の
疾患（癌、肝疾患、腎疾患など）患者血漿中には認めら
れないことが知られており、慢性関節リウマチの疾患特
異物質と考えられている。さらに、現在慢性関節リウマ
チの診断において盛んに測定されているリウマチ因子（
Ｒｅｕｍａｔｏｉｄ　　ｆ　ａｃｔｏｒ　：　ＲＦ　）
、免疫複合体（Ｉ　ｍｍｕｎｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　：　
Ｉ　Ｃ）あるいはＣ反応性蛋白質（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖ
ｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　：　ＣＲＰ　）とは異なる異常蛋
白質であるため、リウマチ特異蛋白質を測定することに
よって、ＲＦ、ＩＣやＣＲＰとは違った新たな臨床的情
報を得ることができる。

ところで、蛋白質の特異的検出法としては、免疫学的方
法によるものが現在量も優れた方法とされている。なぜ
なら、免疫学的方法は、感度、特異性、再現性、定量性
に優れており、かつ多数検体を短時間に測定でき、測定
手技も簡単であるため、一般の検査室で広く行うことが
できるからである。したがって、リウマチ特異蛋白質を
一般の検査室で客観的、定量的に、かつ特異的に測定す
るには、免疫学的測定法を確立することが重要である。

そして、この免疫学的測定法は、抗原・抗体反応を利用
するため、リウマチ特異蛋白質の免疫学的測定法を確立
するには、リウマチ特異蛋白質に対して特異的な抗体が
必要となる。

一方、動物の免疫機構を刺激するような異物（抗原）を
動物に注入した後、その動物の血清（すなわち、抗血清
）より得られる抗体は、免疫に使用した異物に対して高
い特異性をもつ抗体のみでなく、特異性の低い抗体や、
あるいは免疫に使用した異物中に混在した、目的とは異
なる他の異物に対して特異的な抗体をもまた含んでいる
。

さらに、その後の本発明者らの研究結果によれば、リウ
マチ特異蛋白質はヒ）　ＩｇＧと一部共通抗原性を有す
る蛋白質であることが判明した。したがって、リウマチ
特異蛋白質を動物に免疫して抗体を得る場合、ヒ）　Ｉ
ｇＧとの共通抗原性部分に対する抗体もまた混在し、得
られた抗体のリウマチ特異蛋白質に対する特異性は低く
なってしまう。

このため、抗血清をイオン交換クロマトグラフィー等を
行うことによって免疫グロブリン分画を回収して得られ
る抗リウマチ特異蛋白質抗体では、その特異性において
不十分であり、実用には適さない。

さらに、動物を免疫してその抗血清より特異抗体を精製
するならば、動物を免疫するために絶えず抗原となるリ
ウマチ特異蛋白質が必要であり、かっこのリウマチ特異
蛋白質の品質が変われば、当然免疫された動物から得ら
れる抗体も品質が変わってしまう。また、動物の個体間
でも得られる抗体の力価は異なり、したがって、安定し
た品質の抗体を得ることは困難である。

ところで、モロクローナル抗体は、抗血清より得られる
抗体が種々の抗体の混合物であるのに対して、ただ一種
類の抗体（すなわち、モロクローナル抗体）のみから成
るため、常に一定の抗原特異性を示す。このモノクロー
ナル抗体は、ミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　　
ら〔ネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ）。

２５６巻４９５〜４９７頁　１９７５年〕によって示さ
れた細胞融合法によって、抗体産生株を新たに形成せし
め、この抗体産生株より得られることが知られている。

あるいは、ある種のウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂ　ａ
ｒｒ　Ｖ　１ｒｕｓ）などを用いて、抗体産生能を有す
る正常細胞を長期培養可能な抗体産生株に変異させて、
その抗体産生株よりモノクローナル抗体を得ることも可
能である。

ミルシュタインらの方法をさらに詳しく説明するならば
、例えば、マウス等の免疫可能な動物を抗原で免疫し、
免疫成立後、その動物から牌臓等を外科的に取り出すこ
となどによって、抗体産生能を有する細胞を入手する。

この抗体産生能を有する細胞（リンパ球Ｂ細胞）と、あ
る種のマーカーを持つ無限増殖性細胞株（以下、単に親
株と称す）とを融合促進剤の存在下、あるいはある種の
ウィルスの存在下で融合する。ここで用いる親株のマー
カーとしては、一般にある種の成分を欠いた培養液中、
あるいはある種の成分を含む培養液中で生存できないこ
とがよく利用される。例えば、ＤＮＡ合成回路（サルベ
ージ回路）においてＤＮＡ合成に関与する酵素であるヒ
ポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフ
ェラーゼ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−Ｇｕａｎｉｎｅ
　　ＰｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌＴｒａｎｓｆｅｒａ
ｓｅ　：　ＨＧ　Ｐ　ＲＴ）あるいはチミジンキナーゼ
（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　　Ｋ　１ｎａｓｅ　：　Ｔ　Ｋ
　）欠損であることなどである。なぜなら、ＨＧＰＲＴ
やＴＫの酵素をもつ細胞では、ＤＮＡ合成回路（ｄｅ　
ｎｏ−ｖｏ回路）におけるＤＮＡ合成阻害物質であるア
ミノプテリンを含む培養液〔ヒポキサンチン・アミノブ
チリ７　・アミノ７　（Ｈｙｆｌｏｘａｎｔｈｉｎｅ　
ＡｇｉｎｏｐｔｅｒｉｎＴｈｙｍｉｄｉｎｅ　：　ＨＡ
　Ｔ　）を含む選別用培養液（ＨＡＴ培地）〕で培養す
ると、正常な細胞は、アミノプテリンによってＤＮＡ合
成回路（ｄｅ　ｎｏｖｏ回路）が阻害されても、ＨＧＰ
ＲＴあるいはＴＫ等の酵素によって、レスキュー回路（
ｒｅｓｃｕｅ　ｐａｔｈｗａｙ　）であるサルベージ回
路が働き、ＤＮＡ合成が行われる。それに対して、ＨＧ
ＰＲＴあるいはＴＫのような酵素を欠損した細胞では、
ＨＧＰＲＴあるいはＴＫ等の酵素によるサルベージ回路
が働かないため、アミノプテリンによってＤＮＡ合成回
路（ｄｅ　ｎｏｖｏ回路）が阻害されると、ＤＮＡ合成
は可能となり、よってＨＡＴ培地中では生存できないの
である。

このようにして親株と正常細胞である抗体産生能を有す
る細胞との融合“後、親株と融合細胞とを、親株が持つ
マーカーによって分離し、融合細胞のみを選択すること
ができる（融合しなかった抗体産生能を有する細胞は正
常細胞であるため、培養を続けることによって死滅して
しまう）。こうして得られた融合細胞より、目的とする
抗体を産生するただ一個の細胞より***増殖した細胞群
を選択する。この細胞群よりモノクローナル抗体は得る
ことができる。

（発明の目的） 本発明は、モノクローナル抗体技術を応用して、ヒトＩ
ｇＧとは交差反応しない、リウマチ特異蛋白質に対して
特異的に反応する抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル
抗体を産生ずる細胞株を新たに確立し、この細胞株より
抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体を得ることを
目的としている。

（発明の構成） 本発明者らが鋭意研究の末ついに確立に成功した抗体産
生株は、具体的に例を挙げるならば、次のようにして得
ることができる。すなわち、リウマチ特異蛋白質をフロ
イントの完全アジュバント等と共にＢＡＬＢ／Ｃマウス
に免疫し、免疫成立後、そのマウスより肺臓を外科的に
取り出すことによって抗体産生能を有する細胞を得る。

この細胞ト、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスのミエローマ細
胞由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株であるＰ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８−Ｕ１株（親株）を、融合促進剤の存在下で細胞融
合する。親株としては、この他にも多くの株が報告され
ており、それらの親株と、それに適したマウスの系統の
組合わせによる融合もまた可能である。融合促進剤とし
ては、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
が一般によく用いられている。あるいは融合促進剤とし
て、人工脂質少胞であるリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ
　）やセンダイウィルス（ＨＶＪ）を用いて細胞融合す
ることも可能である。さらに、これらの融合促進剤を用
いずに、細胞に電圧をかけることよって細胞融合する電
気融合法も知られている。親株としてＰ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８−Ｕ１株を用いて細胞融合した場合、融合の後、Ｈ
ＡＴ培地で培養することによって、抗体産生能を有する
細胞（正常細胞）とＰ３−Ｘ６３−Ａｇ　８−Ｕ　１と
から成る融合細胞のみを選択することができる。

目的とする抗体を産生ずる融合細胞（すなわち、抗体産
生株）は、融合細胞の培養上、清を用いて、特異抗体測
定のための免疫学的測定法によって選択できる。しかし
、本リウマチ特異蛋白質は免疫学的にヒト　ＩｇＧと非
常に類似した蛋白質であるため、先の細胞融合によって
得られた融合細胞の多くは、ヒト　ｒｇｃと交差反応性
を持つ抗体を産生ずる。それ故、抗体の特異性の検討は
、特にヒ）　ＩｇＧと交差反応性について、綿密に行う
必要である。

特異抗体の測定は、例えば、ポリスチレン製マイクロプ
レート等を固相として、特異抗原であるリウマチ特異蛋
白質または対照抗原であるリウマチ特異蛋白質以外のヒ
ト血漿蛋白質あるいは精製したヒ）　ＩｇＧを吸着させ
、次に、融合細胞培養上清を加えて反応させる免疫測定
法によって行うことができる。例を挙げて詳しく述べる
ならば、まずポリスチレン製マイクロプレートに蛋白質
を吸着させる。この時、蛋白質吸着用緩衝液としては、
一般に炭酸ナトリウム・炭酸水素ナトリウム緩衝液が多
く用いられている。あるいはリン酸緩衝液等を用いるこ
とも可能である。本発明者らの経験では、吸着の際の特
異抗原または対照抗原の濃度は１〜１０μｇ／ｍｅで十
分であった。この濃度以下でも、抗体濃度や以下の反応
条件を変えることによって、十分に測定できた。この炭
酸ナトリウム・炭酸水素ナトリウム緩衝液等で至適濃度
に調製された特異抗原または対照抗原を、ポリスチレン
製マイクロ）レートへ一定量ずつ加え、一定時間静置す
る。これは、４℃で一装置くのが最も一般的であるが、
その他、室温で２時間程度静置することも可能である。

あるいは３７℃で１時間静置によっても可能である。こ
うして抗原を感作したポリスチレン製マイクロプレート
を、例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液等によって
洗浄した後、融合細胞培養液中の抗体を一定時間反応さ
せる。上記と同様にしてポリスチレン製マイクロプレー
トを洗浄した後、あらかじめ決定しておいた希釈倍率に
希釈した酵素標識抗マウスイムノグロブリン（Ｉｇ）抗
体を加えて、ポリスチレン製マイクロプレート上で抗原
・抗体反応した抗体と反応させる。さらに上記と同様に
してポリスチレン製マイクロプレートを洗浄した後、酵
素基質を加えて酵素活性を測定する。ここで測定できた
酵素活性は、ポリスチレン製マイクロプレートに吸着し
た抗原と反応した、融合細胞培養液中の抗体の量を間接
的に示している。これによって、融合細胞培養液中の抗
体の特異性を測定できる。また、ここでは酵素標識抗マ
ウス抗体を用いた酵素免疫測定法について述べたが、こ
の他、ラジオアイソトープで標識した抗マウスＩｇ抗体
を用いて、同様の手技で行うことも可能である。

あるいはリウマチ特異蛋白質を含むリウマチ患者血漿等
を、蛋白変性剤を含まないで２次元電気泳動した後、ニ
トロセルロース膜に泳動蛋白を転写し、そのニトロセル
ロース膜上で、泳動蛋白と融合細胞培養液中の抗体とを
反応させるイムノブロッティング法によっても可能であ
る。この時、等電点（その蛋白の泳動位置に相当するｐ
Ｈをその蛋白の等電点として）７．３〜７．８、移動度
（アルブミンの最先端部の移動度を１．０として）　０
．３０〜０．４５の範囲に存在するりウマチ特異蛋白質
とのみ反応し、他の蛋白とは反応しない抗体を産生ずる
融合細胞を選択すればれよい。

例を挙げて本性をさらに詳しく述べるならば、蛋白変性
剤を含まない２次元電気泳動法はまず、リウマチ特異蛋
白質を含む血漿等をポリアクリルアミド・チューブゲル
を用いて等電点電気泳動する。次に、この等電点電気泳
動した血漿等を、ゲル濃度勾配をつけたポリアクリルア
ミド・スラブゲルで泳動する。こうして２次元電気泳動
した血漿等を、ポリアクリルアミド・スラブゲルからニ
トロセルロース膜等へ、ポリアクリルアミド・スラブゲ
ル上にニトロセルロース膜等を重ねて電圧をかけること
によって転写する。こうして泳動した血漿等を転写した
ニトロセルロース膜を、融合細胞培養上清に浸して、ニ
トロセルロース膜上に転写された血漿等の各蛋白質と、
融合細胞培養上清中に含まれるであろう抗体とを反応さ
せる。次に、あらかじめ至適濃度に調製した酵素標識抗
マウス抗体等を加えて、ニトロセルロース膜上に転写さ
れた血漿等の各蛋白質と反応した融合細胞培養上清中の
抗体とさらに反応させる。その後、ニトロセルロース膜
上に保持された酵素活性を測定することによって、ニト
ロセルロース膜上に転１写された血漿等の各蛋白質と反
応した融合細胞培養上清中の抗体を検出するのである。

その他、一般に用いられる抗体の特異的検出法によって
もできる。これらのスクリーニング法と、例えば、限界
希釈法やソフトアガーを用いる方法等によるクローニン
グ法との組合わせによって、最終的に目的とする抗体を
産生ずる単一の細胞クローンである抗体産生株（すなわ
ち、抗リウマチ特異蛋白質モロクローナル抗体産生株）
を確立できる。

こうして確立した抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル
抗体産生株より、抗リウマチ特異蛋白質モロクローナル
抗体は、次のようにして得ることができる。上記のよう
にして確立した抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗
体産生株を、例えば、プリスタン等であらかじめ刺激し
たマウスの腹腔に注入し、一定期間の後、その動物の腹
腔に溜った腹水を採取する。あるいは抗体産生株を培養
し、培養上清を採取する。このようにして採取した抗リ
ウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体を含む液から、通
常行われる抗体の精製方法によって精製し、抗リウマチ
特異蛋白質モノクローナル抗体を得ることができる。

例えば、腹水よりの抗リウマチ特異蛋白質モノクローナ
ル抗体の精製は、腹水に硫酸ナトリウム等通常塩析に用
いられる塩を加えて塩析し、得られた沈澱を遠心分離に
よって回収する。この沈澱を、リン酸緩衝液等のような
中性の緩衝液で溶解する。透析等によって、硫酸ナトリ
ウム等塩析に用いた塩を除去した後、イオン交換クロマ
トグラフィー等の通常行われる抗体の精製方法によって
、目的とする抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体
を含む分画を回収することによってできる。

あるいは培養上清から抗リウマチ特異蛋白質モノクロー
ナル抗体を得るには、濃縮の後、上記精製方法を行うか
、あるいは抗マウスＩｇ抗体もしくはプロティンＡを用
いたアフィニティークロマトグラフィーによって行うこ
とができる。

こうして得られた抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル
抗体は、イムノグロブリンＧ　（ＩｇＧ）あるいはイム
ノグロブリンＭ　ＣＩｇＭ）クラスであることが多い。

ＩｇＧクラスである場合、ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
　Ｄ　Ｓ）を用いたポリアクリルアミド電気泳動によっ
て、分子量およそ１５０．０００〜１６０．０００を示
し、あるいは、２メルカプトエタノール等の還元剤によ
って還元処理した後に、ＳＤＳを用いたポリアクリルア
ミド電気泳動によって分子量を測定した時、およそ２５
．０００と５０．０００の２種のサブユニットを示す。

（実施例） 次に、実施例を示してより詳細に説明する。

実施例１　　細胞融合 精製ＲＡ　Ｓ　Ｐ　０．３ｍｇをダルベツコのリン酸緩
衝生理食塩液（Ｄｕｌｂｅａｃｏｓ’　　Ｐ　Ｂ　Ｓ　
（−）　３０．５＋ｗｊｉ’に溶かした後、等量のフロ
イント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ　　ｃｏｎ＋ｐ
ｌｅｔｅ　　ａｄｊｕｖａｎｔ　、　Ｇｉｂｃｏ社製、
米国）を加えて十分に混和した。完全な油中水型エマル
ジョンとしたものをＢＡＬＢ／Ｃマウス背部皮下に注射
して免疫した。さらに、同様にして３週問おきに２度免
疫した。その１０日後に、ダルベツコのリン酸緩衝生理
食塩液０．５ｍｊ？に溶かした精製ＲＡ　Ｓ　Ｐ　０．
３Ｉ１ｇを腹腔に注入して免疫強化（ブースト）した。

最終免疫の３日後に肺臓を取り出し、溶血液（ｌｙｓｉ
ｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　：　　０．１６Ｍ　　塩化アンモ
ニウム液と０．１７Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ７，６５）と
を９：１に混ぜ、塩酸を適当量加えてｐＨ７，２とした
液〕にて溶血させた後、ハンクス液　（Ｈａｎｋ’　ｓ
液）にて十分に洗浄し、得られた細胞を抗体産生細胞と
した。

細胞融合は、上述のようにして得た抗体産生細胞（２Ｘ
　１０”個）と、ヒポキサンチン・グアニン・フォスフ
ォリボシル・トランスフェラーゼ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈ
ｉｎｅ　ｇｕａｎｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｂｏｓｙ
ｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：）ＩＧＰＲＴ）欠損株で
あるｐ　３−Ｘ６３−　Ａ　ｇ　８−Ｕｌ　　（２Ｘ１
０’個）とを十分に混合した後、ポリエチレングリコー
ル（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　：ＰＥ
Ｇ　（ＭＷ　４，０００）　、シグマ（Ｓｉｇｎ＋ａ）
社製、米国〕の存在下で融合した。すなわち、抗体産生
細胞とＰ　３−Ｘ６３−Ａｇ　８−Ｕ　１の混合物に、
ハンクス液　２゜８ＩＩｌｌ当りＰＥＧ２．Ｏｇを溶解
した液１．５ｍ　ｌを３７℃の湯浴中で加えて融合した
。融合操作後、十分に洗浄し、これらの細胞をヒポキサ
ンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ　）　１０−’Ｍｓ
アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎｅ　）　４　
Ｘｌ０−７Ｍ％チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）１．６
Ｘ１０−’Ｍ、ウシ胎児血清１０％を含むＲＰＭＩ−１
６４０培養液（以下、ＨＡＴ培地という）で培養するこ
とによって、融合細胞のみを選択した。

目的とする抗体を産生ずる細胞は、酵素免疫測定法によ
って次のようにして選択した。

（１）　　マイクロプレートの抗原感作免疫に用いた精
製リウマチ特異蛋白質（特異抗原）または市販の精製ヒ
トアルブミンあるいは精製ヒト免疫グロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）（対照抗原：いずれもマイルス（Ｍｉｌｅｓ）社製
、米国〕を、０．０２Ｍ炭酸ナトリウム・炭酸水素ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９，６）で蛋白濃度１０μｇ／ｎ／
！となるように調製した。この液をポリスチレン製マイ
クロプレートの各ウェルに１００μｌずつ加えて、蒸発
を防いで４℃で一晩静置し、蛋白質を吸着させた。

（２）　　−次反応 こうして物理吸着によって特異抗原または対照抗原を固
定したポリスチレン製マイクロプレート（以下、単にマ
イクロプレートと称す）を、リン酸緩衝生理食塩液（塩
化ナトリウム８．０　ｇ　／　７？、リン酸−カリウム
０．２ｇ／ｌ、リン酸二ナトリウム・７水塩２．１７ｇ
／Ａ’、塩化力’）つＬｏ、２ｇ／ｌ、ツイーン２０　
　（Ｔｗｅｅｎ　２０）　　０．５ｍ　（！　／　Ｉｌ
、アジ化ナトリウム０．２ｇ／ｌを含む液、ｐＨ７，４
、以下、ＰＢＳＴと称す）で洗浄した。このマイクロプ
レートに、融合細胞の培養上清（１０ｏμｌ／ウエル）
を加えて反応させた〔室温（２２〜２５℃であった）、
２時間〕。この時、培養上清中に、マイクロプレートに
固定した特異抗原または対照抗原との反応性を有する抗
体が存在すれば、その抗体は、抗原・抗体反応によって
マイクロプレート上に保持される。

（３）　二次反応 反応後、ＰＢＳＴによってマイクロプレートを洗浄した
。次に、あらかじめ決定した至適希釈倍数（この時は２
０００倍であった）にＰＢＳＴによって希釈したアルカ
リフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体〔マイルス
（Ｍｉｌｅｓ）社製、米国〕液を、マイクロプレートの
各ウェルに１００μβずつ添加して、室温（２２〜２５
℃であった）で２時間反応させた。このアルカリフォス
ファターゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体は、マイクロプレー
ト上に保持された培養上清中のマウスＩｇＧと反応する
。

（４）　　酵素活性の測定 二次反応後、ＰＢＳＴでマイクロプレートを洗浄した後
、マイクロプレート上に保持されたアルカリフォスファ
ターゼ活性を測定した。酵素基質であるパラニトロフェ
ニルリン酸ジシクロヘキシルアンモニウム塩（ｐ−Ｎ１
ｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＋Ｄｉ（ｃ
ｙｃｌｏｔｉｅｘｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）　５ａｌｔ　
）を、ジェタノールアミン緩衝液〔ジェタノールアミン
（Ｄｉ　−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ＞　　９７ｍ　ｌ
　／　ｌ　ｓ塩化マグネシウム・６水塩１００ｍｇ／　
ｌ　、アジ化ナトリウム０．２ｇ／Ｊを含む液を塩酸を
用いてｐＨ９，８に調製した液〕にて２ｍｇ／ｍｊ！と
なるように溶解した液を酵素基質溶液とした。この酵素
基質溶液をマイクロプレートの各ウェルに１００μβず
つ添加して、室温（２２〜２５℃であった）で１時間反
応させた。反応後、ＩＮ水酸化ナトリウム液を５０μｌ
ずつ各ウェルに加えて酵素反応を止めた。各ウェルの酵
素基質溶液の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定して
、酵素活性を測定した。この酵素活性は、マイクロプレ
ート上の特異抗原あるいは対照抗原と反応した、培養上
清中の抗体量を間接的に示している。

以上の測定法と、限界希釈法によるクローニングとを繰
り返して、目的とする抗体を産生ずる、単一の細胞由来
の細胞集団（すなわち、モノクローナルな新規雑種細胞
）を６クローン得た。これら６クローンの抗リウマチ特
異蛋白質モノクローナル抗体産生新規雑種細胞（以下、
単に新規雑種細胞という）の各クローンを５Ｓ−１，５
Ｓ−３゜５ｓ−４Ａ、　５ｓ−１４，５ｓ−１５，５ｓ
−１６、また、これらの各新規雑種細胞が産生ずる抗り
θマチ特異蛋白質モノクローナル抗体を、それぞれＳ−
１，Ｓ−３，５−４Ａ、５−１４．３−１５．３−１６
と呼ぶことにした。

実施例３−２で得た精製抗リウマチ特異蛋白質モノクロ
ーナル抗体を用いて、上述の酵素免疫測定法を行った結
果を第１図〜第３図に示す。第１図には５−４Ａ、！：
５−１４、第２図には５−１５と５−１６、第３図には
Ｓ−１とＳ−３の希釈曲線を示した。それぞれ縦軸に波
長４０５ｎｍにおける吸光度（すなわち、酵素活性）、
横軸に反応に加えた抗リウマチ特異蛋白質モノクローナ
ル抗体の濃度（１０Ｍｇ／ｍβから倍々希釈）を示す。

図中１は５−４Ａと精製リウマチ特異蛋白質との反応、
２は５−４Ａと精製ヒトアルブミンとの反応、３は５−
４Ａと精製ヒト　ＩｇＧとの反応、４は５−１４と精製
リウマチ特異蛋白質との反応、５は５−１４と精製ヒト
アルブミンとの反応、６は５−１４と精製ヒトＩｇＧと
の反応、７は５−１５と精製リウマチ特異蛋白質との反
応、８は５−１５と精製ヒトアルブミンとの反応、９は
５−１５と精製ヒトＩｇＧとの反応、１０は５−１６と
精製リウマチ特異蛋白質との反応、１１は５−１６と精
製ヒトアルブミンとの反応、１２は５−１６と精製ヒト
ＩｇＧとの反応、１３は５−１５と精製リウマチ特異蛋
白質との反応、１４はＳ−１と精製ヒトアルブミンとの
反応、１５はＳ−１と精製ヒト　ＩｇＧとの反応、１６
はＳ−３と精製リウマチ特異蛋白質との反応、１７はＳ
−３と精製ヒトアルブミンとの反応、１８はＳ３と精製
ヒト１ｇＧとの反応である。

ける吸光度より計算した。抗リウマチ特異蛋白質モノク
ローナル抗体と特異抗原との反応は、加えた抗リウマチ
特異蛋白質モノクローナル抗体の蛋白濃度と相関した吸
光度（すなわち、酵素活性）を示した。それに対して、
抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体と対照抗原と
の反応は、抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体の
種々の蛋白濃度で反応は認められなかった。以上より、
今回確立に成功した抗リウマチ特異蛋白質モノクローナ
ル抗体は、いずれもリウマチ特異蛋白質と特異的に反応
し、ヒトアルブミンやヒトＩｇＧとは反応しないことが
わかる。

実施例２　イムノブロッティング法によるモノクローナ
ル抗体の特異性の 確認 １、　２次元電気泳動 リウマチ特異蛋白質を含む血漿を、蛋白変性剤を加えず
に２次元電気泳動した。すなわち、まずポリアクリルア
ミド・チューブゲル（ゲルサイズ径３　ｍｍ　Ｘ　６．
５ｍｍ）にリウマチ特異蛋白質を含む血漿６μｌを加え
、０．０１Ｍリン酸と０．１４Ｎ水酸化ナトリウムとを
用いて、ｐＨ３，５〜１０の間で等電点電気泳動した（
定電圧２００Ｖ、　　１２０分）。

次に、このチューブゲルを４〜１７％の濃度勾配を持つ
ポリアクリルアミドスラブゲル（ゲルサイズ横７５×縦
６０Ｘ厚さ２．７ｍｍ）上に密着させた後、ｌ・リス・
グリシン緩衝液１　（トリスヒドロキシメチルアミノメ
タン０．０５Ｍ、グリシン０．３８４Ｍ、　ｐ　Ｈ８，
３）を用いて、定電流（ゲル当り３０ｍＡ）でおよそ１
８０分間泳動した〔泳動時間はブロムフェノールブルー
（Ｂ　Ｐ　Ｂ）と結合したアルブミンの泳動状態より判
断した〕。

２、　２次元電気泳動ゲルからニトロ セルロース膜への泳動蛋白質の 転写 転写用容器（イムノメゾイカ社製、製品名　水平型電気
泳動式トランスファー・プロッティング装置、日本）に
トリス・グリシン緩衝液２　（トリスヒドロキシメチル
アミノメタン０．０２５Ｍ、グリシン０．１９２Ｍ、　
ｐ　Ｈ８，３）を“おさえバット”が浸るまで入れた後
、おさえバットの上にろ紙をのせた。このろ紙の上に、
１で２次元電気泳動したポリアクリルアミドスラブゲル
（２次元電気泳動ゲル）をのせ、さらに、その上にニト
ロセルロース膜　〔シュライバー　アンド　シュエル（
Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　　５ｃｈｕｅｌｌ）社製、
***、７５×５５１サイズに切って使用〕を重ねた。こ
れらに一定電圧（２０Ｖ）で１８分間通電して、２次元
電気泳動法で泳動・分画した血清蛋白質を、２次元電気
泳動ゲルからニトロセルロース膜へ転写した。

３、　転写ニトロセルロース膜上での モノクローナル抗体の反応 ２で蛋白質を転写したニトロセルロース膜（以下、転写
ニトロセルロース膜という）を２％ウシ血清アルブミン
を含むトリス・塩酸緩衝液（１０ｎＭトリスヒドロキシ
メチルアミノメタン・塩酸緩衝液、ｐＨ７，２，０，８
％ＮａＣｊ！、０．０１％ＮａＮ：＋）中に浸し、−晩
４℃で静置した。次に、転写ニトロセルロース膜をモノ
クローナル抗体を含む培養上清を、トリス・塩酸緩衝液
で５倍希釈した液に浸して、室温（２０〜２５℃であっ
た）で１時間振盪（２０回／分）して反応させた。反応
後、転写ニトロセルロース膜をトリス・塩酸緩衝液に浸
して室温で振盪（２０回／分）することによって洗浄し
た。

この時トリス・塩酸緩衝液は、５分おきに５回交換した
。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体〔
マイルス（Ｍｉｌｅｓ）社製、イスラエル〕を、１％ウ
シ血清アルブミンを含むトリス・塩酸緩衝液によって、
あらかじめ決定しておいた水通濃度に希釈（通常１００
０倍であった）した液（２次抗体液）に、転写ニトロセ
ルロース膜を浸して室温で２時間静置し、反応させた。

次に、上記と同様にして転写ニトロセルロース膜を洗浄
した後、酵素基質溶液を加えて室温で１０分間静置し、
転写ニトロセルロース膜上のペルオキシダーゼ活性を測
定した。ここで酵素基質溶液には、０．２ｍＭ３．３′
−ジアミノベンジジン、３０％過酸化水素水を０．０２
％含むトリス・塩酸緩衝液を用いた。

４、結果 直視により観察した。Ｓ−１，Ｓ−３，３−４Ａ、　　
５−１４．　５−１５．　５−１６のいずれの抗リウマ
チ特異蛋白質モノクローナル抗体においても、リウマチ
特異蛋白質の泳動位置に相当するニトロセルロース膜上
の位置、すなわち、２次元電気泳動ゲル上の等電点（蛋
白の泳動位置に相当するｐＨをその蛋白の等電点として
）７．３〜７．８、移動度（アルブミンの最先端部の移
動度を１．０として）０．３０〜０．４５の範囲内に茶
色のスポットとしてペルオキシダーゼ活性が認められ、
抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体が検出できた
。しかしながら、２次元電気泳動ゲル上のりウマチ特異
蛋白質の泳動位置に相当するニトロセルロース膜上の位
置以外では、ペルオキシダーゼ活性が認められず、よっ
て抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体がリウマチ
特異蛋白質以外の血漿蛋白質とは反応しないことが示さ
れた。５−４Ａの結果を第４図に示す。２次元電気泳動
ゲル上の等電点７．３〜７．８、移動度０．３０〜０．
４５の範囲に相当するニトロセルロース膜上の位置にの
み、抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体が反応し
たことがわかる。ここでは示さないが、Ｓ−１，Ｓ−３
，５−１４、３−１５，５−１６についても同様の結果
が得られた。参考までに、リウマチ特異蛋白質を含む血
漿を上記１の方法にて２次元電気泳動し、コオマジー・
ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓ　１ｅＢｒｉｌ
ｌｉａｎｔ　　Ｂｒｕｅ　Ｒ−２５０）にて染色した結
果を第５図に示す。等電点７．３〜７．８、移動度０．
３０〜０．４５の位置に、リウマチ特異蛋白質のスポッ
トが認められる。

実施例３　抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体の
作製 １、　培養による方法 新規雑種細胞を市販の無血清培地〔製品名　ＨＢｌｏｌ
、ハナメディア（）（ａｎａ−ｍｅｄｉａ）社製、米国
〕で、細胞濃度０．５〜２×１０個／ｍｌで一培養し、
２４時間毎にその培養上清を回収した。回収した培養上
清は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）に対して４
℃で一晩透析してｐＨを８．０に調整した。この液をプ
ロティンＡ結合セファロース　ＣＬ−４Ｂ　（Ｐｒ−ｏ
ｔｅｉｎ　Ａ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ　
、、ファルマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）社製、スウ
ェーデン〕を充填したカラムに流し、培養上清中の抗リ
ウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体をセファロースＣ
Ｌ−４Ｂ上のプロティンＡに結合させた。０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ８，０）で十分に洗浄後、グリシン−塩
酸緩衝液（０，１Ｍグリシン、０．１Ｍ塩化ナトリウム
を含む液に塩酸を加えてｐＨ３，０に調整した液）を流
し、溶出される蛋白分画を回収した。回収した蛋白分画
は、直ちに０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）を加え
て中性にし、これを精製抗リウマチ特異蛋白質モノクロ
ーナル抗体溶液とした。この特待た精製抗リウマチ特異
蛋白質モノクローナル抗体量を第１表に示す。

第１表 （Ｅ＝１４．０として、波長２８０ｎ−における吸光度
より計算）２、　マウス腹腔による方法 あらかじめ腹腔にプリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ　、シ
グマ（Ｓｉｇｍａ）社製、米国）０．５ｍｌを注入して
刺激しておいたマウス（６週令、ＢＡＬＢ／Ｃ，雌）の
腹腔に、５×１０個の新規雑種細胞を注入した。

およそ１週間後より腹水が貯留しだした。適宜注射器に
よって腹腔に溜った腹水を採取した。

このようにして得た腹水は、次のようにして精製を行っ
た。腹水をまず３．００Ｏｒｐｍで２０分間遠沈して沈
澱を除去した。次に、得られた上清に１０１１ＩＩｌ当
り硫酸ナトリウム１．８ｇを加えて２時間室温で振盪、
１時間室温で静置して塩析した。塩析により生じた沈澱
を８．０００　ｇで２０分間遠沈して回収した。回収し
た沈澱を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８，０，０
５Ｍ塩化ナトリウムと０．０２％アジ化ナトリウムを含
む）で溶解し、−晩透析した。この液を次に、上記リン
酸緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−セファデックスカラ
ム（Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ　−５０
、ファルマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）社製、スウェ
ーデン〕に流して分画した。各分画の抗リウマチ特異蛋
白質モノクローナル抗体活性を、精製リウマチ特異蛋白
質を用いた酵素免疫測定法によって測定し、抗リウマチ
特異蛋白質モノクローナル抗体活性を有する分画を回収
した。この分画はＩｇＧ溶出位置に合致した。これを精
製抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体溶液とした
。

実施例４　抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体の
生化学的性質 １、抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体の分子量 実施例３−１で得られた精製抗リウマチ特異蛋白質モノ
クローナル抗体溶液を用いた。精製抗リウマチ特異蛋白
質モノクローナル抗体溶液にドデシル硫酸ナトリウム（
Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ。

ＳＤＳと略す）を、１％濃度となるように加え、１００
℃に３分装置いて加温した。加温後、室温（１５〜２５
℃であった）で−晩装置した。このＳＤＳ処理した抗リ
ウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体と等量の１０Ｍ尿
素液を混ぜた液を検体とし、ポリアクリルアミド・チュ
ーブゲル（ゲルサイズ径４ｍｍｘ長さ７０ｍｍ）を用い
て電気泳動した。泳動緩衝液には、ＳＤＳ　１％を含む
０．１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，２）を用いた。同時
に、分子量の標準物として、ファルマシア（Ｐ　ｈａｒ
ｍａｃｉａ、スウェーデン）社製の電気泳動用分子量マ
ーカーを泳動した。

泳動後、以下のようにして染色した。ＳＯ３処理抗リウ
マチ特異蛋白質モノクローナル抗体または電気泳動用分
子量マーカーを泳動したポリアクリルアミド・チューブ
ゲルを、コオマジー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍ
ａｓｓｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅＲ−２５０
）　　０．０２５％、メタノール５０％、酢酸７％を含
む液を染色液に浸して、８時間室温で振盪した。この後
、１０％メタノール、７％酢酸を含む脱色液で、３日間
振盪して脱色した。

２メルカプトエタノールを用いて還元処理した精製抗リ
ウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体溶液を用いて、上
記と同様にして分子量を測定した。

さらに、実施例２−１で示した等電点電気泳動によって
、各抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体の等電点
も測定した。測定結果を第２表に示す。

２、抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体のサブク
ラスの決定 抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体を実施例２で
示したのと同様にして、２次元電気泳動した後、イムノ
ブロッティングしてサブクラスを決定した。抗血清は、
市販の抗マウスＩｇＧ、、抗マウスＩｇＧｚ、抗マウス
ＩｇＧ２、抗マウスＩｇＧ３、抗マウスχ鎖、抗マウス
λ鎖〔いずれもマイルス（Ｍｉｌｅｓ）社製、米国、ウ
サギ血清、製造元能書に記された希釈倍率で使用した〕
を用いた。反応後、直視下で判定した。

いずれの抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体も、
抗マウスχ鎖と反応したことより、Ｌ鎖はχ鎖であった
。Ｈ鎖は、Ｓ−１，Ｓ−３が抗マウスＩｇＧ、と、５−
４Ａ、　　５−１４．　５−１５．　５−１６が抗マウ
スＩｇＧ、と反応したことより、それぞれＴ２およびＴ
、であった。結果を第２表に示す。

（発明の効果） 本発明の最も有用な点は、リウマチ特異蛋白質に対して
特異的で、他のヒト血漿蛋白質、特にヒトＩｇＧ抗体と
は反応しない抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体
を産生ずる細胞株（すなわち、抗体産生株）を確立し、
抗リウマチ特異蛋白質モノクローナル抗体を得ることに
成功したことによって、血清中リウマチ特異蛋白質の免
疫学的測定法の確立を可能にした点にある。

さらに、今回確立に成功した抗体産生株は、常に一定の
抗原特異性や抗原との結合力を有する抗体（すなわち、
モノクローナル抗体）を産生じ、かつ、動物を免疫して
得られる抗体が多種多様な抗体の混合物であるのに対し
て、単一の抗体−であるため、一定の力価に調整するこ
とが容易である。

さらに、培養よっても抗体を得ることができることは、
適当な培養液を選択することによって、得られる抗リウ
マチ特異蛋白質モノクローナル抗体の純度を飛躍的に上
げることも可能である。つまり、安定した品質の抗体を
安定供給できるなど工業的にも有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第３図は精製した抗リウマチ特異蛋白質モ
ノクローナル抗体の希釈曲線を示すグラフ、第４図は５
−４Ａをイムノブロッティングした結果を示す図表、第
５図はリウマチ特異蛋白質を含むヒト血漿を２次元電気
泳動した泳動像を示す図表である。 モツクローナル）九体濃度（×１０周Ａｎｄ）七ツクロ
ーナル抗体；農度（×１０μ９／７１１１）手続補正書 昭和６０年９月１７日

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ドデシル硫酸ナトリウムを用いたポリアクリルア
   ミド電気泳動によって分子量１５０，０００〜１７０，
   ０００を示し、蛋白変性剤を用いない２次元電気泳動に
   おける等電点（蛋白の泳動位置に相当するｐＨをその蛋
   白の等電点として）が７．３〜７．８、移動度（アルブ
   ミンの最先端部の移動度を１．０として）が０．３０〜
   ０．４５の範囲にあるリウマチ特異蛋白質に対するモノ
   クローナル抗体。
2. （２）ドデシル硫酸ナトリウムを用いたポリアルリルア
   ミド電気泳動によって分子量１５０，０００〜１７０，
   ０００を示し、蛋白変性剤を用いない２次元電気泳動に
   おける等電点（蛋白の泳動位置に相当するｐＨをその蛋
   白の等電点として）が７．３〜７．８、移動度（アルブ
   ミンの最先端部の移動度を１．０として）が０．３０〜
   ０．４５の範囲にあるリウマチ特異蛋白質に対するモノ
   クローナル抗体を産生する細胞株。