JPS62138192A - カリジノゲナ−ゼの精製方法およびその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３．１技術分野 本発明はカリジノゲナーゼを含む吐乳動物の種々の組織
や体液から不純物を効率よく除去し、高純度にカリジノ
ゲナーゼを精製する方法に関するものである。

３．２従来技術とその問題点 カリジノゲナーゼは動物生体内で生産される一種の蛋白
分解酵素であり、キニノーゲンに作用し、循環器作用物
質であるキニンを遊離する。そのためこのカリジノゲナ
ーゼは末梢血管拡張作用等の生理活性を右し、循環器疾
患の治療薬として広く使用されている。

医薬品どしては主にブタの膵臓より得られるカリジノゲ
ナーゼが用いられている。

該膵臓には、カリジノゲナーゼの他に共有する７７コ在
蛋白質が非常に多い。特に、キニンを分解するキニナー
ゼの混入は医薬品としてのカリジノゲナーゼの作用を著
しく低下ｙせる。従ってこれら共存する酵素を含まぬカ
リジノゲナーゼを抽出、分離する方法が古くより研究さ
れている。

従来、カリジノゲナーゼの精製方法として、硫安１ハ析
、溶媒性Ｖ、イオン交換クロマＩ・、ゲル濾過等の組合
せを行なったり、或は高価な試薬であるカリジノゲナー
ゼインヒビターを用いてアフィニティクロマトを行なう
などの方が、をとっている。

しかし硫安塩析、溶媒比εによる１、′、製は多くの１
１５間と労力を要し、試料の損失が大きい。イオン交換
クロマトの場合、充填剤に弱ｍノ、（外陰イオン交換ク
ロース笠に吸着分離させる方法ではイオン交換体の物理
的堅牢性や微生物汚染を受は易い性質に難点があり、巨
大網状の強塩）、（外陰イオン交換樹脂を用いる方法で
は、目的物の溶出が遅く完全に溶出、分画するには多量
の溶媒とかなりの時間を要するという欠点がある。

ゲル濾過を用いる方法では、粗カリジノゲナーゼ溶液に
含まれるカリジノゲナーゼと同程度の分子量を有する不
純蛋白を除去することは困難である。

アクィニティクロマトの場合、これに使用する天然性ト
リプシン阻害剤、例えばオボムコイドトリプシン阻害剤
、大豆トリプシン阻害剤等が高価なため、この方法も工
業的に使用する手段としては不適当である。

以−トのようにいずれも一■業的製造方法としては操作
が煩雑であったり、また大に生産のためには経費がかか
りすぎること、また精製効率が不十分、高純度のものが
得られない等の多くの問題を残している。

３．３本発明の１．１的 本発明はに記の如き現状に鑑み、操作が容易で迅速にし
かも高い純度のカリジノゲナーゼを安価に精製すること
ができる方が、および装置を提供することを目的として
なされたものである。

３．４本発明の構成 本発明はカリジノゲナーゼの高純度精製方法に関するも
のでブタの膵臓から得られる自己消化液の濾過を容易に
するために凝集剤を用い、その濾過液を弱陰イオン交換
樹脂を充填したカラムで分離を行ない、得た分取物を膜
を用いて脱塩濃縮し、凍結乾燥して高純度の精製物を得
る方法およびその装置を提供する。

従来のカリジノゲナーゼ精製ではセルロース、セファデ
ックスゲル、ポリアクリルアミドゲル等の柔らかい充填
剤を用いたカラムでカリジノゲナーゼを分離している。

そのため粒径の小さい充填剤を用いると流草を非常に小
さくしないと充填材が変形しカラム圧が非常に高くなっ
てしまう。

−・般に粒径を小さくすると分離の性能は良くなるが、
この種の充填剤では以−１−の理由で、分離の性能と分
画′の速度を同時に１−げろごとは困難である。

この発明においては高速液体クロマトグラフィー（高速
ＬＣ）用の粒径の小さい、硬む）充填剤を充填したカラ
ムを用いたため、高性能な分離が短時間で可能となった
。尚この発明で用いる高速液体クロマトグラフィー川充
填剤は、粒径が５〜５０ｐｍ、水に対する膨ｆｉ？ｊ度
（水中での体積／乾燥状態における体積）が１〜１．５
で硬質であるものをいう。

一般に、陰イオン交ＪＭ樹脂を充填したカラムを使用す
ればカリジノゲナーゼの分離精製が可能であるが分離精
製効率が不十分であり、１段の分離ｖ 精製では、最終製品で２ｏｏＸ＃／ｍｇ相当以１−のち
のを４Ｘすることができない。本発明においては、弱イ
オン交換樹脂例えば、交換基としてジェタノールアミン
をもつ樹脂を充）ｉ４１．たカラＪ、を使用することに
より、１段の液体りＩ′：１マドグラフイ一番こより十
分な分離精製がｉｔ（俺となった。

以下本発明の構成についてｌｉＹ述する。

第１図は本発明の構成を示すだめのプロ・ンクダイヤグ
ラムで ７参 １−凝集槽、２−濾過槽、３〜液体クロマトグラフィー
、４−分離膜、５−凍結乾燥器、６−原料槽、７−製品
槽 である。

次に各上程の内容について説明する。

（１）ブタの膵臓の自己消化液を凝集剤により処理する
。そのとき、凝集剤どしてカオチン系のものを用い、通
常の酸溶液を滴下してｐＨを４．０〜７．０、好ましく
はｐＨ４，５〜５．０にし、凝集剤を５０〜５００ｐｐ
ｍ、好ましくは１００〜３００ｐｐｍ加え良く撹拌する
。数分後に凝集効果が現われ、リーイロンのメツシュで
分離かり能となる。この時のカリジノゲナーゼの回収率
は８０％以上となる。

（２）凝集物を除き更に濾過を行ない、２μ５ｍ以１−
の粒子を除いた後、 （３）この濾過液を弱陰イオン交換樹脂を充填したカラ
ムに１Ｙ人し、カリジノゲナーゼを吸着させる。注入早
はカラム体積の３０倍を限度とする。

次に０．００１〜０．１　ｍｏｌ　、好ましくは０．０
３〜０．０５ｍｏｌ　ｒ）’）酎・酸アンモニウム（Ｇ
Ｏ３ＧＯＯＮＨ４）をカラム体積の１〜４イｊ゛１、好
ましくは１．５〜２．５倍の量をカラムに流し、　０．
１〜０．３　ｍｏｌ　、好ましくは０．１５〜０．２５
ｍｏｌの酢酸アンモニウムなカラム体積の２〜２０倍、
好ましくは８〜１２倍の４１．’　ｋカラムに流し、カ
ラム内の洗浄を行なう。次に０．８〜２．０ｍｏｌ、好
ましくは０．７〜０．９　ｍｏｌの酢酸アンモニウムを
流すことによりカリジノゲナーゼ比活性が約５　ＥＵ／
Δ２８０である分取液をカラムの体積と開開−からその
坏の昂はど得る。

なお、カラムは次に２．０〜４．０ｍｏｌの酢酸アンモ
ニウムなカラム体積の約数倍流し、強くカラムに吸着さ
れている成分を溶出し、更にカラム内の洗ｎ１に用いた
０、０１〜０．０３ｍｏｌの酢酸アンモニウムを体積の
数倍流し、カラムを平衡化しておき、次のカリジノゲナ
ーゼの精製ができる状態にしておく。

（４）この分取物を分離膜により脱塩、濃縮し、（５）
凍結乾燥器によりカリジノゲナーゼの乾燥物を得る。２
００ｋｔｌ　／ｍｇ以七の精製物を得ることができる。

上記の各操作について、酢酸アンモニウムに代え、ｐＨ
域が４．５〜８．５の間に重なる緩衝溶液、例えばリン
酸二水素カリウム、水酸化すトリウム、乳酪、乳酸すＩ
・リウム雰を好適に用いることができる。

３．５実施例 １、ブタの膵臓１ｋｇに水３Ω、を加え放置し、自己消
化した後、アセトンを２５ｗｔ％加えたものを試料とす
る。

試料２５ｍＭに０．２％のカオチン系凝集剤（スミフロ
ックＦＣ−２５０）を添加］７た時の凝集状Ｈ。

と濾過した後の回収率を示す。

ｐＨが４．５〜５．０の範囲が凝集状ｊ魚、回収率共に
良かった。

凝集した後、ナイロンメツシュにより凝集物を除き、そ
の後濾過を行なう。凝集剤を用いず直接濾過を行なうと
濾紙の口詰りかひど〈濾過に多くの時間を要する。

２、この濾過液を、弱陰イオン交換樹脂（交換基として
ジェタノールアミンを持つ樹脂を使用）を充填したカラ
ム（内径２０ｗｍ＋、長さ２５０＋ｕ＋）に注入し、カ
リジノゲナーゼを吸着さす。次に０．０４ｍｏｌの酢酸
アンモニウム（ｐＨ＝Ｅｔ、０）　１５０膳すを流し更
に０．２ｍｏｌ酢酸アンモニウム（ｐＨｅ、ｏ）８００
　ｍ交流し洗詐を行なった後、　０．８＋＊ｏｌの酢酸
アンモニウム（ｐＨ＝ｅ、０）を流しカリジノゲナーゼ
を溶出さす、この際紫外吸収モニター（波長２８０ｎｍ
）で吸光度を連続的に測定し、吸収が大きくなった部分
を分取する。第２図にこれを図解する。約８０　ｍ文の
分取液な１１１だ。

第１表に測定したカリジノゲナーゼの活性値を示す（酵
素化学的方法により測定）。

（以下余白） 第１表 回収率は約９０％であり、比活性（ＥＵ／Ａ２８０）は
約　１８０倍となった。

このカラムを用い、精製条件を変えた場合の回収率及び
透過率の変化を第３．４および５図に示す。

第３図は洗浄液の濃度と回収率の関係を、第４図は洗浄
液の量とその２８０ｍ＋＋＋における透過率との関係を
、第５図はカリジノゲナーゼ溶出液の塩濃度と回収率の
関係を示す。

なお、第６図に、ｐｌが６．０における酢酸アンモニウ
ム濃度と保持比に′との関係を示した。

保持比に′はカラムに保持される程度を示すもので、次
式で表わされる。

ｋ’＝　（ｔ　　−ｔ　　）／ｌ。

Ｏ ここで、　１ｏは吸着されない成分の保持時間ｔ　は目
的成分の保持時間 である。

カリジゲノナーゼの分離には、ｋ′は１から１０の範囲
を用いる。

カリジゲノナーゼを溶出させないで、早く溶出する成分
を完全にカラムから溶出させるには、　ｋ′が数十にな
る濃度（：０．４Ｍ）を用いる。

カリジゲノナーゼを分離した後、遅く溶出する成分をカ
ラムから溶出させるには、　ｋ′＝０の濃度（：１．２
Ｍ）を用いる。（カリジゲノナーゼは２つの成分ＡとＢ
に分離されるため、２木の直線が得られる。） この分取液を脱１ス１シ、凍結乾燥器により乾燥し、２
００　ｋＵ／ｍｇのほぼ純粋と考えられるカリジノゲナ
ーゼを得た。この数値は血流増加測定法［Ｈ，Ｍｏｒｉ
ｙａ、　Ｋ、Ｙａｍａｚａｋｉ　ａｎｄ　Ｈ，Ｆｕｋｕ
ｓｈｉｍａ。

Ｊ、Ｂ１０，０００ｃｈｅｍ、、５８，２０１（＋９６
５）　１によって得た。

３．６比較例 カラム充填材として、弱陰イオン交換樹脂のかわりに交
換基としてトリメチルアミンをもつ樹脂を強陰イオン交
換樹脂として用いた外は、基本的には、実施例と同一の
吸着・脱着条件により、ブタの膵臓を原料としてカリジ
ノゲナーゼを精製した。

第　　２　　表 第１表と第２表を比較すれば、比較例においては、１段
の分離精製では不１−分であり、この分取液をさらに液
体クロマトグラフィーにより精製する必要があることが
判る。

３．７本発明の効果 本発明のカリジノゲナーゼの精製法およびその装置にお
いて、１本のカラムを用いることにより高純度のカリジ
ノゲナーゼを得ることができた。

又、高速液体クロマトグラフィー用の充填剤を用いてい
るため分離の速度は早く、更に高速液体クロマトグラフ
ィーを用いたため工程の自動化が容易である。

その結果、精製に要する時間は従来〃、の数分の１とな
り、コストを大幅に低減にすることが可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の構成を示すためのブロックダイヤグラ
ムで １−凝集槽、２−濾過槽、３−液体クロマトグラフィー
、４−分翔膜、５−凍結乾燥器、６−原料槽、７−製品
槽 である。 第２図は紫外吸収モニターの利用方法の説明図である。 第３図は液体クロマトグラフィーにおける洗詐液濃度と
回収率の関係図、 第４図は同じく洗浄液の−４１と透過率の関係図、第５
図は同じく溶出液塩濃度と回収率の関係図第６図は、そ
のｐＨ＝ｆｉにおける酢酸アンモニラム濃度と　ｋ′の
関係図 である。 第６図に対して、 横軸：酢酸アンモニウム緩衝液の塩濃度（モル） 縦軸：カリジノゲナーゼの保持比（ｋ′）である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カリジノゲナーゼを含有する原料液を、高速液体ク
   ロマトグラフィー用弱陰イオン交換樹脂をカラム充填材
   として用いた液体クロマトグラフィー装置を通過せしめ
   ることによりカリジノゲナーゼの精製物を得ることを特
   徴とする、カリジノゲナーゼの精製方法。 ２、カリジノゲナーゼを含有する原料液に （１）凝集剤を加えて凝集させ （２）大きい粒子を除いた後、ろ過し （３）液体クロマトグラフィーにより精製し（４）この
   分取物を分離膜を用いて脱塩濃縮し（５）凍結乾燥して カリジノゲナーゼの乾燥精製物を得るカリジノゲナーゼ
   の精製方法。 ３、カリジノゲナーゼを含有する原料液を精製してその
   乾燥精製物を得るための （１）凝集装置 （２）ろ過装置 （３）液体クロマトグラフィー装置 （４）脱塩濃縮装置 （５）凍結乾燥装置 を直列に有することを特徴とするカリジノゲナーゼの精
   製装置。 ４、弱イオン交換樹脂が交換基としてジエタノールアミ
   ンを持つ樹脂である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、凝集剤がカチオン系のものである特許請求の範囲第
   ２項記載の方法。 ６、凝集剤がカチオン系のものであり、凝集操作時のｐ
   Ｈが４．０〜７．０、凝集濃度が５０〜５００ｐｐｍで
   あるところの特許請求の範囲第２項記載の方法。 ７、液体クロマトグラフィー用カラム充填材が高速液体
   クロマトグラフィー用弱陰イオン交換樹脂であるところ
   の特許請求の範囲第３項記載の装置。 ８、凝集剤がカチオン系のものであり、液体クロマトグ
   ラフィー用カラム充填材が高速液体クロマトグラフィー
   用弱陰イオン交換樹脂であるところの特許請求の範囲第
   ３項記載の装置。 ９、分離膜の分画分子量が５００〜１０，０００、好ま
   ししくは　１，０００〜５，０００である特許請求の範
   囲第３項記載の装置。