JPS62126980A - Dna断片 - Google Patents
Dna断片Info
- Publication number
- JPS62126980A JPS62126980A JP26545485A JP26545485A JPS62126980A JP S62126980 A JPS62126980 A JP S62126980A JP 26545485 A JP26545485 A JP 26545485A JP 26545485 A JP26545485 A JP 26545485A JP S62126980 A JPS62126980 A JP S62126980A
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- JP
- Japan
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- dna
- mrna
- cdna
- fragment
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6445—Kallikreins (3.4.21.34; 3.4.21.35)
Landscapes
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、ヒトカリクレイン又はそれと同等の生理活性
を有するヒトカリクレイン様物5MをコードするDNA
を含有するDNA断片に関する。
を有するヒトカリクレイン様物5MをコードするDNA
を含有するDNA断片に関する。
(従来の技術)
カリクレインはセリングロテアーゼの1群を占める酵素
でるり、血圧調節、炎症反応に関与するキニンをその前
駆体であるキニノーゲンより切り出す1妥な酵素でめる
。又、臨床医学においてもカリクレインは血止低下剤と
して現在頻繁に開用されている薬剤ではめるが、そのも
のはいずれも部分舗装したものKすぎない。
でるり、血圧調節、炎症反応に関与するキニンをその前
駆体であるキニノーゲンより切り出す1妥な酵素でめる
。又、臨床医学においてもカリクレインは血止低下剤と
して現在頻繁に開用されている薬剤ではめるが、そのも
のはいずれも部分舗装したものKすぎない。
マクトYルド
カリクレインは最近、8china及びMacaona
ldK砿よ りiol、 Ohem、、2j7.273g−2761
,/91コ及びProa。
ldK砿よ りiol、 Ohem、、2j7.273g−2761
,/91コ及びProa。
Natl Acad、 8ci、 USA、−7
9,?コ47−7267、/91.2 )。
9,?コ47−7267、/91.2 )。
(発明が解決しようとする問題点)
本発明者は、ヒトカリクレインを産生ずるために必要な
ヒ) c DliAを得るべく検討2行ない、本発明に
到通した。
ヒ) c DliAを得るべく検討2行ない、本発明に
到通した。
(問題点を解決するための手段)
すなわち、本発明の要旨は、ヒトカリクレイン又はそれ
と同等の生理活性を有するヒトカリクレイン様物質をコ
ードするDNA1に含有するDNA断片[J+る。以下
、本発明の詳細な説明する。
と同等の生理活性を有するヒトカリクレイン様物質をコ
ードするDNA1に含有するDNA断片[J+る。以下
、本発明の詳細な説明する。
まず、本発明ンこ議るDNAWr片は次のような方法に
よってa14製される◎ /)cDNAの率庵 a)mRNAの、V4螢 ヒト膵臓断片をグアジニルチオシアネートとともにホモ
ジナイズし、Ca1l平衡密度勾配超遠心によって全R
NAを分離する。
よってa14製される◎ /)cDNAの率庵 a)mRNAの、V4螢 ヒト膵臓断片をグアジニルチオシアネートとともにホモ
ジナイズし、Ca1l平衡密度勾配超遠心によって全R
NAを分離する。
ついで、常法によりこれをオリゴ(dT)セルロースカ
ラムクロマトグラフィーで梢装し、ポリ(A)含有RI
JA’g単陥する( mRNA原料)。
ラムクロマトグラフィーで梢装し、ポリ(A)含有RI
JA’g単陥する( mRNA原料)。
b)cDNAライブラリーの調整
法(Mo1ecular and Ce1lular
Biology、 2.16/〜/り0./91コ)に
よって、c DNAライブラリーを得る。すなわち、p
BR3,2−とBV@0のハイブリッドプラスミツドを
用いて、オリゴ(dT)テールをもつベクタープライマ
ーとオリゴ(dG)テールリンカ−を得る。このベクタ
ープライマーと上記mRNA共存下に逆転写酵素を作用
↓ さぜcDNAを合成し、その後制限酵素H1nd lで
消化し、ついで上dピリンカーを用いて環化させる。そ
の後mRNA部分をDNAで置換して、cDNAフラグ
メント含有プラスミド?:得る。
Biology、 2.16/〜/り0./91コ)に
よって、c DNAライブラリーを得る。すなわち、p
BR3,2−とBV@0のハイブリッドプラスミツドを
用いて、オリゴ(dT)テールをもつベクタープライマ
ーとオリゴ(dG)テールリンカ−を得る。このベクタ
ープライマーと上記mRNA共存下に逆転写酵素を作用
↓ さぜcDNAを合成し、その後制限酵素H1nd lで
消化し、ついで上dピリンカーを用いて環化させる。そ
の後mRNA部分をDNAで置換して、cDNAフラグ
メント含有プラスミド?:得る。
ついで、常法によりこれt大腸−く形質導入し、アンピ
シリン耐性株を取得する・c)cDNムライブラリ−の
スクリーニング参考例/の方法により早跪される2ソト
プロープとして用いて、上記のcDNAライブラリーを
スクリーニングし相補性のめるクローンを璃択する。
シリン耐性株を取得する・c)cDNムライブラリ−の
スクリーニング参考例/の方法により早跪される2ソト
プロープとして用いて、上記のcDNAライブラリーを
スクリーニングし相補性のめるクローンを璃択する。
コ) cDNAの同定
a)グラスミツドDNAの単離
得られたポジティブクローンをM?m地にて培養し、常
法によりグラスミドDNAyal−準脂する。その10
801平衡密度勾配超遠心によって、CCフオームのグ
ラスミドDNAを単層する。
法によりグラスミドDNAyal−準脂する。その10
801平衡密度勾配超遠心によって、CCフオームのグ
ラスミドDNAを単層する。
b)塩基配列の決定
得られたグラスミツドD N AよりcDNムフラグメ
ント乞抽出し、に法により1fllJ限酵素地図乞作製
する。図/の地図に基づいてMa XILmとG1)b
ertの方法(Methods 1nEnzymo1o
g、4)、、t99〜s&0.79IO)によって、塩
基Ce列を決定する。
ント乞抽出し、に法により1fllJ限酵素地図乞作製
する。図/の地図に基づいてMa XILmとG1)b
ertの方法(Methods 1nEnzymo1o
g、4)、、t99〜s&0.79IO)によって、塩
基Ce列を決定する。
J)RNAプロット分析
mRNAcD佃出はFill記の方法に従うことができ
る。PO17(A) RN Aを/ M glyoxa
l、40%(v/v)ジメチルスルホキシドにて変性し
た後/俤アガロースゲルにて電気泳動した。
る。PO17(A) RN Aを/ M glyoxa
l、40%(v/v)ジメチルスルホキシドにて変性し
た後/俤アガロースゲルにて電気泳動した。
Me MasterとOarmichael の方法
(Proc。
(Proc。
Natl、Acad、 Sci、 7a 、aざj、t
、 /97り)によりジアゾベンジルオキシメチル紙に
RNA’llトランスファーする。
、 /97り)によりジアゾベンジルオキシメチル紙に
RNA’llトランスファーする。
ハイブリダイジェーションと洗浄はAlwineらの方
法(Proc、Natl、 Acad%Sciイ?<c
、!801/タック)K従9ことができる。
法(Proc、Natl、 Acad%Sciイ?<c
、!801/タック)K従9ことができる。
/?7j)に従う。
得られるDNAll1片は、ヒトカリクレイン又はそれ
と同等の生理活性を有するヒトカリクレイン様物質をコ
ードするDNAを含肩する。
と同等の生理活性を有するヒトカリクレイン様物質をコ
ードするDNAを含肩する。
その−例Y図−に示すが、本発明に係るDNA断片は必
ずしもこれと同一の塩−$配列を有すること?要求され
ず、該DNA1I/r片に苫まれるDNAによってコー
ドされる物質が、ヒトカリクレインと同等の生理活性を
有するヒトカリクレイン様物質でろれば、該塩基配列の
一部が置換もしくは削除され又は塩基が付加された塩基
配列でめってもよい。
ずしもこれと同一の塩−$配列を有すること?要求され
ず、該DNA1I/r片に苫まれるDNAによってコー
ドされる物質が、ヒトカリクレインと同等の生理活性を
有するヒトカリクレイン様物質でろれば、該塩基配列の
一部が置換もしくは削除され又は塩基が付加された塩基
配列でめってもよい。
本発明に係るDNA断片は、常法により発現ベクターの
クローニング部位に導入することによって、これを鋳型
とする翻訳によりヒトカリクレイン又はヒトカリクレイ
ン様物質、あるいはこれt含む融合蛋白を得ることがで
きる。
クローニング部位に導入することによって、これを鋳型
とする翻訳によりヒトカリクレイン又はヒトカリクレイ
ン様物質、あるいはこれt含む融合蛋白を得ることがで
きる。
得られるヒトカリクレイン等は、血圧低下剤として用い
ることができる。
ることができる。
明するが、本発明は、七〇賢旨を超えない限り以下の実
施例により限定されない。
施例により限定されない。
なお、実施例において、制限酵素、修飾酵素等の処理は
、これらの試薬の装造・販売者(宝酒造株式会社、Ne
w England Biolabs )の指示書に従
って行なった。
、これらの試薬の装造・販売者(宝酒造株式会社、Ne
w England Biolabs )の指示書に従
って行なった。
実施例/
fi+ ヒト膵臓切片乞准体窒素で破砕した後グアニ
ジニウムチオシアネート水浴液?添加しホモジナイズし
た。得られたホモジネートを、Chirgwinらの方
法(Biochemistry 、 / t 。
ジニウムチオシアネート水浴液?添加しホモジナイズし
た。得られたホモジネートを、Chirgwinらの方
法(Biochemistry 、 / t 。
12?4’−!;299. /97? ) K l、た
がって、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心によって全1
(NA%−停船した。ついで、常法によりこれヶオリゴ
((iT)セルロースカラムクロマトグラフィーで村製
し、ポリ(A)含有RNAを単離し、mRNA涼料とし
た。
がって、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心によって全1
(NA%−停船した。ついで、常法によりこれヶオリゴ
((iT)セルロースカラムクロマトグラフィーで村製
し、ポリ(A)含有RNAを単離し、mRNA涼料とし
た。
(2) 一方、岡山とBergの方法(Mo1ecu
xarand Ce1lular Biologyコ、
/A/−/70゜1qta )により、pBR,?Ju
と5vuoのハイブリッドプラスミドを用いて、ベクタ
ープライマーとオリゴ(dG )テールリンカ−を得た
。すなわち、pBRJココとSV弘O(マツプユニット
0.7 /−0,14)のハイブリッドプラスミド41
OOμgを、ウシ血清アルブミンを言む緩衝液中で制御
衣酵素j通1で37℃、9時間消化させた。
xarand Ce1lular Biologyコ、
/A/−/70゜1qta )により、pBR,?Ju
と5vuoのハイブリッドプラスミドを用いて、ベクタ
ープライマーとオリゴ(dG )テールリンカ−を得た
。すなわち、pBRJココとSV弘O(マツプユニット
0.7 /−0,14)のハイブリッドプラスミド41
OOμgを、ウシ血清アルブミンを言む緩衝液中で制御
衣酵素j通1で37℃、9時間消化させた。
ついで、常f−によりエタノール沈澱によってDNAを
回収し、これをdTTPを會む緩fI液に溶解し、ター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを重
加して、37℃で30分間反応させて、制限#索岱1の
消化部位に約60個のαTデテール付加させた後、エタ
ノール沈諏によりDNAケ回収した。ついで、このDN
A7ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で、制限酵素)
(pa lにより消化した(37℃、S時間)。大きい
方のDNA町片を、アガロースゲル電気泳動により祠製
し、ガラスパウダー法(Vogslsteinら、Pr
oc、Natl、 Acad、8ci、U、8.A、
、 76、 AI!t −4/9./9’;/9)
VCよって回収した。その後、このD N A’40℃
でオリゴ(aa)セルロースカラムに付し、水で浴出さ
せた後、エタノールで回収し、オリゴ(dT)テールを
イするベクタープライマーを得た。
回収し、これをdTTPを會む緩fI液に溶解し、ター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを重
加して、37℃で30分間反応させて、制限#索岱1の
消化部位に約60個のαTデテール付加させた後、エタ
ノール沈諏によりDNAケ回収した。ついで、このDN
A7ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で、制限酵素)
(pa lにより消化した(37℃、S時間)。大きい
方のDNA町片を、アガロースゲル電気泳動により祠製
し、ガラスパウダー法(Vogslsteinら、Pr
oc、Natl、 Acad、8ci、U、8.A、
、 76、 AI!t −4/9./9’;/9)
VCよって回収した。その後、このD N A’40℃
でオリゴ(aa)セルロースカラムに付し、水で浴出さ
せた後、エタノールで回収し、オリゴ(dT)テールを
イするベクタープライマーを得た。
他方、pBRj!−とSVダO(マップユ二ソトQ、7
9〜0.3コ)とのハイブリッドプラスミド100μy
をウシ血清アルブミンを含むυ伽液中で、制限酵素り匹
1により消化した(37℃、7時1i1半)、)ついで
、DNAを回収し、dGTPY含む緩衝液に溶解し、タ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ?
添加して、37℃で10分間反応させ、約10〜/jの
dGデテール付加させた。回収したDNAを、ウシ血7
かアルブミンを汁む#働液中で割限酵素本qd屋により
消化させ(,77’C1/時間)、ついでアガロースゲ
ル(/、f%)電気泳動に付し、小さいオリゴ(dG)
テールリンカ−DNAを抽出、回収した。
9〜0.3コ)とのハイブリッドプラスミド100μy
をウシ血清アルブミンを含むυ伽液中で、制限酵素り匹
1により消化した(37℃、7時1i1半)、)ついで
、DNAを回収し、dGTPY含む緩衝液に溶解し、タ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ?
添加して、37℃で10分間反応させ、約10〜/jの
dGデテール付加させた。回収したDNAを、ウシ血7
かアルブミンを汁む#働液中で割限酵素本qd屋により
消化させ(,77’C1/時間)、ついでアガロースゲ
ル(/、f%)電気泳動に付し、小さいオリゴ(dG)
テールリンカ−DNAを抽出、回収した。
Ce1lular Biologyコ、/l、/ −/
70./91コ)により、CDIJAライブラリーを得
た・すなわち、Tris−M(1!l(pHr、 J
) 、MgO1t、KOl、ジチオスレイトール、ti
ATP、(iTTP、dGTP及び[”P〕d OT
Pを含む水浴液に上記(1)で得られたmRNAJOμ
ylと上記(2)で得られたベクタープライマー10μ
Iを添加して、逆転写酵素の存在下に37℃、10分間
、反応させ、プラスミド−cDNA:+nRNAを合成
し、これ!エタノール沈澱しベレット状で回収した。こ
のベレットをIE o O1t s ジチオスレイトー
ル、ポリ(A)、(”P)dOTP及びターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーセを含有する緩衝
液ll′c浴解し溶解7℃、70分[…反応させ、末端
めたシdOMFの10〜15の残基を付加させた。つい
で、回収したオリゴ(aC)テールグラスミド−cDN
A :mRNAを官有するベレットtウシl1ll l
’lltアルブゝミンを甘む緩衝液に浴解し、制限#素
復、nd lで37′C1/時間消化し、エタノール沈
澱により、町、ndlτ白化オリゴ(aC)テールcD
NA:n+RNAグラスミドを回収し九。これY Pi
IJ記(21で得られたオリゴ(dG )テールリンカ
−DNAを含む緩衝液に浴解し、bs℃、−分間インキ
ュベートし、さらに41−℃、30分間保持し、o ’
c fで冷却した。ついで、/−NADにコチンアデニ
ンジヌクレチド〕存在下、大8菌(Lcali) D
N Aリガーゼな加えて、−夜インキユペートした。そ
の後、aATP、ct’rTP、dGTPSdOTP、
β−N A D 、 E。
70./91コ)により、CDIJAライブラリーを得
た・すなわち、Tris−M(1!l(pHr、 J
) 、MgO1t、KOl、ジチオスレイトール、ti
ATP、(iTTP、dGTP及び[”P〕d OT
Pを含む水浴液に上記(1)で得られたmRNAJOμ
ylと上記(2)で得られたベクタープライマー10μ
Iを添加して、逆転写酵素の存在下に37℃、10分間
、反応させ、プラスミド−cDNA:+nRNAを合成
し、これ!エタノール沈澱しベレット状で回収した。こ
のベレットをIE o O1t s ジチオスレイトー
ル、ポリ(A)、(”P)dOTP及びターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーセを含有する緩衝
液ll′c浴解し溶解7℃、70分[…反応させ、末端
めたシdOMFの10〜15の残基を付加させた。つい
で、回収したオリゴ(aC)テールグラスミド−cDN
A :mRNAを官有するベレットtウシl1ll l
’lltアルブゝミンを甘む緩衝液に浴解し、制限#素
復、nd lで37′C1/時間消化し、エタノール沈
澱により、町、ndlτ白化オリゴ(aC)テールcD
NA:n+RNAグラスミドを回収し九。これY Pi
IJ記(21で得られたオリゴ(dG )テールリンカ
−DNAを含む緩衝液に浴解し、bs℃、−分間インキ
ュベートし、さらに41−℃、30分間保持し、o ’
c fで冷却した。ついで、/−NADにコチンアデニ
ンジヌクレチド〕存在下、大8菌(Lcali) D
N Aリガーゼな加えて、−夜インキユペートした。そ
の後、aATP、ct’rTP、dGTPSdOTP、
β−N A D 、 E。
coliDNAリガーゼ、F、、 coli D N
Aポリメラーゼ及びRcoli RNasθHをめ\加
して、この混合物Y/−′C1/時間、次いで室温で7
時間インキュベートした後、冷却し、反応を停止させ目
的とするcDNA#片含有プラスミ ドY得た。
Aポリメラーゼ及びRcoli RNasθHをめ\加
して、この混合物Y/−′C1/時間、次いで室温で7
時間インキュベートした後、冷却し、反応を停止させ目
的とするcDNA#片含有プラスミ ドY得た。
(41ついで、このグラスミドを用いてイ法(’ Mo
1ecular Oloning ’ 、 Co1d
SpringHarbor Laboratory /
? tコ、p2(49−照。)によシ、大腸菌(ル、
0O1i) HB / 0 /ケ形質転4させ之・ 一部として用いてスクリーニングし、ポジティブシグナ
ル?与えるクロー777個を取得した。これらのクロー
ンのうち、i&長のcD絆 IJ A断片?もつクローンphJIXコjを選び、こ
のプラスミドDNA1$、iIIした。このcDNA断
片の制限酵素地図2作製しく図/)、これを基にcDN
A的E片の塩基配列をMaxamとG1)bertの力
云により決定した。
1ecular Oloning ’ 、 Co1d
SpringHarbor Laboratory /
? tコ、p2(49−照。)によシ、大腸菌(ル、
0O1i) HB / 0 /ケ形質転4させ之・ 一部として用いてスクリーニングし、ポジティブシグナ
ル?与えるクロー777個を取得した。これらのクロー
ンのうち、i&長のcD絆 IJ A断片?もつクローンphJIXコjを選び、こ
のプラスミドDNA1$、iIIした。このcDNA断
片の制限酵素地図2作製しく図/)、これを基にcDN
A的E片の塩基配列をMaxamとG1)bertの力
云により決定した。
It/塩基対よりなるcDNAの塩基配列は図λの通り
である。プライマー延長法によk りこのph42!rのcDNAはほぼ児全長のカリクレ
インmRNAに相当することが示避九た。
である。プライマー延長法によk りこのph42!rのcDNAはほぼ児全長のカリクレ
インmRNAに相当することが示避九た。
参考例1 ラットカリクレインcDNAクローに&
ン’9’1g/の作成
a)mRNAのv4製
ラット膵IQIUr片をグアジニルチオシアネートとと
もにホモジナイズし、Ce1l XF衡田W勾配M遠心
によって全RNAを分離する。ついで、常法によりこれ
をオリゴ(dT)セルロースカラムクロマトグラフィー
で精製し、ポリ(幻含有RNAを単離する(mRNA原
料)。
もにホモジナイズし、Ce1l XF衡田W勾配M遠心
によって全RNAを分離する。ついで、常法によりこれ
をオリゴ(dT)セルロースカラムクロマトグラフィー
で精製し、ポリ(幻含有RNAを単離する(mRNA原
料)。
b) c D N A Bankの調製このmRN
A原料よプ、岡山とBe rgの方法(Mo1ecul
ar ancl 0rllu’lar Biology
+2/ !a/−/70./91コ)Kよって、cD
NAライブラリーを得る。すなわち、pBR3−一とB
V’IOのハイブリッドプラスミドを用いてオリゴ(d
T)テールをもつベクタープライマ・−とオリゴ(dG
)テールリンカ−を得る。このベクタークライマーと
上記mRNA共存下に逆転写酵素を作用させてcDNA
)p合成し、その後?i+lJ限酵素H1nd lで消
化し、ついで上記リンカ−を用いて環化させる。その後
、mRNA部分をDNAで直換して、cDNAフラグメ
ント含有グ含有グラスミドラ ついで、常法によりこれケ大腸■に形質尋人し、アンピ
シリン耐性株を取得する。
A原料よプ、岡山とBe rgの方法(Mo1ecul
ar ancl 0rllu’lar Biology
+2/ !a/−/70./91コ)Kよって、cD
NAライブラリーを得る。すなわち、pBR3−一とB
V’IOのハイブリッドプラスミドを用いてオリゴ(d
T)テールをもつベクタープライマ・−とオリゴ(dG
)テールリンカ−を得る。このベクタークライマーと
上記mRNA共存下に逆転写酵素を作用させてcDNA
)p合成し、その後?i+lJ限酵素H1nd lで消
化し、ついで上記リンカ−を用いて環化させる。その後
、mRNA部分をDNAで直換して、cDNAフラグメ
ント含有グ含有グラスミドラ ついで、常法によりこれケ大腸■に形質尋人し、アンピ
シリン耐性株を取得する。
c)cDNAライブラリーのスクリーニングMacdo
naldによって明らかにされたラットカリクレインc
DNAのアミノ酸配列の/部Met −Leu −Le
u −Hls −Leu K対するcDNATあるj’
−AGGT()GAGOAGOAT−,7”k化学合
成した。
naldによって明らかにされたラットカリクレインc
DNAのアミノ酸配列の/部Met −Leu −Le
u −Hls −Leu K対するcDNATあるj’
−AGGT()GAGOAGOAT−,7”k化学合
成した。
この合a D N A Yグローブとして用いて、上記
のQDNAライブラリーの一部の14oo。
のQDNAライブラリーの一部の14oo。
イ固のトランスフォーマントをスクリーニングし相補性
のめるクローンを1個選択する。
のめるクローンを1個選択する。
すCDNAの同定
a) プラスミドDNAの単離
得られたポジティブクローンをM?場地にて培養し、常
法によりプラスミドDNAY単離する。その後0ecl
l平衡密度勾配超遠心によって、CCフオームのグラス
ミドDNA’4単延する。
法によりプラスミドDNAY単離する。その後0ecl
l平衡密度勾配超遠心によって、CCフオームのグラス
ミドDNA’4単延する。
この断片の制限酵素地図を作り、既知のラツインと同一
のものであることが判明した(図そこでこのi/ff〆
/のクローンのcDNAa#片の塩基配列を決定した。
のものであることが判明した(図そこでこのi/ff〆
/のクローンのcDNAa#片の塩基配列を決定した。
このクローンはラット膵臓カリクレインのコ一番目のグ
リシンのコドンから終結コドンまでの64!を塩基対及
び3′末端の非翻訳羨城qS−基対の計693地基対を
含むクローンであることが明らかとなった。
リシンのコドンから終結コドンまでの64!を塩基対及
び3′末端の非翻訳羨城qS−基対の計693地基対を
含むクローンであることが明らかとなった。
(発明の効果)
本発明に係るDNAFIjr片は、遺伝子組み換えによ
るヒトカリクレインの産生に’N用である。
るヒトカリクレインの産生に’N用である。
図7及びコは、それぞれ不発明K IMるcDNA断片
のl!III限酵禦地図並びに塩基配列(及びそれより
想定されるアミノ酸配列)を示す。 す。 代 理 人 弁理士 長谷用 − ほか7名 巳−2
のl!III限酵禦地図並びに塩基配列(及びそれより
想定されるアミノ酸配列)を示す。 す。 代 理 人 弁理士 長谷用 − ほか7名 巳−2
Claims (2)
- (1)ヒトカリクレイン又はそれと同等の生理活性を有
するヒトカリクレイン様物質をコードするDNAを含有
するDNA断片。 - (2)下記の塩基配列、その塩基の一部が置換もしくは
削除され、又は塩基が付加された塩基配列を有する特許
請求の範囲第1項記載のDNA断片。 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26545485A JPS62126980A (ja) | 1985-11-26 | 1985-11-26 | Dna断片 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26545485A JPS62126980A (ja) | 1985-11-26 | 1985-11-26 | Dna断片 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62126980A true JPS62126980A (ja) | 1987-06-09 |
Family
ID=17417386
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP26545485A Pending JPS62126980A (ja) | 1985-11-26 | 1985-11-26 | Dna断片 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS62126980A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01300893A (ja) * | 1988-05-27 | 1989-12-05 | Shigetada Nakanishi | ヒトカリクレイン様蛋白質の産生方法 |
JPH01503679A (ja) * | 1987-06-30 | 1989-12-14 | アムジエン・インコーポレーテツド | カリクレインの生産 |
WO1998020117A1 (en) * | 1996-11-05 | 1998-05-14 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Prostate-specific kallikrein |
-
1985
- 1985-11-26 JP JP26545485A patent/JPS62126980A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HOPPE-SEYLER'S Z. PHYSIOL.CHEM=1979 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01503679A (ja) * | 1987-06-30 | 1989-12-14 | アムジエン・インコーポレーテツド | カリクレインの生産 |
JPH01300893A (ja) * | 1988-05-27 | 1989-12-05 | Shigetada Nakanishi | ヒトカリクレイン様蛋白質の産生方法 |
JPH0448432B2 (ja) * | 1988-05-27 | 1992-08-06 | Shigetada Nakanishi | |
WO1998020117A1 (en) * | 1996-11-05 | 1998-05-14 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Prostate-specific kallikrein |
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