JPS62126980A - Ｄｎａ断片 - Google Patents
Ｄｎａ断片Info
- Publication number
- JPS62126980A JPS62126980A JP26545485A JP26545485A JPS62126980A JP S62126980 A JPS62126980 A JP S62126980A JP 26545485 A JP26545485 A JP 26545485A JP 26545485 A JP26545485 A JP 26545485A JP S62126980 A JPS62126980 A JP S62126980A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- mrna
- cdna
- fragment
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6445—Kallikreins (3.4.21.34; 3.4.21.35)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ヒトカリクレイン又はそれと同等の生理活性
を有するヒトカリクレイン様物５ＭをコードするＤＮＡ
を含有するＤＮＡ断片に関する。
を有するヒトカリクレイン様物５ＭをコードするＤＮＡ
を含有するＤＮＡ断片に関する。
（従来の技術）
カリクレインはセリングロテアーゼの１群を占める酵素
でるり、血圧調節、炎症反応に関与するキニンをその前
駆体であるキニノーゲンより切り出す１妥な酵素でめる
。又、臨床医学においてもカリクレインは血止低下剤と
して現在頻繁に開用されている薬剤ではめるが、そのも
のはいずれも部分舗装したものＫすぎない。
でるり、血圧調節、炎症反応に関与するキニンをその前
駆体であるキニノーゲンより切り出す１妥な酵素でめる
。又、臨床医学においてもカリクレインは血止低下剤と
して現在頻繁に開用されている薬剤ではめるが、そのも
のはいずれも部分舗装したものＫすぎない。
マクトＹルド
カリクレインは最近、８ｃｈｉｎａ及びＭａｃａｏｎａ
ｌｄＫ砿よ りｉｏｌ、 Ｏｈｅｍ、、２ｊ７．２７３ｇ−２７６１
，／９１コ及びＰｒｏａ。
ｌｄＫ砿よ りｉｏｌ、 Ｏｈｅｍ、、２ｊ７．２７３ｇ−２７６１
，／９１コ及びＰｒｏａ。
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、 ＵＳＡ、−７
９，？コ４７−７２６７、／９１．２ ）。
９，？コ４７−７２６７、／９１．２ ）。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明者は、ヒトカリクレインを産生ずるために必要な
ヒ） ｃ ＤｌｉＡを得るべく検討２行ない、本発明に
到通した。
ヒ） ｃ ＤｌｉＡを得るべく検討２行ない、本発明に
到通した。
（問題点を解決するための手段）
すなわち、本発明の要旨は、ヒトカリクレイン又はそれ
と同等の生理活性を有するヒトカリクレイン様物質をコ
ードするＤＮＡ１に含有するＤＮＡ断片［Ｊ＋る。以下
、本発明の詳細な説明する。
と同等の生理活性を有するヒトカリクレイン様物質をコ
ードするＤＮＡ１に含有するＤＮＡ断片［Ｊ＋る。以下
、本発明の詳細な説明する。
まず、本発明ンこ議るＤＮＡＷｒ片は次のような方法に
よってａ１４製される◎ ／）ｃＤＮＡの率庵 ａ）ｍＲＮＡの、Ｖ４螢 ヒト膵臓断片をグアジニルチオシアネートとともにホモ
ジナイズし、Ｃａ１ｌ平衡密度勾配超遠心によって全Ｒ
ＮＡを分離する。
よってａ１４製される◎ ／）ｃＤＮＡの率庵 ａ）ｍＲＮＡの、Ｖ４螢 ヒト膵臓断片をグアジニルチオシアネートとともにホモ
ジナイズし、Ｃａ１ｌ平衡密度勾配超遠心によって全Ｒ
ＮＡを分離する。
ついで、常法によりこれをオリゴ（ｄＴ）セルロースカ
ラムクロマトグラフィーで梢装し、ポリ（Ａ）含有ＲＩ
ＪＡ’ｇ単陥する（ ｍＲＮＡ原料）。
ラムクロマトグラフィーで梢装し、ポリ（Ａ）含有ＲＩ
ＪＡ’ｇ単陥する（ ｍＲＮＡ原料）。
ｂ）ｃＤＮＡライブラリーの調整
法（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ２．１６／〜／り０．／９１コ）に
よって、ｃ ＤＮＡライブラリーを得る。すなわち、ｐ
ＢＲ３，２−とＢＶ＠０のハイブリッドプラスミツドを
用いて、オリゴ（ｄＴ）テールをもつベクタープライマ
ーとオリゴ（ｄＧ）テールリンカ−を得る。このベクタ
ープライマーと上記ｍＲＮＡ共存下に逆転写酵素を作用
↓ さぜｃＤＮＡを合成し、その後制限酵素Ｈ１ｎｄ ｌで
消化し、ついで上ｄピリンカーを用いて環化させる。そ
の後ｍＲＮＡ部分をＤＮＡで置換して、ｃＤＮＡフラグ
メント含有プラスミド？：得る。
Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ２．１６／〜／り０．／９１コ）に
よって、ｃ ＤＮＡライブラリーを得る。すなわち、ｐ
ＢＲ３，２−とＢＶ＠０のハイブリッドプラスミツドを
用いて、オリゴ（ｄＴ）テールをもつベクタープライマ
ーとオリゴ（ｄＧ）テールリンカ−を得る。このベクタ
ープライマーと上記ｍＲＮＡ共存下に逆転写酵素を作用
↓ さぜｃＤＮＡを合成し、その後制限酵素Ｈ１ｎｄ ｌで
消化し、ついで上ｄピリンカーを用いて環化させる。そ
の後ｍＲＮＡ部分をＤＮＡで置換して、ｃＤＮＡフラグ
メント含有プラスミド？：得る。
ついで、常法によりこれｔ大腸−く形質導入し、アンピ
シリン耐性株を取得する・ｃ）ｃＤＮムライブラリ−の
スクリーニング参考例／の方法により早跪される２ソト
プロープとして用いて、上記のｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングし相補性のめるクローンを璃択する。
シリン耐性株を取得する・ｃ）ｃＤＮムライブラリ−の
スクリーニング参考例／の方法により早跪される２ソト
プロープとして用いて、上記のｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングし相補性のめるクローンを璃択する。
コ） ｃＤＮＡの同定
ａ）グラスミツドＤＮＡの単離
得られたポジティブクローンをＭ？ｍ地にて培養し、常
法によりグラスミドＤＮＡｙａｌ−準脂する。その１０
８０１平衡密度勾配超遠心によって、ＣＣフオームのグ
ラスミドＤＮＡを単層する。
法によりグラスミドＤＮＡｙａｌ−準脂する。その１０
８０１平衡密度勾配超遠心によって、ＣＣフオームのグ
ラスミドＤＮＡを単層する。
ｂ）塩基配列の決定
得られたグラスミツドＤ Ｎ ＡよりｃＤＮムフラグメ
ント乞抽出し、に法により１ｆｌｌＪ限酵素地図乞作製
する。図／の地図に基づいてＭａ ＸＩＬｍとＧ１）ｂ
ｅｒｔの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ １ｎＥｎｚｙｍｏ１ｏ
ｇ、４）、、ｔ９９〜ｓ＆０．７９ＩＯ）によって、塩
基Ｃｅ列を決定する。
ント乞抽出し、に法により１ｆｌｌＪ限酵素地図乞作製
する。図／の地図に基づいてＭａ ＸＩＬｍとＧ１）ｂ
ｅｒｔの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ １ｎＥｎｚｙｍｏ１ｏ
ｇ、４）、、ｔ９９〜ｓ＆０．７９ＩＯ）によって、塩
基Ｃｅ列を決定する。
Ｊ）ＲＮＡプロット分析
ｍＲＮＡｃＤ佃出はＦｉｌｌ記の方法に従うことができ
る。ＰＯ１７（Ａ） ＲＮ Ａを／ Ｍ ｇｌｙｏｘａ
ｌ、４０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドにて変性し
た後／俤アガロースゲルにて電気泳動した。
る。ＰＯ１７（Ａ） ＲＮ Ａを／ Ｍ ｇｌｙｏｘａ
ｌ、４０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドにて変性し
た後／俤アガロースゲルにて電気泳動した。
Ｍｅ ＭａｓｔｅｒとＯａｒｍｉｃｈａｅｌ の方法
（Ｐｒｏｃ。
（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ７ａ 、ａざｊ、ｔ
、 ／９７り）によりジアゾベンジルオキシメチル紙に
ＲＮＡ’ｌｌトランスファーする。
、 ／９７り）によりジアゾベンジルオキシメチル紙に
ＲＮＡ’ｌｌトランスファーする。
ハイブリダイジェーションと洗浄はＡｌｗｉｎｅらの方
法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ％Ｓｃｉイ？＜ｃ
、！８０１／タック）Ｋ従９ことができる。
法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ％Ｓｃｉイ？＜ｃ
、！８０１／タック）Ｋ従９ことができる。
／？７ｊ）に従う。
得られるＤＮＡｌｌ１片は、ヒトカリクレイン又はそれ
と同等の生理活性を有するヒトカリクレイン様物質をコ
ードするＤＮＡを含肩する。
と同等の生理活性を有するヒトカリクレイン様物質をコ
ードするＤＮＡを含肩する。
その−例Ｙ図−に示すが、本発明に係るＤＮＡ断片は必
ずしもこれと同一の塩−＄配列を有すること？要求され
ず、該ＤＮＡ１Ｉ／ｒ片に苫まれるＤＮＡによってコー
ドされる物質が、ヒトカリクレインと同等の生理活性を
有するヒトカリクレイン様物質でろれば、該塩基配列の
一部が置換もしくは削除され又は塩基が付加された塩基
配列でめってもよい。
ずしもこれと同一の塩−＄配列を有すること？要求され
ず、該ＤＮＡ１Ｉ／ｒ片に苫まれるＤＮＡによってコー
ドされる物質が、ヒトカリクレインと同等の生理活性を
有するヒトカリクレイン様物質でろれば、該塩基配列の
一部が置換もしくは削除され又は塩基が付加された塩基
配列でめってもよい。
本発明に係るＤＮＡ断片は、常法により発現ベクターの
クローニング部位に導入することによって、これを鋳型
とする翻訳によりヒトカリクレイン又はヒトカリクレイ
ン様物質、あるいはこれｔ含む融合蛋白を得ることがで
きる。
クローニング部位に導入することによって、これを鋳型
とする翻訳によりヒトカリクレイン又はヒトカリクレイ
ン様物質、あるいはこれｔ含む融合蛋白を得ることがで
きる。
得られるヒトカリクレイン等は、血圧低下剤として用い
ることができる。
ることができる。
明するが、本発明は、七〇賢旨を超えない限り以下の実
施例により限定されない。
施例により限定されない。
なお、実施例において、制限酵素、修飾酵素等の処理は
、これらの試薬の装造・販売者（宝酒造株式会社、Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ）の指示書に従
って行なった。
、これらの試薬の装造・販売者（宝酒造株式会社、Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ）の指示書に従
って行なった。
実施例／
ｆｉ＋ ヒト膵臓切片乞准体窒素で破砕した後グアニ
ジニウムチオシアネート水浴液？添加しホモジナイズし
た。得られたホモジネートを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの方
法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 ／ ｔ 。
ジニウムチオシアネート水浴液？添加しホモジナイズし
た。得られたホモジネートを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの方
法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 ／ ｔ 。
１２？４’−！；２９９． ／９７？ ） Ｋ ｌ、た
がって、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心によって全１
（ＮＡ％−停船した。ついで、常法によりこれヶオリゴ
（（ｉＴ）セルロースカラムクロマトグラフィーで村製
し、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡ涼料とし
た。
がって、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心によって全１
（ＮＡ％−停船した。ついで、常法によりこれヶオリゴ
（（ｉＴ）セルロースカラムクロマトグラフィーで村製
し、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡ涼料とし
た。
（２） 一方、岡山とＢｅｒｇの方法（Ｍｏ１ｅｃｕ
ｘａｒａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙコ、
／Ａ／−／７０゜１ｑｔａ ）により、ｐＢＲ，？Ｊｕ
と５ｖｕｏのハイブリッドプラスミドを用いて、ベクタ
ープライマーとオリゴ（ｄＧ ）テールリンカ−を得た
。すなわち、ｐＢＲＪココとＳＶ弘Ｏ（マツプユニット
０．７ ／−０，１４）のハイブリッドプラスミド４１
ＯＯμｇを、ウシ血清アルブミンを言む緩衝液中で制御
衣酵素ｊ通１で３７℃、９時間消化させた。
ｘａｒａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙコ、
／Ａ／−／７０゜１ｑｔａ ）により、ｐＢＲ，？Ｊｕ
と５ｖｕｏのハイブリッドプラスミドを用いて、ベクタ
ープライマーとオリゴ（ｄＧ ）テールリンカ−を得た
。すなわち、ｐＢＲＪココとＳＶ弘Ｏ（マツプユニット
０．７ ／−０，１４）のハイブリッドプラスミド４１
ＯＯμｇを、ウシ血清アルブミンを言む緩衝液中で制御
衣酵素ｊ通１で３７℃、９時間消化させた。
ついで、常ｆ−によりエタノール沈澱によってＤＮＡを
回収し、これをｄＴＴＰを會む緩ｆＩ液に溶解し、ター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを重
加して、３７℃で３０分間反応させて、制限＃索岱１の
消化部位に約６０個のαＴデテール付加させた後、エタ
ノール沈諏によりＤＮＡケ回収した。ついで、このＤＮ
Ａ７ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で、制限酵素）
（ｐａ ｌにより消化した（３７℃、Ｓ時間）。大きい
方のＤＮＡ町片を、アガロースゲル電気泳動により祠製
し、ガラスパウダー法（Ｖｏｇｓｌｓｔｅｉｎら、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、８ｃｉ、Ｕ、８．Ａ、
、 ７６、 ＡＩ！ｔ −４／９．／９’；／９）
ＶＣよって回収した。その後、このＤ Ｎ Ａ’４０℃
でオリゴ（ａａ）セルロースカラムに付し、水で浴出さ
せた後、エタノールで回収し、オリゴ（ｄＴ）テールを
イするベクタープライマーを得た。
回収し、これをｄＴＴＰを會む緩ｆＩ液に溶解し、ター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを重
加して、３７℃で３０分間反応させて、制限＃索岱１の
消化部位に約６０個のαＴデテール付加させた後、エタ
ノール沈諏によりＤＮＡケ回収した。ついで、このＤＮ
Ａ７ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中で、制限酵素）
（ｐａ ｌにより消化した（３７℃、Ｓ時間）。大きい
方のＤＮＡ町片を、アガロースゲル電気泳動により祠製
し、ガラスパウダー法（Ｖｏｇｓｌｓｔｅｉｎら、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、８ｃｉ、Ｕ、８．Ａ、
、 ７６、 ＡＩ！ｔ −４／９．／９’；／９）
ＶＣよって回収した。その後、このＤ Ｎ Ａ’４０℃
でオリゴ（ａａ）セルロースカラムに付し、水で浴出さ
せた後、エタノールで回収し、オリゴ（ｄＴ）テールを
イするベクタープライマーを得た。
他方、ｐＢＲｊ！−とＳＶダＯ（マップユ二ソトＱ、７
９〜０．３コ）とのハイブリッドプラスミド１００μｙ
をウシ血清アルブミンを含むυ伽液中で、制限酵素り匹
１により消化した（３７℃、７時１ｉ１半）、）ついで
、ＤＮＡを回収し、ｄＧＴＰＹ含む緩衝液に溶解し、タ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ？
添加して、３７℃で１０分間反応させ、約１０〜／ｊの
ｄＧデテール付加させた。回収したＤＮＡを、ウシ血７
かアルブミンを汁む＃働液中で割限酵素本ｑｄ屋により
消化させ（，７７’Ｃ１／時間）、ついでアガロースゲ
ル（／、ｆ％）電気泳動に付し、小さいオリゴ（ｄＧ）
テールリンカ−ＤＮＡを抽出、回収した。
９〜０．３コ）とのハイブリッドプラスミド１００μｙ
をウシ血清アルブミンを含むυ伽液中で、制限酵素り匹
１により消化した（３７℃、７時１ｉ１半）、）ついで
、ＤＮＡを回収し、ｄＧＴＰＹ含む緩衝液に溶解し、タ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ？
添加して、３７℃で１０分間反応させ、約１０〜／ｊの
ｄＧデテール付加させた。回収したＤＮＡを、ウシ血７
かアルブミンを汁む＃働液中で割限酵素本ｑｄ屋により
消化させ（，７７’Ｃ１／時間）、ついでアガロースゲ
ル（／、ｆ％）電気泳動に付し、小さいオリゴ（ｄＧ）
テールリンカ−ＤＮＡを抽出、回収した。
Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙコ、／ｌ、／ −／
７０．／９１コ）により、ＣＤＩＪＡライブラリーを得
た・すなわち、Ｔｒｉｓ−Ｍ（１！ｌ（ｐＨｒ、 Ｊ
） 、ＭｇＯ１ｔ、ＫＯｌ、ジチオスレイトール、ｔｉ
ＡＴＰ、（ｉＴＴＰ、ｄＧＴＰ及び［”Ｐ〕ｄ ＯＴ
Ｐを含む水浴液に上記（１）で得られたｍＲＮＡＪＯμ
ｙｌと上記（２）で得られたベクタープライマー１０μ
Ｉを添加して、逆転写酵素の存在下に３７℃、１０分間
、反応させ、プラスミド−ｃＤＮＡ：＋ｎＲＮＡを合成
し、これ！エタノール沈澱しベレット状で回収した。こ
のベレットをＩＥ ｏ Ｏ１ｔ ｓ ジチオスレイトー
ル、ポリ（Ａ）、（”Ｐ）ｄＯＴＰ及びターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーセを含有する緩衝
液ｌｌ′ｃ浴解し溶解７℃、７０分［…反応させ、末端
めたシｄＯＭＦの１０〜１５の残基を付加させた。つい
で、回収したオリゴ（ａＣ）テールグラスミド−ｃＤＮ
Ａ ：ｍＲＮＡを官有するベレットｔウシｌ１ｌｌ ｌ
’ｌｌｔアルブゝミンを甘む緩衝液に浴解し、制限＃素
復、ｎｄ ｌで３７′Ｃ１／時間消化し、エタノール沈
澱により、町、ｎｄｌτ白化オリゴ（ａＣ）テールｃＤ
ＮＡ：ｎ＋ＲＮＡグラスミドを回収し九。これＹ Ｐｉ
ＩＪ記（２１で得られたオリゴ（ｄＧ ）テールリンカ
−ＤＮＡを含む緩衝液に浴解し、ｂｓ℃、−分間インキ
ュベートし、さらに４１−℃、３０分間保持し、ｏ ’
ｃ ｆで冷却した。ついで、／−ＮＡＤにコチンアデニ
ンジヌクレチド〕存在下、大８菌（Ｌｃａｌｉ） Ｄ
Ｎ Ａリガーゼな加えて、−夜インキユペートした。そ
の後、ａＡＴＰ、ｃｔ’ｒＴＰ、ｄＧＴＰＳｄＯＴＰ、
β−Ｎ Ａ Ｄ 、 Ｅ。
７０．／９１コ）により、ＣＤＩＪＡライブラリーを得
た・すなわち、Ｔｒｉｓ−Ｍ（１！ｌ（ｐＨｒ、 Ｊ
） 、ＭｇＯ１ｔ、ＫＯｌ、ジチオスレイトール、ｔｉ
ＡＴＰ、（ｉＴＴＰ、ｄＧＴＰ及び［”Ｐ〕ｄ ＯＴ
Ｐを含む水浴液に上記（１）で得られたｍＲＮＡＪＯμ
ｙｌと上記（２）で得られたベクタープライマー１０μ
Ｉを添加して、逆転写酵素の存在下に３７℃、１０分間
、反応させ、プラスミド−ｃＤＮＡ：＋ｎＲＮＡを合成
し、これ！エタノール沈澱しベレット状で回収した。こ
のベレットをＩＥ ｏ Ｏ１ｔ ｓ ジチオスレイトー
ル、ポリ（Ａ）、（”Ｐ）ｄＯＴＰ及びターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーセを含有する緩衝
液ｌｌ′ｃ浴解し溶解７℃、７０分［…反応させ、末端
めたシｄＯＭＦの１０〜１５の残基を付加させた。つい
で、回収したオリゴ（ａＣ）テールグラスミド−ｃＤＮ
Ａ ：ｍＲＮＡを官有するベレットｔウシｌ１ｌｌ ｌ
’ｌｌｔアルブゝミンを甘む緩衝液に浴解し、制限＃素
復、ｎｄ ｌで３７′Ｃ１／時間消化し、エタノール沈
澱により、町、ｎｄｌτ白化オリゴ（ａＣ）テールｃＤ
ＮＡ：ｎ＋ＲＮＡグラスミドを回収し九。これＹ Ｐｉ
ＩＪ記（２１で得られたオリゴ（ｄＧ ）テールリンカ
−ＤＮＡを含む緩衝液に浴解し、ｂｓ℃、−分間インキ
ュベートし、さらに４１−℃、３０分間保持し、ｏ ’
ｃ ｆで冷却した。ついで、／−ＮＡＤにコチンアデニ
ンジヌクレチド〕存在下、大８菌（Ｌｃａｌｉ） Ｄ
Ｎ Ａリガーゼな加えて、−夜インキユペートした。そ
の後、ａＡＴＰ、ｃｔ’ｒＴＰ、ｄＧＴＰＳｄＯＴＰ、
β−Ｎ Ａ Ｄ 、 Ｅ。
ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｆ、、 ｃｏｌｉ Ｄ Ｎ
Ａポリメラーゼ及びＲｃｏｌｉ ＲＮａｓθＨをめ＼加
して、この混合物Ｙ／−′Ｃ１／時間、次いで室温で７
時間インキュベートした後、冷却し、反応を停止させ目
的とするｃＤＮＡ＃片含有プラスミ ドＹ得た。
Ａポリメラーゼ及びＲｃｏｌｉ ＲＮａｓθＨをめ＼加
して、この混合物Ｙ／−′Ｃ１／時間、次いで室温で７
時間インキュベートした後、冷却し、反応を停止させ目
的とするｃＤＮＡ＃片含有プラスミ ドＹ得た。
（４１ついで、このグラスミドを用いてイ法（’ Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎｇ ’ 、 Ｃｏ１ｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ／
？ ｔコ、ｐ２（４９−照。）によシ、大腸菌（ル、
０Ｏ１ｉ） ＨＢ ／ ０ ／ケ形質転４させ之・ 一部として用いてスクリーニングし、ポジティブシグナ
ル？与えるクロー７７７個を取得した。これらのクロー
ンのうち、ｉ＆長のｃＤ絆 ＩＪ Ａ断片？もつクローンｐｈＪＩＸコｊを選び、こ
のプラスミドＤＮＡ１＄、ｉＩＩした。このｃＤＮＡ断
片の制限酵素地図２作製しく図／）、これを基にｃＤＮ
Ａ的Ｅ片の塩基配列をＭａｘａｍとＧ１）ｂｅｒｔの力
云により決定した。
１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎｇ ’ 、 Ｃｏ１ｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ／
？ ｔコ、ｐ２（４９−照。）によシ、大腸菌（ル、
０Ｏ１ｉ） ＨＢ ／ ０ ／ケ形質転４させ之・ 一部として用いてスクリーニングし、ポジティブシグナ
ル？与えるクロー７７７個を取得した。これらのクロー
ンのうち、ｉ＆長のｃＤ絆 ＩＪ Ａ断片？もつクローンｐｈＪＩＸコｊを選び、こ
のプラスミドＤＮＡ１＄、ｉＩＩした。このｃＤＮＡ断
片の制限酵素地図２作製しく図／）、これを基にｃＤＮ
Ａ的Ｅ片の塩基配列をＭａｘａｍとＧ１）ｂｅｒｔの力
云により決定した。
Ｉｔ／塩基対よりなるｃＤＮＡの塩基配列は図λの通り
である。プライマー延長法によｋ りこのｐｈ４２！ｒのｃＤＮＡはほぼ児全長のカリクレ
インｍＲＮＡに相当することが示避九た。
である。プライマー延長法によｋ りこのｐｈ４２！ｒのｃＤＮＡはほぼ児全長のカリクレ
インｍＲＮＡに相当することが示避九た。
参考例１ ラットカリクレインｃＤＮＡクローに＆
ン’９’１ｇ／の作成
ａ）ｍＲＮＡのｖ４製
ラット膵ＩＱＩＵｒ片をグアジニルチオシアネートとと
もにホモジナイズし、Ｃｅ１ｌ ＸＦ衡田Ｗ勾配Ｍ遠心
によって全ＲＮＡを分離する。ついで、常法によりこれ
をオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラフィー
で精製し、ポリ（幻含有ＲＮＡを単離する（ｍＲＮＡ原
料）。
もにホモジナイズし、Ｃｅ１ｌ ＸＦ衡田Ｗ勾配Ｍ遠心
によって全ＲＮＡを分離する。ついで、常法によりこれ
をオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラフィー
で精製し、ポリ（幻含有ＲＮＡを単離する（ｍＲＮＡ原
料）。
ｂ） ｃ Ｄ Ｎ Ａ Ｂａｎｋの調製このｍＲＮ
Ａ原料よプ、岡山とＢｅ ｒｇの方法（Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｃｌ ０ｒｌｌｕ’ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
＋２／ ！ａ／−／７０．／９１コ）Ｋよって、ｃＤ
ＮＡライブラリーを得る。すなわち、ｐＢＲ３−一とＢ
Ｖ’ＩＯのハイブリッドプラスミドを用いてオリゴ（ｄ
Ｔ）テールをもつベクタープライマ・−とオリゴ（ｄＧ
）テールリンカ−を得る。このベクタークライマーと
上記ｍＲＮＡ共存下に逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡ
）ｐ合成し、その後？ｉ＋ｌＪ限酵素Ｈ１ｎｄ ｌで消
化し、ついで上記リンカ−を用いて環化させる。その後
、ｍＲＮＡ部分をＤＮＡで直換して、ｃＤＮＡフラグメ
ント含有グ含有グラスミドラ ついで、常法によりこれケ大腸■に形質尋人し、アンピ
シリン耐性株を取得する。
Ａ原料よプ、岡山とＢｅ ｒｇの方法（Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｃｌ ０ｒｌｌｕ’ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
＋２／ ！ａ／−／７０．／９１コ）Ｋよって、ｃＤ
ＮＡライブラリーを得る。すなわち、ｐＢＲ３−一とＢ
Ｖ’ＩＯのハイブリッドプラスミドを用いてオリゴ（ｄ
Ｔ）テールをもつベクタープライマ・−とオリゴ（ｄＧ
）テールリンカ−を得る。このベクタークライマーと
上記ｍＲＮＡ共存下に逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡ
）ｐ合成し、その後？ｉ＋ｌＪ限酵素Ｈ１ｎｄ ｌで消
化し、ついで上記リンカ−を用いて環化させる。その後
、ｍＲＮＡ部分をＤＮＡで直換して、ｃＤＮＡフラグメ
ント含有グ含有グラスミドラ ついで、常法によりこれケ大腸■に形質尋人し、アンピ
シリン耐性株を取得する。
ｃ）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングＭａｃｄｏ
ｎａｌｄによって明らかにされたラットカリクレインｃ
ＤＮＡのアミノ酸配列の／部Ｍｅｔ −Ｌｅｕ −Ｌｅ
ｕ −Ｈｌｓ −Ｌｅｕ Ｋ対するｃＤＮＡＴあるｊ’
−ＡＧＧＴ（）ＧＡＧＯＡＧＯＡＴ−，７”ｋ化学合
成した。
ｎａｌｄによって明らかにされたラットカリクレインｃ
ＤＮＡのアミノ酸配列の／部Ｍｅｔ −Ｌｅｕ −Ｌｅ
ｕ −Ｈｌｓ −Ｌｅｕ Ｋ対するｃＤＮＡＴあるｊ’
−ＡＧＧＴ（）ＧＡＧＯＡＧＯＡＴ−，７”ｋ化学合
成した。
この合ａ Ｄ Ｎ Ａ Ｙグローブとして用いて、上記
のＱＤＮＡライブラリーの一部の１４ｏｏ。
のＱＤＮＡライブラリーの一部の１４ｏｏ。
イ固のトランスフォーマントをスクリーニングし相補性
のめるクローンを１個選択する。
のめるクローンを１個選択する。
すＣＤＮＡの同定
ａ） プラスミドＤＮＡの単離
得られたポジティブクローンをＭ？場地にて培養し、常
法によりプラスミドＤＮＡＹ単離する。その後０ｅｃｌ
ｌ平衡密度勾配超遠心によって、ＣＣフオームのグラス
ミドＤＮＡ’４単延する。
法によりプラスミドＤＮＡＹ単離する。その後０ｅｃｌ
ｌ平衡密度勾配超遠心によって、ＣＣフオームのグラス
ミドＤＮＡ’４単延する。
この断片の制限酵素地図を作り、既知のラツインと同一
のものであることが判明した（図そこでこのｉ／ｆｆ〆
／のクローンのｃＤＮＡａ＃片の塩基配列を決定した。
のものであることが判明した（図そこでこのｉ／ｆｆ〆
／のクローンのｃＤＮＡａ＃片の塩基配列を決定した。
このクローンはラット膵臓カリクレインのコ一番目のグ
リシンのコドンから終結コドンまでの６４！を塩基対及
び３′末端の非翻訳羨城ｑＳ−基対の計６９３地基対を
含むクローンであることが明らかとなった。
リシンのコドンから終結コドンまでの６４！を塩基対及
び３′末端の非翻訳羨城ｑＳ−基対の計６９３地基対を
含むクローンであることが明らかとなった。
（発明の効果）
本発明に係るＤＮＡＦＩｊｒ片は、遺伝子組み換えによ
るヒトカリクレインの産生に’Ｎ用である。
るヒトカリクレインの産生に’Ｎ用である。
図７及びコは、それぞれ不発明Ｋ ＩＭるｃＤＮＡ断片
のｌ！ＩＩＩ限酵禦地図並びに塩基配列（及びそれより
想定されるアミノ酸配列）を示す。 す。 代 理 人 弁理士 長谷用 − ほか７名 巳−２
のｌ！ＩＩＩ限酵禦地図並びに塩基配列（及びそれより
想定されるアミノ酸配列）を示す。 す。 代 理 人 弁理士 長谷用 − ほか７名 巳−２
Claims (2)
- （１）ヒトカリクレイン又はそれと同等の生理活性を有
するヒトカリクレイン様物質をコードするＤＮＡを含有
するＤＮＡ断片。 - （２）下記の塩基配列、その塩基の一部が置換もしくは
削除され、又は塩基が付加された塩基配列を有する特許
請求の範囲第１項記載のＤＮＡ断片。 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26545485A JPS62126980A (ja) | 1985-11-26 | 1985-11-26 | Ｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26545485A JPS62126980A (ja) | 1985-11-26 | 1985-11-26 | Ｄｎａ断片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62126980A true JPS62126980A (ja) | 1987-06-09 |
Family
ID=17417386
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26545485A Pending JPS62126980A (ja) | 1985-11-26 | 1985-11-26 | Ｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62126980A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01300893A (ja) * | 1988-05-27 | 1989-12-05 | Shigetada Nakanishi | ヒトカリクレイン様蛋白質の産生方法 |
| JPH01503679A (ja) * | 1987-06-30 | 1989-12-14 | アムジエン・インコーポレーテツド | カリクレインの生産 |
| WO1998020117A1 (en) * | 1996-11-05 | 1998-05-14 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Prostate-specific kallikrein |
-
1985
- 1985-11-26 JP JP26545485A patent/JPS62126980A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HOPPE-SEYLER'S Z. PHYSIOL.CHEM=1979 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01503679A (ja) * | 1987-06-30 | 1989-12-14 | アムジエン・インコーポレーテツド | カリクレインの生産 |
| JPH01300893A (ja) * | 1988-05-27 | 1989-12-05 | Shigetada Nakanishi | ヒトカリクレイン様蛋白質の産生方法 |
| JPH0448432B2 (ja) * | 1988-05-27 | 1992-08-06 | Shigetada Nakanishi | |
| WO1998020117A1 (en) * | 1996-11-05 | 1998-05-14 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Prostate-specific kallikrein |
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