JPS62116262A - Method and kit for quantifying terminal peptide of human i-type procollagen c - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To enable rapid quantification with high sensitivity, by preparing a monoclonal antibody specifically reacted with the terminal of procollagen C. CONSTITUTION:A specimen is simultaneously reacted with an anti-procollagen C terminal antibody or antibody fragment binding solid phase substance and an enzyme labelled anti-procollagen C terminal antibody or antibody fragment in one process and the sandwich structure of the procollagen C terminal in the specimen is formed between the solid phase antibody or antibody fragment and the enzyme labelled antibody or antibody fragment. Next, the enzyme on the obtained sandwich is reacted with a substrate specific to said enzyme and enzymatic activity is measured. By this method, a procollagen C terminal amount can be rapidly quantified within about 1hr with high sensitivity.

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒトＩ型プロコラーゲンＣ末端ペプチド（以下
プロコラーゲンＣ末端と略記する）の定量法及び定量用
キットに関し、更に詳細には、酵素免疫測足法を用いる
プロコラーゲンＣ末端の定量法及び定量用キットに関す
る。Detailed Description of the Invention [Field of Industrial Application] The present invention relates to a method and kit for quantifying human type I procollagen C-terminal peptide (hereinafter abbreviated as procollagen C-terminal), and more specifically relates to an enzyme The present invention relates to a method for quantifying procollagen C-terminus using an immunopedometric method and a kit for quantifying the procollagen C terminus.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

生体内タン白質コラーゲンは王に線維芽細胞内で、その
前駆体プロコラーゲンとして合成され、分泌時に特異的
ペプチダーゼに↓す、その。末端ペプチドが切断されて
完全なタン自分子に変換する。In vivo protein collagen is synthesized within fibroblasts as its precursor procollagen, and is converted into specific peptidases during secretion. The terminal peptide is cleaved and converted into a complete protein molecule.

肝線維症などの種々の線維化症の主な病状は、その組織
におけるコラーゲンの過剰合成、過剰沈着であり、体内
コラーゲン形成の側矩は、肝線維症などの柿々の線維化
症の診断、あるいは治療の重要な指針とな９うるもので
ある。The main pathology of various fibrosis diseases such as liver fibrosis is excessive synthesis and excessive deposition of collagen in the tissue, and the side effects of collagen formation in the body are important for the diagnosis of persimmon fibrosis diseases such as liver fibrosis. 9 or can serve as an important guideline for treatment.

プロコラーゲンＣ末端はプロコラーゲンから遊離後も、
血中に一足時間存在する。したがって、血中のプロコラ
ーゲンＣ床端量の測定は、組織における線維形成を診断
するという点で臨床検査上重要であり、その簡便で迅速
な定量法の確立が望１れていた。Even after release from procollagen, procollagen C terminus remains
It remains in the blood for a period of time. Therefore, measurement of the amount of procollagen C in the blood is important in clinical testing in terms of diagnosing fibrosis in tissues, and it has been desired to establish a simple and rapid quantitative method.

今日１で組織線維化の診断は、組織生検、尿中及び組織
中のヒドロキシプロリン量、血中プロリンヒドロキシラ
ーゼ活性、血中リジンオキシダーゼ活性の測定などによ
り行われていたが、操作が煩雑でめり、特異性にも問題
があるといった欠点がめった。Today1, tissue fibrosis was diagnosed by tissue biopsy, measurement of hydroxyproline levels in urine and tissues, blood proline hydroxylase activity, and blood lysine oxidase activity, but the procedures were complicated and However, they often have shortcomings such as problems with accuracy and specificity.

更に最近、プロコラーゲン０末端に対するウサギ抗血清
を用いたラジオイムノアッセイ法が開発されたし幸田久
半、肝臓、第２５巻第１９２＝２０３頁（１９８４）〕
。この定量法は、あらかじめ放射能で標識されたプロコ
ラーゲンＣ末端と検体を同時にかつ競合的ＶＣ抗プロコ
ラーゲンＣ末端抗体に作用させ、約１〜２日間反石抜、
抗つサギＩｇＧ抗体と約１日間ＰＬ応させて、免疫沈降
物の放射能活性あるいは上清に残存した放射能活性を創
ることにより、検体中のプロコラーゲンＣ床端量を定量
するものである。Furthermore, a radioimmunoassay method using rabbit antiserum against procollagen 0-terminus has been recently developed; see Hisaha Koda, Liver, Vol. 25, No. 192, p. 203 (1984).
. In this quantitative method, procollagen C-terminus labeled with radioactivity in advance and the sample are simultaneously reacted with a competitive VC anti-procollagen C-terminus antibody, and anti-stone removal is performed for about 1 to 2 days.
The amount of procollagen C in the sample is quantified by reacting PL with anti-heron IgG antibody for about 1 day to create radioactivity in the immunoprecipitate or radioactivity remaining in the supernatant. .

〔発明が解決しょうとする問題点〕[Problem that the invention seeks to solve]

上記のラジオイムノアッセイは少なくとも２日間の操作
時間を要ｔ／　％操作の煩雑さと共に、放射能物質によ
る環境汚染、人体への影響という点や、目的抗原に対す
る抗体として抗血清を使用しているため、その反応性の
特異性といり点に問題がめった。ｔｆｃ、この抗血清及
び放射能標識プロコラーゲンＣ末端を調製するためには
、多量のプロコラーゲンＣ木端を精製しなければならず
、この点でも大きな問題を含んでいた。The radioimmunoassay described above requires at least two days of operation time.In addition to the complexity of the operation, there are concerns about environmental contamination with radioactive substances and the impact on the human body, and because antiserum is used as an antibody against the target antigen. However, problems arose with the specificity and strength of its reactivity. In order to prepare tfc, its antiserum, and radiolabeled procollagen C terminus, a large amount of procollagen C wood ends had to be purified, which was also a major problem.

本発明は、上記従来技術の定量法の問題点を克服するた
めになされたものであり、その目的は体液などの試料中
のプロコラーゲンＣ末端量を免疫学的に定量する方法、
及びそれに使用する足亀用キットを提供することにある
。The present invention has been made to overcome the problems of the conventional quantitative methods described above, and its purpose is to provide a method for immunologically quantifying the amount of procollagen C-terminal in a sample such as a body fluid;
and to provide a foot turtle kit for use therewith.

〔問題点を解決するための手段〕[Means for solving problems]

本発明を概祝すれば、本発明の第１の発明はプロコラー
ゲンＣ木端に対して特異的に反応するモノクローナル抗
体を調製したことである。To summarize the present invention, the first invention of the present invention is the preparation of a monoclonal antibody that specifically reacts with procollagen C wood tips.

本発明の第２の発明は、第１の発明の用途としてのプロ
コラーゲンＣ床端定量用キットに関し、下記（イ）、（
ロ）、Ｃ９を必須成分とするプロコラーゲンＣ床端定量
用キットにある。The second invention of the present invention relates to a kit for quantitative determination of procollagen C bed edge as a use of the first invention, and includes the following (a), (
b), a procollagen C bed edge determination kit containing C9 as an essential component.

（イ）抗グロコラーゲンＯ末端抗体結合固相物（ロ）酵
素ｍ繊抗プロコラーゲン０末端抗体Ｃ′９　　該＃累（
ロ）に特異的な基質また、本発明の第３の発明は第２の
発明のキットを用いたプロコラーゲンＣ末端の定量法に
関し、検体中のプロコラーゲンＣ末端を酵素免疫測足法
を用いて定量するに際し、検体に抗プロコラーゲンＣ木
端抗体結合固相物及び酵素橡識抗グロコラーゲンＣ禾端
抗体を同時に作用させるプロコラーゲンＣ末端の定量法
にある。(a) Anti-glocollagen O-terminal antibody-bound solid phase substance (b) Enzyme m-fiber anti-procollagen 0-terminal antibody C'9
b) Substrate specific for The present invention is a method for quantifying procollagen C terminus in which an anti-procollagen C terminal antibody-bound solid phase substance and an enzyme-based anti-glocollagen C terminus antibody are simultaneously applied to the sample.

抗体をＩｉＭ！整する際に、その抗原とするプロコラー
ゲンＣ床端はホフマンらの方法［ＨｌＰ、ホフ−ｒ　７
　（Ｈ，Ｐ、　Ｈｏｆｆｍａｎ　）プロシーディンゲス
　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オプ　サイｘ　ｙ
　ｘ　　Ｕ、８．Ａ、　　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ。IiM antibodies! During preparation, the procollagen C bed end, which is used as an antigen, was prepared using the method of Hoffman et al. [HlP, Hoff-r 7
(H, P, Hoffman) Proceedings of the National Academy of Sciences x y
x U, 8. A, (Proc, Natl, A
cad, sci.

Ｕ、８．ム、）、第７５巻ｍ４３０４〜４　！Ｓ　０８
頁（１９７６）〕にエリ、ヒト線維芽細胞の培養Ｐ液よ
り得ることができる。線維芽細胞を血清を含まない培地
中で通常２４時間培養し培養液を集める。プロコラーゲ
ンを含むタン自画分を硫安で沈殿させ、そして以下に例
示した実施例におけるように、＃Ｉ累処理、カラムクロ
マトグラフィーによりプロコラーゲンＣ末端を精製する
。プロコラーゲンＣ末端の分離ａｌ！！にエリ、その特
異的抗体の作製が可能となる。この精製抗原に対する抗
血清は、既に確立している方法に、！ニジ調製すること
ができる。すなわちウサギなどの実験動物に鞘製したグ
ロコラーゲンＣ禾端を数１ｍｌにわたって免疫し、そし
て適当な期間の後、その動物から血清を抜取れば↓い。U, 8. ), Volume 75 m4304-4! S08
(1976)], it can be obtained from culture P solution of human fibroblasts. Fibroblasts are usually cultured in a serum-free medium for 24 hours, and the culture fluid is collected. The tongue fraction containing procollagen is precipitated with ammonium sulfate, and the procollagen C-terminus is purified by #I treatment and column chromatography as in the examples illustrated below. Separation of procollagen C terminus al! ! This makes it possible to produce specific antibodies. Antiserum against this purified antigen can be produced using an already established method! Niji can be prepared. That is, an experimental animal such as a rabbit can be immunized with several 1 ml of the sheathed glocollagen C husks, and after an appropriate period of time, the serum can be extracted from the animal.

＃素免疫測定法（ＫＬ工８Ａ　Ｊ　、ウェスタン　プロ
ツナインク法などの技術により、特異的抗体が抗血清中
に存在することを試験することができる。The presence of specific antibodies in the antiserum can be tested by techniques such as #prime immunoassay (KL Engineering 8A J, Western Protein Ink assay).

しかし、この方法に↓す特異抗体を得るためには、免疫
にハＪいる抗原は純度の商い単一のタン白質でなければ
ならない。また、ウサギやヤギなどの大型の実験動物を
免疫するためには多量の抗原をｖ？４製する必要がある
。それ故、従来法により、特異抗体を得ることは極めて
困難であった。However, in order to obtain specific antibodies using this method, the antigen used for immunization must be a single protein in terms of purity. In addition, in order to immunize large experimental animals such as rabbits and goats, large amounts of antigen must be administered. It is necessary to make 4. Therefore, it has been extremely difficult to obtain specific antibodies using conventional methods.

本発明者らは、従来法にエリ抗プロコラーゲンＣ末端抗
体を調製する際のいろいろな問題点を解決するためにケ
ーラーとミルシュティンの方法（Ｋ６ｈｌｅｒ、　Ｍｉ
ｌａｔｅｉｎ、ネーチャー（Ｎａｔｕ−ｒθ）、第２５
６巻第４７６頁（１９７５））を用いている。この方法
を用いることに↓す、多量の抗原を用意する必要なく、
かつその抗原を絶対的に純粋に１で柑製する必要もなく
なる。The present inventors developed the Köhler and Milstein method (K6hler, Mi) in order to solve various problems in preparing Eri anti-procollagen C-terminal antibodies using conventional methods.
latein, Nature (Natur-rθ), 25th
6, p. 476 (1975)). By using this method, there is no need to prepare a large amount of antigen,
Moreover, there is no need to make the antigen absolutely pure.

なぜなら、ヒトエ型プロコラーゲンを免疫した実験動物
の肝臓細胞とミエローマ細胞とを融合し、試験管条件下
で特異的抗体を産生ずるクローン細胞を選択するからで
ある。特に実験動物としてマウスがよく用いられる。例
えばＢａ１ｂ１０マウスの腹腔内に線維芽細胞の培養液
より抽出したヒトエ型プロコラーゲンを免疫し、４週間
後に追加免疫を行い、その３日後にマウスエり肝臓を摘
出する。肺臓細胞とマウスミエローマ細胞とを、ポリエ
チレングリコールの作用にエフ融合させ、そして常法に
よ！１１９６穴プレート中にて培養する。各培養液の上
清を採取し、ＥＬＩ８八法により特異的抗体を産生じて
いる細胞を選択し、更に限界希釈法によりクローニング
をｈい、抗プロコラーゲンＣ禾端モノクローナル抗体産
生細胞（ハイブリドーマ）を取得する。This is because the liver cells of an experimental animal immunized with human E type procollagen are fused with myeloma cells, and cloned cells that produce specific antibodies are selected under in vitro conditions. In particular, mice are often used as experimental animals. For example, a Ba1b10 mouse is intraperitoneally immunized with human type E procollagen extracted from a fibroblast culture solution, a booster immunization is performed 4 weeks later, and the mouse liver is removed 3 days later. Fuse lung cells and mouse myeloma cells with the action of polyethylene glycol, and then use the conventional method! Culture in a 1196-well plate. The supernatant of each culture solution was collected, and cells producing specific antibodies were selected using the ELI method, and further cloning was performed using the limiting dilution method to obtain anti-procollagen C monoclonal antibody producing cells (hybridoma). get.

これらのハイプリドーマは培養液中にモノクローナル抗
体を分泌する。These hybridomas secrete monoclonal antibodies into the culture medium.

市販の無血清培地などを用いてノ・イブリドーマを培養
しその上清から硫安塩析などの操作により抗体画分を得
ることができる。また同系のマウス体内にて、ノ１イブ
リドーマを培養し、その動物の体液より同様の操作に↓
り抗体画分を得ることもできる。Antibody fractions can be obtained from the supernatant by culturing No. hybridoma using a commercially available serum-free medium or the like by performing operations such as ammonium sulfate salting out. In addition, No. 1 hybridoma was cultured in the body of a syngeneic mouse, and the same procedure was performed using the animal's body fluid.
Antibody fractions can also be obtained.

これらの抗プ四コラーゲン。末端抗体は、不溶化担体に
固足化した抗体結合固相物や、酵素との結合体としての
酵素標識抗体として本発明の一部を形成する定量用キッ
トに用いられる。These anti-P4 collagens. The terminal antibody is used in the quantitative kit that forms part of the present invention as an antibody-bound solid phase material immobilized on an insolubilized carrier or as an enzyme-labeled antibody as a conjugate with an enzyme.

本発明で使用する抗体は、抗血清又はモノクローナル抗
体のいずれでもよいが、モノクローナル抗体が特に適し
ている。例えば、上記（イ）、幹】に用いる抗体として
、２柚の異なる抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナル
抗体が使用できる。The antibody used in the present invention may be either an antiserum or a monoclonal antibody, but monoclonal antibodies are particularly suitable. For example, two different anti-procollagen C-terminal monoclonal antibodies can be used as the antibodies used in (a) above.

この場合、両者共グロコラーゲンＯ禾端に対して指向性
を示すが、特に、プロコラーゲンｃ禾端の別個のエピト
ープに対して指向性を示すものが用いられる。更に、こ
れらの抗体は免疫グロブリンのまま使用されるに限られ
ず、これらの抗体をペプシン処理して得られるＦ’（ａ
ｂ’）２ｓＦａｂ″などのフラグメントとしても用いる
ことができる。これらのフラグメントを用いた場合、非
特異的吸着を防ぐことができる。In this case, both of them show tropism toward the glocollagen O hemis, but in particular, those showing tropism against distinct epitopes of the procollagen C husks are used. Furthermore, these antibodies are not limited to being used as immunoglobulins; F'(a) obtained by treating these antibodies with pepsin
It can also be used as a fragment such as b')2sFab''. When these fragments are used, non-specific adsorption can be prevented.

すなわち、本発明によるプロコラ−デフＣ末端の定量法
は ａ）検体を抗プロコラーゲン。末端抗体又は抗体フラグ
メント結合固相物と、酵素標識抗プロコラーゲンＣ木端
抗体又は抗体フラグメントとに同時に一工程で反応させ
、検体中のグロコラーゲンＯ末端を同相化抗体又は抗体
フラグメントと酵素標識抗体又は抗体フラグメントとの
間でサンドウィッチを形成させｂ）得られたサンドウィ
ッチ上の酵素を該酵素に特異的な基質と反応させて酵素
活性を測定することよりなる。That is, the method for quantifying Procolla-def C-terminus according to the present invention includes: a) using anti-procollagen as the specimen; The terminal antibody or antibody fragment-bound solid phase is reacted with the enzyme-labeled anti-procollagen C wood end antibody or antibody fragment simultaneously in one step, and the glocollagen O-terminus in the sample is in phase with the antibody or antibody fragment and the enzyme-labeled antibody. or by forming a sandwich with an antibody fragment, b) reacting the enzyme on the resulting sandwich with a substrate specific to the enzyme, and measuring the enzyme activity.

抗体結合固相物に用いられる不溶化担体としては抗体を
結合する能力を有するものが使用可能であり、例えばポ
リスチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロライド、
あるいはポリカーボネート製のマイクロプレート、ビー
ズ、スティック又は試験管などが用いられる。As the insolubilizing carrier used in the antibody-binding solid phase material, those having the ability to bind antibodies can be used, such as polystyrene, polypropylene, polyvinyl chloride,
Alternatively, polycarbonate microplates, beads, sticks, test tubes, etc. may be used.

また、＃累標識抗体は、例えはマレイミド法、ピリジル
・ジスルフィド法などの当業者によりよく知られた方法
により酵素標識して製造される。酵素標識に用いる酵素
の例としては、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラ
ーゼ、チロシナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラ
クトペルオキシダーゼ等が挙けられ、中でもアルカリホ
スファターゼが好ましい。Further, the #-labeled antibody is produced by enzyme labeling by methods well known to those skilled in the art, such as the maleimide method and the pyridyl disulfide method. Examples of enzymes used for enzyme labeling include alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase, acetylcholinesterase, lactate dehydrogenase, glucoamylase, tyrosinase, horseradish peroxidase, lactoperoxidase, etc. Among them, alkaline phosphatase is preferred. .

基質としては、酵素標識に用いた＃累に特異的な基質で
あればよい。例えば酵素がアルカリホスファターゼの場
合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とし、その酵
素反応によって生じるｐ−ニトロフェノールの濃度を波
長４２０ｎｍ　における吸光度として測定すればよい。The substrate may be any substrate specific to the enzyme used for enzyme labeling. For example, when the enzyme is alkaline phosphatase, p-nitrophenyl phosphate may be used as a substrate, and the concentration of p-nitrophenol produced by the enzymatic reaction may be measured as absorbance at a wavelength of 420 nm.

かくして求められた酵素活性からプロコラーゲンＣ末端
蓋を換算し、定量することができる。From the enzyme activity thus determined, the procollagen C-terminal cap can be calculated and quantified.

以上のとおり、本発明は検体中のプロコラーゲン。末端
の測定におけるψ「規な定置法を提ＩＪｔするもので、
肝′＆ｉ！変などの組織線維化の診断に利用されるもの
である。As described above, the present invention relates to procollagen in a specimen. We propose a standard method of fixing ψ in the measurement of the terminal end,
Liver'&i! It is used for diagnosing tissue fibrosis such as cancer.

〔実施例〕〔Example〕

次に本発明の実施例を挙けて具体的に述べるが、本発明
は何らこれによって限定されるものではない。Next, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.

なお、第１図及び第２図は、本発明の定置法で使用する
検１線を、４２０ｎｍにおける吸光度（縦軸）とプロコ
ラ−タフ０末端ｍ度（ｎｇ／ｄ、横軸］との関係で示し
たグラフである。In addition, FIG. 1 and FIG. 2 show the relationship between the absorbance at 420 nm (vertical axis) and Procortough 0 terminal m degree (ng/d, horizontal axis) for the first line used in the stationary method of the present invention. This is a graph shown in .

実施例１ （１）　プルコラーゲン０末端抗原の単離プロコラーゲ
ン０末端抽出のために、ヒト胎児肺由来の線維芽細胞（
工ＭＲ−９０）を１０−牛脂児血清を含むダルベツコ改
質イーグル（ＤＭＦｔＭ　）培地中にて５７℃で培養す
る。細胞が適当な密度に増殖したところで、５０ｍＷ／
１アスコルビン６Ｎ　ト２０　ｍＷ／ｌ　　Ｌ　−７’
ロリンを添加した血清無添加のＤＭＫＭ培地に交換し、
２４時間培養した後、培養上清を集めた。この培養上清
にタン白質分解酵素阻害剤として２５ｍＭ　　エチレン
ジアミンテトラ酢酸ナトリウＡ　（ＥＤＴＡ）、１０　
ｍＭ　　Ｎ−エチルマレイミド（ＮＫＮＪ、１ｍＭ　　
フェニルメチルホニルフルオライド（ＰＭＢＦ　）　、
　１　ｍＭ　　ｐ−アミノベンズアミド塩酸を加えたの
ち、硫酸アンモニウム（１７６ｍｆ７ｍｌ　）にてタン
白質を塩析沈殿させた。その沈殿を２Ｍ尿素、２．５ｍ
Ｍ　　Ｆ！ＤＴムを含むα１Ｍトリス−塩酸緩衛ｇ（ｐ
Ｈ７，８）Ｋ溶解したものをＤＩ！ｆＡＩｌｉセファセ
ルカラムに添加し、同緩衝液１５０−と［Ｌ２ＭＮａＯ
ｔを含む同緩衝液１５０１１ｄのグラジュエントヲ用い
て溶出し、Ｎａｏｚ　（１９度α０５Ｍにて溶出された
ピークを集めた。８Ｄ８ポリアクリルアミド電気泳動に
↓シこのピークがヒトＩ型プロコラーゲン分画であるこ
とを確かめた。このようにして得たヒトエ型プロコラー
ゲンとＳ製バクテリア由米コラゲナーゼ（シグマ社製、
アメリカＪを量比５０：１にて混合し４℃で２０時間イ
ンキュベートし、ヒト耳型プロコラーゲン分子中のコラ
ーゲン部分のみの分解を行った。この分解産物からのプ
ロコラーゲン。末端の最終的な精製はバイオ・ゲルＡ−
１、５ｍ　（／（イオーラッド社製−アメリカｉカラム
クロマトグラフィーにより行い、分子量約１０万に相当
するピークをＮ製プロコラーゲン０宋端分画として収集
した。Example 1 (1) Isolation of procollagen 0-terminal antigen For extraction of procollagen 0-terminal, human fetal lung-derived fibroblasts (
MR-90) is cultured at 57°C in Dulbecco's modified Eagle (DMFtM) medium containing 10-tallow serum. When the cells have grown to an appropriate density, 50 mW/
1 Ascorbine 6N 20 mW/l L -7'
Replace with serum-free DMKM medium supplemented with Lorin,
After culturing for 24 hours, the culture supernatant was collected. Add 25mM ethylenediaminetetraacetate A (EDTA) as a proteolytic enzyme inhibitor to this culture supernatant.
mM N-ethylmaleimide (NKNJ, 1mM
Phenylmethylhonyl fluoride (PMBF),
After adding 1 mM p-aminobenzamide hydrochloric acid, the protein was salted out and precipitated with ammonium sulfate (176 mf7 ml). The precipitate was treated with 2M urea, 2.5M
MF! α1M Tris-HCl containing DT
H7,8) DI the dissolved K! fAIli Sephacel column and the same buffer 150- and [L2MNaO
Elution was performed using a gradient of the same buffer solution 15011d containing T, and the eluted peaks were collected at 05M at 19°C. We confirmed that the human E type procollagen thus obtained and S-produced Bacteria-Yumei collagenase (manufactured by Sigma,
America J was mixed at a ratio of 50:1 and incubated at 4°C for 20 hours to decompose only the collagen portion in the human ear procollagen molecule. Procollagen from this breakdown product. Final purification of the ends was performed using Bio-Gel A-
1.5 m (/(Iorad Co., Ltd. - America i column chromatography), and a peak corresponding to a molecular weight of about 100,000 was collected as N procollagen 0 Song end fraction.

（２）　　プロコラーゲン。末端に対する抗血清の詞製 精製プルコラーゲン０末端抗原１５ｍｆを生理食塩水α
５ｓｄＫ溶解し、これに等量の児全７０インド・アジュ
バントを加え、乳化させた後ウサギ皮下に注射した。２
週間ｔｌ！！＠に、同量の抗原を不完全７０インド・ア
ジュバントと乳化させたものを４回皮下注射し、最終免
疫！ｖ１０日後にその全血を採血し、６０分間室温で放
置した後、遠心分離することにより抗グロコラーゲン０
末端抗体を含有する抗血清を得た。その抗体の特異性と
力価は尚業者に、Ｊ：り工く知られた方法、すなわちＢ
Ｌ工８八法、ウェスタンブロッティング法により確かめ
た。(2) Procollagen. Preparation of antiserum against terminal purified pulled collagen 0 terminal antigen 15mf in saline α
5sdK was dissolved, and an equal amount of 70% India adjuvant was added thereto, emulsified, and then subcutaneously injected into rabbits. 2
Weekly tl! ! The same amount of antigen was emulsified with incomplete 70 India adjuvant and subcutaneously injected 4 times to final immunization! After 10 days, the whole blood was collected, left at room temperature for 60 minutes, and then centrifuged to remove anti-globin collagen.
Antiserum containing terminal antibodies was obtained. The specificity and titer of the antibody can be determined by one skilled in the art using methods well known in the art, namely B.
It was confirmed by the L Technique 88 method and the Western blotting method.

１３＋　　プロコラーゲンＣ末端に対するモノクローナ
ル抗体の調製 精製ヒトＩ型グロコラーゲ７５０μｍを生理食塩水α１
−に溶解し等佃の完全７０インドψアジユバントを加え
乳化させ、　Ｂａｌ’ｂ／ｃマウスの腹腔内に注射した
。４週間後に抗原５０μ２　のみを同マウスの腹腔内に
注射した。その３日後にマウスエル摘出した肺臓より、
肝臓細胞を得、マウスミエローマｍ　胞（８Ｐ２１０　
）と細胞数１０：１の比で混合し、５０優ポリエチレン
グリコール及び２０％ジメチルスルホキシドの存在下で
１分間放置し、細胞融合を行った。無血清ＤＭＥ：Ｍ　
ｔ＠地を加え希釈したのち、遠心分離にエリその上清を
除き、１０チ牛脂児血清含有ＤＭＢＭ培地にて細胞を懸
濁し、９６穴マイクロタイタープレートｒｃ　ｔ　大当
り２　Ｘ　１０’ｍ胞となるように公社した。その後１
〜５日ごとに培地の半分量をＨＡＴ培地で交換し、１０
〜２０日後に融合細胞（ハイブリドーマ］の生育してき
たウェルの培養上清を採取し、抗体産生の有無をＦｆＬ
工８Ａ法等にエリ満べ、プロコラーゲンＣ末端に対する
抗体を産生じているハイブリドーマを５株選択した。13+ Preparation of monoclonal antibody against procollagen C-terminus Purified human type I glycollage 750 μm was dissolved in saline α1.
- and emulsified by adding Totsutsukuda's complete 70 indium adjuvant, and injected intraperitoneally into Bal'b/c mice. Four weeks later, 50 μ2 of the antigen alone was injected intraperitoneally into the mice. Three days later, from the lungs removed from the mouse,
Liver cells were obtained and mouse myeloma cells (8P210
) and cells at a ratio of 10:1 and left for 1 minute in the presence of 50% polyethylene glycol and 20% dimethyl sulfoxide to perform cell fusion. Serum-free DME: M
After diluting by adding t@di, remove the supernatant by centrifugation, suspend the cells in DMBM medium containing 10 times tallow serum, and prepare 2 x 10'm cells in a 96-well microtiter plate. It was established as a public corporation. then 1
~ Replace half of the medium with HAT medium every 5 days,
After ~20 days, collect the culture supernatant from the well in which the fused cells (hybridoma) have grown, and check for the presence or absence of antibody production using FfL.
Using the Engineering 8A method, etc., five hybridoma strains producing antibodies against the C-terminus of procollagen were selected.

これらのハイブリドーマについて限界希釈法により２回
クローニングを行い、最も力価の高い抗体を産生ずるハ
イブリドーマのクローンとして、ＰＯ５−５とＰＯ３−
７の２株を取得した。These hybridomas were cloned twice using the limiting dilution method, and PO5-5 and PO3- were cloned as the hybridoma clones that produced the highest antibody titer.
Acquired 2 shares of 7.

これらのハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗体
がプロコラーゲンＣ木端と特異的に反応することをウェ
スタンブロッティングに↓り確かめた。これらのモノク
ローナル抗体を大量に得るために、Ｂａ１ｂ１０マウス
腹腔内に約２Ｘ１０？個のノ・イブリドーマを江射し、
腹水Ｍ場を作らせ、１０Ｂ後に腹水を採取し、抗プロコ
ラーゲンＯ禾端モノクローナル抗体を取得した。It was confirmed by Western blotting that the monoclonal antibodies produced by these hybridomas specifically reacted with procollagen C wood ends. To obtain large amounts of these monoclonal antibodies, approximately 2 x 10 ml of Ba1b10 mice were intraperitoneally administered. Ejaculate the individual's Ibridoma,
An ascites M field was created, and after 10 days, ascites was collected, and an anti-procollagen O-end monoclonal antibody was obtained.

（４）抗体の不鹸化担体への結合 （２）で得られた抗血清を常法に従い硫安塩析を行いＤ
ＦｉＡＷセルロースカラムクロマトグラフィーにより抗
プロコラーゲンＣ宋端抗体をｔｌｊＭｔ、た。得られた
抗体を石川らの方法〔Ｅ。(4) Binding of antibody to unsaponifiable carrier The antiserum obtained in (2) was subjected to ammonium sulfate salting out according to a conventional method.
Anti-procollagen C Songtian antibody was detected by FiAW cellulose column chromatography. The obtained antibody was prepared using the method of Ishikawa et al. [E.

石川（Ｊ　Ｉｓｈｉｋａｗａ　）　ａ　　スカンジナビ
アンジャーナル　オブ　イムノロジー（５ｃａｎ、　ｙ
−工ｍｍｕｎｏＬ　）　、ｐ　８巻第４３頁（１９７８
））に↓９ペプシン処理し、抗体フラグメントＰ（ａｂ
’）必得た。J Ishikawa a Scandinavian Journal of Immunology (5can, y
- Engineering mmunoL), p. 8, p. 43 (1978
)) was treated with ↓9pepsin, and antibody fragment P (ab
') Must have.

この抗体フラグメントを１０ｍＭ　　炭酸ナトリウＡＨ
衝液（ｐＨａ５）に１００　ｆｉｔ／−となるように溶
解し、これにポリスチレンボール（１＊水化字社製、粒
径直４■２を浸し、４℃にて１８時間インキエベートし
て抗体フラグメントをボールに固定化した。これ仁１％
牛血清アルブミン、１１１９６）ｌａＮｍを含むトリス
緩衝生理食塩水（ＴＢ８）中に４℃にて保存した。This antibody fragment was dissolved in 10mM sodium carbonate AH.
The antibody fragments were dissolved in a buffer solution (pHa5) to a concentration of 100 fit/-, and a polystyrene ball (1 * manufactured by Suikaji Co., Ltd., particle size: 4 x 2) was immersed in this solution, and the antibody fragments were incubated at 4°C for 18 hours. Fixed to the ball. This is 1%
Bovine serum albumin, 11196) laNm was stored in Tris-buffered saline (TB8) at 4°C.

（５）アルカリホスファターゼ標識抗プロコラーゲンＣ
床端モノクローナル抗体の調製 （３）で得られた抗プロコラーゲン０宋端モノクローナ
ル抗体（ＰＯ８−７３を含む腹水より常法に従い、抗プ
ロコラーゲンＣ床端モノクローナル抗体（ＰＯ８−７３
を精製し、前記石川らの方法にエリモノクローナル抗体
フラグメン）　Ｆａｂ’　　を得た。(5) Alkaline phosphatase labeled anti-procollagen C
Preparation of bed end monoclonal antibody (3) From ascites containing anti-procollagen 0 Song end monoclonal antibody (PO8-73), anti-procollagen C bed end monoclonal antibody (PO8-73
was purified to obtain a monoclonal antibody fragment (Fab') according to the method of Ishikawa et al.

このようにして得たモノクローナル抗体（ＰＯ８−７）
フラグメントをＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト（ジ−ベンケンカル社製、束東）を用い、石川らの方
法（酵素免疫測定法　第２版　第９２頁１９８２年１２
月１５日発行、医学書院）４Ｃ従ってアルカリホスファ
ターゼ（ベーリンガー社製、西ドイツ）に結合させた。Monoclonal antibody thus obtained (PO8-7)
Using N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate (manufactured by Dibenkencal Co., Ltd., Sokuto), the fragment was prepared using the method of Ishikawa et al. (Enzyme immunoassay, 2nd edition, p. 92, 1982). Year 12
4C (Igaku Shoin, published on May 15, 2013) was then bound to alkaline phosphatase (Boehringer, West Germany).

（６）　　プロコラーゲンＣ末端の側足プロコラーゲン
０末端を含む検体５０μｔを試験管に採ｐ　（４１で調
製した抗体同定化ポリスチレンボールを１個添加し、（
５）で調製した酵索棟識抗体フラグメントを１１．１％
牛血清アルブミン含有ＴＢＳで１〃ｆ／−に希釈した液
を直ちに［Ｌ６―加え、室温で３０分間インキュベート
する。次いでポリスチレンボールを分取し、０１％トウ
イーン（Ｔｗｅｅｎ　）　２０（牛井化学薬品社戒、別
邸）を含むＴＢＳ　２　ｇＬｔで４回洗浄し、基質とし
てｐ−ニトロフェニルリン酸（和光純薬工業社表、大阪
Ｊを１０ｍＭとなるようにα０５Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９、７、２ｍＭ　ＭｇＯ，／、官有）で溶解した
液をＣＬ６ｄ添加し、室温で１５分間インキュベートす
る。その稜［ＬｊＮＮａＯＨ２−を添加し反応を停止さ
せ、波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定結
果より求めた検量線を第１図に示す。(6) Collect 50 μt of the sample containing procollagen C terminus and side leg procollagen 0 terminus into a test tube.
11.1% of the enzyme-recognizing antibody fragment prepared in 5)
A solution diluted to 1 f/- with TBS containing bovine serum albumin was immediately added to [L6-] and incubated for 30 minutes at room temperature. The polystyrene balls were then separated and washed four times with 2 gLt of TBS containing 01% Tween 20 (Ushii Chemical Co., Ltd., Bettei), and p-nitrophenyl phosphate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a substrate. Table 1. Add CL6d to a solution of Osaka J dissolved in α05M Tris-HCl buffer (pH 9, 7, 2mM MgO, proprietary) to 10mM, and incubate at room temperature for 15 minutes. was added to stop the reaction, and the absorbance at a wavelength of 420 nm was measured.A calibration curve obtained from the measurement results is shown in FIG.

実施例２ （１）　　プロコラーゲン。末端量原の単離実施例１に
準じて行った。Example 2 (1) Procollagen. Isolation of terminal mass was carried out according to Example 1.

（２）抗グロコラーケンＣ末端モノクローナル抗体の調
製 実施例１に準じて行った。(2) Preparation of anti-Glocolaken C-terminal monoclonal antibody The procedure of Example 1 was followed.

（３）抗プロコラーゲンＣ末端モノクローナル抗体の不
溶化担体への結合 実施例１の（４）と同様に行った。すなわち、モノクロ
ーナル抗体（ＰＯ５−５）を営む腹水からモノクローナ
ル抗体（ＰＯ５−５３をｆｐＩ製し、ペプシン処理にエ
リ抗体フラグメントＦ（ａｂ　）ｓ　　を得た。これを
１０ｍＭ　炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨａ５　）に１０
０μｆ／−となるように溶解し、この溶液中にてポリス
チレンボールを４℃で１８時間インキヱベートすること
によシ製造した。(3) Binding of anti-procollagen C-terminal monoclonal antibody to insolubilized carrier The same procedure as in Example 1 (4) was carried out. That is, monoclonal antibody (PO5-53) was prepared from ascites containing monoclonal antibody (PO5-5) by fpI, and Eri antibody fragment F(ab)s was obtained by pepsin treatment. This was added to 10 mM sodium carbonate buffer (pHa5). 10
A polystyrene ball was manufactured by incubating a polystyrene ball in this solution at 4° C. for 18 hours.

（４）酵素標識抗プロコラーゲン０末端モノクローナル
抗体の調製 実施例１に準じて行った。(4) Preparation of enzyme-labeled anti-procollagen 0-terminal monoclonal antibody The procedure of Example 1 was followed.

（５）プロコラーゲンＣ末端の測定 実施例１に準じて行った。測定結果より求めた検量線を
第２図に示す。(5) Measurement of procollagen C-terminus The measurement was carried out according to Example 1. The calibration curve obtained from the measurement results is shown in Figure 2.

〔発明の効果〕〔Effect of the invention〕

以上旺卸１に説明したように、本発明により、プロコラ
ーゲン。末端量が１時間で迅速にしかも５　ｏｆ／−と
いう高感腿で足置することが可能となった。As explained above in Part 1, the present invention provides procollagen. It became possible to quickly place the foot on the thigh with a high sensitivity of 5 of/- in one hour.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図及び第２図は本発明の足置法で使用する検１ｉ１
１１ｉ！を、４２０ｎｍでの吸光度とグロコラーゲンＯ
木端皇との関係で示したグラフである。Figures 1 and 2 show test 1i1 used in the foot placement method of the present invention.
11i! , absorbance at 420 nm and glocollagen O
This is a graph showing the relationship with Emperor Kobata.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １、ヒト I 型プロコラーゲン。末端ペプチドに特異的
であることを特徴とするモノクローナル抗体。 ２、下記（イ）、（ロ）及び（ハ） （イ）抗ヒト I 型プロコラーゲンＣ末端ペプチド抗体
結合固相物 （ロ）酵素標識抗ヒト I 型プロコラーゲンＣ末端ペプ
チド抗体 （ハ）該酵素（ロ）に特異的な基質 を必須成分とすることを特徴とするヒト I 型プロコラ
ーゲンＣ末端ペプチド定量用キット。 ３、該抗体が、ヒト I 型プロコラーゲンＣ末端ペプチ
ドに特異的なモノクローナル抗体である特許請求の範囲
第２項記載の定量用キット。 ４、検体中のヒト I 型プロコラーゲンＣ末端ペプチド
を酵素免疫測定法を用いて定量するに際し、検体に抗ヒ
ト I 型プロコラーゲンＣ末端ペプチド抗体結合固相物
と酵素標識抗ヒト I 型プロコラーゲンＣ末端ペプチド
抗体を同時に作用させることを特徴とするヒト I 型プ
ロコラーゲンＣ末端ペプチドの定量法。 ５、該抗体が、ヒト I 型プロコラーゲンＣ末端ペプチ
ドに特異的なモノクローナル抗体である特許請求の範囲
第４項記載の定量法。[Claims] 1. Human type I procollagen. A monoclonal antibody characterized by being specific to a terminal peptide. 2. The following (a), (b) and (c) (a) Anti-human type I procollagen C-terminal peptide antibody-bound solid phase (b) Enzyme-labeled anti-human type I procollagen C-terminal peptide antibody (c) A kit for quantifying human type I procollagen C-terminal peptide, which is characterized by containing an enzyme (b)-specific substrate as an essential component. 3. The quantitative kit according to claim 2, wherein the antibody is a monoclonal antibody specific for human type I procollagen C-terminal peptide. 4. When quantifying human type I procollagen C-terminal peptide in a sample using enzyme immunoassay, anti-human type I procollagen C-terminal peptide antibody-bound solid phase and enzyme-labeled anti-human type I procollagen are added to the sample. A method for quantifying human type I procollagen C-terminal peptide, which is characterized by simultaneously using a C-terminal peptide antibody. 5. The quantitative method according to claim 4, wherein the antibody is a monoclonal antibody specific for human type I procollagen C-terminal peptide.