JP2864219B2 - Fractional determination of free active matrix metalloproteases - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、医学的生理学的分野に
係るものであり、遊離のマトリックスメタロプロテアー
ゼ類（ＭＭＰｓ）、とりわけ遊離の活性型ＭＭＰｓの分
別定量法に関する。さらに詳しく言えば、本発明はＭＭ
Ｐｓに対し特異的に結合する各々のモノクローナル抗体
及びＭＭＰｓのインヒビターであるティシュ インヒビ
ター オブメタロプロテアーゼ類（ＴＩＭＰｓ）を用い
て、遊離の活性型ＭＭＰｓを分別定量する方法に関す
る。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to the field of medicine and physiology, and relates to a method for the differential determination of free matrix metalloproteases (MMPs), particularly free active MMPs. More specifically, the present invention relates to an MM
The present invention relates to a method for differentially quantifying free active MMPs using each monoclonal antibody that specifically binds to Ps and tissue inhibitors of metalloproteases (TIMPs), which are inhibitors of MMPs.

【０００２】[0002]

【背景技術】細胞外マトリックスは、コラーゲン、プロ
テオグリカン、エラスチン、フィブロネクチン及びラミ
ニンなどの接着性糖タンパク質から構成されている（Ｍ
ａｒｔｉｎｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４８，６５６−６７７，１９
８３）。これらマトリックス成分の分解にはマトリック
スメタロプロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）が重要な役割を果
たしていることは周知のことである。知られているＭＭ
Ｐの種類とそのナンバーリングは以下のようになってい
る。間質型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、７２キロダル
トン（ｋＤａ）ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）、ストロム
ライシン−１ （ＭＭＰ−３）、ＰＵＭＰ−１ （ＭＭ
Ｐ−７）、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ−８）、９２ｋ
Ｄａゼラチナーゼ（ＭＭＰ−９）、ストロムライシン−
２（ＭＭＰ−１０）、ストロムライシン−３（ＭＭＰ−
１１）、マクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＰ−
１２）、コラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）及び膜型Ｍ
ＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）である（Ｈ．Ｂｉｒｋｅｄａｌ−
Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ．Ｍ
ｅｄ．，４，１９７−２５０，１９９３；Ｓ．Ｄ．Ｓｈ
ａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６８，２３８２４−２３８２９，１９９３；
Ｊ．Ｍ．Ｐ．Ｆｒｅｊｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１６７６６−１６７７３，１
９９４；Ｈ．Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，
３７０，６１−６５，１９９４）。BACKGROUND ART The extracellular matrix is composed of adhesive glycoproteins such as collagen, proteoglycan, elastin, fibronectin and laminin (M
artinez-Hernandez et al. ,
Lab. Invest. , 48, 656-677, 19
83). It is well known that matrix metalloproteases (MMPs) play an important role in the degradation of these matrix components. Known MM
The types of P and their numbering are as follows. Interstitial collagenase (MMP-1), 72 kilodalton (kD a) gelatinase (MMP-2), stromelysin -1 (MMP-3), PUMP -1 (MM
P-7), neutrophil collagenase (MMP-8), 92k
Da gelatinase (MMP-9), stromlysin-
2 (MMP-10), Stromlysin-3 (MMP-
11), macrophage metalloelastase (MMP-
12), collagenase-3 (MMP-13) and membrane type M
MP (MT-MMP ) (H. Birkedal-
Hansen et al. , Oral Biol. M
ed. , 4,197-250, 1993; D. Sh
apiro et al. , J. et al. Bio l. Che
m. , 268, 23824-23829, 1993;
J. M. P. Freje et al. , J. et al. Bio
l. Chem. , 269, 16766-16773, 1
994; Sato et al. , Nature,
370, 61-65, 1994).

【０００３】ＭＭＰｓは、細胞内で合成、産生され、必
要に応じて細胞外へ前駆体（プロ体もしくは潜在型）と
して放出される。潜在型ＭＭＰｓはアミノ末端よりプロ
ペプチド、活性中心領域（中央領域）及びカルボキシル
末端領域などから構成されており、その潜在型ＭＭＰｓ
自身はマトリックス成分の分解には関与せず、体内では
プラスミンやＭＭＰ−３などにより限定分解を受けて活
性化され、あるいは実験的にはチオール基反応性有機水
銀化合物などによりアミノ末端プロペプチドが切断され
活性型ＭＭＰｓとなり、各々の基質に対応するマトリッ
クス成分を分解することが知られている（Ｈ．Ｂｉｒｋ
ｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｂ
ｉｏｌ．Ｍｅｄ．，４，１９７−２５０，１９９３）。
また組織や体液中においてＭＭＰｓ活性を特異的に阻害
するＭＭＰｓのインヒビターであるティシュ インヒビ
ター オブ メタロプロテアーゼ類（ＴＩＭＰｓ）が存
在することが知られている（Ｔ．Ｈａｙａｋａｗａ，Ｃ
ｅｌｌ ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，１９，１０９−
１１４，１９９４）。ＴＩＭＰｓは現在３種類報告され
ており、各々ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２及びＴＩＭＰ
−３と呼ばれている。これらＴＩＭＰｓは、通常活性型
ＭＭＰｓに結合し、組織の修復、組織破壊の阻止、癌転
移抑制あるいは細胞増殖促進などの生理的作用を持って
いると考えられている。またＴＩＭＰ−１は潜在型ＭＭ
Ｐ−９に、ＴＩＭＰ−２は潜在型ＭＭＰ−２に結合し、
各々のＭＭＰｓの活性化及び自己分解活性を制御してい
ると考えられている。[0003] MMPs are synthesized and produced in cells and released as precursors (pro-forms or latent forms) outside the cells as needed. Latent MMPs are composed of a propeptide, an active center region (center region) and a carboxyl terminal region from the amino terminus.
It is not involved in the degradation of matrix components, but is activated by limited degradation in the body by plasmin or MMP-3, or the amino-terminal propeptide is cleaved experimentally by thiol-reactive organomercury compounds. To form active MMPs and decompose matrix components corresponding to each substrate (H. Birk).
edal-Hansen et al. , Oral B
iol. Med. , 4,197-250, 1993).
It is also known that tissue inhibitors of metalloproteases (TIMPs), which are inhibitors of MMPs that specifically inhibit MMPs activity in tissues and body fluids, are present (T. Hayagawa, C.
cell structure. Funct. , 19,109-
114, 1994). Three types of TIMPs are currently reported, TIMP-1, TIMP-2, and TIMP, respectively.
-3. These TIMPs usually bind to active MMPs and are considered to have physiological effects such as tissue repair, tissue destruction inhibition, cancer metastasis suppression, and cell growth promotion. TIMP-1 is a latent MM
At P-9, TIMP-2 binds to latent MMP-2,
It is thought that they control the activation and autolytic activity of each MMP.

【０００４】[0004]

【解決すべき課題】遊離の活性型ＭＭＰｓの測定は、組
織や体液中に存在するＭＭＰｓのうちマトリックス成分
の分解に直接関与する活性型ＭＭＰｓ量を知る手段とな
り得るものである。従って、遊離の活性型ＭＭＰｓを定
量することにより、ＭＭＰｓ活性が亢進する疾患、例え
ば関節症、癌の浸潤、転移、歯周病及び肺線維症のよう
な病態の診断あるいはモニターを行うことが可能とな
る。ところが、活性型ＭＭＰｓ量を測定する方法として
は、一般的に考えられるのは各々の基質を分解させると
ころの酵素活性による方法であるが、組織中や体液中に
は、他のＭＭＰｓやＴＩＭＰｓが存在しており、また各
ＭＭＰの基質特異性が広いことからＭＭＰｓの分別定量
は困難であった。Ｚｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（ＰＣＴ
ＷＯ９３／２０４４７）は二種類の抗体すなわち各Ｍ
ＭＰに対する抗体及び各ＴＩＭＰに対する抗体を用い、
ＭＭＰ−ＴＩＭＰ複合体を測定している。この方法では
既に形成された不活性なＭＭＰ−ＴＩＭＰ複合体を測定
するのみで、マトリックス成分の分解に直接関わる遊離
状態にある活性型ＭＭＰｓ（遊離の活性型ＭＭＰｓ）を
測定することはできない。またＴＩＭＰｓは全ての活性
型ＭＭＰｓと結合し、さらにＴＩＭＰ−１あるいはＴＩ
ＭＰ−２は各々潜在型ＭＭＰ−９あるいは潜在型ＭＭＰ
−２とも結合することから、一つの活性型ＭＭＰを定量
するには、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２及びＴＩＭＰ−
３との複合体をすべて定量しなければならず、さらには
ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９については潜在型ＭＭＰｓと
複合体との分別定量が必要となるため正確な活性型ＭＭ
Ｐｓ量を定量するのは困難である。こうして現在まで遊
離状態にある活性型ＭＭＰｓのみの定量法については報
告がない。さらに潜在型ＭＭＰを認識せず活性型ＭＭＰ
ｓのみに特異的な抗体を用いれば活性型ＭＭＰｓを測定
できると考えられるが、未だこのような抗体が得られた
という報告もない。The measurement of free active MMPs can be a means of knowing the amount of active MMPs directly involved in the decomposition of matrix components among MMPs present in tissues and body fluids. Therefore, by quantifying free active MMPs, it is possible to diagnose or monitor diseases in which MMPs activity is enhanced, such as arthropathy, cancer invasion, metastasis, periodontal disease and pulmonary fibrosis. Becomes However, as a method for measuring the amount of active MMPs, generally, a method based on an enzyme activity for decomposing each substrate is used, but other MMPs and TIMPs are present in tissues and body fluids. The presence and presence of a wide substrate specificity of each MMP made it difficult to separate and quantify MMPs. Zucker et al. (PCT
WO 93/2047) has two types of antibodies, namely each M
Using an antibody against MP and an antibody against each TIMP,
MMP-TIMP complex is measured. In this method, only the inactive MMP-TIMP complex that has already been formed is measured, but the active MMPs in a free state (free active MMPs) directly involved in the decomposition of the matrix component cannot be measured. Further, TIMPs bind to all active MMPs, and furthermore, TIMP-1 or TIMP-1
MP-2 is latent MMP-9 or latent MMP, respectively.
-2 also binds to TIMP-1, TIMP-2 and TIMP-
3 must be quantified, and for MMP-2 and MMP-9, it is necessary to separate and quantify the complex between latent MMPs and the complex.
It is difficult to determine the amount of Ps. Thus, up to now, there is no report on a method for quantifying only active MMPs in a free state. Activated MMP that does not recognize latent MMP
It is thought that active MMPs can be measured by using an antibody specific to s alone, but there is no report that such an antibody was obtained yet.

【０００５】[0005]

【課題の解決】本発明の目的は、簡単な操作及び試薬を
用い、感度並びに精度良く、また迅速にそれぞれの活性
型ＭＭＰｓ量を分別して定量し得る方法を提供すること
にある。こうした方法に用いる試薬キットを提供するこ
とも本発明の目的の一つである。本発明者らは、活性型
ＭＭＰｓに結合し、その活性を抑制するインヒビター、
例えばＴＩＭＰｓ、α_２−マクログロブリン、ペプチド
インヒビター及び合成化合物などのうち、ＴＩＭＰｓが
すべてのＭＭＰｓの活性型に特異的に結合することに着
目し、各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とＴＩＭＰｓと
の組合せにより簡便な遊離の活性型ＭＭＰｓの分別定量
法を提供できるのではないかと考えて、鋭意研究の結
果、各ＭＭＰに特異的に結合する抗体と、ＴＩＭＰｓあ
るいはＴＩＭＰｓと各ＴＩＭＰに特異的に結合する抗体
との複合物を組合せて使用する遊離の活性型ＭＭＰｓの
分別定量法を確立した。さらにＴＩＭＰｓを標識付与用
として用いる場合、ＴＩＭＰｓの活性型ＭＭＰｓに対す
る結合能を損することなく直接または間接的に標識物を
付与することに成功し、この標識物を付与したＴＩＭＰ
ｓと各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とを組合せること
により、簡便な遊離の活性型ＭＭＰｓの分別定量法を確
立した。特に直接標識物を付与したＴＩＭＰ−１と各Ｍ
ＭＰに特異的に結合する抗体とを組み合わせて用いる場
合、遊離の活性型ＭＭＰ−１、−２、−３、−７、−
８、−１０、−１１、−１２及び−１３並びにＭＴ−Ｍ
ＭＰを定量することができ、直接標識物を付与したＴＩ
ＭＰ−２と各ＭＭＰに特異的に結合する抗体とを組み合
わせて用いる場合、遊離の活性型ＭＭＰ−１、−３、−
７、−８、−９、−１０、−１１、−１２及び−１３並
びにＭＴ−ＭＭＰを定量することができる。さらに固相
用にＴＩＭＰ−１あるいはＴＩＭＰ−２を用いる場合も
上記と同様各々の遊離の活性型ＭＭＰｓを定量すること
ができる。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a method for separating and quantifying the amount of each active MMPs with high sensitivity, high accuracy and quickness using simple procedures and reagents. It is also an object of the present invention to provide a reagent kit used in such a method. The present inventors provide an inhibitor that binds to active MMPs and suppresses the activity thereof,
For example, among TIMPs, α ₂ -macroglobulin, peptide inhibitors, synthetic compounds, and the like, focusing on the fact that TIMPs specifically bind to all the active forms of MMPs, an antibody that specifically binds to each MMP and TIMPs Considering that the combination could provide a simple method for differentially quantifying free active MMPs, as a result of intensive studies, an antibody that specifically binds to each MMP, TIMPs or TIMPs and TIMPs and each TIMP specifically A method for the differential quantification of free active MMPs using a conjugate with the antibody to be used was established. Furthermore, when TIMPs are used for labeling, TIMPs succeeded in directly or indirectly labeling without impairing the binding ability of TIMPs to active MMPs,
By combining s with an antibody that specifically binds to each MMP, a simple method for the quantitative determination of free active MMPs was established. In particular, TIMP-1 directly labeled and each M
When used in combination with an antibody that specifically binds to MP, free active MMP-1, -2, -3, -7,-
8, -10, -11, -12 and -13 and MT-M
MPs can be quantified, and TIs directly labeled
When MP-2 and an antibody that specifically binds to each MMP are used in combination, free active MMP-1, -3,-
7, -8, -9, -10, -11, -12 and -13 average
And MT-MMP can be quantified. Further, when TIMP-1 or TIMP-2 is used for the solid phase, the amount of each free active MMP can be determined in the same manner as described above.

【０００６】またさらに各ＭＭＰに特異的に結合する抗
体と各ＴＩＭＰとを組み合わせて用いる場合、標識物を
付与した抗ＴＩＭＰ抗体を用いて間接的に標識物を付与
した各ＴＩＭＰを用いることにより、すべての遊離の活
性型ＭＭＰｓ、すなわちＭＭＰ−１、−２、−３、−
７、−８、−９、−１０、−１１、−１２及び−１３並
びにＭＴ−ＭＭＰを定量することができる。本発明は、
ＴＩＭＰｓから成る群から選ばれたものと各ＭＭＰに対
するモノクローナル抗体から成る群から選ばれたものと
を組合わせて用い、その組合わせ成分の一方を直接ある
いは間接に検知可能な標識物を付与した成分とし、他の
組合わせ成分を固相化した成分として用い、被検試料中
の遊離の活性型ＭＭＰｓを分別定量する方法及びその方
法に用いる試薬を提供することにある。こうして典型的
には本発明の目的は、上記の標識物を付与したＴＩＭＰ
ｓ（各ＴＩＭＰに対する標識物を付与した各モノクロー
ナル抗体で間接的に標識物を付与したＴＩＭＰｓを含
む）あるいは各ＭＭＰに対するモノクローナル抗体及び
固相担体用として各ＭＭＰに対するモノクローナル抗体
あるいはＴＩＭＰｓを用い、被検試料中の遊離の活性型
ＭＭＰｓを分別定量する優れた方法及びその為の試薬キ
ットを提供することにある。本発明はこうした遊離の活
性型ＭＭＰｓを分別定量することのできる試薬キットの
うちの各試薬をすべてその実施態様のうちに含むと理解
される。さらに本発明の目的は、上記定量法を用いて遊
離の活性型ＭＭＰｓを分別定量することにより、組織破
壊や癌転移などの病態をモニターし得る方法並びに試薬
あるいは診断剤を提供することにある。したがって、医
学的生理学的分野における上記試薬の各種利用、組織破
壊や癌転移、組織の修復の程度の判断、あるいは細胞増
殖促進などの生理的作用の指標として上記試薬を使用す
ることはすべて本発明のその実施態様のうちに含むと理
解される。Further, when an antibody that specifically binds to each MMP and each TIMP are used in combination, each TIMP to which a labeled substance is indirectly applied by using a labeled anti-TIMP antibody is used. All free active MMPs, ie, MMP-1, -2, -3,-
7, -8, -9, -10, -11, -12 and -13 average
And MT-MMP can be quantified. The present invention
A component in which a member selected from the group consisting of TIMPs and a member selected from the group consisting of monoclonal antibodies against each MMP are used in combination, and one of the combined components is provided with a label that can be detected directly or indirectly. Another object of the present invention is to provide a method for separating and quantifying free active MMPs in a test sample by using another combination component as a solid-phased component, and a reagent used for the method. Thus, typically, the object of the present invention is to provide a labeled TIMP
s (including TIMPs labeled indirectly with each monoclonal antibody labeled with each TIMP) or a monoclonal antibody against each MMP and a monoclonal antibody or TIMPs against each MMP for a solid phase carrier, An object of the present invention is to provide an excellent method for differentially quantifying free active MMPs in a sample and a reagent kit therefor. It is understood that the present invention includes in its embodiment all the reagents of the reagent kit capable of differentially quantifying such free active MMPs. It is a further object of the present invention to provide a method, a reagent or a diagnostic agent capable of monitoring a disease state such as tissue destruction or cancer metastasis by differentially quantifying free active MMPs using the above-mentioned quantification method. Therefore, various uses of the above reagents in the medical and physiological fields, tissue destruction and cancer metastasis, judgment of the degree of tissue repair, and use of the above reagents as indicators of physiological effects such as promotion of cell proliferation are all within the scope of the present invention. Are understood to be included within that embodiment.

【０００７】本発明に従った態様によれば、例えば下記
の定量法が提供される。 （１）標識物が付与されたＴＩＭＰｓと各ＭＭＰに特異
的に結合するモノクローナル抗体あるいは（２）ＴＩＭ
Ｐに特異的に結合するモノクローナル抗体を介して標識
物が付与されたＴＩＭＰｓと各ＭＭＰに特異的に結合す
るモノクローナル抗体をそれぞれ用い、個々の活性型Ｍ
ＭＰを標準物質として、被検試料中の個々の遊離の活性
型ＭＭＰの分別定量を行うことを特徴とする遊離の活性
型ＭＭＰｓの定量法及びそれに用いる試薬。本発明の定
量法において、使用されるＭＭＰに特異的に結合するモ
ノクローナル抗体は、各々のＭＭＰに特異的に結合し、
別のＭＭＰｓと交差反応しないモノクローナル抗体で、
特には各ＭＭＰの中央領域またはカルボキシル末端領域
を認識するものが挙げられる。According to an embodiment of the present invention, there is provided, for example, the following quantification method. (1) Labeled TIMPs and monoclonal antibodies that specifically bind to each MMP or (2) TIM
TIMPs labeled with a monoclonal antibody that specifically binds to P and a monoclonal antibody that specifically binds to each MMP were used.
A method for quantifying free active MMPs, wherein MP is used as a standard substance, and a method for quantifying free active MMPs in a test sample, and a reagent used therefor. In the quantification method of the present invention, the monoclonal antibody specifically binding to the MMP used specifically binds to each MMP,
A monoclonal antibody that does not cross react with other MMPs,
In particular, those that recognize the central region or the carboxyl terminal region of each MMP can be mentioned.

【０００８】本発明で使用されるＭＭＰｓに対するイン
ヒビターは、ＭＭＰ遺伝子ファミリー由来のＭＭＰｓに
対するインヒビターを含んでいてよく、例えばＴＩＭＰ
−１、ＴＩＭＰ−２といったＭＭＰｓに対するインヒビ
ターであることができる。ＴＩＭＰ−１は、最初ＭＭＰ
−１を阻害することからコラゲナーゼインヒビターと呼
ばれていたが、その後ゼラチナーゼやストロムライシン
も阻害することからＴＩＭＰと呼ばれるようになったも
ので、オタマジャクシからヒトに至る由来の異なるコラ
ゲナーゼを広く阻害する。ＴＩＭＰ−１は、多くの体外
培養組織、例えば大動脈、軟骨、胎児骨、腱、歯髄、歯
肉、滑膜、子宮など、培養細胞、例えば線維芽、上皮、
内皮、骨芽、軟骨、平滑筋などの細胞、血小板、単球、
マクロファージ、腫瘍細胞などにより産生されているこ
とが認められ、歯髄由来細胞、ヒト胎盤などから得るこ
とができ、例えばＫｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌ
ｌａｇｅｎ Ｒｅｌ． Ｒｅｓ．，７，３４１−３５
０，１９８７及びＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６，３９５〜
４０４，１９８４に記載の方法に従い、ウシの未萌出知
歯の根部歯髄といったウシ歯髄由来細胞の培養液から単
離したり、Ｋｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２７，１０３−１０８，１
９９０に記載の方法に従いヒト胎盤などから得ることが
できる。[0008] The inhibitors for MMPs used in the present invention may include inhibitors for MMPs from the MMP gene family, for example, TIMPs.
-1 and TIMP-2 can be inhibitors of MMPs. TIMP-1 is initially an MMP
-1 was called a collagenase inhibitor because it inhibits -1 and later came to be called TIMP because it also inhibits gelatinase and stromlysin, and widely inhibits different collagenases from tadpoles to humans. TIMP-1 is used in many in vitro cultured tissues such as aorta, cartilage, fetal bone, tendon, pulp, gingiva, synovium, uterus, etc., and cultured cells such as fibroblasts, epithelium,
Cells such as endothelium, osteoblasts, cartilage, smooth muscle, platelets, monocytes,
It is recognized that it is produced by macrophages, tumor cells, and the like, and can be obtained from dental pulp-derived cells, human placenta, and the like. For example, Kodama et al. , Col
lagen Rel. Res. , 7,341-35
0, 1987 and J.M. Biochem. 96,395-
404, 1984, and isolated from a culture of bovine pulp-derived cells, such as the root pulp of unpigmented bovine teeth, as described in Kodama et al. , J. et al. Immu
nol. Methods, 127, 103-108, 1
990 can be obtained from human placenta or the like.

【０００９】ＴＩＭＰ−２は、その含有アミノ酸配列が
ＴＩＭＰ−１とホモロジーを有する部位を持つことが知
られている。ＴＩＭＰ−２は、マウス結腸癌細胞、例え
ばｃｏｌｏｎ２６細胞、ヒト胎盤などから得ることがで
き、例えばＦｕｊｉｍｏｔｏｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９３、
特開平６−３００７５７号公報などに記載の方法に従い
ヒト胎盤などから得ることができる。ＴＩＭＰ−１及び
ＴＩＭＰ−２は、遺伝子組換えの技術で得ることもで
き、例えばＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６８，２６７−２７４，１９９
０、Ｂｏｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２８００−２８０
４，１９９０に記載の方法を参考にして得ることができ
る。これらＴＩＭＰｓは、従来公知の方法、例えば硫酸
アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどに
よるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電
気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマト
グラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などによ
り精製してから用いることができる。基本的にはＭＭＰ
ｓに対するインヒビターであるものを、限定されること
無く利用できるが、好ましくは活性型ＭＭＰｓに特異的
に結合できるものが挙げられる。It is known that TIMP-2 has a site whose amino acid sequence has homology with TIMP-1. TIMP-2 can be obtained from mouse colon cancer cells, for example, colon 26 cells, human placenta, and the like. For example, Fujimoto et al. , Clin.
Chim. Acta, 220, 31-45, 1993,
It can be obtained from human placenta or the like according to the method described in JP-A-6-300575. TIMP-1 and TIMP-2 can also be obtained by genetic recombination techniques, as described, for example, in Williamson et al. , Bi
ochem. J. , 268, 267-274, 199
0, Boone et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 87, 2800-280
4, 1990. These TIMPs can be prepared by a conventionally known method, for example, salting out such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration by Sephadex, ion exchange chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, affinity chromatography, high-speed chromatography, and the like. It can be used after purification by liquid chromatography or the like. Basically MMP
Inhibitors of SMP can be used without limitation, but preferably include those capable of specifically binding to active MMPs.

【００１０】本発明で使用されるモノクローナル抗体
は、ケラー及びミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，
４９５−４９７，１９７５）などにより開示されたミエ
ローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して得られた
モノクローナル抗体であってもよいことはいうまでもな
い。本発明で使用されるモノクローナル抗体は、次のよ
うな工程で作製できる。 １．免疫原性抗原の調製 ２．免疫原性抗原による動物の免疫 ３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 ４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 ５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクロー
ン化 ６．モノクローナル抗体の製造The monoclonal antibodies used in the present invention are described by Köhler, G. &
Milstein, C.I. ) (Nature, 256,
495-497, 1975) and the like. The monoclonal antibody used in the present invention can be prepared by the following steps. 1. 1. Preparation of immunogenic antigen 2. Immunization of animals with immunogenic antigens. 3. Preparation of myeloma cells (myeloma cells) 4. Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells 5. Selection and monocloning of hybridomas (fused cells) Production of monoclonal antibodies

【００１１】１．免疫原性抗原の調製 抗原としては、例えばＫｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｏｌｌａｇｅｎＲｅｌ． Ｒｅｓ．，７，３４１−３５
０，１９８７及びＫｏｄａｍａ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２７，１０３−１０
８，１９９０に記載の方法により調製したＴＩＭＰ−
１、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９３に記載
の方法により調製したＴＩＭＰ−２、特開平５−１９９
８６８号に記載の方法に従い調製したリコンビナントＴ
ＩＭＰ−１（ｒＴＩＭＰ−１）、Ａｏｋｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ，２６，２
８１−２９０，１９９５に記載の方法に従い調製したリ
コンビナントＴＩＭＰ−２（ｒＴＩＭＰ−２）などを用
いることができる。ここでは、ＭＭＰｓ活性を阻害する
ＴＩＭＰｓであればどのＴＩＭＰｓでも使用できる。1. Preparation of immunogenic antigens As antigens, for example, Kodama et al. , C
ollagenRel. Res. , 7,341-35
0, 1987 and Kodama et al. , J. et al. Im
munol. Methods, 127, 103-10
8, TIMP- prepared by the method described in 1990
1, Fujimoto et al. , Clin. Ch
im. Acta, 220, 31-45, 1993, TIMP-2 prepared by the method described in JP-A-5-199.
Recombinant T prepared according to the method described in No. 868
IMP-1 (rTIMP-1), Aoki et a
l. , Connective Tissue, 26 , 2
81-290 , 1995. Recombinant TIMP-2 (rTIMP-2) prepared according to the method described in 81-290 , 1995 can be used. Here, any TIMPs that inhibit MMPs activity can be used.

【００１２】また抗原としては、例えばＺｈａｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１９，
１−１４，１９９３に記載の方法に従い調製したＭＭＰ
−１、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ， ２２１，９１−１０３，１９９３
に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−２、Ｏｋａｄａｅ
ｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５４，７３１−
７４１，１９８８に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−
３、Ｋｎａｕｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ．，３７１，２９５−３
０４，１９９０に記載の方法により調製したＭＭＰ−
８、Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６７，２１７１２−２１７１９，１９９２に記
載の方法に従い調製したＭＭＰ−９、Ｐａｒｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１５８４
−１５９０，１９９１に記載の方法に従い調製したリコ
ンビナントＭＭＰ−１０、Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８４９−２５８５
５，１９９４に記載の方法に従い調製したリコンビナン
トＭＭＰ−１１、Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．，２６８，２３８２４−２３８２
９，１９９３に記載の方法に従い調製したＭＭＰ−１２
及びリコンビナントＭＭＰ−１２、Ｆｒｅｉｊｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１６７
６６−１６７７３，１９９４に記載の方法に従い調製し
たリコンビナントＭＭＰ−１３、特願平６−３３１３０
５号に記載の方法に従い調製したＭＴ−ＭＭＰなどで、
それらの文献やそこで引用する文献に記載の方法に従い
調製したＭＭＰｓ、さらには遺伝子組み換え等によって
得られたＭＭＰｓなどを用いることができる。As antigens, for example, Zhange
t al. , Clin. Chim. Acta, 219,
1-14, MMP prepared according to the method described in 1993
-1, Fujimoto et al. , Clin. C
him. Acta, 221, 91-103, 1993
MMP-2, Okadae prepared according to the method described in
t al. , Biochem. J. , 254, 731-
MMP- prepared according to the method described in U.S. Pat.
3, Knauper et al. , Biol. Che
m. Hoppe-Seyler. , 371, 295-3
MMP- prepared by the method described in U.S. Pat.
8, Okada et al. , J. et al. Biol. Che
m. , 267, 21712-21719, 1992, MMP-9, Park et al.
al. , J. et al. Biol. Chem. , 266, 1584
Recombinant MMP-10 prepared according to the method described in -1590, 1991, Pei et al. , J. et al.
Biol. Chem. , 269, 25849-2585
Recombinant MMP-11 prepared according to the method described in 5, 5, 1994, Shapiro et al. , J. et al.
Bio1. Chem. , 268, 23824-2382
9, MMP-12 prepared according to the method described in 1993
And recombinant MMP-12, Freige et
al. , J. et al. Biol. Chem. , 269,167
66-16773, 1994. Recombinant MMP-13 prepared according to the method described in Japanese Patent Application No. 6-33130.
With MT-MMP prepared according to the method described in No. 5,
MMPs prepared according to the methods described in those documents and the documents cited therein, and MMPs obtained by genetic recombination or the like can be used.

【００１３】ここでは、潜在型や活性型のものが好まし
く使用できる。こうした抗原は、各種原料、例えば培養
細胞、培養組織など、形質転換体細胞などの抗原産生材
料から従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法
などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限
外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速
液体クロマトグラフィー法などにより精製して得ること
ができる。好ましくは、ポリアクリルアミド電気泳動、
モノクローナル抗体などの抗原を特異的に認識する抗体
あるいはインヒビターを固定化したアフィニティー・ク
ロマトグラフィーなどで処理し精製分離処理できる。特
に好ましくはゼラチン−アガロース・アフィニティー・
クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・クロマト
グラフィーなどが挙げられる。Here, the latent type and the active type can be preferably used. Such antigens can be obtained from various raw materials, for example, cultured cells, cultured tissues, and other antigen-producing materials such as transformed cells, by conventionally known methods, for example, salting-out such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration by Sephadex, etc., ion-exchange chromatography, and the like. It can be obtained by purification by a chromatography method, electrophoresis method, dialysis, ultrafiltration method, affinity chromatography method, high performance liquid chromatography method and the like. Preferably, polyacrylamide electrophoresis,
Monoclonal antibodies can be an antigen that specifically recognizes the antibody or inhibitor treated with such immobilized Affinity chromatography purification and separation process, such as. Particularly preferred is gelatin-agarose affinity.
Chromatography, heparin-agarose chromatography and the like.

【００１４】こうして得られた抗原は、さらに免疫原性
コンジュゲートなどにしてもよいが、そのまま適当なア
ジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できる。
さらに抗原は、それを断片化したものを適当な縮合剤を
介して種々の担体タンパク質類と結合させてハプテン−
タンパク質の如き免疫原性コンジュゲートとし、これを
用いて特定の配列のみを認識できるモノクローナル抗体
をデザインするのに用いることもできる。例えば、Ｂｏ
ｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２８００−２８０４，１９
９０に記載のヒトＴＩＭＰ−２のｃＤＮＡ配列から予測
されるアミノ酸配列をもつポリペプチドをデザインして
合成して得られたポリペプチドを用いることが挙げられ
る。デザインされるポリペプチドには予めシステイン残
基などを付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易
にできるようにしておくことができる。担体タンパク質
類と結合させるにあたっては、担体タンパク質類はまず
活性化されることができる。こうした活性化にあたり活
性化結合基を導入することが挙げられる。The antigen thus obtained may be further used as an immunogenic conjugate or the like, but can be used as it is for immunizing animals by mixing it with an appropriate adjuvant.
Further, the antigen is obtained by binding the fragmented product to various carrier proteins via an appropriate condensing agent to form a hapten-antigen.
It can be used as an immunogenic conjugate such as a protein to design a monoclonal antibody that can recognize only a specific sequence. For example, Bo
one et al. Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 87, 2800-2804, 19
90, using a polypeptide obtained by designing and synthesizing a polypeptide having an amino acid sequence predicted from the cDNA sequence of human TIMP-2. A cysteine residue or the like can be added to the designed polypeptide in advance so that the immunogenic conjugate can be easily prepared. Upon binding to carrier proteins, the carrier proteins can first be activated. For such activation, introduction of an activation bonding group may be mentioned.

【００１５】活性化結合基としては、（１）活性化エス
テルあるいは活性化カルボキシル基、例えばニトロフェ
ニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、
１−ベンゾトリアゾールエステル基、Ｎ−スクシンイミ
ドエステル基など、（２）活性化ジチオ基、例えば２−
ピリジルジチオ基などが挙げられる。担体タンパク質類
としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ），牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミ
ン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイド、細
菌菌体成分、例えばＢＣＧなどが挙げられる。The activated linking group includes (1) an activated ester or an activated carboxyl group such as a nitrophenyl ester group, a pentafluorophenyl ester group,
(2) activated dithio groups such as 1-benzotriazole ester group and N-succinimide ester group, for example, 2-
And a pyridyldithio group. As carrier proteins, keyhole limpet hemocyanin (K
LH), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, globulin, polypeptides such as polylysine, and bacterial cell components such as BCG.

【００１６】２．免疫原性抗原による動物の免疫 動物を免疫するには、例えば村松繁、他編、実験生物学
講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日
本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究
法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生
化学実験講座１２、分子免疫学 III、抗原・抗体・補
体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じ
て行うことができる。抗原と共に用いられるアジュバン
トとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ
（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、
リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカ
などが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどの
マウスをはじめとする動物を使用して行われる。抗原の
投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動
物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後
１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔
内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０
回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ
／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウス
とのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応
じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫
の程度を確認できる。2. Immunization of Animals with Immunogenic Antigen To immunize animals, for example, Shigeru Muramatsu, et al., Experimental Biology Course 14, Immunobiology, Maruzen Co., Ltd., 1985, Japan Biochemical Society, Seikagaku Experimental Course 5. Immunobiochemical research method, Tokyo Chemical Dojin, 1986, edited by The Japanese Biochemical Society, New Chemistry Experiment Course 12, Molecular Immunology III, antigen / antibody / complement, Tokyo Chemical Dojin, 1992, etc. It can be performed according to it. Adjuvants used with antigens include, for example, Freund's complete adjuvant, Ribi adjuvant, pertussis vaccine, BCG,
Lipid A, liposomes, aluminum hydroxide, silica and the like. Immunization is performed using an animal such as a mouse such as BALB / c. The dose of the antigen is, for example, about 1 to 400 μg / animal for a mouse, which is generally injected intraperitoneally or subcutaneously into a host animal, and thereafter intraperitoneally every 1 to 4 weeks, preferably every 1 to 2 weeks. 2-10 boosters subcutaneously, intravenously or intramuscularly
Repeat about once. BALB as a mouse for immunization
In addition to / c mice, F1 mice of BALB / c mice and other mice can also be used. If necessary, an antibody titer measurement system is prepared, and the antibody titer is measured to confirm the degree of animal immunity.

【００１７】３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）と
しては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶこと
ができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−
１，Eur. J. Immunology, 6, 511〜519, 1976)、ＳＰ２
／０−Ａｇ１４（ＳＰ２，Nature, 276, 269〜270, 197
8 ) 、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来
のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１，Current to
pics in Microbiol. and Immunol., 81, 1〜7, 1978
）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３，Nature, 256, 49
5〜497, 1975 ) 、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３ (６
５３，J.Immunol., 123, 1548〜1550, 1979) などを用
いることができる。８−アザグアニン耐性のマウスミエ
ローマ細胞株はダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培
地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地に、例え
ばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清
（ＦＣＳ）などを加え、さらに８−アザグアニン（例え
ば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、
細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細
胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結
保存株を約３７℃で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６
４０培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で
培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよ
い。3. Preparation of myeloma cells (myeloma cells) Infinitely proliferative strains (tumor cell strains) used for cell fusion can be selected from cell lines that do not produce immunoglobulin. For example, P3-NS-1-Ag4-1 ( NS-
1, Eur. J. Immunology, 6, 511-519, 1976), SP2
/ 0-Ag14 (SP2, Nature, 276, 269-270, 197
8), P3-X63-Ag8-U1 derived from mouse myeloma MOPC-21 cell line (P3U1, Current to
pics in Microbiol. and Immunol., 81, 1-7, 1978
), P3-X63-Ag8 (X63, Nature, 256, 49
5-497, 1975), P3-X63-Ag8-653 (6
53, J. Immunol., 123, 1548-1550, 1979). The 8-azaguanine-resistant mouse myeloma cell line is prepared by adding an antibiotic such as penicillin or amikacin, fetal calf serum (FCS), etc. to a cell culture medium such as Dulbecco's MEM medium (DMEM medium) or RPMI-1640 medium. Passaged in a medium supplemented with azaguanine (for example, 5-45 μg / ml),
The required number of cell lines can be prepared by passage in a normal medium 2 to 5 days before cell fusion. The cell strain used was a thawed RPMI-16 after completely thawing the cryopreserved strain at about 37 ° C.
After washing three times or more with a normal medium such as 40 medium, the cells may be cultured in a normal medium to prepare a required number of cell lines.

【００１８】 ４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、脾細胞
懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を
得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうし
て得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に従い得られ
たミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培
地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細
胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリ
コールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当
該分野で知られたものを用いることができ、この様なも
のとしては不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈ
ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ
Ｊａｐａｎ）などが挙げられる。好ましくは、例えば３
０〜６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ
加えることができ、分子量が１，０００〜８，０００の
ポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分
子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコー
ルがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチ
レングリコールの濃度は、例えば３０〜６０％となるよ
うにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチル
スルホキシドなどを少量加え、融合を促進することもで
きる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ
細胞株の割合は、例えば１：１〜２０：１とすることが
挙げられるが、より好ましくは４：１〜７：１とするこ
とができる。融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地などの細胞培地を加える。融合反応処
理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心な
どにより細胞を分離した後選択用培地に移す。[0018] 4. Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells. An animal, for example, a mouse immunized according to the step described above is spleen removed 2 to 5 days after the final immunization to obtain a spleen cell suspension. In addition to spleen cells, lymph node cells from various parts of the body can be obtained and used for cell fusion. The thus obtained spleen cell suspension and 3 . The myeloma cell line obtained according to the step is placed in a cell culture medium such as a minimum essential medium (MEM medium), a DMEM medium, and an RPMI-1640 medium, and a cell fusion agent such as polyethylene glycol is added. As the cell fusion agent, various other known agents in the art can be used, and such an inactivated Sendai virus (HVJ: H
emagglutinating viruses of
Japan). Preferably, for example, 3
0.5 to 2 ml of 0 to 60% polyethylene glycol
Polyethylene glycol having a molecular weight of 1,000 to 8,000 can be used, and polyethylene glycol having a molecular weight of 1,000 to 4,000 can be more preferably used. It is preferable that the concentration of polyethylene glycol in the fusion medium be, for example, 30 to 60%. If necessary, fusion can be promoted by adding a small amount of, for example, dimethyl sulfoxide. The ratio of spleen cells (lymphocytes) to myeloma cell line used for the fusion may be, for example, 1: 1 to 20: 1, and more preferably 4: 1 to 7: 1. The fusion reaction is performed for 1 to 10 minutes and then RPM
Add a cell culture medium, such as 1-1640 medium. The fusion reaction treatment can be performed plural times. After the fusion reaction, the cells are separated by centrifugation or the like, and then transferred to a selection medium.

【００１９】５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及
びモノクローン化 選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙
げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレ
ートに分注した容量と当容量を翌日加え、その後１〜３
日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというようにす
ることができるが、適宜これに変更を加えて行うことも
できる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリン
を除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をす
ることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺
細胞を使用することもでき、それが好ましい場合があ
る。ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養
上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、
蛍光免疫分析（ＦＩＡ）などの測定系、あるいは蛍光惹
起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）などで、各ＴＩＭＰあるい
は各ヒトＭＭＰ抗原あるいはその断片ペプチドを抗原と
して用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目的
抗体を測定するなどして、スクリーニングしたり分離す
る。目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニ
ングする。クローニングは、寒天培地中でコロニーをピ
ック・アップするか、あるいは限界希釈法によりなされ
うる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。ク
ローニングは複数回行うことが好ましい。5. Selection and Monocloning of Hybridomas (Fused Cells) As a selection medium, for example, an FCS-containing MEM medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine, R
A medium such as a PMI-1640 medium, a so-called HAT medium can be used. The method of replacing the selective medium is generally such that the volume and the equivalent volume dispensed to the culture plate are added the next day, and then 1 to 3
The HAT medium can be replaced by half each day, but it can also be modified as appropriate. On the 8th to 16th days after the fusion, the medium can be exchanged every 1 to 4 days with a so-called HT medium excluding aminopterin. As a feeder, for example, mouse thymocytes can be used, which may be preferred. Culture supernatants from the culture wells of the hybridoma growth can be analyzed by, for example, radioimmunoassay (RIA), ELISA,
Using a TIMP or each human MMP antigen or its fragment peptide as an antigen, or a labeled anti-mouse antibody using a measurement system such as fluorescence immunoassay (FIA) or a fluorescence-induced cell separation device (FACS) Screening or isolation, for example, by measuring The hybridoma producing the desired antibody is cloned. Cloning can be done by picking up colonies in an agar medium or by limiting dilution. It can be more preferably performed by a limiting dilution method. Cloning is preferably performed multiple times.

【００２０】６．モノクローナル抗体の製造 得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培
養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得
ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリ
ドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエロ
ーマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に
各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、例えばヌー
ド・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖さ
せ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を
回収して得ることが出来る。ハイブリドーマの移植に先
立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、ハイ
ブリドーマを増殖させ、腹水を採取すればよい。腹水液
はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アン
モニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによる
ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳
動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラ
フィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精
製してモノクローナル抗体として用いることができる。
好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫
安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオ
ン交換ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィニティ
ーカラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好まし
くは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗
原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識す
る部位など）を固定化したアフィニティー・クロマトグ
ラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティー・
クロマトグラフィーなどが挙げられる。6. Production of Monoclonal Antibody The obtained hybridoma strain was prepared using a MEM medium containing FCS,
After culturing in a suitable growth medium such as RPMI-1640 medium, a desired monoclonal antibody can be obtained from the culture supernatant. In order to obtain a large amount of antibodies, ascites of the hybridoma can be mentioned. In this case, each hybridoma is transplanted and grown in the abdominal cavity of a histocompatible animal of the same type as the myeloma cell-derived animal, or, for example, each hybridoma is transplanted and grown in a nude mouse or the like and produced in the ascites of the animal. The obtained monoclonal antibody can be recovered and obtained. Prior to the transplantation of the hybridoma, a mineral oil such as pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) may be administered intraperitoneally, and then the hybridoma may be grown and ascites may be collected. Ascites fluid as it is or conventionally known methods such as salting out such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration by Sephadex, etc., ion exchange chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, affinity chromatography And purified by high performance liquid chromatography or the like and used as a monoclonal antibody.
Preferably, the ascites containing the monoclonal antibody can be purified and separated by fractionating with ammonium sulfate and then treating it with an anion exchange gel such as DEAE-Sepharose and an affinity column such as a protein A column. Particularly preferably, affinity chromatography in which an antigen or antigen fragment (for example, a synthetic peptide, a recombinant antigen protein or peptide, a site specifically recognized by an antibody, etc.) is immobilized, and affinity in which protein A is immobilized.
Chromatography.

【００２１】こうして得られたモノクローナル抗体は、
市販のアイソタイプ特異的抗マウスＩｇ抗体、例えばア
イソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体などを用いて
その抗体構成鎖の重鎖及び軽鎖のタイプについて調べる
ことができる。モノクローナル抗体は、また特開平６−
３００７５７号及びＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ
（Ｊ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２１９，１−１４，
１９９３）記載の方法で調製されたもの、例えば該文献
記載のクローン７８−１２Ｇ８（微工研受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３１１５）からのモノクローナル抗体、特開
平６−２１３８８８号及びＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔ
ａ（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏｅｔ ａｌ．，２２１，９１
−１０３，１９９３）記載の方法で調製されたもの、例
えば該文献記載のクローン７５−７Ｆ７（微工研受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３５）からのモノクローナル抗
体、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏ
ｔｏ ｅｔ ａｌ．，２３１，７９−８８，１９９４）
記載の方法で調製されたもの、例えば該文献記載のクロ
ーン７３−１８Ｂ３（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
３６９５）からのモノクローナル抗体などであることが
できる。この各ＭＭＰに対し特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体は、各ＭＭＰの潜在型及び活性型を認識する
ものが好ましいものとして挙げられる。The monoclonal antibody thus obtained is
Using a commercially available isotype-specific anti-mouse Ig antibody, for example, an isotype-specific rabbit anti-mouse Ig antibody, the type of heavy chain and light chain of the antibody constituent chains can be examined. Monoclonal antibodies are also disclosed in
No. 300575 and Clin. Chim. Acta
(J. Zhang et al., 219, 1-14,
1993), for example, clone 78-12G8 described in the literature (Microfabrication Accession No. FER)
MP-13115), JP-A-6-213888 and Clin. Chim. Act
a (N. Fujimoto et al., 221, 91)
-103, 1993), for example, a monoclonal antibody derived from clone 75-7F7 (Microcosms Accession No. FERM P-13335) described in the literature, Clin. Chim. Acta (N. Fujimoto)
to et al. , 231, 79-88, 1994).
Those prepared by the method described, for example, clone 73-18B3 (raw Engineering Research accession of the literature No. FERM P-1
3695). Preferred monoclonal antibodies that specifically bind to each MMP are those that recognize the latent and active forms of each MMP.

【００２２】またこうして大量に得られた抗体の配列を
決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコー
ドする塩基配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗
体を作製することも可能である。さらにこれら抗体をト
リプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理し
て、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）₂ といった抗体フラグメントにして使用して
もよい。これらフラグメントは、ＣＭ−又はＤＥＡＥ−
セルロースクロマトグラフィー、ゲルろ過及びアフィニ
ティクロマトグラフィーなどの方法で精製できる。標識
物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画分、更にはペプシ
ン消化後還元して得られる特異的結合部Ｆａｂ’を用い
ることができる。これらの場合の標識物の例としては、
下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなど）、
化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素などがあ
る。It is also possible to determine the sequence of the antibody obtained in such a large amount, and to prepare an antibody by a gene recombination technique using a base sequence encoding the antibody obtained from the hybridoma strain. Further, these antibodies are treated with an enzyme such as trypsin, papain, pepsin and the like, and optionally reduced to obtain Fab, Fab '
It may be used as an antibody fragment such as (ab ') ₂ . These fragments are CM- or DEAE-
It can be purified by methods such as cellulose chromatography, gel filtration and affinity chromatography. As an antibody to be labeled, an IgG fraction, and further a specific binding portion Fab ′ obtained by digestion and reduction after pepsin can be used. Examples of labels in these cases include:
Enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase or β-D-galactosidase etc.) as described below,
There are chemical substances, fluorescent substances and radioisotopes.

【００２３】本発明では、こうして得られた各ＭＭＰに
対し特異的に結合するモノクローナル抗体とＴＩＭＰｓ
を組合わせて用いて検体試料中の遊離の各活性型ＭＭＰ
を免疫学的に分別して定量する方法が提供される。さら
にこうして得られた各ＭＭＰに対し特異的に結合するモ
ノクローナル抗体とＴＩＭＰｓあるいは各ＴＩＭＰに対
し特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたＴ
ＩＭＰｓとを組合わせて用いて検体試料中の遊離の各活
性型ＭＭＰを免疫学的に分別して定量する方法が提供さ
れる。特に各ＴＩＭＰを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体としては、ＴＩＭＰ−１を特異的に認識するモノ
クローナル抗体、ＴＩＭＰ−２を特異的に認識するモノ
クローナル抗体が挙げられる。特開平５−２４４９８５
号の記載に従い調製し、得られた抗体が挙げられるが、
そのうち特異性が高く且つ親和性の強いマウス抗ＴＩＭ
Ｐ−２ ＩｇＧ（クローン６７−４Ｈ１１、微工研受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６９０）あるいはそれと実質的
に同様の特異性を持つものなどが挙げられる。各ＭＭＰ
を特異的に認識するモノクローナル抗体としては、各Ｍ
ＭＰの少なくとも活性型を認識するモノクローナル抗体
が用いられ、各ＭＭＰの中央領域を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体、各ＭＭＰのカルボキシル末端領域を
認識するモノクローナル抗体が挙げられる。各ＴＩＭＰ
と各ＴＩＭＰを特異的に認識し且つ標識化されたモノク
ローナル抗体は、活性型ＭＭＰｓとの反応前に相互に結
合されていてよい。その結合は架橋結合などの比較的安
定で、各ＴＩＭＰの各ＭＭＰに対する反応性に比較的影
響しない方法が挙げられる。より強い結合形態にある場
合には、潜在型ＭＭＰ−２あるいは潜在型ＭＭＰ−９と
の反応において各ＴＩＭＰと各ＴＩＭＰを特異的に認識
し且つ標識化されたモノクローナル抗体との間の解離の
問題などがなくより好ましい。その結合は上記免疫原性
コンジュゲートに適用される方法、下記標識化に用いる
方法、固相化に用いる方法などの中から適宜選択して用
いることができる。好ましくはホルムアルデヒドなどの
アルデヒド類を架橋剤として使用する方法が挙げられる
が、これには限定されない。In the present invention, a monoclonal antibody specifically binding to each MMP thus obtained and TIMPs
Activated MMP free in the specimen sample by using
And a method for immunologically differentiating and quantifying the same. Further, the thus obtained monoclonal antibody which specifically binds to each MMP and TIMPs or the monoclonal antibody which specifically binds to each TIMP is bound to TMP.
There is provided a method for immunologically differentiating and quantifying each free active MMP in a specimen sample using IMPs in combination. In particular, examples of the monoclonal antibody that specifically recognizes each TIMP include a monoclonal antibody that specifically recognizes TIMP-1 and a monoclonal antibody that specifically recognizes TIMP-2. JP-A-5-244985
Prepared according to the description of the item, obtained antibodies are mentioned,
Mouse anti-TIM with high specificity and high affinity
P-2 IgG (clone 67-4H11, accession number FERM P-12690) or a substance having substantially the same specificity as that of P-2 IgG. Each MMP
Monoclonal antibodies that specifically recognize
A monoclonal antibody that recognizes at least the active form of MP is used, and examples include a monoclonal antibody that specifically recognizes the central region of each MMP and a monoclonal antibody that recognizes the carboxyl terminal region of each MMP. Each TIMP
And the monoclonal antibodies specifically recognizing and labeling each TIMP may be mutually bound before the reaction with the activated MMPs. The bonding is relatively stable, such as cross-linking, and does not relatively affect the reactivity of each TIMP to each MMP. When in a stronger binding form, the problem of dissociation between each TIMP and a monoclonal antibody that specifically recognizes and labels each TIMP in the reaction with latent MMP-2 or latent MMP-9 It is more preferable because there is no such thing. The binding can be appropriately selected and used from the method applied to the immunogenic conjugate, the method used for labeling described below, the method used for immobilization, and the like. Preferable examples include a method using an aldehyde such as formaldehyde as a crosslinking agent, but the method is not limited thereto.

【００２４】さらに本発明では、各ＭＭＰに対し特異的
に結合するモノクローナル抗体と、ＴＩＭＰｓに特異的
に結合する抗体とＴＩＭＰｓとの複合体を用いて、検体
試料中の遊離の各活性型ＭＭＰを免疫学的に分別して定
量する方法も提供される。特にＴＩＭＰ−１を特異的に
認識するモノクローナル抗体あるいはＴＩＭＰ−２を特
異的に認識するモノクローナル抗体とＴＩＭＰｓとの複
合体を標識試薬として用い、各ＭＭＰに対し特異的に結
合するモノクローナル抗体を固相化試薬として用いて検
体試料中の遊離の各活性型ＭＭＰを免疫学的に分別して
定量する方法が好ましく提供される。糖が結合している
ＭＭＰｓは、糖鎖などにより分子量にバラツキを生じた
り、研究者により報告される測定分子量も異なる。した
がって本発明では実質的に遊離のＭＭＰの活性型を測定
するものであればとくにその分子量は限定されるもので
ない。ＭＭＰｓは、大きく分けてプロペプチド（ｐｒｏ
ｐｅｐｔｉｄｅ）、触媒活性ドメイン（ｃａｔａｌｙｔ
ｉｃ ｄｏｍａｉｎ）、ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅ
ｇｉｏｎ）及びペキシン様ドメイン（ｐｅｘｉｎ−ｌｉ
ｋｅ ｄｏｍａｉｎ）の４つの領域に分けられ、プロペ
プチド領域をアミノ末端領域、ペキシン様ドメイン領域
をカルボキシル末端領域とされ、その間の触媒活性ドメ
イン及びヒンジ領域を中央領域とされるのが一般的であ
る。Further, in the present invention, each of the active MMPs in the test sample can be purified using a monoclonal antibody that specifically binds to each MMP and a complex of the antibody and TIMPs that specifically bind to TIMPs. Also provided are methods for immunologically differentiating and quantifying. In particular, a monoclonal antibody that specifically recognizes TIMP-1 or a complex of a monoclonal antibody that specifically recognizes TIMP-2 and TIMPs is used as a labeling reagent, and a monoclonal antibody that specifically binds to each MMP is used as a solid phase. It is preferable to provide a method for immunologically differentiating and quantifying each free active MMP in a sample sample by using the same as a reagent for the quantification. MMPs to which sugars are bound vary in molecular weight due to sugar chains and the like, and also have different measured molecular weights reported by researchers. Therefore, in the present invention, the molecular weight of the active form of MMP is not particularly limited as long as it is to measure the active form of substantially free MMP. MMPs are roughly divided into propeptides (pro
peptide, catalytically active domain (catalyt)
ic domain, hinge region
gion) and a pexin-like domain (pexin-li)
is divided into four regions ke domain), amino-terminal region of the propeptide region is a Pekishin like domain region and carboxyl-terminal region, common that is between them catalytically active domain and a hinge region and the central region is there.

【００２５】本発明の測定は、イムノアッセイ、例えば
競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで
行うことができ、ラジオイムノメトリックアッセイ、Ｅ
ＬＩＳＡなどを用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行って
もあるいは行わないでその測定を行うことができる。各
ＴＩＭＰは直接検出可能に標識化されてもよいし、アッ
セイ反応前に各ＴＩＭＰに対し特異的に結合する検出可
能に標識化されたモノクローナル抗体でもって間接的に
検出可能に標識化されていてよい。一方各ＭＭＰに対す
る抗体を固相に固定化する。別の態様ではＴＩＭＰｓを
固相に固定化することもでき、この場合各ＭＭＰに対す
る抗体は検出可能に標識化されていてもよい。検体と標
識化ＴＩＭＰｓ及び固相化抗体を必要に応じ順次反応さ
せるためインキュベーション処理し、ここで非結合ＴＩ
ＭＰｓを分離後、標識物を測定する。測定された標識の
量は抗原、すなわち各活性型ＭＭＰの量と比例する。洗
浄、撹拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特
定の状況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用され
る。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはインキ
ュベーション処理時間などのその他の測定条件は、検体
中の抗原の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変える
ことができる。当業者は通常の実験法を用いながら各測
定に対して有効な最適の条件を適宜選定して測定を行う
ことが出来る。The measurement of the present invention can be carried out by an immunoassay, for example, a competitive immunoassay or a noncompetitive immunoassay, a radioimmunometric assay,
LISA or the like can be used, and the measurement can be performed with or without BF separation. Each TIMP may be directly detectably labeled, or may be indirectly detectably labeled with a detectably labeled monoclonal antibody that specifically binds to each TIMP prior to the assay reaction. Good. On the other hand, antibodies against each MMP are immobilized on a solid phase. In another embodiment, the TIMPs can be immobilized on a solid phase, in which case the antibody to each MMP may be detectably labeled. Incubation is performed to sequentially react the sample with the labeled TIMPs and the immobilized antibody as necessary.
After separating the MPs, the label is measured. The amount of the label measured is proportional to the amount of the antigen, that is, each active MMP. Washing, stirring, shaking, filtration, pre-extraction of antigen, etc. are appropriately adopted in these measurement steps under specific circumstances. Other measurement conditions such as the concentration of a specific reagent, buffer, etc., temperature, or incubation time can be changed according to factors such as the concentration of the antigen in the sample and the properties of the sample. Those skilled in the art can appropriately select the optimum conditions effective for each measurement and perform the measurement using ordinary experimental methods.

【００２６】固相化するための担体としては、抗原ある
いは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、本
発明ではそれらから適宜選んで用いることができる。担
体としては、抗原抗体反応などに使用されるものが種々
知られており、本発明においても勿論これらの公知のも
のの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるも
のとしては、例えばガラス、例えば活性化ガラス、多孔
質ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナ、
磁化鉄、磁化合金などの無機材料、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、
ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリレート、ポリスチレン、
スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリルアミド、
架橋ポリアクリルアミド、スチレン−メタクリレート共
重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン
−エチレングリコールジメタクリレート共重合体など、
架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、デキストラ
ン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶
セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロース
アセテートなどの天然または変成セルロース、架橋デキ
ストラン、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、
ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質、さらにそれら
を乳化重合して得られたもの、細胞、赤血球などで、必
要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入
してあるものが挙げられる。さらに、ろ紙、ビーズ、試
験容器の内壁、例えば試験管、タイタープレート、タイ
ターウェル、ガラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材
料からなるセル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端
を太くしたりあるいは細くしたりした棒、末端に丸い突
起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状に
した棒などの固体物質（物体）の表面などが挙げられ
る。これら担体へは、抗体を結合させることができ、好
ましくはＭＭＰに対し特異的に結合する各モノクローナ
ル抗体を結合させることができる。担体とこれら抗原抗
体反応に関与するものとの結合は、吸着などの物理的な
手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたも
のなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化
学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出
来る。As carriers for solid-phase immobilization, many carriers capable of immobilizing antigens or antibodies are known, and in the present invention, they can be appropriately selected and used. As the carrier, various carriers used for an antigen-antibody reaction and the like are known, and in the present invention, of course, any of these known carriers can be used. Particularly preferably used are, for example, glass, for example activated glass, porous glass, silica gel, silica-alumina, alumina,
Inorganic materials such as magnetized iron and magnetized alloys, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride,
Polyvinyl acetate, polymethacrylate, polystyrene,
Styrene-butadiene copolymer, polyacrylamide,
Crosslinked polyacrylamide, styrene-methacrylate copolymer, polyglycidyl methacrylate, acrolein-ethylene glycol dimethacrylate copolymer, etc.
Crosslinked albumin, collagen, gelatin, dextran, agarose, crosslinked agarose, cellulose, microcrystalline cellulose, carboxymethylcellulose, natural or denatured cellulose such as cellulose acetate, crosslinked dextran, polyamide such as nylon, polyurethane,
Organic polymer substances such as polyepoxy resins, those obtained by emulsion polymerization thereof, cells, erythrocytes, etc., where necessary, functional groups have been introduced with a silane coupling agent or the like. . Further, filter paper, beads, inner walls of test containers, for example, test tubes, titer plates, titer wells, cells made of synthetic materials such as glass cells, synthetic resin cells, glass rods, rods made of synthetic materials, and thicker ends. Alternatively, the surface of a solid material (object) such as a thinned rod, a rod having a round or flat projection at its end, or a thin plate-shaped rod may be used. An antibody can be bound to these carriers, and preferably, each monoclonal antibody that specifically binds to MMP can be bound. The binding between the carrier and those involved in the antigen-antibody reaction is performed by a physical method such as adsorption, a condensing agent, or a chemical method using an activated material, or a mutual method. It can be performed by a method utilizing a chemical binding reaction or the like.

【００２７】標識としては、酵素、酵素基質、酵素イン
ヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵
素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、
発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コ
ロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵
素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸
化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル
基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転
移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテ
ル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵
素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げるこ
とができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に
利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利
用することもできる。Labels include enzymes, enzyme substrates, enzyme inhibitors, prosthetic molecules, coenzymes, enzyme precursors, apoenzymes, fluorescent substances, dye substances, chemiluminescent compounds,
A luminescent substance, a coloring substance, a magnetic substance, a metal particle such as a gold colloid, and a radioactive substance can be given. Enzymes include dehydrogenases, reductases, oxidoreductases such as oxidases, and transfer enzymes that catalyze transfer of amino groups, carboxyl groups, methyl groups, acyl groups, phosphate groups, and the like, such as ester bonds, Examples include a hydrolase that hydrolyzes a glycosidic bond, an ether bond, a peptide bond, and the like, a lyase, an isomerase, and a ligase. Enzymes can be used for detection by using a plurality of enzymes in combination. For example, enzymatic cycling can be used.

【００２８】代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ
−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラー
ゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリ
ホスファターゼなどのアルカリ・フォスファターゼなど
が挙げられる。アルカリホスファターゼを用いた場合、
４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウン
ベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなど
のリン酸化フェノール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素
的サイクリング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン
誘導体などの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光
などにより測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ
系を利用したりすることもできる。カタラーゼを用いた
場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、その
酸素を電極などで検知することもできる。電極としては
ガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電
極、高分子膜電極などであることもできる。酵素標識
は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトア
ビジン）に置き換えることも可能である。標識は、複数
の異なった種類の標識を使用することもできる。こうし
た場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、
そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすること
もできる。Representative enzyme labels include peroxidase such as horseradish peroxidase and E. coli β-D.
-Galactosidase such as galactosidase; maleate dehydrogenase; glucose-6-phosphate dehydrogenase; glucose oxidase; glucoamylase; acetylcholinesterase; catalase; When using alkaline phosphatase,
Umbelliferone derivatives such as 4-methylumbelliferyl phosphate, phosphorylated phenol derivatives such as nitrophenyl phosphate, enzymatic cycling systems utilizing NADP, luciferin derivatives, and substrates such as dioxetane derivatives are used. It can be measured by fluorescence or luminescence. Luciferin and luciferase systems can also be used. When catalase is used, it reacts with hydrogen peroxide to generate oxygen, and the oxygen can be detected by an electrode or the like. The electrode may be a glass electrode, an ion electrode using a poorly soluble salt film, a liquid film electrode, a polymer film electrode, or the like. The enzyme label can be replaced with a biotin label and an enzyme-labeled avidin (streptavidin). A plurality of different types of labels may be used. In such cases, multiple measurements can be performed continuously or discontinuously,
And it can be possible to do it simultaneously or separately.

【００２９】本発明においては、信号の形成に４−ヒド
ロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テ
トラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダ
ーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニル
ガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の
組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾ
キノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合
物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェ
ノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働き
で形成しうるものが使用できる。In the present invention, 4-hydroxyphenylacetic acid, 1,2-phenylenediamine, tetramethylbenzidine and the like and horseradish peroxidase, umbelliferyl galactoside, nitrophenyl galactoside and the like and β-D-galactosidase are used for signal formation. Combinations of enzyme reagents such as glucose-6-phosphate dehydrogenase can also be used, and quinol compounds such as hydroquinone, hydroxybenzoquinone and hydroxyanthraquinone, thiol compounds such as lipoic acid and glutathione, phenol derivatives, ferrocene derivatives and the like can be used as enzymes. What can be formed by the action of can be used.

【００３０】蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合
物としては、フルオレセインイソチオシアネート、例え
ばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネートなどのローダミン誘導体、ダ
ンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスサミ
ン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフ
ェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノー
ル、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート
化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。標識するに
は、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスル
フィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基
の反応などを利用して行うことができ、公知の方法ある
いは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらには
それらを修飾した方法の中から適宜選択して適用でき
る。例えば、ＮａＩＯ₄ を用いた架橋法（例えば、１−
フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなどでアミノ基を
保護した後、メタＮａＩＯ₄ で酸化し、次に抗体などの
タンパク質を反応させた後ＮａＢＨ₄ により還元する方
法よりなっている）なども挙げられる。また上記免疫原
性複合体作製に使用されることのできる縮合剤、担体と
の結合に使用されることのできる縮合剤などを用いるこ
とができる。Examples of the fluorescent substance or chemiluminescent compound include fluorescein isothiocyanate, for example, rhodamine derivatives such as rhodamine B isothiocyanate and tetramethylrhodamine isothiocyanate, dansyl chloride, dansyl fluoride, fluorescamine, phycobiliprotein, acridinium salt, Luminols such as luminiferin, luciferase and equorin, imidazole, oxalate, rare earth chelate compounds, coumarin derivatives and the like can be mentioned. Labeling can be performed using a reaction between a thiol group and a maleimide group, a reaction between a pyridyl disulfide group and a thiol group, a reaction between an amino group and an aldehyde group, and the like. The method can be applied by appropriately selecting from methods that can be used, and methods modified from those methods. For example, a crosslinking method using NaIO ₄ (for example, 1-
After protecting the amino group with fluoro-2,4-dinitrobenzene or the like, oxidizing with meta-NaIO ₄ , reacting a protein such as an antibody, and then reducing with NaBH ₄ ). . In addition, a condensing agent that can be used for the preparation of the immunogenic complex, a condensing agent that can be used for binding to a carrier, and the like can be used.

【００３１】縮合剤としては、例えばグルタルアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレン
ジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨ
ードアセトアミド、ｐ−ベンゾキノン、Ｎ，Ｎ’−ｏ−
フェニレンジマレイミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレ
イミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシ
ネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシン
イミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート、Ｎ−スクシンイミジル （４−ヨードアセチ
ル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−
（１−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マ
レイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣ
Ｓ）、イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク
酸無水物（ＡＭＳＡ）、メチル−３−（４’−ジチオピ
リジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプ
トブチリルイミデート（ＭＭＢＩ）、メチル−３−メル
カプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−
Ｓ−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。Examples of the condensing agent include glutaraldehyde, hexamethylene diisocyanate, hexamethylene diisothiocyanate, N, N'-polymethylenebisiodoacetamide, p-benzoquinone, N, N'-o-
Phenylenedimaleimide, N, N'-ethylenebismaleimide, ethylene glycol bissuccinimidyl succinate, bisdiazobenzidine, 1-ethyl-3- (3
-Dimethylaminopropyl) carbodiimide, succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), N-sulfosuccinimidyl 4 − (N
-Maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, N-succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate, N-succinimidyl 4-
(1-maleimidophenyl) butyrate, N- (ε-maleimidocaproyloxy) succinimide (EMC
S), iminothiolane, S-acetylmercaptosuccinic anhydride (AMSA), methyl-3- (4'-dithiopyridyl) propionimidate, methyl-4-mercaptobutyrylimidate (MMBI), methyl-3-mercapto Propion imidate, N-succinimidyl-
And S-acetylmercaptoacetate.

【００３２】本発明の測定法によれば、測定すべき物質
を担体に結合されたＴＩＭＰあるいは抗体と、酵素など
で標識した抗体試薬あるいは酵素などで標識したＴＩＭ
Ｐ試薬に順次反応させることができるし、それらを同時
に反応させることもできる。試薬を加える順序は選ばれ
た担体系の型により異なる。感作されたプラスチックな
どのビーズを用いた場合には、該感作されたプラスチッ
クなどのビーズを測定すべき物質を含む検体試料と共に
最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後酵素などで標
識したモノクローナル抗体試薬あるいはＴＩＭＰ試薬を
加えることにより測定を行うことができる。本発明の定
量法においては、免疫学的測定法が用いられるが、その
際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着
するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピ
レン製あるいはポリビニル製のボール、マイクロプレー
ト、スティック、微粒子あるいは試験管などの種々の材
料および形態を任意に選択し、使用することができる。
測定にあたっては至適ｐＨ、例えばｐＨ約４〜９に保つ
ように適当な緩衝液系中で行うことができる。特に適切
な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸
塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリ
エタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩
衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝剤などが挙げら
れる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いること
ができる。抗体抗原反応は約０℃〜６０℃の間の温度で
行うことが好ましい。According to the measurement method of the present invention, a substance to be measured is prepared by binding TIMP or antibody bound to a carrier to an antibody reagent labeled with an enzyme or a TIM labeled with an enzyme.
The reaction can be carried out sequentially with the P reagent, or they can be carried out simultaneously. The order in which the reagents are added depends on the type of carrier system chosen. When sensitized plastic beads or the like are used, the sensitized plastic beads or the like are first put together with an analyte sample containing a substance to be measured in an appropriate test tube, and then labeled with an enzyme or the like. The measurement can be performed by adding the prepared monoclonal antibody reagent or TIMP reagent. In the quantification method of the present invention, an immunological measurement method is used, and in this case, as a solid support, polystyrene, polycarbonate, polypropylene or polyvinyl balls, microplates, which well adsorb proteins such as antibodies, and microplates Various materials and forms such as, a stick, a fine particle or a test tube can be arbitrarily selected and used.
The measurement can be performed in an appropriate buffer system so as to maintain the optimum pH, for example, about pH 4 to 9. Particularly suitable buffers include, for example, acetate buffers, citrate buffers, phosphate buffers, Tris buffers, triethanolamine buffers, borate buffers, glycine buffers, carbonate buffers, Tris-HCl. Buffers and the like can be mentioned. Buffering agents can be used by mixing them at an arbitrary ratio. Preferably, the antibody-antigen reaction is performed at a temperature between about 0 ° C and 60 ° C.

【００３３】酵素などで標識した抗体試薬、酵素などで
標識したＴＩＭＰ試薬、担体に結合せしめられた抗体試
薬及び担体に結合せしめられたＴＩＭＰ試薬、さらには
測定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達
するまで行うことができるが、抗体抗原反応の平衡が達
成されるよりもずっと早い時点で固相と液相とを分離し
て限定されたインキュベーション処理の後に反応を止め
ることができ、液相又は固相のいずれかにおける酵素な
どの標識の存在の程度を測ることができる。測定操作
は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であ
り、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクター
などを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表
示シグナルを検知して測定することもできる。The incubation of an antibody reagent labeled with an enzyme or the like, a TIMP reagent labeled with an enzyme or the like, an antibody reagent bound to a carrier and a TIMP reagent bound to a carrier, and a substance to be measured are equilibrium. The reaction can be stopped after a limited incubation treatment by separating the solid and liquid phases much earlier than the equilibrium of the antibody-antigen reaction is achieved. The extent of the presence of a label, such as an enzyme, in any of the solid phases can be measured. The measurement operation can be performed using an automated measurement device, and a luminescence detector, a photo detector, or the like is used to detect a display signal generated by the conversion of a substrate by the action of an enzyme and to perform measurement. You can also.

【００３４】抗体抗原反応及び活性型ＭＭＰｓとＴＩＭ
Ｐｓとの反応においては、それぞれ用いられる試薬、測
定すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化した
り、抗体抗原反応及び活性型ＭＭＰｓとＴＩＭＰｓとの
反応自体を安定化するように適切な手段を講ずることが
できる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働
く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したり
するため、タンパク質、安定化剤、界面活性化剤、キレ
ート化剤などをインキュベーション溶液中に加えること
もできる。当該分野で普通に採用されていたりあるいは
当業者に知られた非特異的結合反応を防ぐためのブロッ
キング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正
常血清タンパク質、アルブミン、スキムミルク、乳発酵
物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができ
る。非特異的結合反応を防ぐ目的である限り、それらの
方法は特に限定されず用いることが出来る。本発明の測
定方法で測定される試料としては、あらゆる形態の溶液
やコロイド溶液などが使用しうるが、好ましくは生物由
来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、関節液、脳脊
髄液、唾液、羊水、尿、その他の体液、細胞培養液、組
織培養液、組織ホモジュネートなどが挙げられる。特に
好ましくは血漿、血清、関節液、唾液、細胞培養液、組
織培養液、組織ホモジュネートなどが挙げられる。本発
明に従えば、ＭＭＰｓ活性が亢進する病態、例えば関節
症、癌、転移性癌、歯周病などの患者あるいは動物体液
中の遊離の活性型ＭＭＰｓを本発明に係る定量法を用い
て定量することにより、上記疾患群の診断あるいはモニ
ターに応用することができる。Antibody-antigen reaction and activated MMPs and TIM
In the reaction with Ps, an appropriate means is used to stabilize the reagents to be used, the substance to be measured, and the label such as an enzyme, or to stabilize the antibody antigen reaction and the reaction itself between active MMPs and TIMPs. Can be taken. In addition, proteins, stabilizers, surfactants, chelating agents, etc. should be added to the incubation solution to remove non-specific reactions and reduce inhibitory effects, or to activate measurement reactions. Can be added. It may be subjected to a blocking treatment to prevent non-specific binding reactions commonly used in the art or known to those skilled in the art. , Collagen, gelatin and the like. These methods can be used without any particular limitation as long as the purpose is to prevent a non-specific binding reaction. As the sample to be measured by the measurement method of the present invention, any form of solution or colloid solution may be used, but preferably a biological fluid sample, such as blood, plasma, serum, synovial fluid, cerebrospinal fluid, saliva , Amniotic fluid, urine, other body fluids, cell culture solutions, tissue culture solutions, tissue homogenates and the like. Particularly preferred are plasma, serum, synovial fluid, saliva, cell culture, tissue culture, tissue homogenate and the like. According to the present invention, free active MMPs in body fluids of patients or animals such as arthropathy, cancer, metastatic cancer, periodontal disease, etc. are quantified using the quantification method according to the present invention. By doing so, it can be applied to diagnosis or monitoring of the above disease groups.

【００３５】[0035]

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明
するが、本発明は実施例に限定されること無く様々な態
様が含まれることは理解されるべきである。 実施例１ ＴＩＭＰｓの調製 ＴＩＭＰ−１は、ウシ未萌出知歯の根部歯髄を最小必須
Ｅａｇｌｅ培地（日水製薬）中で培養し、ウシ歯髄由来
細胞の培養液からカラムクロマトグラフィーにかけ精製
した。例えばＫｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌａ
ｇｅｎ Ｒｅｌ． Ｒｅｓ．，７，３４１−３５０，１
９８７の方法に従い、各種材料から調製した。またＴＩ
ＭＰ−２はＦｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９
３及び特開平６−３００７５７号公報）の方法に従い、
各種材料から調製した。例えば胎盤を細切後緩衝液中で
撹拌し、得られた上清を抗ＴＩＭＰ−２モノクローナル
抗体（例えば特開平５−２４４９８５号公報に開示のク
ローンＮｏ．６７−４Ｈ１１など）結合セファロース
４Ｂカラムのクロマトグラフィーにかけて処理し、必要
に応じ限外ろ過、ゲルろ過、例えばＵｌｔｒｏｇｅｌ
ＡｃＡ５４（ＬＫＢ）などで処理し、精製ヒトＴＩＭＰ
−２を調製した。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but it should be understood that the present invention is not limited to the examples and includes various embodiments. Example 1 Preparation of TIMPs TIMP-1 was obtained by culturing the root pulp of bovine unerupted teeth in a minimum essential Eagle's medium (Nissui Pharmaceutical) and purifying it by column chromatography from a culture of bovine pulp-derived cells. See, for example, Kodama et al. , Colla
gen Rel. Res. , 7,341-350,1
Prepared from various materials according to the method of 987. Also TI
MP-2 is described in Fujimoto et al. (Cli
n. Chim. Acta, 220, 31-45, 199
3 and JP-A-6-300575).
Prepared from various materials. For example, the placenta is minced and then stirred in a buffer, and the obtained supernatant is mixed with an anti-TIMP-2 monoclonal antibody (for example, clone No. 67-4H11 disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. H5-244985).
The mixture is processed by chromatography on a 4B column, and if necessary, ultrafiltration, gel filtration, for example, Ultragel
Purified human TIMP treated with AcA54 (LKB)
-2 was prepared.

【００３６】リコンビナントＴＩＭＰ−１（ｒＴＩＭＰ
−１）はヒト正常歯肉線維芽細胞（ヒトＧｉｎ−１細
胞）などから得られた全ＲＮＡ画分よりオリゴ（ｄＴ）
−セルロースカラムを用いて、ポリＡ⁺ ｍＲＮＡ画分を
分離し、これを鋳型にしてｃＤＮＡを逆転写酵素を用い
て調製し、Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３１８，６６−６９，１９８５などで知られたＴ
ＩＭＰ−１ｃＤＮＡの配列を参考にＰＣＲプライマーを
作成し、このＰＣＲプライマー（プライマーＴＩＦ１：
５’−ＡＴＧＧＣＣＣＣＣＴＴＴＧＡＧＣＣＣＣＴＧ−
３’及びプライマーＴＩＲ１：５’−ＣＡＧＧＡＴＴＣ
ＡＧＧＣＴＡＴＣＴＧ−３’）を用いてＰＣＲ法により
ＴＩＭＰ遺伝子を増幅し、得られたＤＮＡ断片をプラス
ミドＰＥＸ，ｐＭＥＭｎｅｏなどのベクターに組込み、
大腸菌、ＣＨＯ細胞などで発現させて得ることができ
る。ｒＴＩＭＰ−１は、特開平５−１９９８６８号記載
の方法に従い得られた。調製されたｒＴＩＭＰ−１は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％均一ゲル、還元条件）で約３
０ｋＤａの単一のバンドとして認められ、ウエスタンブ
ロッティング（ペルオキシダーゼ標識マウス抗ＴＩＭＰ
−１モノクローナル抗体で染色）においても約３０ｋＤ
ａの単一のバンドとして認められたものであった。ｒＴ
ＩＭＰ−１のヒト線維芽細胞（ＣＣＤ−４１ＳＫ細胞）
由来ＭＭＰ−１に対する阻害活性は、ＩＣ₅₀が約１×１
０^-9Ｍであった。Recombinant TIMP-1 (rTIMP)
-1) is oligo (dT) from the total RNA fraction obtained from human normal gingival fibroblasts (human Gin-1 cells) and the like.
-Using a cellulose column to separate the poly A ⁺ mRNA fraction, using this as a template to prepare a cDNA using reverse transcriptase, and using Docherty et al. , Natu
re, 318, 66-69, 1985, etc.
A PCR primer was prepared with reference to the sequence of the IMP-1 cDNA, and this PCR primer (primer TIF1:
5'-ATGGCCCCCTTTGAGCCCCTG-
3 'and primer TIR1: 5'-CAGGATTC
AGGCTATCTG-3 ′) to amplify the TIMP gene by the PCR method, and integrate the obtained DNA fragment into a vector such as plasmid PEX or pMEMneo;
It can be obtained by expressing in E. coli, CHO cells and the like. rTIMP-1 was obtained according to the method described in JP-A-5-199868. The prepared rTIMP-1 is
About 3 by SDS-PAGE (12% homogeneous gel, reducing conditions)
0 kDa was observed as a single band, and Western blotting (peroxidase-labeled mouse anti-TIMP)
-1 monoclonal antibody)
a was observed as a single band. rT
IMP-1 human fibroblasts (CCD-41SK cells)
Inhibitory activity against derived MMP-1 is, IC ₅₀ of approximately 1 × 1
It was ^0-9M .

【００３７】またリコンビナントＴＩＭＰ−２（ｒＴＩ
ＭＰ−２）は、ヒトＧｉｎ−１細胞などから得られた全
ＲＮＡ画分よりオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムを用
いてポリＡ^＋ｍＲＮＡ画分を分離し、これを鋳型、オリ
ゴｄＴ（１５〜１８個）をプライマーにしてｃＤＮＡを
逆転写酵素を用いて調製し、Ｂｏｏｎｅ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８７，２８００−２８０４，１９９０などで知られ
たＴＩＭＰ−２ｃＤＮＡの配列を参考に作成したプライ
マーＴ２Ｆ７；ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣ
ＣＧＣＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣＣＴ及びプライマーＴ２Ｒ
５；ＴＴＡＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＧＡＴ
ＣＣＴＣＧＡＴＡＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＧＣを用
いてＰＣＲ法によりＴＩＭＰ−２遺伝子を増幅し、得ら
れたＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＧなどのベクターに組
込み、ＣＨＯ細胞などで発現させて得ることができる。
ｒＴＩＭＰ−２は、Ａｏｋｉら（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ
Ｔｉｓｓｕｅ，２６，２８１−２９０，１９９５）の
方法に従い調製した。抗ＴＩＭＰ−２モノクローナル抗
体結合セファロース ４Ｂカラムのクロマトグラフィー
にかけて処理し、必要に応じ限外ろ過、ゲルろ過などで
処理し、精製ｒＴＩＭＰ−２を調製した。調製されたｒ
ＴＩＭＰ−２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％均一ゲル、
還元条件）で約２４ｋＤａの単一のバンドとして認めら
れ、胎盤から調製された天然型ＴＩＭＰ−２と同じ分子
量の位置に認められた。エピトープの異なる抗ヒトＴＩ
ＭＰ−２モノクローナル抗体（特開平５−２４４９８５
号公報）によるウエスタンブロッティングを行った結
果、約２４ｋＤａの位置に単一のバンドとして認められ
たものであった。ＣＣＤ−４１ＳＫ細胞由来ＭＭＰ−１
に対する阻害活性は、ＩＣ_５０が約１．１×１０^−９Ｍ
であった。またＮ末端及びＣ末端構造解析の結果、得ら
れたｒＴＩＭＰ−２は、天然型ＴＩＭＰ−２と同一の物
質であることが示唆された。ここでは、ＭＭＰｓ活性を
阻害するＴＩＭＰｓであればどのようなＴＩＭＰｓでも
使用できるが、人為的に作成したｒＴＩＭＰｓを使用し
た。Further, the recombinant TIMP-2 (rTI
MP-2) was obtained by separating a poly A ⁺ mRNA fraction from the total RNA fraction obtained from human Gin-1 cells or the like using an oligo (dT) -cellulose column, using this as a template, oligo dT (15 to 18) as primers and cDNA was prepared using reverse transcriptase, and Boone et a
l. , Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 87, 2800-2804, 1990, etc. Primer T2F7 prepared with reference to the sequence of TIMP-2 cDNA; AAAGTCGACCATGGGCGC
CGCGGCCCGCACCCT and primer T2R
5; TTAAGATCTGTCGACTTAAGGAT
The TIMP-2 gene can be amplified by PCR using CCTCGATATCGAGGAATTCTTGC, and the obtained DNA fragment can be inserted into a vector such as plasmid pKG and expressed in CHO cells or the like.
rTIMP-2 is available from Aoki et al. (Connective).
Tissue, 26 , 281-290 , 1995 ). The resulting product was subjected to chromatography on a Sepharose 4B column bound to an anti-TIMP-2 monoclonal antibody, followed by ultrafiltration, gel filtration, and the like, as necessary, to prepare purified rTIMP-2. Prepared r
TIMP-2 was obtained by SDS-PAGE (12% homogeneous gel,
(Reducing conditions), a single band of about 24 kDa was observed at the same molecular weight position as native TIMP-2 prepared from placenta. Anti-human TI with different epitopes
MP-2 monoclonal antibody (Japanese Unexamined Patent Publication No.
As a result of performing Western blotting according to the publication, a single band was recognized at a position of about 24 kDa. MMP-1 derived from CCD-41SK cells
Inhibitory activity, _{IC 50} of about 1.1 × ^{10 -9} M for
Met. In addition, as a result of N-terminal and C-terminal structural analysis, it was suggested that the obtained rTIMP-2 was the same substance as natural TIMP-2. Here, any TIMPs that inhibit MMPs activity can be used, but artificially created rTIMPs were used.

【００３８】実施例２ 標識ＴＩＭＰｓの調製 通常、タンパク質の標識物として低分子の放射性同位元
素、化学物質あるいは蛍光物質がタンパク質自身が持っ
ている活性を損なうことを避けるために用いられるが、
ここでは一般的には、ＴＩＭＰに対してはそのタンパク
質自身の活性を損なう恐れが高い高分子の酵素で標識す
る方法を示す。 （ａ）ｒＴＩＭＰｓ−あるいはＩｇＧ−ペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）複合体の調製 １）ＳＨ基標識ｒＴＩＭＰあるいはＳＨ基標識ＩｇＧの
調製 ｒＴＩＭＰ−１、ｒＴＩＭＰ−２あるいはＩｇＧを０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し透析し、その溶
液１ｍｌに含有されている各々のｒＴＩＭＰに対して１
００倍モルのＡＭＳＡをジメチルホルムアミド溶液とし
て加え、３０℃、３０分間インキュベーションした。次
に０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μ
ｌ、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ，ｐ
Ｈ６．０）１０μｌ、１Ｍヒドロキシルアミン溶液（ｐ
Ｈ７．０）１００μｌを加え、３０℃、５分間静置後、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−２５でゲルろ過し、ＳＨ基標識ｒＴＩＭ
Ｐ−１、ＳＨ標識ｒＴＩＭＰ−２あるいはＳＨ基標識Ｉ
ｇＧをそれぞれ得た。Example 2 Preparation of Labeled TIMPs Usually, a low-molecular radioisotope, a chemical substance or a fluorescent substance is used as a protein label in order to avoid impairing the activity of the protein itself.
Here, a method of labeling TIMP with a high molecular enzyme which is likely to impair the activity of the protein itself is shown. (A) Preparation of rTIMPs- or IgG-peroxidase (HRP) complex 1) Preparation of SH group-labeled rTIMP or SH group-labeled IgG
Dialyze against 1M phosphate buffer (pH 6.5) and add 1 ml for each rTIMP contained in 1 ml of the solution.
A 00-fold molar amount of AMSA was added as a dimethylformamide solution, and the mixture was incubated at 30 ° C. for 30 minutes. Next, 100 μM of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0)
l, 0.1 M ethylenediaminetetraacetate (EDTA, p
H6.0) 10 μl, 1 M hydroxylamine solution (p
H7.0) 100 μl was added and left at 30 ° C. for 5 minutes.
The mixture was subjected to gel filtration with Sephadex G-25 equilibrated with a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0), and SH-labeled rTIM was used.
P-1, SH-labeled rTIMP-2 or SH-labeled I
gG was obtained.

【００３９】２）マレイミド標識ＨＲＰの調製 ＨＲＰを１２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、そのＨＲＰ量に対
して２５倍量のＥＭＣＳをジメチルホルムアミド溶液と
して加え、３０℃、３０分間反応させた。この反応液を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−２５でゲルろ過し、マレイミド標識ＨＲ
Ｐ画分を分取した。2) Preparation of Maleimide-Labeled HRP HRP was dissolved in a 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) so as to have a concentration of 12 mg / ml, and 25 times the amount of EMCS in the HRP was dissolved in dimethyl. It was added as a formamide solution and reacted at 30 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was subjected to gel filtration with Sephadex G-25 equilibrated with a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0), and the maleimide-labeled HR was used.
The P fraction was collected.

【００４０】３）ｒＴＩＭＰ−ＨＲＰあるいはＩｇＧ−
ＨＲＰ複合体の調製 上記１）で調製したＳＨ基標識ｒＴＩＭＰ−１、ＳＨ基
標識ｒＴＩＭＰ−２あるいはＳＨ基標識ＩｇＧ １モル
に上記２）で得られたマレイミド標識ＨＲＰを各々３モ
ル、３モルあるいは５モル加え、４℃、２４時間静置し
た。これらの混合液を０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）もしくは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４カラ
ムでゲルろ過し、ｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ、ｒＴＩＭＰ
−２−ＨＲＰあるいはＩｇＧ−ＨＲＰ複合体画分をそれ
ぞれ分取した。得られた標識ｒＴＩＭＰ−１及び標識ｒ
ＴＩＭＰ−２についてＨＲＰの標識の程度をＨＲＰ活性
を指標に比色法で調べた。反応させる上記２）で得られ
たマレイミド標識ＨＲＰの量を増加させることにより、
結合ＨＲＰの量は増加することが確かめられたが、ｒＴ
ＩＭＰ−１あるいはｒＴＩＭＰ−２ １モル当りＨＲＰ
が各々１．８あるいは１．６結合したものが、以下の測
定に用いる試薬としてより好ましいと判断した。3) rTIMP-HRP or IgG-
Preparation of HRP complex The SH-labeled rTIMP-1, SH-labeled rTIMP-2 or SH-labeled IgG prepared in 1) above was mixed with 3 moles, 3 moles or 3 moles of maleimide-labeled HRP obtained in 2) above, respectively. 5 mol was added and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours. These mixtures were mixed with a 0.1 M Tris-HCl buffer (p
H7.0) or 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0).
Gel filtration was performed on an Ultrogel AcA 44 column equilibrated in 0), and rTIMP-1-HRP, rTIMP
-2-HRP or IgG-HRP complex fractions were respectively collected. Obtained labeled rTIMP-1 and labeled r
The degree of HRP labeling of TIMP-2 was examined by colorimetry using HRP activity as an index. By increasing the amount of maleimide-labeled HRP obtained in the above 2) to react,
Although the amount of bound HRP was found to increase, rT
HRP per mole of IMP-1 or rTIMP-2
Were determined to be more preferable as reagents used in the following measurements, respectively.

【００４１】（ｂ）ｒＴＩＭＰ−ＩｇＧ−ＨＲＰの調製 ｒＴＩＭＰをＨＲＰで標識する際、ｒＴＩＭＰに特異的
に結合する物質を介してｒＴＩＭＰを間接的にＨＲＰで
標識することができる。ｒＴＩＭＰに特異的に結合する
物質としては、ここではＴＩＭＰに特異的に結合するモ
ノクローナル抗体を使用した。ヒトＴＩＭＰ−２ポリペ
プチドあるいは天然型ＴＩＭＰ−２を免疫原として調製
されたモノクローナル抗体を使用できる。Ｂｏｏｎｅ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８７，２８００−２８０４，１９９０に記
載のｃＤＮＡから予測されるアミノ酸配列から三種のポ
リペプチド、例えばＰ−１；ＤＳＧＮＤＩＹＧＮＰＩＫ
ＲＩＱＣ、Ｐ−２；ＤＴＬＳＴＴＱＫＫＳＬＮＨＲＹＱ
ＱＣ及びＰ−３；ＹＲＧＡＡＰＰＫＱＥＦＬＤＩＥＤＣ
を合成し、これらを免疫原としてマウスを免疫し、免疫
マウスからの脾細胞を用い細胞融合法で作成されたハイ
ブリドーマクローンから得られるモノクローナル抗体を
用い、マレイミド標識ＨＲＰを反応させて抗ＴＩＭＰ−
２モノクローナル抗体−ＨＲＰを得ることができる。こ
うした抗体としては潜在型ＭＭＰ−２がＴＩＭＰ−２に
結合することを阻害することのできる抗体が好ましく使
用される。ＴＩＭＰ−２のカルボキシル末端領域を認識
する抗体が使用できる。(B) Preparation of rTIMP-IgG-HRP When rTIMP is labeled with HRP, rTIMP can be indirectly labeled with HRP via a substance that specifically binds to rTIMP. As the substance that specifically binds to rTIMP, a monoclonal antibody that specifically binds to TIMP was used here. Monoclonal antibodies prepared using human TIMP-2 polypeptide or natural TIMP-2 as an immunogen can be used. Boone
et al. Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 87, 2800-2804, 1990. Three polypeptides, for example, P-1;
RIQC, P-2; DTLSTTQKKSLNHRYQ
QC and P-3; YRGAAPPKQEFLDIEDC
And immunizing a mouse using these as an immunogen. Using a monoclonal antibody obtained from a hybridoma clone prepared by a cell fusion method using spleen cells from the immunized mouse, reacting maleimide-labeled HRP with anti-TIMP-
2 monoclonal antibody-HRP can be obtained. As such an antibody, an antibody capable of inhibiting latent MMP-2 from binding to TIMP-2 is preferably used. Antibodies that recognize the carboxyl-terminal region of TIMP-2 can be used.

【００４２】こうしてＴＩＭＰ−２のカルボキシル末端
領域のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を特開
平５−２４４９８５号の記載に従い調製し、得られた抗
体のうち、特異性が高く且つ親和性の強いマウス抗ＴＩ
ＭＰ−２ ＩｇＧ（クローン６７−４Ｈ１１、微工研受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６９０）を選択し、それを用
い前記（ａ）項記載にしたがってＨＲＰを標識した。こ
のＩｇＧ−ＨＲＰ（１００μｇ）溶液にｒＴＩＭＰ−２
２０μｇを加え、１０℃、３時間静置反応させた。こ
の混合液にさらに最終濃度４％となるようにホルムアル
デヒドを加え（固定反応）、室温で２時間反応させた。
使用した抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧ（クローン６７−４Ｈ
１１）はＴＩＭＰ−２のカルボキシル末端領域を認識す
る抗体で、潜在型ＭＭＰ−２によりＴＩＭＰ−２−抗Ｔ
ＩＭＰ−２ ＩｇＧの結合が解離されることがわかって
いる（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２０，３１−４５，１９９
３）。Thus, a monoclonal antibody against the polypeptide in the carboxyl terminal region of TIMP-2 was prepared according to the description in Japanese Patent Application Laid-Open No. H5-244985.
MP-2 IgG (clone 67-4H11, accession number of FERM P-12690) was selected, and HRP was labeled using the same as described in the above (a). RTIMP-2 was added to this IgG-HRP (100 μg) solution.
20 μg was added, and the reaction was allowed to stand at 10 ° C. for 3 hours. Formaldehyde was further added to this mixture to a final concentration of 4% (fixation reaction), and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours.
The anti-TIMP-2 IgG used (clone 67-4H
11) an antibody that recognizes the carboxyl terminal region of the TIMP-2, TIMP-2- Anti-T by latent MMP-2
It has been found that the binding of IMP-2 IgG is dissociated (N. Fujimoto et al., Cli).
n. Chim. Acta, 220, 31-45, 199
3).

【００４３】上記固定反応は、形成された免疫複合体
（ｒＴＩＭＰ−２−ＩｇＧ−ＨＲＰ）が潜在型ＭＭＰ−
２により解離しないようにするためで、室温、０．５〜
６時間反応を行った結果、反応２時間が最良の条件であ
った。固定反応後、セファデックスＧ−２５でホルムア
ルデヒドを除いた。この複合体は、潜在型ＭＭＰ−２に
より解離せず、ｒＴＩＭＰ−２とＩｇＧが固定されてい
ることを確認した。このことより調製したｒＴＩＭＰ−
２−ＩｇＧ−ＨＲＰはそのｒＴＩＭＰ−２の潜在型ＭＭ
Ｐ−２への結合領域が抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧでブロッ
クされたため、潜在型ＭＭＰ−２と反応しないことが示
された。すなわち上記ｒＴＩＭＰ−２−ＩｇＧ−ＨＲＰ
はすべての活性型ＭＭＰｓと反応し、さらに潜在型ＭＭ
Ｐ−２と活性型ＭＭＰ−２の分別を可能にした。ｒＴＩ
ＭＰ−２をｒＴＩＭＰ−１に代え、上記と同様の方法で
ｒＴＩＭＰ−１−ＩｇＧ−ＨＲＰも調製できた。抗ヒト
ＴＩＭＰ−１モノクローナル抗体は、実施例１のように
して得られた精製ＴＩＭＰ−１を免疫原としてマウスを
免疫し、免疫マウスからの脾細胞を用い細胞融合法で作
成されるハイブリドーマクローンから得られる。Ｋｏｄ
ａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｌ．
Ｒｅｓ．，７，３４１−３５０，１９８７記載のマウス
抗ＴＩＭＰ−１ ＩｇＧから選んで使用される。The above-mentioned fixation reaction was carried out in such a manner that the formed immune complex (rTIMP-2-IgG-HRP) was converted to latent MMP-
2 to prevent dissociation, at room temperature, 0.5 to
After performing the reaction for 6 hours, the best conditions were 2 hours for the reaction. After the fixing reaction, formaldehyde was removed with Sephadex G-25. This complex was not dissociated by latent MMP-2, confirming that rTIMP-2 and IgG were fixed. The rTIMP-
2-IgG-HRP is a latent MM of rTIMP-2.
Since the binding region to P-2 was blocked with anti-TIMP-2 IgG, it was shown not to react with latent MMP-2. That is, the above rTIMP-2-IgG-HRP
Reacts with all active MMPs,
It was possible to separate P-2 from active MMP-2. rTI
RTIMP-1-IgG-HRP was also prepared in the same manner as described above, except that MP-2 was replaced with rTIMP-1. The anti-human TIMP-1 monoclonal antibody was obtained by immunizing a mouse with the purified TIMP-1 obtained as described in Example 1 as an immunogen, and using a spleen cell from the immunized mouse by a cell fusion method using a hybridoma clone. can get. Kod
ama et al. , Collagen Rel.
Res. , 7, 341-350, 1987.

【００４４】実施例３ モノクローナル抗体の選択 抗ヒトＭＭＰ−１モノクローナル抗体は、ヒトプロＭＭ
Ｐ−１を免疫原としてマウスを免疫し、免疫マウスから
の脾細胞を用い細胞融合法で作成されるハイブリドーマ
クローンから得られる。精製ヒトプロＭＭＰ−１は、ヒ
ト正常皮膚線維芽細胞ＣＣＤ−４１ＳＫ（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ． ＣＲＬ１５０５）を１０％ＦＣＳ含有最小必須Ｅ
ａｇｌｅ培地中で培養し、必要に応じインターロイキン
１αで細胞刺激して得られた細胞培養上清から、限外ろ
過（東洋濾紙ＵＰ−７６）による濃縮、ヘパリンセファ
ロース ＣＬ−６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、セファクリル−Ｓ−２０
０（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）、グリーンＡ アクチゲル−ＡＬＤカラム（Ｓｔｅ
ｒｏｇｅｎｅ）などによりクロマトグラフィーにかけ精
製した。得られた抗ヒトＭＭＰ−１モノクローナル抗体
のうち、少なくとも活性型ＭＭＰ−１を認識する抗体を
使用することができる。抗ヒトＭＭＰ−１モノクローナ
ル抗体は、特開平６−３００７５７号及びＣｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１９，１−１４，１９９３記載の
モノクローナル抗体のうち、クローン７８−１２Ｇ８
（微工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３１１５）からの抗
体を選んだ。この抗体は潜在型及び活性型ＭＭＰ−１を
認識し、ＥＤＴＡなどのキレート剤によってはその免疫
反応性の変化が認められないという性質をもっている。Example 3 Selection of Monoclonal Antibody The anti-human MMP-1 monoclonal antibody was prepared using human proMM
A mouse is immunized with P-1 as an immunogen, and is obtained from a hybridoma clone created by a cell fusion method using splenocytes from the immunized mouse. Purified human pro-MMP-1 was obtained from human normal dermal fibroblast CCD-41SK (ATCC N
o. CRL1505) containing 10% FCS minimum essential E
The cell culture supernatant obtained by culturing the cells in an agle medium and, if necessary, stimulating the cells with interleukin 1α, was concentrated by ultrafiltration (TOYO filter paper UP-76), and heparin Sepharose CL-6B column (Pharmacia Fi).
ne Chemicals), Sephacryl-S-20
0 (Pharmacia Fine Chemical)
s), Green A Actigel-ALD column (Steel
and purified by chromatography. Among the obtained anti-human MMP-1 monoclonal antibodies, an antibody that recognizes at least active MMP-1 can be used. An anti-human MMP-1 monoclonal antibody is disclosed in JP-A-6-300575 and Clin. C
him. Among the monoclonal antibodies described in Acta, 219, 1-14, 1993, clone 78-12G8
The antibody from (Microtechnical accession number FERM P-13115) was selected. This antibody recognizes latent and active MMP-1, and has the property that no change in its immunoreactivity is recognized by a chelating agent such as EDTA.

【００４５】抗ヒトＭＭＰ−２モノクローナル抗体は、
ＣＣＤ−４１ＳＫ細胞をヒトプロＭＭＰ−１の場合と同
様にして処理し、得られた細胞培養上清からゼラチンア
ガロース、抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧ結合セファロース、
抗フィブロネクチンＩｇＧ結合セファロースなどにより
クロマトグラフィーにかけ精製されるヒトプロＭＭＰ−
２を免疫原としてマウスを免疫し、免疫マウスからの脾
細胞を用い細胞融合法で作成されるハイブリドーマクロ
ーンから得られる。得られた抗ヒトＭＭＰ−２モノクロ
ーナル抗体のうち、少なくとも活性型ＭＭＰ−２を認識
する抗体を使用することができる。抗ヒトＭＭＰ−２モ
ノクローナル抗体は、特開平６−２１３８８８号及びＦ
ｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．
Ａｃｔａ，２２１，９１−１０３，１９９３に記載のモ
ノクローナル抗体のうち、親和性の強いクローン７５−
７Ｆ７（微工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３５）か
らの抗体を使用した。この抗体は、ＭＭＰ−２のカルボ
キシル末端領域を認識し、潜在型及び活性型ＭＭＰ−２
を認識する抗体である。The anti-human MMP-2 monoclonal antibody is
CCD-41SK cells were treated in the same manner as in the case of human pro-MMP-1, and from the resulting cell culture supernatant, gelatin agarose, anti-TIMP-2 IgG-bound Sepharose,
Human pro-MMP- purified by chromatography using anti-fibronectin IgG-bound Sepharose or the like
A mouse is immunized with 2 as an immunogen, and is obtained from a hybridoma clone created by a cell fusion method using spleen cells from the immunized mouse. Among the obtained anti-human MMP-2 monoclonal antibodies, an antibody that recognizes at least active MMP-2 can be used. The anti-human MMP-2 monoclonal antibody is disclosed in JP-A-6-213888 and F
ujimoto et al. , Clin. Chim.
Acta, 221, 91-103, 1993, clone 75- having high affinity.
An antibody from 7F7 (Microfabrication Accession No. FERM P-13335) was used. This antibody recognizes the carboxyl-terminal region of MMP-2 and has latent and active forms of MMP-2.
Is an antibody that recognizes

【００４６】抗ヒトＭＭＰ−７モノクローナル抗体は、
ヒト直腸癌細胞由来ＣａＲ−１細胞の培養液から、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１４２４５−１４２５
５，１９８６及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，
２１７１２−２１７１９，１９９２に記載のＯｋａｄａ
ｅｔ ａｌ．の方法に従い精製したヒトＭＭＰ−７
を、さらにＤＥＡＥ−セルロースカラム、Ｇｒｅｅｎ
Ａ Ｄｙｅｍａｔｒｉｘｇｅｌ（Ａｍｉｃｏｎ製）カラ
ム、亜鉛キレートセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
製）カラム、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＩＢＦ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｃｓ製）カラムなどで処理し、得られたヒ
トプロＭＭＰ−７を抗原として用いてＢＡＬＢ／ｃ雌マ
ウスを免疫し、こうして免疫されたマウスから採取した
脾臓細胞を８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ２
（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）と細胞融合させ、ハイブリド
ーマを選択し、クローニングして得られる。抗ヒトＭＭ
Ｐ−７モノクローナル抗体のうち、クローン１２５−２
０Ｈ１１（生工研受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４７３
５）は、活性型ＭＭＰ−７を認識する抗体である。The anti-human MMP-7 monoclonal antibody is
From the culture of human rectal cancer cell-derived CaR-1 cells,
Biol. Chem. , 261, 14245-1425
5, 1986 and J.M. Biol. Chem. , 267,
Okada described in 21712-21719, 1992
et al. Human MMP-7 purified according to the method of
And a DEAE-cellulose column, Green
A Dymatrix gel (Amicon) column, zinc chelate Sepharose (Pharmacia)
) Column, Ultrogel AcA44 (IBF Bio)
and BALB / c female mice were immunized using the obtained human pro-MMP-7 as an antigen.
(SP2 / 0-Ag14), hybridomas are selected and cloned. Anti-human MM
Among the P-7 monoclonal antibodies, clone 125-2
0H11 (Seikaken Laboratories accession number FERM P-1473
5) is an antibody that recognizes active MMP-7.

【００４７】抗ヒトＭＭＰ−９モノクローナル抗体は、
ヒト線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０細胞）を培養し、必
要に応じｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ
−αで細胞剌激して得られた細胞培養上清から、限外ろ
過、ゼラチンアガロースカラム、抗ＴＩＭＰ−１モノク
ローナル抗体結合セファロース４Ｂ、抗フィブロネクチ
ン抗体結合セファロース４Ｂなどによりクロマトグラフ
ィーにかけ精製して得られたヒトプロＭＭＰ−９を免疫
原としてマウスを免疫し、免疫マウスからの脾細胞を用
い細胞融合法で作成されるハイブリドーマクローンから
得られる。得られた抗ヒトＭＭＰ−９モノクローナル抗
体のうち、少なくとも活性型ＭＭＰ−９を認識する抗体
を使用することができる。抗ヒトＭＭＰ−９モノクロー
ナル抗体は、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２３１，７９−８８，１９９
４に記載のモノクローナル抗体のうち、親和性の強いク
ローン７３−１８Ｂ３（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１３６９５）からの抗体を用いることにした。この抗体
は、ＭＭＰ−９の中央領域を認識し、潜在型及び活性型
ＭＭＰ−９を認識する抗体である。同様にしてＭＭＰ−
３、−８、−１０、−１１、−１２及び−１３並びにＭ
Ｔ−ＭＭＰに対するそれぞれのモノクローナル抗体を調
製し、適切なクローンを選択して使用できる。The anti-human MMP-9 monoclonal antibody is
Human fibrosarcoma cells (HT-1080 cells) are cultured, and if necessary, tumor necrosis factor
A cell culture supernatant obtained by stimulating cells with -α is purified by ultrafiltration, chromatography on a gelatin agarose column, Sepharose 4B conjugated with anti-TIMP-1 monoclonal antibody, Sepharose 4B conjugated with anti-fibronectin antibody, etc. Mice are immunized using the obtained human pro-MMP-9 as an immunogen, and obtained from a hybridoma clone prepared by a cell fusion method using splenocytes from the immunized mice. Among the obtained anti-human MMP-9 monoclonal antibodies, an antibody that recognizes at least active MMP-9 can be used. Anti-human MMP-9 monoclonal antibodies are described in Fujimoto et al. , Cli
n. Chim. Acta, 231, 79-88, 199
Among the monoclonal antibody according to 4, strong clone 73-18B3 (raw Engineering Research accession number of affinity FERM P-
13695). This antibody recognizes the central region of MMP-9 and recognizes latent and active MMP-9. MMP-
3, -8, -10, -11, -12 and -13 and M
Each monoclonal antibody against T-MMP can be prepared and an appropriate clone selected and used.

【００４８】実施例４ 活性型ＭＭＰｓの調製 活性型ＭＭＰ−１は、ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＣＤ−４
１ＳＫ）培養上清より精製した潜在型ＭＭＰ−１を０．
１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム含有５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（緩衝液Ａ）に
溶解し、終濃度が１ｍＭになるようにアミノフェニルマ
ーキュリックアセテート（ＡＰＭＡ）を加え、３７℃、
２時間インキュベーションした（Ｊ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１９，１
−１４，１９９３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ゲ
ル、２−メルカプトエタノール存在下）によりヒト潜在
型ＭＭＰ−１は完全に活性型ＭＭＰ−１へ活性化された
ことを確認した。Example 4 Preparation of Active MMPs Active MMP-1 was prepared from human dermal fibroblast (CCD-4).
1SK) Latent MMP-1 purified from the culture supernatant was added to 0.
1M sodium chloride, 10mM calcium chloride containing 50
mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) (buffer A), aminophenyl mercuric acetate (APMA) was added to a final concentration of 1 mM,
Incubation for 2 hours (J. Zhang et.
al. , Clin. Chim. Acta, 219, 1
-14, 1993). It was confirmed by SDS-PAGE (12.5% gel, in the presence of 2-mercaptoethanol) that human latent MMP-1 was completely activated to active MMP-1.

【００４９】活性型ＭＭＰ−２は、ＣＣＤ−４１ＳＫ培
養上清から精製した潜在型ＭＭＰ−２を上記緩衝液Ａに
溶解し、１ｍＭ ＡＰＭＡで３７℃、３０分間インキュ
ベーションすることにより得た（Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２
１，９１−１０３，１９９３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上潜
在型ＭＭＰ−２が活性型ＭＭＰ−２に活性化されたこと
を確認した。活性型ＭＭＰ−７は、実施例３に記載のヒ
トプロＭＭＰ−７の調製の際、亜鉛キレートセファロー
ス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）カラムでの処理において１
ｍＭＣａＣｌ₂ ，０．０５％ Ｂｒｉｊ３５，０．０２
％ ＮａＮ₃ 含有２５ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．５）に溶解したＮａＣｌの濃度勾配により溶
出すると、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有同緩衝液で溶出さ
れ得られた。Active MMP-2 was obtained by dissolving latent MMP-2 purified from the culture supernatant of CCD-41SK in the above buffer A and incubating with 1 mM APMA at 37 ° C. for 30 minutes (N.M. Fujimoto
et al. , Clin. Chim. Acta, 22
1, 91-103, 1993). It was confirmed on SDS-PAGE that latent MMP-2 was activated by activated MMP-2. Activated MMP-7 was treated with a zinc chelate Sepharose (Pharmacia) column during the preparation of human pro-MMP-7 described in Example 3.
mM CaCl ₂ , 0.05% Brij 35, 0.02
When eluted with a concentration gradient of NaCl dissolved in a 25 mM sodium cacodylate buffer (pH 6.5) containing 25% NaN ₃ , elution was obtained with the same buffer containing 0.15 M NaCl.

【００５０】活性型ＭＭＰ−９は、ヒト線維肉腫細胞Ｈ
Ｔ１０８０培養上清から精製した潜在型ＭＭＰ−９を緩
衝液Ａに溶解し、１ｍＭ ＡＰＭＡで３７℃、２４時間
インキュベーションすることにより得た（Ｙ．Ｏｋａｄ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
７，２１７１２−２１７１９，１９９３）。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上潜在型ＭＭＰ−９が活性型ＭＭＰ−９に活性化
されたことを確認した。ＭＭＰ−３（Ｙ．Ｏｋａｄａ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５４，７３１
−７４１，１９８８）、ＭＭＰ−８（Ｖ．Ｋｎａｕｐｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−
Ｓｅｙｌｅｒ．，３７１，２９５−３０４，１９９
０）、ＭＭＰ−１０（Ａ．Ｊ．Ｐａｒｋ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１５８４−
１５９０，１９９１）、ＭＭＰ−１１ （Ｄ．Ｐｅｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２
５８４９−２５８５５，１９９４）、ＭＭＰ−１２
（Ｓ．Ｄ．Ｓｈａｐ１ｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２３８２４−２３８２９，１
９９３）、ＭＭＰ−１３（Ｊ．Ｍ．Ｐ．Ｆｒｅｉｊｅ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１
６７６６−１６７７３，１９９４）、ＭＴ−ＭＭＰ（特
願平６−３３１３０５号）についても各活性型ＭＭＰを
調製して、同様にして使用できる。Activated MMP-9 was obtained from human fibrosarcoma cells H
Latent MMP-9 purified from T1080 culture supernatant was dissolved in buffer A and incubated with 1 mM APMA at 37 ° C for 24 hours (Y. Okad).
a et al. , J. et al. Biol. Chem. , 26
7, 21712-21719, 1993). SDS-P
It was confirmed that latent MMP-9 was activated to active MMP-9 on AGE. MMP-3 (Y. Okada)
et al. , Biochem. J. , 254,731
−741, 1988), MMP-8 (V. Knappe)
r et al. , Biol. Chem. Hoppe-
Seeyler. , 371, 295-304, 199
0), MMP-10 (AJ Park et a)
l. , J. et al. Biol. Chem. , 266, 1584-
1590, 1991), MMP-11 (D. Pei)
et al. , J. et al. Biol. Chem. , 269,2
5849-25855, 1994), MMP-12
(SD Shapro et al., J. Bio.
l. Chem. , 268, 23824-23829, 1
993), MMP-13 (JMP Freige)
et al. , J. et al. Biol. Chem. , 269,1
6766-16773, 1994) and MT-MMP (Japanese Patent Application No. 6-331305) can be prepared in the same manner by preparing each active MMP.

【００５１】実施例５ 活性型ＭＭＰｓの定量法 （ａ）モノクローナル抗体結合担体の調製法 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ４，２０９−３２７，１
９８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．の方法
に従って、マウス抗ヒトＭＭＰｓ ＩｇＧ（クローンＮ
ｏ．７８−１２Ｇ８、７５−７Ｆ７あるいは７３−１８
Ｂ３）を各々０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶
解し、１００μｇ／ｍｌの濃度に調製した。そのモノク
ローナル抗体溶液を９６穴マイクロプレートにウエル当
り１００μｌずつ加え、４℃、２４時間静置した。次に
モノクローナル抗体溶液を除去し、各々０．１Ｍ塩化ナ
トリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２
回洗浄後、１％ ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１
０ｍＭ塩化カルシウム含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．４、緩衝液Ｂ）に浸漬し、４℃で保存した。Example 5 Method for Quantifying Active MMPs (a) Preparation of Monoclonal Antibody-Binding Carrier Immunoassay 4,209-327,1
No. 983, Ishikawa et al. Mouse anti-human MMPs IgG (clone N
o. 78-12G8, 75-7F7 or 73-18
B3) were each dissolved in a 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5) to prepare a concentration of 100 μg / ml. The monoclonal antibody solution was added to a 96-well microplate at 100 μl per well, and left at 4 ° C. for 24 hours. Next, the monoclonal antibody solution was removed, and 2 mM each with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 M sodium chloride.
After washing twice, 1% BSA, 0.1 M sodium chloride, 1
It was immersed in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4, buffer B) containing 0 mM calcium chloride and stored at 4 ° C.

【００５２】（ｂ）活性型ＭＭＰｓの定量法 ＭＭＰｓのうちＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９を除くすべて
のＭＭＰｓはその潜在型がＴＩＭＰｓと結合せず、遊離
の活性型のみがＴＩＭＰｓと結合するという共通の性質
を有するためそれらはすべて同一原理で定量される。従
って実施例として活性型ＭＭＰ−１の定量法を代表例と
して記載した。また、ＭＭＰ−２あるいはＭＭＰ−９に
ついては潜在型でも各々ＴＩＭＰ−２あるいはＴＩＭＰ
−１が結合するため、その潜在型との分別を行うために
標識物を直接付与したＴＩＭＰ−１あるいは標識物を間
接的に付与したＴＩＭＰ−２を使用した定量法を記載し
た。(B) Quantitative method of active MMPs: Among the MMPs, all MMPs except MMP-2 and MMP-9 have a common property that their latent forms do not bind to TIMPs and only free active forms bind to TIMPs. , They are all quantified on the same principle. Therefore, a method for quantifying active MMP-1 was described as a representative example in the Examples. Regarding MMP-2 or MMP-9, TIMP-2 or TIMP,
Since -1 binds, a quantification method using TIMP-1 to which a label is directly added or TIMP-2 to which a label is indirectly added for discrimination from its latent form is described.

【００５３】１）活性型ＭＭＰ−１の定量法 実施例４に記載した活性型ＭＭＰ−１を標準とし、既知
濃度の活性型ＭＭＰ−１あるいは遊離の活性型ＭＭＰ−
１を含む検体を９６穴ビニルプレート（Ｆａｌｃｏｎ
製）に各々２０μｌ加えた。次に実施例２（ａ）項で調
製したｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ複合体を５μｇ／ｍｌと
なるように緩衝液Ｂで希釈し、あるいは実施例２（ｂ）
項で調製したｒＴＩＭＰ−２−抗ＴＩＭＰ−２ ＩｇＧ
−ＨＲＰ複合体を１８μｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ｂ
で希釈し、上記ビニルプレートに各々１００μｌずつ加
え混合した。この混合液を前記（ａ）項で調製した抗Ｍ
ＭＰ−１抗体（クローンＮｏ．７８−１２Ｇ８）結合プ
レートに１００μｌ加え、室温で２時間反応させ、生理
食塩液で３回洗浄した。次に０．０２％過酸化水素含有
０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．９）に溶解
した２ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミンをウエル当
り１００μｌ加え、室温で２０分間反応後、２Ｎ硫酸１
００μｌを添加し、反応を停止させた。この反応混合液
の４９２ｎｍにおける吸光度（Ａ₄₉₂ ）をマイクロプレ
ートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東ソー）を用いて測定
し、検量線を作成した（図１）。ｒＴＩＭＰ−１−ＨＲ
Ｐ複合体を用いた定量系の感度は、標準０ｎｇ／ｍｌ値
＋２Ｓ．Ｄ．から５ｎｇ／ｍｌ（８４ｐｇ／アッセイ）
で、活性型ＭＭＰ−１標準液２０〜６４０ｎｇ／ｍｌ
（０．３３〜１０．７ｎｇ／アッセイ）の範囲で直線性
が認められた。ｒＴＩＭＰ−２−ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体
を用いた定量法の感度は、１．３ｎｇ／ｍｌ（２２ｐｇ
／アッセイ）で、活性型ＭＭＰ−１標準液４〜３３０ｎ
ｇ／ｍｌ（６７〜５５００ｐｇ／アッセイ）の範囲で直
線性が認められた。なお、ｒＴＩＭＰ−２−ＨＲＰ複合
体を用いた定量法でも、ｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ複合体
を用いた定量法とほぼ同じ様な結果が得られた。1) Method for Quantifying Active MMP-1 Using the active MMP-1 described in Example 4 as a standard, a known concentration of active MMP-1 or free active MMP-1 was used.
Sample No. 1 was transferred to a 96-well vinyl plate (Falcon
20 μl each. Next, the rTIMP-1-HRP complex prepared in Example 2 (a) was diluted with buffer B to a concentration of 5 μg / ml, or Example 2 (b)
-2-anti-TIMP-2 IgG prepared in section
-Buffer B so that the HRP complex becomes 18 μg / ml.
And added to the above vinyl plate in an amount of 100 μl each, followed by mixing. This mixed solution was prepared using the anti-M prepared in the above (a).
100 μl was added to a plate bound with MP-1 antibody (clone No. 78-12G8), reacted at room temperature for 2 hours, and washed three times with physiological saline. Next, 100 μl of 2 mg / ml o-phenylenediamine dissolved in 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 4.9) containing 0.02% hydrogen peroxide was added to each well, and reacted at room temperature for 20 minutes. Sulfuric acid 1
The reaction was stopped by adding 00 μl. The absorbance (A ₄₉₂ ) of this reaction mixture at 492 nm was measured using a microplate reader (MPR-A4, Tosoh), and a calibration curve was prepared (FIG. 1). rTIMP-1-HR
The sensitivity of the quantification system using the P complex was the standard 0 ng / ml value + 2S. D. To 5 ng / ml (84 pg / assay)
Activated MMP-1 standard solution 20-640 ng / ml
(0.33 to 10.7 ng / assay), linearity was observed. The sensitivity of the quantification method using the rTIMP-2-IgG-HRP complex is 1.3 ng / ml (22 pg
/ Assay), activated MMP-1 standard solution 4-330 n
Linearity was observed in the range of g / ml (67-5500 pg / assay). In addition, in the quantification method using the rTIMP-2-HRP complex, almost the same result as the quantification method using the rTIMP-1-HRP complex was obtained.

【００５４】２）活性型ＭＭＰ−２の定量法 実施例４に記載した活性型ＭＭＰ−２を標準とし、既知
濃度の活性型ＭＭＰ−２あるいは遊離の活性型ＭＭＰ−
２を含む検体を９６穴ビニルプレートに各々２０μｌ加
えた。次に実施例２（ａ）項で調製したｒＴＩＭＰ−１
−ＨＲＰ複合体を５μｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ｂで
希釈し、上記ビニルプレートに各々１００μｌずつ加え
混合した。この混合液を前記（ａ）項で調製したマウス
抗ＭＭＰ−２抗体（クローンＮｏ．７５−７Ｆ７）結合
プレートに加え、以下の操作は上記１）と同様に行っ
た。検量線を図２に示した。この定量法の感度は標準０
ｎｇ／ｍｌ値＋２Ｓ．Ｄ．から３４ｎｇ／ｍｌ（０．５
７ｎｇ／アッセイ）であり、直線性は３４〜９３０ｎｇ
／ｍｌ（０．５７〜１５．５ｎｇ／アッセイ）の範囲で
認められた。2) Method for Quantifying Active MMP-2 Using the active MMP-2 described in Example 4 as a standard, a known concentration of active MMP-2 or free active MMP-2 was used.
20 μl of each sample containing No. 2 was added to a 96-well vinyl plate. Next, rTIMP-1 prepared in Example 2 (a)
The HRP complex was diluted with buffer B to a concentration of 5 μg / ml, and 100 μl of each was added to the vinyl plate and mixed. This mixture was added to the mouse anti-MMP-2 antibody (clone No. 75-7F7) binding plate prepared in (a) above, and the following operation was performed in the same manner as in 1) above. The calibration curve is shown in FIG. The sensitivity of this assay is standard 0
ng / ml value + 2S. D. To 34 ng / ml (0.5
7 ng / assay), with a linearity of 34-930 ng.
/ Ml (0.57-15.5 ng / assay).

【００５５】３）活性型ＭＭＰ−９の定量法 実施例４に記載した活性型ＭＭＰ−９を標準とし、既知
濃度の活性型ＭＭＰ−９あるいは遊離の活性型ＭＭＰ−
９を含む検体を９６穴ビニルプレートに各々２０μｌ加
えた。次に実施例２（ｂ）項で調製したｒＴＩＭＰ−２
−ＩｇＧ−ＨＲＰ複合体を１８μｇ／ｍｌとなるように
緩衝液Ｂで希釈し、上記ビニルプレートに各々１００μ
ｌずつ加え混合した。この混合液を前記（ａ）項で調製
したマウス抗ヒトＭＭＰ−９抗体（クローンＮｏ．７３
−１８Ｂ３）結合プレート１００μｌに加え、以下の操
作は上記１）と同様に行った。検量線を図３に示した。
この測定系の感度は標準０ｎｇ／ｍｌ値＋２Ｓ．Ｄ．か
ら５ｎｇ／ｍｌ （８４ｐｇ／アッセイ）であり、直線
性は１０〜３２０ｎｇ／ｍｌ （０．１７〜５．３ｎｇ
／アッセイ）の範囲で認められた。同様にしてＭＭＰ−
３、−７、−８、−１０、−１１、−１２及び−１３並
びにＭＴ−ＭＭＰについてもそれぞれの活性型ＭＭＰを
分別定量する。3) Method for Quantifying Active MMP-9 Using the active MMP-9 described in Example 4 as a standard, a known concentration of active MMP-9 or free active MMP-9 was used.
Samples containing 9 were each added to a 96-well vinyl plate in an amount of 20 μl. Next, rTIMP-2 prepared in Example 2 (b)
-Dilute the IgG-HRP complex with buffer B to 18 µg / ml and add 100 µg each to the vinyl plate.
l was added and mixed. This mixed solution was prepared using the mouse anti-human MMP-9 antibody prepared in the above section (a) (clone No. 73).
-18B3) In addition to 100 μl of the binding plate, the following operation was performed in the same manner as in the above 1). The calibration curve is shown in FIG.
The sensitivity of this measurement system is standard 0 ng / ml value + 2S. D. To 5 ng / ml (84 pg / assay) with a linearity of 10-320 ng / ml (0.17-5.3 ng).
/ Assay). MMP-
3, -7, -8, -10, -11, -12 and -13 average
In addition , also for MT-MMP , each active MMP is separately quantified.

【００５６】実施例６ ヒト関節液中及びヒト血清中活
性型ＭＭＰｓの定量 検体として組織破壊の進行している慢性関節リウマチ
（ＲＡ）及びコントロールとしての変形性関節症（Ｏ
Ａ）患者の関節液、及びヒト血清を用い、ＲＡ患者血清
でレベルの上昇が認められているＭＭＰ−２（Ｎ．Ｆｕ
ｊｉｍｏｔｏ ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃ
ｔａ，２２１，９１−１０３，１９９３）を実施例５
（ｂ）項２）に記載の方法でｒＴＩＭＰ−１−ＨＲＰ及
び抗ＭＭＰ−２抗体を用いて遊離の活性型ＭＭＰ−２を
測定した。ＯＡ患者関節液及びヒト血清中の遊離の活性
型ＭＭＰ−２濃度は、すべてこの定量法の感度以下であ
った。一方、組織破壊の進行しているＲＡ患者関節液中
の遊離の活性型ＭＭＰ−２濃度は、一部感度以下であっ
たが、ＯＡ患者関節液及びヒト血清中の遊離の活性型Ｍ
ＭＰ−２濃度よりも著しく高かった（図４）。ＯＡ患者
関節液及びヒト血清中で活性型ＭＭＰ−２は検出されな
かったが、これら検体中には遊離状態のＴＩＭＰｓが存
在することが知られており、遊離状態の活性型ＭＭＰｓ
が存在しないことと一致する。例として活性型ＭＭＰ−
２定量法の臨床応用例を示したが、その他にも組織破
壊、炎症あるいは癌転移などの疾患をもつ患者からの細
胞、組織ホモジネート、関節液、血液あるいは尿などに
おいて、本定量法により遊離状態の活性型ＭＭＰｓの分
別定量が可能となる。Example 6 Activity in Human Synovial Fluid and Human Serum
Of rheumatoid arthritis in which tissue destruction is progressing as a specimen
(RA) and osteoarthritis (O
A) Serum of RA patient using synovial fluid of patient and human serum
MMP-2 (N. Fu
jimoto et al. , Clin. Chim. Ac
ta, 221, 91-103, 1993)5
(B) rTIMP-1-HRP and
And free active MMP-2 using anti-MMP-2 antibody
It was measured. Free activity in OA patient synovial fluid and human serum
Type MMP-2 concentrations were all below the sensitivity of this assay.
Was. On the other hand, in synovial fluid of RA patients with progressive tissue destruction
The concentration of free active MMP-2 was slightly lower than the sensitivity.
However, free active form M in the synovial fluid and human serum of OA patients
It was significantly higher than the MP-2 concentration (FIG. 4). OA patients
Active MMP-2 was not detected in synovial fluid and human serum.
However, free TIMPs were present in these samples.
Active MMPs in the free state
Does not exist. As an example, active MMP-
2 Clinical application of quantitative method was shown, but other tissue
From patients with diseases such as destruction, inflammation or cancer metastasis.
Vesicle, tissue homogenate, synovial fluid, blood or urine
The amount of active MMPs in the free state was determined by this assay.
Separate quantification is possible.

【００５７】[0057]

【発明の効果】本発明では、各ＭＭＰを特異的に認識す
ることができるモノクローナル抗体と各ＴＩＭＰを用い
ることにより遊離の各活性型ＭＭＰの免疫学的測定を達
成できる。特に被検試料中の活性型ＭＭＰを認識するモ
ノクローナル抗体と各ＴＩＭＰとを用いることにより、
遊離の各活性型ＭＭＰを測定することができ、その結果
活性型ＭＭＰを感度ならびに精度良く、また迅速に定量
し得る。そしてこうしてＭＭＰの免疫学的測定を達成で
きることにより、慢性関節リウマチなどのような炎症性
疾患、癌、腫瘍性疾患においても重要な働きをしている
と考えられる各活性型ＭＭＰを精度良く且つ迅速に分別
定量できるので、これら炎症反応の診断の道を開き、さ
らには慢性関節リウマチなどのような炎症性疾患、腫瘍
性疾患、転移性癌などの診断剤として有用である。According to the present invention, immunological measurement of each free active MMP can be achieved by using a monoclonal antibody capable of specifically recognizing each MMP and each TIMP. In particular, by using a monoclonal antibody recognizing active MMP in a test sample and each TIMP,
Each free active MMP can be measured, and as a result, the active MMP can be quantified with high sensitivity and accuracy, and quickly. By being able to achieve the immunological measurement of MMP in this way, it is possible to accurately and rapidly activate each active MMP that is considered to play an important role also in inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, cancer and neoplastic diseases. The method is useful as a diagnostic agent for inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, neoplastic diseases, metastatic cancer, etc.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】活性型ＭＭＰ−１の標準曲線を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing a standard curve of activated MMP-1.

【図２】活性型ＭＭＰ−２の標準曲線を示す図である。FIG. 2 is a view showing a standard curve of activated MMP-2.

【図３】活性型ＭＭＰ−９の標準曲線を示す図である。FIG. 3 is a view showing a standard curve of activated MMP-9.

【図４】ＲＡ患者、ＯＡ患者関節液あるいはヒト血清中
の遊離の活性型ＭＭＰ−２量を示す図である。FIG. 4 is a graph showing the amount of free active MMP-2 in synovial fluid or human serum of RA patients and OA patients.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 東海 秀明 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品 工業株式会社内 (72)発明者 品川 朗 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品 工業株式会社内 (72)発明者 吉田 真一 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品 工業株式会社内 (72)発明者 岩田 和士 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品 工業株式会社内 (56)参考文献 特開 平４−504418（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−300757（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−213888（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−183397（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−34353（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−244985（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/573 G01N 33/577──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification symbol FI // (C12P 21/08 C12R 1:91) (72) Inventor Hideaki Tokai 530 Chokeiji Temple, Takaoka City, Toyama Prefecture Inside Fuji Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (72) Inventor Akira Shinagawa 530 Chokeiji Temple, Takaoka City, Toyama Prefecture Inside Fuji Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (72) Inventor Shinichi Yoshida 530 Chokeiji Temple Takaoka City, Toyama Prefecture Inside Fuji Pharmaceutical Industry Co., Ltd. 530 Chokeiji, Takaoka City Inside Fuji Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (56) References JP-A-4-504418 (JP, A) JP-A-6-300577 (JP, A) JP-A-6-213888 (JP, A) JP-A-4-183397 (JP, A) JP-A-5-34353 (JP, A) JP-A-5-244985 (JP, A) (58) Fields investigated (Int. Cl. ⁶ , DB name) G01N 33 / 53 G01N 33/573 G01N 33/577

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 遊離の活性型マトリックスメタロプロテ
アーゼ類を分別定量するにあたり、 （ｉ）各マトリックスメタロプロテアーゼ分子中の少な
くとも中央領域またはカルボキシル末端領域に対し特異
的に結合するモノクローナル抗体及びマトリックスメタ
ロプロテアーゼのインヒビターを組み合わせて用い、 （ｉｉ）該マトリックスメタロプロテアーゼのインヒビ
ターは、マトリックスメタロプロテアーゼのインヒビタ
ーの少なくともカルボキシル末端領域に特異的に結合す
るモノクローナル抗体であり且つ標識物が付与されてい
るモノクローナル抗体と該インヒビターとの免疫複合体
であり、 （ｉｉｉ）該免疫複合体は、該インヒビターとそれの少
なくともカルボキシル末端領域に特異的に結合するモノ
クローナル抗体との免疫複合体が解離しないように架橋
結合により固定化操作が行われているものであることを
特徴とする遊離の活性型マトリックスメタロプロテアー
ゼ類を分別定量する方法。 1. A free activated matrix metalloprotein.
In separating and quantifying ases, it is necessary to: (i) use a small amount of
Specific to at least central region or carboxyl terminal region
Binding monoclonal antibodies and matrix meta
And (ii) an inhibitor of the matrix metalloprotease.
Are inhibitors of matrix metalloproteases
Specifically binds to at least the carboxyl-terminal region of
Monoclonal antibody and a labeled substance
Complex of Monoclonal Antibody with the Inhibitor
And (iii) the immune complex comprises the inhibitor and a small amount thereof.
At least one that specifically binds to the carboxyl-terminal region
Cross-linking to prevent dissociation of immune complex with clonal antibody
That the immobilization operation has been performed by joining
Characterized free active matrix metalloproteins
A method for separating and quantifying zeolites. 【請求項２】 マトリックスメタロプロテアーゼのイン
ヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタロ
プロテアーゼ−１あるいはティシュ インヒビター オ
ブ メタロプロテアーゼ−２を用いることを特徴とする
請求項１記載の方法。2. The method according to claim 1 , wherein tissue inhibitor of metalloprotease-1 or tissue inhibitor of metalloprotease-2 is used as the matrix metalloprotease inhibitor. 【請求項３】 架橋結合が架橋剤としてホルムアルデヒ
ドを用いてなされていることを特徴とする請求項１又は
２記載の方法。 3. A crosslinking agent wherein formaldehyde is used as a crosslinking agent.
2. The method according to claim 1, wherein
2. The method according to 2. 【請求項４】 マトリックスメタロプロテアーゼのイン
ヒビターに特異的に結合する抗体として、ティシュ イ
ンヒビター オブ メタロプロテアーゼ−１あるいはテ
ィシュ インヒビター オブ メタロプロテアーゼ−２
に特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする請求
項１記載の方法。4. An antibody which specifically binds to an inhibitor of a matrix metalloprotease, wherein the antibody specifically binds to a tissue inhibitor of metalloprotease-1 or tissue inhibitor of metalloprotease-2.
The method according to claim 1 , wherein an antibody that specifically binds to is used. 【請求項５】 マトリックスメタロプロテアーゼのイン
ヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタロ
プロテアーゼ−１を、各マトリックスメタロプロテアー
ゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体として各
マトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域または
カルボキシル末端領域を認識する抗体を用い、遊離の活
性型マトリックスメタロプロテアーゼを測定することを
特徴とする請求項１記載の方法。5. An antibody recognizing a central region or a carboxyl terminal region of each matrix metalloprotease molecule as a monoclonal antibody that specifically binds tissue inhibitor of metalloprotease-1 as an inhibitor of matrix metalloprotease and a monoclonal antibody that specifically binds to each matrix metalloprotease. using method of claim 1, wherein the measuring free of active matrix metalloproteinase. 【請求項６】 マトリックスメタロプロテアーゼのイン
ヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタロ
プロテアーゼ−１を、各マトリックスメタロプロテアー
ゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体として各
マトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域または
カルボキシル末端領域を認識する抗体を用い、遊離の活
性型マトリックスメタロプロテアーゼ−１、−２、−
３、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２及び−
１３並びに遊離の活性型膜型マトリックスメタロプロテ
アーゼから成る群から選ばれたものを測定することを特
徴とする請求項５記載の方法。6. An antibody recognizing a central region or a carboxyl terminal region of each matrix metalloprotease molecule as a monoclonal antibody which specifically binds tissue inhibitor of metalloprotease-1 as an inhibitor of matrix metalloprotease and a monoclonal antibody which specifically binds to each matrix metalloprotease. Using free active matrix metalloprotease-1, -2,-
3, -7, -8, -9, -10, -11, -12 and-
13. The method according to claim 5 , wherein a substance selected from the group consisting of 13 and free activated membrane-type matrix metalloprotease is measured. 【請求項７】 マトリックスメタロプロテアーゼのイン
ヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタロ
プロテアーゼ−２を、各マトリックスメタロプロテアー
ゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体として各
マトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域または
カルボキシル末端領域を認識する抗体を用い、遊離の活
性型マトリックスメタロプロテアーゼを測定することを
特徴とする請求項１記載の方法。7. An antibody recognizing a central region or a carboxyl terminal region of each matrix metalloprotease molecule as a matrix metalloprotease inhibitor, a tissue inhibitor of metalloprotease-2 as a matrix metalloprotease inhibitor, and a monoclonal antibody specifically binding to each matrix metalloprotease molecule. using method of claim 1, wherein the measuring free of active matrix metalloproteinase. 【請求項８】 マトリックスメタロプロテアーゼのイン
ヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタロ
プロテアーゼ−２を、各マトリックスメタロプロテアー
ゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体として各
マトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域または
カルボキシル末端領域を認識する抗体を用い、遊離の活
性型マトリックスメタロプロテアーゼ−１、−２、−
３、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２及び−
１３並びに遊離の活性型膜型マトリックスメタロプロテ
アーゼから成る群から選ばれたものを測定することを特
徴とする請求項７記載の方法。8. An antibody recognizing a central region or a carboxyl-terminal region of each matrix metalloprotease molecule as a matrix metalloprotease inhibitor, a tissue inhibitor of metalloprotease-2 as a matrix metalloprotease inhibitor, and a monoclonal antibody specifically binding to each matrix metalloprotease molecule. Using free active matrix metalloprotease-1, -2,-
3, -7, -8, -9, -10, -11, -12 and-
8. The method according to claim 7 , wherein a substance selected from the group consisting of 13 and free activated membrane matrix metalloprotease is measured. 【請求項９】 （ｉ）各マトリックスメタロプロテアー
ゼ分子中の少なくとも中央領域またはカルボキシル末端
領域に対し特異的に結合するモノクローナル抗体及びマ
トリックスメタロプロテアーゼのインヒビターを組み合
わせて用い、 （ｉｉ）該マトリックスメタロプロテアーゼのインヒビ
ターは、マトリックスメタロプロテアーゼのインヒビタ
ーの少なくともカルボキシル末端領域に特異 的に結合す
るモノクローナル抗体であり且つ標識物が付与されてい
るモノクローナル抗体と該インヒビターとの免疫複合体
であり、 （ｉｉｉ）該免疫複合体は、該インヒビターとそれの少
なくともカルボキシル末端領域に特異的に結合するモノ
クローナル抗体との免疫複合体が解離しないように架橋
結合により固定化操作が行われているものであることを
特徴とする遊離の活性型マトリックスメタロプロテアー
ゼ類の分別定量用試薬セット。 9. (i) Each matrix metalloprotein
At least the central region or carboxyl terminus in the ze molecule
Monoclonal antibodies and antibodies that specifically bind to
Combines inhibitors of Tricks metalloprotease
Using Te Align, Inhibi of (ii) the matrix metalloproteinase
Are inhibitors of matrix metalloproteases
Specifically binds to at least the carboxyl-terminal region of
Monoclonal antibody and a labeled substance
Complex of Monoclonal Antibody with the Inhibitor
And (iii) the immune complex comprises the inhibitor and a small amount thereof.
At least one that specifically binds to the carboxyl-terminal region
Cross-linking to prevent dissociation of immune complex with clonal antibody
That the immobilization operation has been performed by joining
Characterized free active matrix metalloproteins
Reagent set for fractionation and quantification of zemos. 【請求項１０】 マトリックスメタロプロテアーゼのイ
ンヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタ
ロプロテアーゼ−１あるいはティシュ インヒビター
オブ メタロプロテアーゼ−２を用いることを特徴とす
る請求項９記載の試薬セット。10. Tissue inhibitor of metalloprotease-1 or tissue inhibitor as a matrix metalloprotease inhibitor
10. The reagent set according to claim 9 , wherein the reagent set uses metalloprotease-2. 【請求項１１】 架橋結合が架橋剤としてホルムアルデ
ヒドを用いてなされていることを特徴とする請求項９又
は１０記載の試薬セット。 11. A crosslinking agent wherein formaldehyde is used as a crosslinking agent.
10. The method according to claim 9, wherein the step is performed using a hide.
Is a reagent set described in 10. 【請求項１２】 マトリックスメタロプロテアーゼのイ
ンヒビターに特異的に結合する抗体として、ティシュ
インヒビター オブ メタロプロテアーゼ−１あるいは
ティシュ インヒビター オブ メタロプロテアーゼ−
２に特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする請
求項９記載の試薬セット。12. An antibody that specifically binds to an inhibitor of a matrix metalloprotease,
Inhibitor of metalloprotease-1 or tissue Inhibitor of metalloprotease-
10. The reagent set according to claim 9, wherein an antibody that specifically binds to No. 2 is used. 【請求項１３】 マトリックスメタロプロテアーゼのイ13. A matrix metalloprotease a.
ンヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタTissue inhibitor of meta as inhibitor
ロプロテアーゼ−１を、各マトリックスメタロプロテアProteinase-1 with each matrix metalloprotein
ーゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体としてMonoclonal antibody that specifically binds to
各マトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域またThe central region of each matrix metalloprotease molecule or
はカルボキシル末端領域を認識する抗体を用いることをUses an antibody that recognizes the carboxyl-terminal region.
特徴とする請求項９記載の試薬セット。The reagent set according to claim 9, characterized in that: 【請求項１４】 マトリックスメタロプロテアーゼのイ14. A matrix metalloprotease a.
ンヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタTissue inhibitor of meta as inhibitor
ロプロテアーゼ−１を、各マトリックスメタロプロテアProteinase-1 with each matrix metalloprotein
ーゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体としてMonoclonal antibody that specifically binds to
各マトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域またThe central region of each matrix metalloprotease molecule or
はカルボキシル末端領域を認識する抗体を用い、遊離のUses an antibody that recognizes the carboxyl-terminal region,
活性型マトリックスメタロプロテアーゼ−１、−２、−Activated matrix metalloprotease-1, -2,-
３、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２及び−3, -7, -8, -9, -10, -11, -12 and-
１３並びに遊離の活性型膜型マトリックスメタロプロテ13 and free activated membrane matrix metalloprotein
アーゼから成る群から選ばれたものを測定するものであMeasuring a substance selected from the group consisting of
ることを特徴とする請求項１３記載の試薬セット。The reagent set according to claim 13, wherein 【請求項１５】 マトリックスメタロプロテアーゼのイ15. A matrix metalloprotease a.
ンヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタTissue inhibitor of meta as inhibitor
ロプロテアーゼ−２を、各マトリックスメタロプロテアLoprotease-2 is added to each matrix metalloprotein.
ーゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体としてMonoclonal antibody that specifically binds to
各マトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域またThe central region of each matrix metalloprotease molecule or
はカルボキシル末端領域を認識する抗体を用い、遊離のUses an antibody that recognizes the carboxyl-terminal region,
活性型マトリックスメタロプロテアーゼを測定することMeasuring activated matrix metalloprotease
を特徴とする請求項９記載の試薬セット。The reagent set according to claim 9, wherein: 【請求項１６】 マトリックスメタロプロテアーゼのイ16. A matrix metalloprotease a.
ンヒビターとしてティシュ インヒビター オブ メタTissue inhibitor of meta as inhibitor
ロプロテアーゼ−２を、各マトリックスメタロプロテアLoprotease-2 is added to each matrix metalloprotein.
ーゼに対し特異的に結合するモノクローナル抗体としてMonoclonal antibody that specifically binds to
各マトリックスメタロプロテアーゼ分子の中央領域またThe central region of each matrix metalloprotease molecule or
はカルボキシル末端領域を認識する抗体を用い、遊離のUses an antibody that recognizes the carboxyl-terminal region,
活性型マトリックスメタロプロテアーゼ−１、−２、−Activated matrix metalloprotease-1, -2,-
３、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２及び−3, -7, -8, -9, -10, -11, -12 and-
１３並びに遊離の活性型膜型マトリックスメタロプロテ13 and free activated membrane matrix metalloprotein
アーゼから成る群から選ばれたものを測定するものであMeasuring a substance selected from the group consisting of
ることを特徴とする請求項１５記載の試薬セット。The reagent set according to claim 15, wherein