JPS6163699A - ヒト形質転換発育因子 - Google Patents
ヒト形質転換発育因子Info
- Publication number
- JPS6163699A JPS6163699A JP60031380A JP3138085A JPS6163699A JP S6163699 A JPS6163699 A JP S6163699A JP 60031380 A JP60031380 A JP 60031380A JP 3138085 A JP3138085 A JP 3138085A JP S6163699 A JPS6163699 A JP S6163699A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tgf
- item
- fragment
- protein
- species
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
産業上の利用分野
本発明はヒト組織中に見出されるもの4二対・応する、
ヒト形質転換発育因子−α前駆物質およびそのフラグメ
ント、特に成熟−ヒト形質転換発育因子α(’1’ C
F−α)1.11びにその新規な製剤ね10組成物、さ
らには、それらを治療および/または診断用に均一な状
態で大量に生産する方法に関する。 本発明は、望ましくないタンパク質を含んだ天然の物質
を、極く少量しか得ることができなかった従来の方法、
即ち、既存の細胞培養中で生産し、抽出する単離法と比
較して、高純度の物質を大量に生産することのできる方
法を堤供するものである。 本明細盲中で言及した文献およびその他の物質は詳細な
説明中に参照例として挿入し、更に、便宜上、記載順に
番号を付し、それぞれ文献目録中にまとめて示した。 発明の技術的背景 F3’lt転換発育因子類(TGFIllm)は、正常
細胞における表現型の(フエノティピカルな)形質転換
を可逆的な方法で支配する因子である。TGFを投与す
ると、正常細胞のコントロールされていない増殖が刺激
され、また軟寒天中の形質転換細胞の形成状態を測定し
た結果、アンカレッジ・インディベンダンス(anch
orage 1lIdependence)が増加する
ことが示された(l−3)。2種類のTGFが識別され
た。TGF−αは広範なヒトまたはゲブ歯類起源のU瘍
細胞から分泌される(4−7)。TGF−αおよび表皮
性発育因子(EGF)は同じ受容体を競合しく5.8.
9)、この受容体は、TGF−αまたはEGFの結合後
、チロシン残基の位置でリン酸分解される(10−11
)。TGF−αに特異的−他の受容体の存在を提示する
幾つかの証拠があろ(12)。TGF−αによるアンカ
レッジ・インディベンダンスな増殖はTGF−βによっ
て著しく補強される(13.14)。この後行のTGF
は多くの正常細胞および腫瘍細胞中に検出されており(
13〜+7)、しん腎臓(I8)、胎盤(I9)および
血小板(20)から精製されている。TGF−βはEG
F受容体と結合しないとされており、まf二、自身の形
質転換活性またはNRK細胞活性のfこめにEGFま几
はTGF−αを必要とする、と信しられている。 TGFIの生物学的な役割は未だ明瞭に解明されていな
い。多くの研究がTGPI[が形質転換1こおいて重要
な役割を果たしていることを示唆している。レトロウィ
ルス(21〜24)、S V 40 C25)またはポ
リオーマウィルス(26)における細胞形質転換におい
てTGF−αが分泌されていることが示された。細胞形
質転換におけろTGF分泌の密接な係り合いはポリオー
マウィルスDNAのトランスフェクション実験で示され
た。即ち、ミドルT抗原についてのDNAセグメントの
導入が、形質転換された表現型、およびTGF分泌の両
番を誘導するのに必要かつ十分な条件であることが示さ
れた(26)。K 1rstenのネズミ肉腫ウィルス
の熱感受性突然変異体を用いた形質転換に関する研究に
おいてら、表現型の形質転換が許容温度で起こった場合
にのみTGF−αが分泌されることが指示された(21
)。加えて、最近の研究によると、クローンされたT2
4膀胱がん遺伝子の導入でTGFの生産が誘導されるこ
とが示されている(27)。腫瘍の進行との生物学的な
関連性は、健常人χ・i照との比較にjjいて、11・
[!患との尿中に)ヱTGF−αの活性てあろ、と同定
される活性が削性することによって6暗示されている(
28〜30)。しかしながら、採用された分析法ではE
GFの如き池の発育因子の活性を区別し得なかっf二か
らしれない。これら、またはその他の観察の結果は、T
GF αが自己分泌(autosecrine)機構を
介して腫瘍形成に関与し、そのことによってTGFff
iが形質転換細胞から分泌され、そして同様の細胞集団
においてこれらの形質転換された特性を維持し、刺激す
る、ということを示唆している(31〜32)。しかし
ながら、腫瘍細胞がTGFαとβの両者を分泌するとい
うことから示唆される様に、TGF−βの増強作用か必
要からしれない(14)。この様に、TGF−αは腫瘍
の形成期間における極めて強力なエフェクター分子であ
り得る。 TGF−αのヘテロローガスな(異種の)分子種は、腫
瘍細胞からの抽出物および上澄み(5,12゜22.3
3〜34)並びに尿中(28〜30)のらのについて報
告されζいる。約7キしIクルトノUノ小さいものか、
ゲ、l歯類(27,35)およびヒト(24゜35)の
両細胞供給源に関して精製されfこ。このラットおよび
マウスのT G F−αについてのアミノ酸配列決定に
よって、これはEGFと幾分かのホモロノー(homo
logy)を示すことかねかっj二(27゜35)。報
告されたヒトTGF−αの部分的なポリペプチド配列は
、ラットおよびネズミ種のそれと強いホモロノー関係に
あることを示している(35)。 転移性の腎細胞腫患者では進行性の骨の脱仄か起こり、
それが体液性の高カルシウム血症に反映されていること
か観察された(36)。不純なタンパク質製剤を用いて
行なわれた最近の研究によると、形質転換発育因子(T
QF−αを含む)は組織培養系で骨吸収を若起すること
が示唆された(37)。 ウィルスによる細胞の形質転換では、TGF〜αは上記
の治療または診断用薬として用いるには非実用的な、限
られた量しか生産されない。 組換えDNA技術 ヘテロローガスなタンパク質、即ち、ある細胞か11゛
常状態ては産生しないタンパク質、は、外来性DNAに
よって形質転換された細胞によって生成される。これは
通常、外来性DNAをベクターの形で細胞内に導入する
ことによって達成される。 ベクターの構成要素、即ち、複製起源、1またはそれ以
上の表現型の選択特性、発現プロモーター、ヘテロロー
ガスな遺伝子挿入物およびベクターの残余部分、に関す
るDNA組換え操作は通常、宿1ミ細胞の外部で行なわ
れる。得られた複製可能な組みえ発現ビヒクル、または
プラスミド、を形質転換によって細胞に導入し、該形質
転換体を増殖さU゛て、大量の組換えビヒクルを得るこ
とかできる。遺伝子を、それが暗号化しているDNAメ
ッセーノの転写および翻訳を支配する部分に関して適切
に挿入することによって得られた発現ビヒクルは、挿入
した遺伝子か暗号化しているポリペプチド配列を実際に
生産するのに、また、発現の工程にとって、a用でd5
ろ。生産物は宿主細胞を溶解して該細胞内から得るか、
または分泌型生産物の場合には培地から得、しかる後適
当な精製法により不純物中から回収゛4′ることがてき
ろ。 魚吸Δ髪性 本発明は、組換えDNA技術を使用することにより、商
業化にとって必要な作業である動物実験および臨床実験
を開始し、行うのに充分な量の形質転換発育因子−α(
TGF−α)前駆体を得ることに成功したという発見に
基づいている。T G F’ −α前駆体およびそのフ
ラグメント(特に成熟TGF−αを乙含む)(所望によ
りヒト形質転換発育因子−βを併用する)は、例えばヒ
トにおけろ骨疾徹の治療および損傷の治癒の促進にfイ
用である。加えて、T G F−αは細胞培養の補助剤
として乙用いることかでき、その様にして培地中の自涜
の必要量を減少しくその結果、精製か何)りとなる)、
細胞培養内での細胞の増殖を刺激し、増大させることか
できる。また、TGF−α前駆体およびそのフラグメン
トの大組生産により、新生物その他の疾j、lを診断す
るための、体液中のTGF−α前駆体およびそのフラグ
メントの分計用試薬の製造か可能となる。 ′r G F n +iii駆体の完全なヌケレオチ
ドおよび対応するアミノ酸配列を第3図に示す。該前駆
体す)様々な主領域を同定するために、便宜上、3個の
ポリペプチド、即ち、成熟TGF−α(第3図において
、残基40から89までの、枠で囲んだ部分)、残基9
0〜160(主要部はC1n911からVa1160ま
での62残基からなるポリペプチド)のTGF−α末端
ポリペプチドであって、本明細書中てはTGF−αCと
弥するもの、並びにMe目DりらAla22までのTG
F−αN末端ポリペプチド(TGF−αN)、を定めた
。従って、TGF−α1ト1駆体は成熟TGF−αを含
むTGF−α担持ポリペプチドであり、TG’F−αと
その正常な非翻訳間pHとの融合によって得られるしの
である。更に、便宜上、本明細書中ではTGF〜α而駆
体お面びそのフラグメント(成熟TGF−α、TGF−
αCおよびTGF−αNを含む)を総括的にPRTGF
−α種(spec 1es)と呼称fる。TGF−aと
言うときは成熟TGF−αを意味することとする。また
、特に明記しない限り、PRTGF−α種という語句は
、以1・に、より詳1.<述へる様に、アミノ酸配列の
突然変異体の様なPRTGF−α種誘導体をも包含する
ものとする。本発明に包含される他のPRTGF−α種
フラグメントはTGF=αCと成熟’r G F−αか
ら成るらのである。このポリペプチド(TGF−amc
と呼称)は、残M20〜+60の間であって、TGF−
αN配列は信号としてのみ機能し、内質細網での処理の
間にTCP−amcから切離されると思われるので、該
TGF−αmCは吐乳類細胞内でのT G F−α前駆
体の発現の初期生産物であると信じられいてる。細胞内
での処理には幾分、変異があるので、これらの主領域は
インビボにおいては、アミノまたはカルボキノ末端と表
現される正確な状態では見出すことができないで李ろう
。 PRTGF−αフラグメントは通常、(a)一般にP
RT G F−αと共に何らかの生物学的活性、例えば
抗体交差反応またはアンカレッジ・インディペンダンス
の誘導、を表し、(b)PRTGF、αと実質的に相同
(homology)な領域を存し、そして、(C)少
なくと65個、通常は10〜130個のアミノ酸残基の
長さを有する。 本発明は、これまで同定されていなかった、TGF−α
Nおよび1’CF−αCの如きPRTGF−αのポリペ
プチドフラグメノトを分析する方法を提供する乙のであ
り、更に詳しくはこれらの配列の部分を包囲または包含
している他のペプチドの妨害を受けることなく分析を行
う方法を提供するしのでめろ。 本発明により、PRT’GF−α種のアミノ酸配タリを
知ることかできたので、予め決定されたPRT G F
−α唾のアミノ配列に対する抗体を生産さけろことか初
めて可能となったのである。PRTGF−α種フラグメ
ント(TGF−αを除く)を示すアミノ酸配列はタンパ
ク質と免役学的な共役関係で結合し、従って動物に免疫
を付与するのに用いられろ。その様な抗体はr’nTG
F−α種に特異的なイムノアッセイや受身免疫療法にお
いて有用でるる。 また本発明は実質上純粋なPlで1’GP−α種であっ
て、1ffi常、非組換え細胞雰囲気トては01(jL
。 ている不純物等を含まないPRTGF−α種を提供する
ものである。その様な不純物は天然に、正常な状態でT
GF−α七−緒に見出される物質、例えば、細胞内では
細胞滲出物や体液、さらにヒト血清アルブミン、ガンマ
グロブリノ、リポタンパク質、並びに表皮性発育因子(
EGF)を含む発育因子等である。PItTGF−αF
IiDNAの供給椋から得られる他のタンパク質ら本明
細書中に示すPRTGF−α種の組成物中に存在し得る
ものであり、それらは、例えばTGF−βおよび血小板
誘導性の発育因子(P D G F )であるか、ここ
では、これらは予め定めた量、存在することになろう。 例えば、非ヒト細胞内での組換え細胞培養により、1出
のヒトタンパク質を全く含まないTGFαを牛irする
ことができるからである。 本発明はまた、P It 1” G F a性を暗号
化したDNAを発現可能なして有する組換D N A発
現ヒヒクル、その槌なりNAで形質転換した微生物の株
または細胞倍径、・■びにそれら形質転換された菌株よ
l−は培貢物であ−で1月じl’ G l”−α種を生
産することができろ微生物または細胞培養、を鴇供する
ことを目的とするしのである。さらにまた本発明は、組
換え発酵法により、該微生物および!lI胞培毘内でP
RTGF・α種を製造する方法を提(共することを目的
とする乙のである。 本発明に係るDNAはPRTGF−α種を暗号化してお
り、組換えられた、または形質転換された培養物中で発
現することにより、PrtTGF−α種を大量に与える
。P R’r G f’ a種合成細胞からの5RN
Aの逆転写によって得られるcDNAはイントロン(介
在配列)を含まず、また、このDNAの供給源にとって
ホモローガスな他のタンパク質を暗号化している如何な
る非翻訳領域をも含んでいないので、上記のDNAは新
規なものといえろ。 PRTGF−α種を暗号化している染色体IT)NAは
、ゲノムDNAライブラリーを、PRTGF−α種を暗
号化しているcDNAでプローブすることにより得られ
るヵ染色体DNAは、それ自身の通常な染色体雰囲気を
1杓ない状聾で得られろ。 従って、それは、ヒトTGF−α前駆体のゲノム暗ぢ配
クリには6個の明瞭なエクソンか含まれている故に、最
初のエクソンの5゛末端より上流の非翻訳領域、あるい
はゲノムDNAの供給源にホモローガスな別のタンパク
質を暗号化している最後のエクソンの3°末端から下流
の非翻訳領域を含まないがイントロンは含むことになる
。その様なりNAは本明細書中で述べる様に、哺乳類の
細胞を形質転換し、PRTGF−αを生産するのに有用
である。 単離したPRTGP−α種のDNAはヌクレオチドの置
換、欠失または挿入(ヌクレオチドの置換の場合には暗
号化されたアミノ酸配列を変化しないことを要すン4こ
よって容易1こ修飾され、その結果、PRTGF−αを
暗号化している新規なりN、A配列または、その配列上
の突然変異体を得ることができる。アミノ酸配列を変え
ずに修飾を施されたDNA配列は、選択した宿主−ベク
ター系でのPRTGF−g発現を高めるのにa用である
(fp4入ば′ヒト コドンをft′tRの宿主細6〕
ことって好ましル^コドンに突黙変ilさせた場合)。 これらの新規なりNA配列またはその7ラグメントをラ
ベル(標識化)L、PRTGP−α種を暗号化している
遺伝物1t(D N Aまたは*RNA)のへイブリダ
イゼーシプン(雑種分子形成)分析に用いろ。 PRTGF−ttM(DIJ1ti方法ハ、PrtTG
F4種を暗号化しているDNAをFM製可能(再生産可
能)なベクターにライゲート(結合)し、このベクター
を用いて宿主細laを形質転換し、この宿主細胞を培養
して該培養からPRTGF−αを回収する工程からなる
。この様にして製造することのできるPRTGF’−α
種には、TGF−α前駆体およびそのフラグメント(’
l’Gl?−αCおよびTGF−α等)、並びにその誘
導体、これには以下の各物質が含まれろ:(a)P R
T G F −α種(成熟T G I” ・αを含む)
か、ヘテロローガスなタンパク質またはポリペプチドと
、TGF−αのアミノおよび/またはカルボキン末端の
アミノ酸の位置で、ペプチド結合を介して結合してなる
、−合タンパク質、(b) Iまたは1以上のアミノs
@gの挿入または置換によるPRTGF−α種の突然変
異体および(C)上記の融合物質、フラグメント類また
は突然変異体等の、メチオニルまたは修飾したメチオニ
ル(ホルミルメチオニルまたはその他の保護メチオニル
)のアミノ末端付加誘導体、が含まれろ。 ヘテロローガスな分泌型リーダー配41(通常、所望の
宿主微生物にホモローガスなタンパク質から得られる信
号)と機能的に結合している、PRTGF−α種を暗号
化したDNAを含むベクター類を宿主細胞の形質転換に
用いる。得られたPRTGF−α種融合物で宿主細胞を
処理することによって、アミノ−末端メチオニルまたは
保護メチオニルを含まないPRTGF一種が分泌される
。 アミノ酸配列以外の変異に係るPrtTGP−α誘導体
ら本発明の範囲に含まれる。その様な誘導体は化学的な
成分との共有または凝集的な会合によって生成されてい
ることが特徴である。この誘導体は通常3クラスに分け
られる。塩類、側鎖ま1=1未喘’Aに対・するJ(イ
1結合的な修飾産物、並びに吸着によるコノブレックス
である。 r’ RT G F−α種か直接、組換え原核生物の培
養物中に蓄積された後(原核生物の信号配列との融合物
以外の形で)、それらを、水不溶性の屈折性の物体とし
ての物理的な形状または、変性に対するかなりの安定性
、のいずれかに基づいて池のタンパク質から分離する。 通常、原核生物培養物から不溶性の物質を回収し、この
不溶性の細胞汚物から屈折性の物体(PRTGF−α種
を含む)を分離し、次いでこの屈折性物体を可溶化する
。タンパク質の適切なホールディング(再屈折)を増大
させるために、上記の段階の後にグルクチオン処理を適
宜、行ってらよい。組換え真核生物細胞からのPRTG
F−α種は水溶性であるため再溶解を要しない、この場
合は、従来天然起源からPRTGF−α種を単離するの
に用いられていた常法に従って精製する。 組換え細胞の培養物から精製したPRTGF−α種を治
療に使用するために、生理学的に無毒な安定剤および賦
形剤と合わせ、凍結乾燥し−ζ坊ヒノに入れた投与剤形
にJAI製するか、または好ましくは水性製剤中に貯え
る。後とのことは、PRTGF−α種が分子中に優勢な
ジサルファイド結合を有しているために熱変性に対して
極めて安定である故に可能となる。別法として、PRT
GF−α種をポリマーマトリックス中に組込んで、埴込
み投与するか、外科的部位の上に取り付け(例えば包帯
中)、そのことによってPR′rGF a任か局所的に
高い濃度勾配で好期に放出される様にすることかできる
。 PRTGF−α種−含有組成物は、動物、特に組織の増
殖の促進を必要とする@青、に治療a効量を投与される
。適当な用量は治療に係る技術者にとって自明であろう
。 図面の説明 第1図はヒトTGF−α前駆体に関するDNA配列を検
出するためのハイブリダイゼーノジンプローブとして用
いられるオリゴヌクレオチドの配列式を示す模式図であ
る。 第2図はヒトl″CF−αの最初の33個のアミノ酸を
暗号化しているエクソンを含む、プラスミドp′rGI
”α15−1CI′)180bpsau3Aフラグメン
トのヌクレオチド配列を示す模式図である。 推定のアミノ酸配列も示されている。大文字で示しに配
列はTGF−αボリベプヂドの部分であり、小文字でタ
イプしたらのは1111駆体中の前記TGF−αのアミ
ノ酸配列を示している。矢印はcDNA配刈と0比較で
決定した介在配列の受容および供与部位であることを示
している。幾つかの過当な制限部位か指摘されている。 第3図はプラスミドpTCiF C1中に含まれている
CDNAのヌクレオチド配列並びに推定のアミノ酸配列
を示す模式図である。cDNAの両側はG−CテールQ
ail)と接している。ライン上の数字は、単一のメチ
オニンがNH2−末端を構成すると推定した場合のアミ
ノ酸の位置を示している。 TGF−αのアミノ酸配列は枠内に囲まれており、その
両側は、Ala−Valに富む配列(オーバーラインで
示した残基)と結合している。幾つかの適切な制限部位
が指摘されている。 第4図はプラスミドpTE1.2.3.4,5.6゜7
.8の組立て経路を表した模式図である。 第5図はTGF−α発現プラスミド、pTE5およびp
TE6を表す模式図であって、TaF−α融合タンパク
質のアミノ酸の連結部をも示している。 第6図は発現プラスミドpTE2、pTE3、pTE5
またはpTE6を含む、E、coliの全細胞溶解物の
5DS−13%ポリアクリルアミドゲル(79)による
電気泳動の結果を示す状態図である。 矢印はTGF α融合タンパク質を示す。右側の値はタ
ンパク質マーカーの位置を表す。 第7図は酸−エタノールー法で豊富にした細菌性の短い
TGF−α融合タンパク質の5DS−ポリアクリルアミ
ドゲル上の状態図である。このゲル内で、68残基のT
GF−α融合タンパク質は幅の広いバンド(矢印)とし
て移動した。右側の値は参考用のタンパク質マーカーの
位置を示している。 第8図はラノオリセプターアッセイにおける細菌PIT
G F tχの短い融合タンパン質と1I51−ラヘ
ルI> CFとの競合状聾を11−4−グラフであり(
実線)、文献記載(5,14,27)の方法に従って行
い、図式的に表しLものである。EGFで得られfコ倹
量線は岐線で示されている。第8B図はEGF倹黴線を
示す。縦軸は115 (ラヘルEGFと細胞との結合を
示している。 第9図はネズミEGF、および臭化シアンによる開裂の
+iiL iUにおける細菌性1’ G F α融合タ
ンパン質の軟寒天コロニー形成活性を示すグラフて(’
5る。この分析実験はヒトTGF−βの存在下、NHK
細胞、クローン49Fを用いて文献記載の方法(14)
に従って行なわれた。縦軸は850μm2以上のコロニ
ーの数を、横軸はEGFまたは細菌性T G F−αの
濃度であって、EGF内で求めた如く、EGF当1k(
ny/aジ)として、それぞれ表されており、実線は臭
化シアンで処理する前(白丸)または後(黒丸)の細菌
性TGF−α融合タン融合タンパ重質結果を示している
。 第10図はTGF−αの酵母内での発現のためのプラス
ミド、I)y TE 2の役弐図で、jうろ1.このプ
ラスミドはTGF−α配列(斜線)と、それに先1jし
、α−因子プ[1モ〜ターの転写コントロール下にある
α−因子(MF α)プレプロ配列とを有する。 このTGF’−ci配列の後方には“Able”遺伝子
の3゜非翻訳領域およびポリアデニル化信号(枠で囲ん
だ部分)かある。TRP Iは酵母内で選択マーカーと
して機能する。酵母内での転写は、2μの転写起源の存
在により確実となる。APR・アンピノリン耐性。α−
因子プレプロ配列とTGF α配ダ11との連結(ju
nction)部分はプラスミド地図の右側に示されて
いる。 詳細な説明 本明細書においては、PRTGF−α種を、第3図に示
したTGF−α前駆体のアミノ酸配列に相同(ホモロノ
ー)で、機能的なアミノ酸に係る本質的な領域、または
そのフラグメントを有している、EGF以外のポリペプ
チドである、と定義する。候補(candidate)
ポリペプチドは、該侯捕内の残基の内、約35%以上が
、保存的(コンサーバティブ)なアミノ酸置換またはき
ずの導入を行イつなくとらPRTGF−α種配列内の配
列と対応している場合には、本明細書中で定義したPR
TGF−α種と実質上ホモローガスであるとする。 候補ポリペプチドは通常、その様な機能的ホモロノーに
加えて、それ自身が相同である、PRTGF−α幡と共
通した生物学的活性を表すことができろ。 あるポリペプチドをPRTGF−α種の定義範囲に入れ
るのに必要なアミノ酸配列におけるホモロノーの程度は
、該候補タンパク質とPRTGF−α種との間のホモロ
ノーかPRTGF−α種の生物学的活性に関与している
領域、即ち、(a)標的細胞内での形態学上の変化の誘
導、(b)非組換え供給ねで起こりiする様な、r’
It ’r G F−α種に対する抗血l、′?の免疫
学的交差反応、または(C)細胞表面の受容体との結合
、にとって臨界的な領域内であるか否かによって種々変
化し、定義範囲に含まれるLめには高度のホモロノーを
示す必要があり、これらの機能の維持と無関係な配列の
場合には、比較的低いホモロノーを示すことになる。加
えて、らし機能的に同様なアミノ酸側鎖を含有する残基
が置換されても、臨界的な領域がこれらの機能のIまた
はそれ以上を表すならば、本明細書で定義するホモロー
ガスに属することになる。機能的に同様であるというこ
とは、側鎖に優勢な特性(例えば塩基性、中性、疎水性
または酸性)、または立体的な塊(bulk)の存在ま
たは不存在を指す。 通常、PRTGF−α種と定義されるポリペプチドは、
図3で示したタンパク質またはそのフラグメントと、少
なくとら約10ないし25個のアミノ酸残基からなる連
続した領域にわたって実質的にホモローガスな領域を含
むものである。 あるポリペプチドがPRTGF−α種であることを確実
に同定する上で重要なファクターは、それと対応する非
組換え体と実質上結合し得る抗血清が、問題のポリペプ
チドの活性とし結合し得るということである。しかしな
がら、免疫学的な同一性とそれ以外の生物学的活性に関
する同一性とは、必ずしも同し範囲内であることを必要
と乙ない、とい・〕ごとは理解できるであろっ。例えば
、第3図の成熟T G F αの受容体結合活性に対
する中和抗体は、それが成熟TGF αの活性にとって
臨界的な部位に特異的に結合することを目的として生し
たらのでないので、候補タンパク質と結ffi L ’
jいかししれない。むしろ、この抗体は無害な領域に結
合し、その中和効果を立体障害によって表しているのか
らしれない。従って、その無害/、L 領域で突然変異
を生した蚊Aliタンパク質は中和抗体と結合しないか
、それにらがかわらず、このタンパク質は実質的なTG
F−αホモロジー、という意味においてTGF−αの定
義範囲内に含まれることになる。 生物学的な活性に関して“可能な(capable)”
という語句は、酵素的加水分解を受けて、チモーゲン類
似の不活性な状態から、所望の生物学的活性を表すポリ
ペプチドフラグメントに変換され得るポリペプチドであ
ることを意味する。通常、不活性な前駆体は、PRTG
F−α種タンパク質のいずれか一方の末端にヘテロロー
ガスなタンパク質またはそのフラグメントがペプチド結
合を介して結合している融合タンパク質である。このペ
プチド結合の配列は、インビボ、またはイノビトロでの
製造工程の一部としてのタンパク分解的加水分解に対し
て感受性を有する様、選択する。 PRTGF−α種は、通常ヒトPRTGF a唾を色
味するが、上記のホモローガス領域に関する居準と合致
する限り、ネズミ、ブタ、ウマまたはランの如き供給源
から得られたP RT G F α種らP It T
G F−α種の定義範囲内に含まれるものである。し
かしながら、あらゆる場合において成熟TGF−αはヒ
トTGF−αを意味する。 PRTGF−6種因子の誘導体もこの語句の範囲内に含
まれる。誘導体には、アミノ酸配列の突然変異体、グリ
コンル化された変種、並びに他の化学成分との共有結合
または会合による複合物等が含まれろ。共有結合成形誘
q体は、PRTGFα種アミノ酸側鎖に見出される基、
またはN6+)るいはC末端と、機能的な成分との結合
によって製造される。これらの誘導体には、例えば以下
、)乙のか3よれろカルボキノ末端またはカルボキン側
鎖を含む残基(例えばasp32または49)の晰肪族
エステルまたはアミド誘導体;ヒドロキノJJ−含有残
基(例えば5er31 、5er3.5er42.5e
r156または5er94)の0−アシル誘導体;およ
びアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基(例えば
リジンまたはアルギニン)のN−アシル誘導体。 アノル基を、アルキル類(C3〜CIOの直鎖アルキル
を含む)の基から選択することにより、アルカノイル種
が生成され、炭素環式または異項環式化合物を選択する
ことにより、アロイル(aroyl)種n・生成されろ
。反応性の基は、それ自体が反応性の側鎖を介して不溶
性のマトリックスを形成し、ン差結合タンパク質として
用い得る様な二機能性・)化合物であることか好ましい
。 共有結合または会合性の誘導体はイムノアッセ(f:j
LIよアフィニチイ精製法における試薬として自゛用で
ある。例えば、PRTGF−α種は、自体周′fi+の
方法で、臭化ンアンー活性化セファa〜スに共a結合さ
Uて不溶化することにより、またはポリオレフィンの表
面に(グルタルアルデヒ!・交差結合の存在または非存
在下で)吸着させることにより、抗−PRTGF−α種
抗体または細胞表面の受容体を分析または精製するのに
用いることができる。また、PRTGF−α種を検出可
能な紙でラヘル(例えば、クロラミンT法による放射性
ヨウ素化、希」1類キレートとの)(何結合、または池
の蛍光物質との兵役)し、診断的な分析法、特に競合型
イムノアッセイによる生物学的資料中のl) RT G
F−α種しベルの診断に用いることができる。 1’ CF −a NおよびTGF−αcはTGF α
前駆体の一部に対する抗体を精製さUoるので、免疫源
(単独またはへテロローガスなタンパク質との免;ン学
的な複合タンパク質として)として有用である。TGI
−α前駆体を成熟TGF α、TGFαNおよびTGF
−αCから識別するための両側サンドウィッチ法による
特異的受容体結合分FLにおいては、分析に先立ち、ま
たはその途中で抗−T G F−αN抗体を固定し、肢
検試料を抗体と)1、にrンギ、1ヘ トし一ζ1記1
111駆体をそれと結合させ、次いでこの結合した前駆
体を抗−TGF−αCとイノキュヘート4゛る。この抗
−TGF−αCはインキュベーンコンの前に例えば放射
性ヨウ素でラベルするか、または後に、この抗−TGF
−αCか高められている種のIgGに向けられた標JI
gGとイノキュヘートする。 予め定められたPRTGF−6種フラグメントに2.+
、+゛る抗血清は、そのフラグメントをアオガイのヘ
モンアニノ(KLH)または血711アルプミノの如き
免疫原性タンパク質と、グルタルアルデヒドや無水コハ
ク酸塩の如き共有結合剤を用いて交差結合させ、マウス
またはウサギ等の適当な動物に通常の賦形剤と一緒に皮
下注射して免疫を付与し、必要ならば追加抗原刺激を行
い、しかる後抗血清を回収することにより、得ることが
できる。モノクローナル抗体は、免疫を得たマウスの牌
細胞から、通常の方法(例えばEBウィルスまたは細胞
融合による不死化)によって調製される。 成熟TGF−αの妨害を受けずにTGF−αCまた(よ
i’ C,F αNを測定するには、T G F
α0支たは゛rGF−αN分子の相反する末端の、予め
定められたフラグメントに対する抗血清を高め、この様
にして得られた2個の抗血清を用いて’r G F −
α11り躯体に関して記述した如くサンドウィッチ法で
分析する。例えば、TGF−αCの場合ならば、式(C
ys)aArg His Glu Lys P
ro 5erAla Leu Leu Lys
Gly Arg ThrΔ1a(Cys)b(
式中、aまたはbのいずれが一方(両方ではない)はl
である)で示されろ配列をKLHとジスルフィド結合を
介して共役(conjugate)させ、この共役結合
物によってウサギを免疫化する。 抗血清をとり、保存する。同様に、KLHと結合したT
GF−αC配列、His Cys Gly Tr
pCys Arg Ala Leu Ile
Cys Argに対し、pH6において無水コハク
酸を用いてウサギを免疫化する。これら2つの抗血清は
競合的な、またはサンドウィッチ法に基づくイムノアッ
セイにa用である。別法として、全TGF−αNまたは
TGF−αCポリペプチドに対してウサギを免疫化し、
3ポリペプチドを分析・4°る丸めの2つの抗血清を、
それらが互いにTGF−αNまたはTGF−αCとの結
合に際して競合的に阻害し合わない、ということに基づ
いて選択する。競合的に阻害する抗血清は、それに対ず
ろ抗血清が高めらイ1ているフラグメントを囲むタンパ
ク質と、該フラグメントとの識別が容易でない場合に、
このタンパク質を競合的に分析するのにq用である。T
GF−αmCは、尿の如き体液試料を使用し、TGF−
αC抗体の内の1つと、抗−成熟TGF−α抗体とを共
に用いて行う連続的な、あるいは同時の、サンドウィッ
チイムノアッセイにより、最も好都aに分析し得る。 1) Ri’ G F−α種には、天然の対を遺伝子性
の変異かq在し、あるしのから池への変異が起こるとい
うことが理解されよう。この様な変異は1まf二はそれ
以上のアミノ酸の欠失、置換または挿入によって示され
る。池の突然変異体は、PItTGF αfiDNAに
おけるサイト指令(配向)性の突然変異により生成され
た、P RT G F−α種の定められた形での変異体
である。 サイト指令性突然変異の目的は、より改善された特性お
よび活性を表すPRTGF α種の暗号1) N A
を組立てることにある。突然変異体PRTGF−α種と
は、それが欠失、置換または挿入のいずれかの原因でP
RT G F−α種のアミノ酸配列と異なる配列を有
するという点を除けば、前述のPRTGF−α種とのホ
モロジーに関する定義にあてはまる様なポリペプチドを
指すしのと定義する。例えば、第96または97位のり
ノン残基かヒスチジンまたは他のアミノ酸残基に突然変
異的に置き換われば、このタンパク質はもはやこの位置
でタンパク分解的に開裂されろことはない。 同様に、システィン・17.55.60.71.73お
よび/または82はセリンに置換され得るし、P RT
G F−αのカルボキシまたはアミノ末端は欠失され
得る。突然変異体はPflTGF−α種の生物学的特性
の全てをaする必要はないが、PRTGF・α種の抗体
と交差反応を行い得るエビトビツク部位(抗原決定部位
)を少なくとら1個は保1、’Jlていることを要11
°1゜ 本発明におけるPRTGF−α種突然変異にお:する突
然変異部位は予め決定されているので、本質的な突然変
異部位を011らって定め)てお、ぐ必要はない。例え
ば、4・71.5.5・、60.71.73まr二::
j、 t 2位での突然変異を適切に実行するために、
ノスティノコドンの位置で無作為な突然変異の誘t’−
X@・し、発現したPRTGF’−α穫突然変異体を生
物学的な活性と原核生物!r)槻胞内条件との適合性(
町ち直接発現での溶解性)との鏝適な組合h・せに関し
てスクリーンする。既知の配列を有するD N A内の
予め定めたtI5位に置換的な突然変異を生成させる技
術は良く知られている(IFlえばM13プライマーの
突然変異生成)か、本発明のサイズの小さいPRTGF
−α種により、予め定めた突然変異をHする所望のDN
Aを化学合成することが容易となる。 突然変異の誘発は、通常約1〜IOアミノ酸残基数のア
ミノ酸を挿入、あるいは約1〜30のアミノ酸残基数の
アミノ酸を欠失させることにより実施される。k3 G
ち的へ組1λ−ζに1゛ろために、p”i′換、欠失、
挿入あるいは一次的な併用(sabcomhinaLi
on)等を組合わU・ろことかできる。挿入にはアミノ
またはカルボキン末端での融合(例えば成、′7!IT
GF−αのC−またはN−末端に疎水性の延長部分を付
加する、こと)をも含G゛。明ら・かに、暗号化された
D・N、 A内(で0突然変異′におい・では、配列が
解読フレームの・外部に位置″してはならず、また、m
11NAの・二次構造を生ぜしめるおそれのある相捕的
な領域をall造する乙の・でないことが・好ましい。 PRTGP−α饅を暗号化しているD′NAにおける突
然変異のすべてが最終生g:物を構成するものではない
。例えば、DNAの挿入#T突然変異体の主な種類は、
ヘテロローガスな分泌型リーダー、または信号、がPR
TGF−α種のN末端に結合した乙のである。別法とし
て、本発明においては、非分泌型へテロローガスポリペ
プチドとのPRTGF−α種のN末端における融合を、
例えば臭化シアンまたは酵素を用いてその様なポリペプ
チドをPRTGF−α種から切り離して非メチオニル化
1)1じrGF α種をirJろ、という目的の場合
に行っことを考慮している。例えば、原核生物での発現
ベクターを組立てる場合には、E、coliアルカリ性
ホスファターゼまたは熱安定性エンテロトキンン■リー
ダーをPRTGF−α種配列の5゛位に、その解読フレ
ーム内において配する。酵母インバーターゼ、アルファ
因子または酸ホスファターゼリーダー類も同様に非メチ
オニル化PrtTGF−α種の酵母内での発現に用いる
ことができる。 しかしながら、天然のTGF−α前駆体の分泌型リーダ
ーはそれ自身の供給源である細胞以外の宿主(より高等
な真核生物の細胞培養において、最らぎり得ることだカ
リによって認識されるかもしれない。分泌型リーダーか
宿主によって“認識”されると、PRTGF−α種とリ
ーダーから成る融合タンパク質は、通常、PRTGF−
α種と問題の信号(これはPRTGF−α種を分泌させ
るよう導く)とが結合しているペプチド結合の位置で開
裂される。かくして、突然変異PRTGF−α種DNA
を宿主の13質転換に使用し、かつ中間体として突然変
異体prcl’lじl’Gli’α種(融合物)/J”
1成されたとしても、得られるPRTGF−α種は融合
物ではないことになる。 本明細書において、形質転換発育因子−β(TGF−β
)とは天然に存在するTGF=βの表現型(例えば、’
r c rx−αまたはEGF(表皮性発育因子)のア
ンカレッノイノディペンダントな増殖効果を増強する)
を有する、β型の形質転換発育因子を指す。 P RTG F−α種を暗号化しているDNAは、蛍光
性基、放射活性元素または化学発光性基の如き検出可能
な物質により、自体周知の方法で共有結合的にラヘルさ
れる。しかる後、これを通常のハイプリダイゼーノヨン
(雑種分子形成)分析に用いる。この分析法は、実施例
で述へる如<PRTGF−α種ベクターおよび形質転換
体の同定、あるいは腫瘍細胞中のPRTGF−α←hR
N Aのディチクトンとして、インビトロでの診断にf
り用される。 0外なことにPRTGF−α種に関するIn[tNAQ
・(r白はかなり、3ド11てJ′うろ、、その結果、
何を探し出すかを指摘されていないとcl)NAを見落
し弓いことになる。しかしなから、本明細吉中で開示し
た様に、一度その存在か理解され、補助DNAを完全に
入手することかi’+J能になれば、PRTG F
a 種cD N A/”、!?、NJ hli 的r;
配列ヲRt ルフローブに用いて腫瘍細胞のcDNA
ライブラリーをスクリーンすることは、日常的な操作に
すぎない。 P R′I’ G F −a種はPR’l’GF a種
を暗号中しているDNAを含んでいる発現ベクターによ
って形質転換された宿主細胞により生成される。発現ベ
クターの中には、宿主細胞と一緒になって該ヘタター中
に含まれているDNA配列(この様な配711はそれを
発現させるための他の配列と機能的に結合している)を
発現させることのできる様なベクターら含まれる。それ
らのベクターは宿主微生物内でエピゾームとして、また
は染色体DNAの組込み部分として、のいずれかの形で
複製され得なければならない。一般に、発現ベクターは
環状1ン二本鎖D N Aループのノ杉のプラスミドで
あり、ベクタ の状態では染色体と結合1−l己1.プ
ラスミドかベクターとして最ら’L’fIIliに用い
ら(1ているのて、本明細中では“プラスミドと“ヘタ
ター”とを相互変換的に用いることとする。しかし戸か
ら、本発明はその他の彩の発現ベクター(例えば共形質
転換ベクターやウィルス等、同等の機能を示す乙の)を
も包含するものである。 DNA領域はそれらか相互に機能的に関連していれば、
機能的に結合しているしのとするっ例えばプレ配列(p
resequence)または分泌型リーダーのための
DNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタ
ノパク質として発現されるならば、ポリペプチドのため
のDNAに機能的に結合しており、プロモーターは、そ
れが配列の転写をコントロールするならば暗号配列と機
能的に結合しており:リボゾーム結合部位は、それが翻
訳を行わせる様な位置にあれば暗号配列と機能的に結合
していることになる。−・般に、機能的な結合とは相接
していること、分泌型リーダーの場合には相接しており
、かつ解読相内にあることを、0味する。 @I換え宿゛1゛細胞とは、1記のへタタ で形質転換
された宿主細胞てめろ。既に明らかにした様に、この形
質転換によって、非形質転換宿主では、前記の如く掻く
少量、または、より一般的には検出しiすない程少量し
か生産されなかっ)= p RT c F −α←lを
大量に生産することができる。その様な細胞によって生
産されたPRTGF αを、組換えP RT G P
a種と称する。 1d主細胞の培養お上びベクター類 ここに開示するベクター類および方法は広範囲に及ふ原
核性、および真核性の微生物に用いるのに好適でのる。 勿論、原核生物が本発明に(1用なベクター類を4硫で
ろためのDNA配列のクローニングに好適であるという
ことは当fこり前のことである。例えば、E、 col
i K I 2菌株294(ATCCNo。 31446)は殊にq用である。その他の使用しi?J
ろ微生物の菌株には、E、colir3およびE、co
liX I 776(A′rCCNo、31537)が
含ま−れろ。これらの例は単なる例示に1゛き゛ず、制
限的な乙のでないことは1、うよ°ζ乙ない、。 我々が行った実験では、P It T G F α種
配列は、通常原核細胞の細胞質に不溶性の屈折性物体と
して析出するか、原核生物らまた発現に用いることがで
きる。これらは容易に回収し、可溶化させることができ
る。上記の菌株、B、 coli W3110(F−λ
−1原栄養体、ATCC27325)、並びにBaci
llus 5ubtilisの如き大腸菌類、その他
、Salmonella Lyphimuriumよた
はS errak 1a11arcescensの如き
腸内菌や様々なP seudomonas種の菌株ら用
い得る。 一般に、宿主細胞に適合し得る←■から誘導されたレプ
リコンおよびコントロール配列を含むプラスミドヘタク
ーを、これらの宿主と一緒に用いる。 普通、ベクターは、複製部位、並びに形質転換細胞内で
表現型に基づく選択性を付与し1すろ標識配列を有する
。例えば、E、coliは一般にE、coli種から導
かれたプラスミドであるpH1t322を用いて形質転
換される(55)。pH1t322はアンピノリンおよ
びテトラサイクリン耐性遺伝子を5′η(i’して(・
ろ・)で、杉質転換細胞を?−11に同定で3る7段を
提供オろらのてめろ。このpBl(322プラスミド、
あるいは他の微生物プラスミドはよf−1微生物かそ(
−L自身のタンパク質を発現さ什るf二めに[11用し
得るプロモーターを含C丁シ、または、τ白(−ろ株に
食′5前Iされていなければならない。客■換ん[)\
A ))組立てに最ら普通に用いられるプロモーターに
は、β ラクタマーゼ(ベニンリナーゼ)およびラクト
ースプロモーター系(53,72,92)並びにトリプ
トファン(trp)プロモーター系(67,93)か含
まれる。これらが最も普通に用いられる乙のでのるか、
その池の微生物プロモーターら発見されて使用されてお
り、それらの詳細なヌタレオヂド配列ら公開され、当業
者はそれらをプラスミトヘタターと機能的にライゲート
する二とかできろ(80)。 京核生物に加えて、酵母培養の如き真核性微生物ら用い
られる。酵母の成熟TGF−αの発現および分泌は細菌
よりも低レベルであるが、そのポリペプチドはE、co
liからの直接的な発現生産物と5′+1な−・て弓溶
Y1てど5ろ1.(“E +Jit’l微11物U)内
、S accharomyces cercvici
aeまたは通祁のパノ酵母か最も一般的に用いられるか
、その池多改の菌株ら言過に用い得る。S accha
romyces内で発現させるためには、例えばプラス
ミドYRp7(81,82,83)か通常用いられろ。 このプラスミドは既にtrpl遺伝子を含有しているの
で、トリプトファン中で増殖する能力を持たない、酵母
の突然変5!411i(例えばATCCNo、4407
6またはPEP 4−1 (84))に選択マーカーを
与えろ。 酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてLrpl障害があると
いうことは、形質転換体をトリブトフ7ノ不在で増hα
させることによって形質転換体を検出するのに有効な状
況か与えられることになる。 酵母用へフグ−の好適なプロモーティング配列には、以
下のらのに対するプロモーターか含まれる 3−ホスホ
グリセレート・キナーゼ(85)まf二はエノラーゼ、
グリセルアルデヒド−3−ホスホグリセレート・ムター
ゼ、ピルベート・キナーゼ、トリオースホスフェート・
イソメラーゼ、ホスホ′!ル:I ス・イツメラ ゼ、
グルコキナ ゼおよびα−ファクター等の他の解糖酵素
類(86,87)。 適当な発現プラスミドを組立てるためには、これらの遺
伝子と関連した終止配列を、発現ベクター中に、発現さ
せるべき所望の配列の3゛とライゲートさせて入れ、m
RN Aの末端、およびポリアデニル化部位を提供す
る。 その池、増殖条件によって転写がコントロールされろと
いう111点をざらにa4゛るプロモーターとして、ア
ルコール・デヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC1
酸ボスフアタ−ゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、前記
グリセルアルデヒド−3ホスフェ〜 ト・デヒドロゲナ
ーゼ、並びにマルトースおよびラクトースの利用に与る
酵素類(87)等に関するプロモーター領域か含まれる
。酵母と適合し得るプロモーター、;に製起源および終
+L配列を含f丁するブラスミトヘタターの全てが適す
る。 微生物の外に、多細胞生物から得た細胞の培養物らまj
−宿主として用いることかできる。培養がiY H1i
動物上たはI++t ONu動物のいずれから得られた
にUoよ、Itif則的にはその様な細fla11の4
“へてか機能し得る。しかしなから、a准動物の細胞に
より大きい関心が寄せられており、最返ては培地(組織
倍径)中でを椎動物細胞を増殖さぜ・ろことは、通常の
操作となっている(75)。その様なf1用な宿主細胞
系(セルライン)にはVEROおよびl−1eLa細胞
、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系、並び
にW+38、BHK、CO5〜7およびMDCK!11
胞系等が含まれる。その様な細胞のための発現ベクター
には、I!!i當(必要ならば)複製起源および発現さ
れるべきPRTGF−α唾配列の11q方に位置してい
るプロモーターか、所望のりボゾーム結合部位、RNA
スプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終止配
列等と共に含有されている。 咄乳類細胞内で使用するための発現ヘタター用のコント
ロール機能は、しばしばウィルス性物質によって供給さ
れる。例えば、普通用いられているプロモーターはポリ
オーマ、アデノウィルス2、および最らV4繁にはノミ
アンウィルス40(SV1())かり棉かイする。5V
llOウィルスのす刀期および後期のプロモーターは、
いずれら該ウィルスからフラグメントとして容易に得る
ことができ、しからSV40ウィルスの複製起源を含a
しているので特に有用である(88)。ウィルス性複製
起H内の、ll1nd[[1部位からBg11部位に向
けて延びる約250bpの配列が含まれている限り、大
きいまたは小さいSV40フラグメントを用いることか
−ζさ/S、、さらに、正常な状態で所望の遺伝子配“
り41・を伴っているプロモーターまたはコントロール
配列、を用(する、ことらでき、またしばしば好ましい
といえる。、ただし、その様なコントロール配列か宿主
細胞1系に適合性を有することを条件とする。 複製起源は、外来性の起源、SV40その(医のウィル
ス性起源(例えばポリオ−7、アデノ、VSV、B、P
V″J)を含t、−tにベクターを組立てるか、みるい
は宿主Mr@の染色体性膜製機構によって与えるか、い
ずれかの方法で付与される。もし乙ヘタターか宿主細胞
染色体に組込まれるならば、後置はしばしば充分に働く
。 ウィルス性;(3A起源を含(1するl\クタ を用い
「に、選択可能なマーカーおよびP r? T G F
α種DNAを用いた共形質転換法によ−て咄乳類細胞
を形質転換することもてきる。適当な選択oJ t&な
マーカーにはノヒトロ葉酸還l己酵木(I) II I
” R)かめる。PflTGF α種とD I−I
Fllの両押をそ 。 れぞれ暗号化しているD N A &!刈を含むベクタ
ーでトランスフェクトするのに好適な哺乳M宿主細胞を
選択するに際しては、用いるD l(I” Itlタン
パク質タイプに鎚って宿主を選択するのか適当であ、る
、。野生型・D)(・lタンパク質を用いる場合には、
DH・FR欠胤宿主細胞を選択するのか好ましく、かく
してヒボキサンチン、グリッツおよびチミジンを欠く選
択用培地・内で、Iシ足のいくトランスフェクンヨンを
選択するマーカーとして[)H’ FR暗号配列を用い
ることができる。この場合に好適な宿主細胞はD)(F
R活、性を欠くチャイニーズハムスターの卵巣(C,H
,O)・細胞系であって、これはU rlaauhj5
よびCkatji(+ 980 、 P roc−Xa
tlAcat、 5cE−(tJ S A)77 :、
42 L 6 )の方l去に上−・てA要し、増幅さU
・ることかできる。Altl転質はアメリカ特許第4,
399,216号に記載されている。この方法をPRT
GF−α種の合成のために、上記特許中に用いられてい
るゲノムまた:よβ−グロブリンDNAを、所望により
過当な合成リンカ−類を用いてPRTGF−α種配列を
暗号化しているDNAに置き換えることによって適用す
ることができる。 池方、メトトレキセート(M’rX)に対する結合の親
和性の低い、DHPRタンパク質の暗号化DNAをコン
トロール配列に用いる場合には、DHF R耐性細胞を
用いろ必要はない。何故ならば突′!へ変%D HF
RはM T X耐性であるので、宕主細qa自身かMT
X感受性であることを条件として、M T X含角゛培
地を選択の手段として用いることがてさろからてめる。 Ml”Xを吸着することのできる只核細胞の大多数は、
メトトレキセート感受性でめろと思イつれる。その様な
有用な細胞系の1つはCHO系、CHOKl(A1’C
CNo、’CGし61)である。 細胞培養からP It ’rG F’ a樟を回収4
゛ろ方法は、それらが可溶性タンパク質または屈折性の
物体(不溶性の会合体)のいずれの杉で発現されろかと
いうことに依存する。後者は通常、バクテリア(細菌)
性発現の場合であり、大多数の細胞内タノバク質は可溶
性であるために、精製は容易である。 可溶性PRTGF−α種は、もしそれが分泌型の宿主−
ベクター系で発現されれば(例えば、それが細菌または
酵母の分泌型リーダーと結合しているか、通常の信号配
列を合釘している全TGF−α前駆体配列で形質転換さ
れたを椎動物細胞系である様な場合)、その細胞培養か
らの回収はより容易なしのとなる。 可溶性PRTGF〜α種は、アルキル−セファ0−スク
ロマトグラフイー、ゲル濾過、ケル電気泳動、または、
固定化した抗体、または受容体を用いた受容体−結合ア
フィニティクロマトグラフィーを用いて精製することが
できる。 Φとに投与するためのPRTGF−α挿合q組成物は、
所望の精?J度のPRTGF−α種と生理、!的に;r
’?i I−fすろ担体(叩肱採用しfこ川l+1お
よび濃度において叫毒な担体)とを混合することにL−
)でJJi製される。これは、通常、P rF 1’
G Fα種と、緩衝剤、アスコルビン酸の如き抗酸化剤
、低分子量(残基数的lθ以下)のポリペプチド、タノ
ペク質、アミノ酸、グルコースよf二はデキストリフ等
の炭水化物、E D T Aの如きキレート剤、並びに
その他の安定剤および賦形剤とを混合することて11−
+′ンれろ。 夫fこ、動物に投与するための組成物としては、PRT
GF−α種の免疫性の共役化合物、又はPRTGF
α種の兵役化合物とPRTGF−α種に結合し得る抗体
から成るものがあり、前者は、特に診断用キットに用い
るために、抗体を高めることを目的とし、後者は抗−抗
体抗血清を生成させることを目的としている。 その様な組成物の投与経路は既知の方法に従う、例えば
静脈内、腹腔内、筋肉内、または滅菌しr二治療用溶液
の病巣内注入または注射、あるいは以下に述べる、時期
調整放出ノステムにより、没1j4′る。 r’RTGF−α種の組成物は植え込みか可能な、放出
時期を調整した(L imed −release)物
質から投与することかできる。その様な適当な系には、
例えばし−グルタミン酸とガノマエチル化−グルタミノ
酸の共重合体(U、 Sidmanら、l983、”b
iopoly+ners”22(1):547〜556
)、ポリ(2ヒドロキンエチル−メタクリレートXR,
L angerら、1981、”J 、 Biosed
、 Maker 1jcs、 −15:167〜27
7並びにR,Langer、 l 932、”Che
w、 Tech、 ” l 2 :98〜+ 05)
またはエチレンビニルアセテート(R,Langerら
、同上)が含まれる。この物質は、外科的部位または創
傷の上に植え込まれる。別法として、この組成物を注射
のために、半透膜のマイクロカプセルかりボゾーム内に
封入してらよい。 該組成物の投与量は、例えば投与経路、標的である疾患
および患者の状況によって左右される。 病巣内への注射においては、体重を基準とする組成物の
必要量は、静注に比べて少ないであろう。 随・て、l′に師は所望の最適なllV性が得られ、か
つ例えば標的組織の生検や診断分析によって測定し得る
様、用量を検定(titer)L、投与経路を修正する
必要がある。 TGF−αは潜在的な骨吸収剤である。従ってこれはこ
の目的において治療上有用である。このものは、注射、
注入、また放出時期を調整した方法によって投与し、用
量を血漿中のカルンウムイオノ値に従って検定(Lit
er)することができる:骨11ノを収を誘導・1゛る
には高カルシウム血症をもたらず111槍について検定
4−る。める1、者にとっては、逆、〕治療が適合する
。その様な患者とは、がんにかかり、ある種の腫瘍の場
合における如く、lll1瘍細抱によるPRTGF−α
種の生成に伴う高カルシウム血症を発現している患者で
ある。この様な患ざは、尿、血清または可能ならば外科
的に切離して得た腫Iullla中に正常値以上のi5
度でTGF−αff1CまたはTGF−αh仔在してい
ることによって診断される。規定の治療法は、その様な
患n達に抗’I” CF−α(またはその抗原−持Sv
的Fab部分)の如きTGF α中和剤あるいはE
G I”受容体(またはそのTGF−α−結合性のアミ
ノ末端細胞外領域)の如きTGF−α受容体を投与する
ことを含む。その方法・χ、選択されたTGF−α領域
に対する抗血清の製造に関して前に述べた。欠いて、そ
の様な患者の高カルンウム血症を是正する抗体の能力を
注射、注入または放出時期を調整した投与法に関してス
クリーンする。別法として、TGF−αまたは前述の如
く、その選択された領域に対して患とを免役化するごと
により、抗体を自己の内部で生成させることらできる。 EGF受容体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は既知
である(A 、 U 1lrichら、198 ・1年
3月、”Nature”309 :4 l 8〜425
)。更に、EGF受容体はA431表皮がん細胞から得
ることができ、一般に入手できる細胞系はその表面に、
大多数の他の型の細胞の10〜50倍らのEGF受容体
を何する。A431細胞はまた、細胞外に結合領域を持
つ、先端に切断された受容体を分泌する(A 、 U
1lrichら、同上)。いずれかのEGF1゛/i体
を、IIc知のノj法(M、 WaLt!rfield
ら、!982”J、 Ce1l Biochem、
”2 l O:l 49−161)、または当栗番周
知の同等手段(例えば、臭化ファンで活性化したセファ
ロース上に結合したE G Fに関ずろアフィニティク
ロマトグラフィーノに従−て精製オろ。それらを、滅菌
食塩水の如ご実学的に許容し得る担体中に、Llz入時
に遊離のTGF−αと結合して血清中のカルシウム値を
下げろIIな、治療1イ1°効なie1隻で含白さU゛
ることにより、製剤化する。治療上のa幼性は、高カル
シウム血症の軽減、または遊離TGF−α結合TGF−
α比を今日、血漿中の遊離チロキノンの測定に利用され
ているイムノアッセイと類似の方法で測定することによ
り、監視する。EGF受容体または1’ G F α
受容体(またはそのT G F−α結合領域)の使用は
、製造か容易でめろ点で抗体の使用より乙好ましい。し
かしながら、抗体は、それらを天?へに生した受容体よ
り乙大きい親和性に基づいて選択し1する、という利点
を存する。 採用した方法 強L!71で手ごわい細胞壁障害のない細胞をM Ig
il+胞として用いろ時には、リン酸力ルノウム沈降法
によってトラノスフエクノヨノを行う(89)。しかし
なから、DNAを細胞内に導入するための他の方法、例
えば核内注入またはプロトプラスト融合等、し用いるこ
とかできる。 実質的な細胞壁構造を打する原核細胞を用(・る場合の
好ましいトランスフエクノヨノ法は塩化カルシウムを用
い!ニカルシウム処理である(90)。 所望の暗号配列およびコノトロール配列を含有する適当
なベクターの組立てには、標準的なライゲーノヨン技術
を用いる。単離したプラスミドまlこはD N Aフラ
グメントを開裂、修復し、所望のプラスミドにとって望
ましい形に1耳ライケートする。 開裂は、適当な緩衝液中で制限酵素(類)を用いて行う
。一般に、約1μ9のプラスミドまたはDNAフラグメ
ントに対して、約20μQの緩衝液中て約1単位の酵素
を用いる。(特定の制限酵素にとって適当な緩衝液およ
び基質のへlは製造楽音によって明らかにされている。 )インキュベーノヨンの時間は、37℃において約1時
間が有効であろう。インキユヘーノヨンした後、フェノ
ールおよびクロロホルムでタンパク質を抽出し、水性画
分をエタノール沈殿に付して核酸を回収する。 粘着末端を必要とする場合には、調製したらのをポリメ
ラーゼI(クレノー)10単位と共に15℃で15分間
処理し、フェノール性クロロホルムで抽出しL後、エタ
ノール沈殿に付す。 開裂したフラグメントのサイズ(大きさ)によるで・7
離は、しばしば6%ポリアクリルアミドゲルにkil、
行なわれる(Gocddclら、67)。 ラヂケーノヨノに際しては、正確に合致する様に末端を
適当に修復した所望の成分を、DNA05μ9に対して
T ll l) NΔリガーゼを約IO単位の割合てI
IILIて処理ずろ。(開裂されたベクターを成分とし
て用いる場合には、該開裂ベクターを細菌性のアルカリ
性ホスフγターゼで前処理し、再うイゲーノヨンを防止
しておくことか行用であろう。) プラスミド中に組立てられたiE確な配列を確認するに
は、ライゲーノヨノミゾクスを用いてEcoli K
l 2l株294(ATCC31446)を形質転換
し、満足すべき形質転換体をアンピノリンまたはテトラ
サイクリン耐性について適当なところで選択する。形質
転換体からのプラスミドをi−t、これを制限酵素法お
よび/または配列決定法により分計する(45.91)
。 好ましい@様の一般的な説明 及敷鯉 以下に示i−実施例は例示をLノ的としており、本発明
を制限するしのではない。二5う実施例においでは、店
主細胞培養としてE、coliの店主細胞培養を用いた
。しかしながら、本発明方法には池の真核および原核生
物の細胞ら同様に通出性を(=rする。 I。11訂府−α特51iiIyLゲノムDi’q−A
然〔l−)の単線 TGF−α遺伝子の!−1!離は合成オリゴヌクレオチ
ドを用いた特y4的ハイブリダイゼーノヨノに基ノと、
二(1らのブ〔l ブは第1[4に示、+如<、 ヒト
T G F αの(1定の部分的アミノ酸配列に基つ
いて定められている。 最近、特質的DNA配列を、多くの組合わせ上、)誤り
(ミスマツチ)を白°する長い合成オリゴヌクレオチド
を用いて、あまり厳r6てない条件下のハイブリグイゼ
ーノヨノによってcDNAよたはデフ1ムD N 、A
ライブラリーから単離し得ることか示s X=、 j:
、、この方法(よ、アメリカ特許出願番号第501.
351号、1983年6月6日出願(EPO出願番号第
84.3037847号)に記載の如く、ヒトーインン
ユリン様発育因子lの几めの遺伝j−の検出において成
功を収めた方法である。同じ方法を、ヒトTGF−αを
暗号化しているDNAの単離において試みた。この目的
のために、2藺の長いオリゴヌクレオチドを合成した(
第1図)。 ・117−(41ff1体)はアミノ酸12〜25の暗
号配列に相当し、他方487−(48徹体)はアミノl
i!21〜16の暗号配列に対して相捕的である。各ア
ミノ酸には数個の異なるコドンか対応し得るのて、この
1リゴヌクし・オチトノl 7’H1V’+いメケレ(
子1・は、ヒトml工NAに幅在して認められているコ
ドンを基に選択した(94)。なお、複数のCpGノヌ
クレオチトの存在は避けた。41マーと487−の3゛
末端はI5残括の長さにわたって相捕的てうろため、こ
れら両オリゴヌクレオチドを准種分子形成し、それらを
鳥類の骨髄性芽球症ウィルス(AMV)の逆転写酵素で
延長し、二重鎖747−を調製゛4゛ることかてきる。 これらの長鎖オリゴヌクレオチドに加えて、2個の14
7−も合成した。I4マーの4つの部分(ブール)、即
ら、IA、n、CおよびDと呼称される部分はアミノ酸
5〜9に関して可能なコドンの全てに一ノいて相捕的で
ある。同様に、147−の池の4つの部分(2A−Dと
命名)はアミノ酸15〜19に対応する。 第1図に示したこれらのオリゴヌクレオチドは、ヒトT
GF−αのためのDNA配列を検出する目的でハイブリ
ダイゼーション・プローブとして用いた。これらのオリ
ゴヌクレオチドはヒトTGFαのための部分的なアミノ
酸配列(35)と関連さUで設計されており、同相トリ
エステル法(38,39)を用いて合成された。 41マー、48マーおよびI47−を、反応ミックス(
7(1mM)リス−)1cI(叶■76)、10−MM
gCLおよび5IIIMノチオトレイトールを含有)中
、37℃において30分間、γ−”P−ATPとポリヌ
クレオチドキナーゼを用いて5゛位で標識化した。また
等モル量の4Iマーと48マーとを、z5μaのミック
ス(105mMトリス−HCI(pH83)、l=10
mMKCI、50mMMgcLおよび210mMβ−メ
ルカプトエタノールを合釘)中において70°Cで5分
間加熱し、その後30分1川をかけて室温まで徐々に冷
却することにより、74マーを調製しf二。次いで、こ
れらのアニールしたオリゴヌクレオチドに、dTTf)
とdGTPとを10mMになるまで、150μCiづつ
のa−32P−dl\′1゛Pわよびα〜”P−dCT
P、更に80単6γのA X4V逆転写酵素を加えて全
容外を70μeとずろことにより、二重鎖の放射l&性
−ラヘル747にしf二。37℃で30分間インキュベ
ーノジノした。次いでラベルされていない(iΔ1’P
および(ICTPを10mMになるまで加え、!5分間
反応を進行させた。5ephadex G50 5u
perfineとのクロマトグラフィーにより、この〕
1イプリダイゼーションプローブから、取り込まれなか
ったヌクレオチド・トリホスフェートを分離した。 当初は、ヒト黒色腫細胞系A2058(5,34)(こ
れは、TGF−αを精製するための供給源として用いら
れていた)からのmRNAから導かれたCDNAライブ
リーより、TGF−α特異的クローノを単離することに
Sl一点か合わされていた。14マー、41マーおよび
747−による広範囲に及ぶスクリーニングによってい
くつかの堆種分子彩成に係るcDNAを単離することか
てき、これらを配列決定に付したところTGF αと
無関係でめった。これか不成功であったので、λシャロ
ン4Aフアーノ(40)内に含有されているヒト−ゲノ
ムDNAライブラリー中にTGF−α遺伝子を捜すこと
を決定した。約7.5XIO’のファージを、5゛位を
tPでラベルした4Iマーとノ\イブ・1ノ(七 ノー
2)−(ろことによ姦)、スタリーノし、−ら+−−、
+5支験で(i、同数J)イII換え一ノフーノを、こ
、!−ら組換え人ファー7を二1・[Jセルロース−フ
ィルター(95)にの仕、レプリカOH製)牢板培にし
、孜射活性(票識化717 と)\イブリダイゼノヨノ
ー(る二と、こより、スリリ−)しf4c これ、−、
)ス々リーニンクの結果、lI lマーわよび/まr二
:よ74マーとw1種分子を形成した35個の組換K
A ’ ””/を検出、ljjl 11.、 357−
y−ノ全てD・らDNAを煩離しfこ。6♀1)換えλ
DNAについて、417−1747−1・187−4し
びに1・1マーのプールl A −Dおよび2 A −
oとのハイブリグイゼーノヨンを“ドツト−プロット”
法(13)(こより、調・\f−0こ1tらのEli離
ファーノDさ;Aの内、とれら明確には48マーまl二
はブールIA−Dと准種!アナ子を形成し戸かっrこか
、147−プーJし2\−Dの混合物と:よ、約1/2
のD N Aか幾′叶1)・、)ハイブリダイセーノヨ
ノを示しr二。 1!マー、487−および74マーを、5X(51=:
+s S C(l X S S C= O、l 5MN
acl、001′5\1り」゛/酸−Ij・リウム)1
.Iび)・1月・nhqr;It、′、二、I&(l<
l)t:nhardt溶子シー+1.1”61’icす
il、O1%ポリヒニルビu jl 1;/、01θ5
C゛1ノ皿ji7アルフミノ、20%ホルムアζ1・)
および50μ7/−QJ)超ご液処理しfこ鮭精(−D
N A中て准唾分子形戎)′こ付しl二。 フィルターを・12°Cて2時間、ブレバイブ!1グイ
ズしfこ後、熱変性さu′fニブローフを加え、42°
Cて15〜20時間ハイブリy(七 /:1)をイJ几
。フィルターを1xsscおよび01%5l)Sて順次
、広範囲に洗浄しf:(37”C)。147−をプロー
ブに用いた場合には、2時間のプレハイブリダイゼーノ
ヨノおよび15時間のハイブリダイセーノヨノを、6X
SSC,0,5%NPIO16mM EDTA、I X
Denhardk溶液および50μff/′マσ鮭***
DNA中、37°Cて行っr為次いて、GXSSC中で
、室温で敢回洗11トシた。 、117−および147−2ADと。)ハイブリグイゼ
ーノ3ノの程度を、ハイブリダイズ57−f二“トノト
ープロット”ニトロセルロースフィルター’i−,IV
i次厳シQ /J’ 1t11められろ条f’lドで洗
/T#4−ることにより評11i1i L rこ。この
ことは、後続の分(4jに適用セへき潜α的な候浦とし
て考慮されるファーツノ)改を、更に制限するためにイ
rなわ4を几。この評価に括ついて12個のファージを
配り11決定のLめ(こ8択しl二つこれらのファージ
D N AをBamHI、1−1 ind[I ′):
fこはこれら両酵素の併用、によって消化し、フラグメ
ントをアガロースゲル上で分離し117−または14マ
ープ〜ル21\−りとハイブリダイズしているファージ
D N Aをサザ〜ノ分lr I’、 44 )に付す
ことで、いずれかのプローブとハイブリダイズしている
配タリは、同一のD N Aセグメント1こ局在してい
ることかねかつf二。各ファージ[)\Aの、ハイブリ
ダイズしたBamHlまたは11ind[lIlフラグ
メント、次いてプラスミドpBR:322にサブクロー
ノしたつ二カキメラブラスミrを、エツトヌクレアーゼ
5au3Al、11sa[ま7: ! i両片、によっ
て順次開裂しf二。このフラグメントJ′)混合物をポ
リアクリルアミドゲルおよびアカ〔l スゲル1で分離
し、二1・(Iセル[7スーツイルター1−に序した。 ll lマーとのハイブリダイゼーノヨノにより、12
[AIのプラスミド全てに関し、2八イブリグイズした
小フラグメノトを同定しr為次いて、これらのフラグメ
ントを〜I13mp8またはmp9(45)にサブクロ
ーノし、それらのヌクレオチド配列をノデオキノヌクレ
オチド鎖末端決定法(4G)により、決定しf二。 ブラスミトノ内、p′rGF15 Iと命名5(1)
こプラスミドは、T G F αの最を月の33個の
アミノ酸の暗弓配列を有(2,180塩活村Q’)Sa
a3、八(フラグメント内に位置していることか明らつ
・i、= ii ッf二(第2図)。pT G F I
5−1 、’j#tl換ンフ7−ノλ15から導かれ
たlo、2Kbp(キロ塩基χ・t)BamHlフラグ
メントを含(1°している。:33番ト1のアミノ酸に
関するコトノの次にはさ3止コト/がある。その位置の
GT−7ヌタレオチトは、介住配刈の供与azbl−て
めろことを示、l′1,1′識てシ5ろ(=17)。I
−’ T G FIラ−1の制限的マノビノケ、および
それ以後の配シリ決定法(データーは記載りi’ i(
’、 1. i 、 S:+1: I A l
−ノラ ′fメ 、1・、ユii 7 (l b
pSaci frallフラグメノト1−に1v置し
、スプラ(X供与品位の下流におけるS au 3.A
I 1%i位はB281酵素の認識耶(1″Lでらあ
ることか小された。 ヒトTG F αの最初の331[/iのアミノ酸を
暗−j化しているエクソンを含わ゛、プラス(1・ll
TGF151ノ) l 80bpSaa37\−フラグ
メントのヌクレオチド配列11、および(1定のアミノ
酸配列をり+ 2 r<1に小4゛、K文′i、′ζ小
しIこ配り;1は′l″G12 αポリペプチドの一部
であり、小文字で示ヒr二配列(よ、前駆体においてT
GF αに先行しているアミノ酸配タリてうろ。矢印
は、cDhA配クリとの比較によ−・て決定された介α
配列の受容わよび供与部位を示している。、(下記参照
)。 二、)ヌクレオチド配列を綿密に検討することによ・〕
、1!マーがハイブリダイズし7J3の残基、よ、得ら
れたTGr” αD N A配列とホモローガスてめ
ろことかわD−ろ。14個のホモローブメスな塩基か連
続的に伸びている。48残梧の内37か十モローカスて
うろにら拘わら1′487−か顕著fコ’\(−/ I
I 7 (7: l−jir・戸・: /−f’l!I
ll:il’ll 、’+4−1: t、t: 1完全
なホモ〔1) (1111同性)を小・11・17−′
J)プールの内の1ってめる2Dは、明瞭すか極めて弱
いハイブリダイゼーノヨノを示しf二。14マーの′1
、八−1)とのハイブリダイゼ=7ヨノの欠如は、成、
訊′I″G F αの71ケに、最初に−F i++
1されていf二〇ツノでなくアスパラギン酸に関するコ
ト7ノノ・(T、在していたことに起因しているうこの
相違によって。 1・17−内に2−)の不適合(ミスマノチノヶ)/i
戊JII5か存在すること(こなっj=。 pTGF15−1の、単離されj二l 80bpSau
31〜1フラグメノトを、引き続き、111jに単離し
た35の組換えファージのドツトプロット分析(43)
におけるハイブリダイゼーノヨンプ〔J−ブとして用い
た。35のファージDNAの内5個かこのフラグメント
とハイブリダイズしr二。サザー7分析法によってそれ
ら全てか同一の、ハイブリダイズし+’=670bpS
acl −Bal lフラグメントを含有していること
が示されLo 2 約5000ヌクレオチド長さのTGF−αmRNA
1−1:己y−: ’61Hfuは、ヒト’I’ G
F +xを!’1′lXJ化しているケノム配タリか
介龜配クリによって中断されていることを、トシている
。完全な形の暗号配列をiする7こ0(二、i” G
F αエクソンを含むゲノム5acl−1(al17
ラグメノトを黒色腫細1泡系A 2058 j>\<Q
’)mlt\、\から導り−イーたcDNAライブラリ
ーのプローブに用いに。これらの試みら不成功てあっ、
rコのて、TGF αmRNAの供給源として、他の
細胞系を捜4゛ことか決定されノー。 広範囲に及ぶ種々の腫瘍a粗系D)ら抽出された佳々f
、h m It N 、+\のコレクノヨノを、ホルム
アルデヒI−7カロースゲル七の電気、水+J+(、l
l)およびTGF α特異的Sacl−Bgllフラ
グメントとの゛、ノ ザノ”ハイブリダイゼーノヨノ(
42)で調べた(デ ターは記載せず)。全ての細胞系
が、弱い、J、コらく非特異的な雑種分子形成にJみづ
くバット全、M にらこれらオリゴd′F−セルロース
選択mR\A山にll:αするリポブームRNAの28
Sの位置7に示しf−、′腎細胞腫から導かれた1つの
細胞系、1072F57:ま、288の位置に明瞭で強
いハ(ブリダイゼ ノジノLj’Lを小し、約・181
111〜5000のヌクレオチド長さの’rGlαnu
’tNAか(を在11゛ろことを示唆した。関連4°ろ
ポリペプチド、EGFらまた、約−t !! 00のヌ
クレオチド長さのm RN Aによって暗号化されてい
る(・18.49)。 このmRNAの一次の翻訳生産物はE G I−” :
’+:i駆体ポ躯体プチドで2うり、このものは、・;
1き続いて数個のポリペプチドへと処理されろか、そノ
)内の1−ノかE G I’である。 +(、TGF αを暗号化しているC D N Aの
手並ヒトTGF αに関する完全戸暗号配クリを含む
C11N Aを蛸離するfこめに、上記のa胞系かり1
1トAを単離した。ポリアデニル化m RN A分画を
、オリゴdT−セルロースクロマトグラフィーに吸収さ
せることによって単離しfこ(50)。常法通りcDN
AをA製しく5l−53)、dC−ホモポリマーで修復
しく54)、更にPSLIで線状化し、dG−テール化
(dG −La11ed)を行−1f41111311
322にアニールした(55)。E、co1i294(
54)における形質転換(56)を)fanahanの
高部−1111,法(58)・工)10・て行)ことに
、1、C)、:う1.)4のcl)NΔライブラリ を
得た。1つのライブラリーは、Ll’l’ l 2−1
8をプライマ〜とする(dT” l 2−18でプライ
ムされた)cDNAを含んでいたか、一方、池の2すの
ライブラリーは合成l67−dCATGCTGGCTT
GTCCTで、特異的にプライムされたcDNA合成法
によって、J^1製された。このオリゴヌクレオチドは
、pTGF15−lの長い180 bpSau3 A
I制限フラグメント内に含まれているTGF−αエクソ
ンから下流の領域(ヌクレオチF l 34〜149)
と相捕的である(第2図)。 プラスミドpTGF15〜1から調製した、放射活性−
標識TGF−α特異的5acl−Ball制限フラクメ
ノトを用いてQ性コσニーをスクリーンした(59)。 特異的にプライムされたcDNA合成によって調製され
た90.000の組換えEcoliクローンの内、唯1
111がこのプローブとハイブリダイズした。このプラ
スミド(pTGF−CIと呼称)を制限酵素分析に付し
たところ、そこには3IL!]のPst[フラグメント
が存在し、その内最短Ul 67 bp−/ラフl /
l−!1、p’s’ G l冒51.)1” G F
αエクソン中(ご乙1’+−(l’、 していろご
とか1引らかになった(第2図)。次いて約900bp
のcDNAの挿入を表している3個のPsclフラグメ
/1・を、M l 3mp8(45)にサブクローンし
、ノデオキノ鎖末端法(・16)による配列決定に付し
几。 プラスミドpTGF−CIのCDNA配?りとその推定
のアミノ酸配列を第3図に示t0 第3図はプラスミドpTGF−CI中に含まれているC
DNAのヌクレオチド配列並びに推定のアミノ酸配列を
示している。G−CテールがcDNAの両側に接して存
在する。ヌクレオチドは各ラインの下側に配されている
。ライン上の数字は、+11独のメチオニンかNH,−
末端を構成する七推定した場合のアミノ酸の位置を示し
ている。TGFαのアミノ酸配列は枠で囲まれており、
その両側にはAla−Valに富む配列(オーバーライ
ンで示した残基)か結合している。 ヌクレオチド配列を調べた結果、CDNAの合成はプラ
イマー(TGF−αエクソンの134〜11!I’ll
;°Ih1°ξ第2図)に特疋されろ1也NA配列てな
く、乙゛しろ、この特異的なオリゴヌクレオチドに泪当
する位置の下流から開始されていることが分かりた。さ
らに、cDNAの3゛末端の直ぐ下流にある遺伝子フラ
グメントを、組換えファージから単離しんところ、特異
的プライマーと似通った配列を有していなかった。従っ
て、このTGF−αcDNAは、ラノダム(無作為)な
cDNA合成開始状況下で生成したものであると推#1
l11される。TGF−αmRNAの二次構造かオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーノジノ、従って、特
異的なcDNAの合成開始を防げている可能性かめる。 CD N Aの配列およびpTGF15−1から得たゲ
ノムフラグメノトを直線状に示した図(第3図および第
2図)は、ゲノムD N A内にスプライス受容および
供与率位(47)が存在することを指摘している。l
80bpSauA Iフラグメント内に含ま利ているT
GF αエクソンの長さは、121bpでゐる(第2図
)。 認め得るTGF−αのアミノ酸配列から、cDNΔ配列
中の解読−ル ノ・か&1M !7さ41/、+ 、
lli’7 ’J配列は、1” OAを終止コドンとし
てヌクレオチド527で終わってJ5す、3゛非翻訳領
域の一部がこれに続いている。オープンリーディングフ
レームはcDNAの5°末端まて連続している。mRN
Aは約4800−5000のヌクレオチド長さを有する
ので、このcDNA上には、TGF−α11j駆体の暗
号配列の内、−1か存在していない可能性かある。しか
しながら、単独のメチオニン残基を指すATGコドコド
対して、Aか一3位で先行しており、また、その直後に
はGが続いているという点か重要である。この様な現象
は高等な真核生物の大多数のmRNA内の開始コドンの
特徴である(60)。更に、8位から18位までの配ク
リは、細胞からのタンパク質分泌に係る信号ペプチドの
疎水性中心(61)に題めて特徴的な配列である。、他
の信号配列(61−62)との比較により、ノブナルペ
プチダーゼによる開裂は、乙しこの配ソリか実際に信号
ペプチドを表しているならば、19位のAla、20位
のCysまたは22位の八laの後方て起ご・Sことが
小唆された。しかしなから、この単独のメチオニンをT
G F α前駆体の出発点に帰属することは、mR
NAの3°非翻訳配列が約4000ヌクレオチドという
通常でない長さを有する可能性のあることを意味する。 第3図のcDNA配列は、前駆体タンパク質のfこめの
より大きい暗号配列中にはめ込まれているヒトTGF−
αに関する完全なりNA配列を示している。ラット、マ
ウスおよびヒトのTGF−αに関する直接的なアミノ酸
分析により(27,35)、NH2−末端にVat−V
at配列のあることが明らかにされた。ポリペプチドの
長さが50アミノ酸長さであること、並びにラットおよ
びマウスの配列決定されたカルボキン末端に基づき、T
GF−αは88および89位のLeu−Ala残基で終
わっているといえる(第3図)。50アミノ酸長さのT
GF−αを生成さ仕るためには、アラニンおよびバリン
残基間のタンパク分解的な開裂が、アミノ−およびカル
ホキソー両末端で起こらなければならない。このNH,
−末端におけるAla−Valダイマ は、配列 V
、II Ala ΔI、1ノヘI、I V3
1Val中に位置しており、これはカルホキノ末端に見
られる配列+Ala−Val−Val−Ala−Ala
と非常によく似ている。この顕著な特異性に関連し、T
GF−α前駆体のタンパク分解的な処理に関与するプロ
テアーゼは未だ記載されていない。 ここに、腎細胞腫から導かれたcDN、Aおよび健常な
胎児の肝臓から導かれたゲノムライブラリーから単離し
た遺伝子フラグメント(40)において、TGF−αに
関する完全な暗号配列が決定された。両配列は同一であ
り、これら両供給源内でのTGF−α遺伝子間には暗号
の相違が無いことを示唆している。 また、TGF−αに関するDNA暗号配列が確立された
ことにより(第3図径照)、この遺伝子を文献記載(3
8,39)の常法を用いて合成することが可能である。 TGF−α前駆体に関する推定のアミノ酸配列から、5
0アミノ酸から成るTGF−αのカルホキノ末端から2
0アミノ酸下流を始点とする、非’7:’+に疎水性の
領域かあることが明らかになった。 これら103〜+21の残基は、その殆んどがロイノン
、イソロイノンおよびバリンで占められている。118
番目のアミノ酸から前駆体ポリペプチドのカルボキノ末
端までの配列は、著しくシスティンに富んでいる。この
42個のアミノ酸配列中には8個のシスティンが含まれ
ており、その内4個は集まって対になっている。このシ
スティンに富む配列は生物学的に活性なポリペプチドを
構成している可能性がある。今までのところ、どの様に
してこのペプチドが前駆体分子から開裂されるかという
ことは推測にしかすぎない。幾つかのポリペプチドホル
モンはより大きい前駆体として合成され、通常、対にな
った塩基性のアミノ酸で結合されている。96−97位
のLys−Lys残基は、プレプロエンケファリン(6
164)、カルノトニノ前駆K(65)およびコルテコ
トロ躯体−β−リポタンパク質前駆体(66)の場合の
様に、タンパク分解的な開裂の作用部位であるからしれ
ζい。 ゲル濾過分析により、概算の分子量か10〜23キロダ
ルトンである大きいTGF−αが数個存在することか示
された(1.5.22.28.29.30.33.34
)。これらの大きいTGF−αの本質は未知である。T
GF−αを暗号化している数個の関連遺伝子かゲノム内
に存在しているのからしれない。しかしながら、全ヒト
−ゲノムDNAと、pTGFI5−1のl 80 bp
Sau3 A lフラグメント並びに670bpSac
l−Ballフラグメノトとのサザーンハイブリダイゼ
ーノヨノ(44)によっては、曳数遺伝子の存在は明ら
かにされなかった。あるいは、これら大きいT G F
の内、幾つかに関してはその本質を、前駆体分子におけ
る翻訳後の処理型が異なることて説明することかできる
からしれない。また、TGF−αが他のタンパク質類と
凝集することによって、見かけ上の分子ら1が大きくな
る可能性らある。 4 、 E、 coli てのTGF−aの =−’
r G F−αは、多くの腫瘍細胞によって、少量が生
産される。実際、TGF−αの“オーバープロ−1”ユ
サ ”て−)ろとさ、!1.ている黒色腫細胞系A2
058 ;’)培養物から得rコLKJ、、&l 36
Qから1.5μ9の、小さいT G F α←lか
単離されたにオぎない(34)。この様に、細胞培養か
らのTGF’ α人丁釘か極めて低いことか、その生
物学的な確認を妨げている。これらの研究を容易にする
ために、E、coli内でのヒトTGF αの合成が
追求されて、ニア=、TGF−αを暗号化した配列は前
駆体の中にはy)込まれているので、我々は該N号配列
のl1Fi方に開始コドンを、後方に終止コドンを導入
しLo この開始コドンにはEcoR1認識部位が先行
し、終止コドンにはBglI[部位が後続しているので
、TGF−α配列はボータプルなEcoRI −BgI
I制限フラグメノトとして利用することか可能となる(
第4図)。 TGF αはE、coli中で、ヒトーソマトスタチ
ノ(72)、インツユリン(73)およびデスアセチル
チモノンーα[(74)と同様な方法で、異なる融合タ
ンペク質の一部として発現された。これら後との場合に
は、成熟タンパク質を臭化ファンを用いて融合タンパク
質から開裂さけろこと更で3た。この化学的処理によっ
て、融合タノバク質し)先端部分と成熟ポリペプチドと
を連結するために導入されたメチオニノ残括の後方で↑
+r異的な開裂か起きた(72)。TGF−αの暗号配
列およびそれに先行4−ろメヂオニノコトノが、trp
リーダーとLrpEの融合タンパク質(trp△LEI
=l13.76)の先端部分と、EcoRI部位で連結
されている様な2四のプラスミドか組立てらA−rこ。 この融合タンパク質の発現は、 trpリーダーのりポ
ゾーム結合配列を用いて、lrpブロモ〜ターのコント
ロール下に置かれている。発現プラスミドpTE6の場
合には、このTrpΔLE1413融合タンI・;り質
の最・初の190個のアミノ酸配列(数個の7ステイン
残基を含む)かフレーム内でTGF。 α配りリと連結され、終止コドンか後続している。 プラスミドpTE5ては、TGF αI) N A配
列に対して、このcrpLE融合タンベク質の最初の1
7個のアミノ酸のみについての暗号配列が先行している
。この17アミノ酸の延長部分にはノステイ7ノノ・1
)よれていないので、このN11.末端が、発現されf
ニタンパク質のノスルフイト結合に影響を峻は°ずこと
はおそらくないであろうといえる(第5a図)。いずれ
の場合にも、1” CF−αの暗号配711の先端にメ
チオニノット/カイを在しているので、臭化ファンによ
る開裂によって成熟TGF αが枚用されるっ 第4図は、TGF−α(第3図におけるアミノ酸1lO
−89)を、その下流の配列(第3図におけるアミノ酸
9(]−160)を伴って、あるいは伴わすに、発現さ
せるための、幾つかのプラスミドの’jll N7)て
方法を模式的に示す図である。制限的なマノビッグによ
って、pTc:FI5−1内で、TGF−αエク′ノン
を有するl 80bpSau3 A I −Bglil
フラグメントは、380bpPvull−5ma17ラ
グメノト内に含まれていることか明らかになった。 この後晋のフラグメントを単離し、変性した後、γ”P
−ATPで5゛標識化をijった合成オリゴヌクレオチ
ドd CA T G G T G G T G ’I’
CCCAT T ’r TとT4リガーゼのr7−α
下て復元させた。 この混合物にE、 coliDNAポリメラーゼ1クレ
ノーフラグメントを加え、thi合成を触媒さuf二(
67)。このプライマー修復法を用いることにより、C
ATG配列をT G F αの暗−吃配列の先端に桿
いた。次いでこの反応生成物をr3gllTで切断し、
ポリアクリルアミドケル電気泳動によって部分的なTG
F−α配列を含む130bpフラグメントを単離した。 ランFFN−β2DNA配列か短い合成りNAフラグメ
ントに置換されている外は発現プラスミドplFN−β
2 (pBo I F N β2)と本質的に同一であ
るプラスミドpYG12+を、そのj1i’−のEco
lj1部(Iγて切り開さ、E、coliDNAポリメ
ラーゼl(クレノーフラグメノト)でうめ、Bgl[l
で切断した。このヘタターに+3obpT” G F−
αフラグメントをライゲートオることにより、EcoR
l ffl!(nを回復した。こ1して得らイーたプラ
スシトはpTElと呼称された。 最?/Iの33個のアミノ酸を暗号化している配列を含
むl 30bpEcofll−I3glllillI限
7ラクメ:/トをp′l’ E +から単離し、テトラ
サイクリン耐性’r It’: l’、l’L: Jl
ilj 1:flすを+’; (1’ してし’ )’
a pF I F trp’69LJ 7 )、)35
0 bpRgl [1−13aIIlll iフラグメ
ント、「、よびl−:coltlわよびL3aml−1
iで切断しl二pINCv Pへl 3−33の大きい
ヘタタフラグメント(叩Zpl NCVC(78)、プ
ラスミノーゲン活性化CI)N、へ挿入体を含在してい
る)にライケートシ、・二。(1#らイtfコブラスミ
ドp’vE2は、111j記1rp几LE1413(7
6)融合タンパク質のN Hを末端、)I7アミノ酸を
暗号化している配列と、Ec。 It I imi位を介して連結しfこ、TGF α
の最初の33アミノ酸のr二めの配列を含有している。 TGF α配列を含有するl 30bpRI−Bg
l■フラグメノトを、まfこ、前記trpLE融合タン
パク質、7)最初の190のアミノ酸のための暗号配列
に連結しfこ。このプラスミド、pTE3は、pTEl
、)l 30bpRI−Bgl[lフラグメントをpF
IFtrpj69のBgl [1−Baaフラグメント
並びにpNC〜・151)のEcoRlおよびBamH
lで得た大きいフjのヘタターフラグメントにライゲー
ノジンする二と1こより1組立てられた。 、“1.:f、な”I’ G F α配シリを短し1
融合物として発現、1ろプラスミドを以トの如くにしで
得た。pTE2をその弔−のP SL I J’;よび
13g111部位で切断し、大きい方のフラグメントを
In離した。cDNAプラスミドpTGF−CI’rP
stl(第3図におけろ233位)jJよびAva[I
(第3図に才バする301位)てl/J l)開き、7
8bpTGl? α特異的フラグメントをit’llし
た。これら両フラグメノトを部分的に何1hli性を有
ずろオリゴヌクレオチドdGACCTCCT G G
CCT A AおよびdGATGTT、AGGCCAG
GAGの存在下においてライゲートした。これらのオリ
ゴマ〜はTGF α暗号配列の背後に終止コドンを導
入し、かつ、\wa11部位とBg1■部位とを連結す
る乙のである。得られたプラスミドはpTE5である。 プラスミドpTE6はtrpL[ε融合物の最初の19
0個のアミノ酸配列に関する完全な暗号配列を有してい
る。これは、TGF−aに特異的な520bp長さのE
coRl −Bam1−117ラグメノトを1)NCV
(51)のEcoRI−BamHlフラグメントの大き
い方にライゲートす・、lとに1.・てFjられた。ブ
ラスミF’ p TE 5およびpTE6からの短い、
または長い、TGF−α融合タンパク質の生成、並びに
Tea”遺伝子の発現は、trpプロモーターのコント
ロール下にある。 T G l” αのためのDNA配列を、その下流に1
i18結している暗号配列と一渚に、直接的に発現させ
るLめに、プラスミドXAP−PA2を単一のXba口
〕よび8g1111位て開裂し、大きい方のヘタターフ
ラグメントを単離した(図4d)。XAP−Pへ2:よ
、IFN βcDNA配列り叱ト組織のブラスミノ−ゲ
ノ活性化物質のためのcDNA配レリとしjj l’i
j Sれでいる外はpF I F trp69 (67
)と本質的に同様のプラスミドであり、プラスミドpt
PALIpI 2(70)内の如く修飾されており、
り・−ノ、′reLRIR伝子の下流のG −11bp
Ava I −pVしnフラグメントを欠失している。 更に、pTEl1ノ)ら、′r G F−α配列の始め
の部分を含む70bpXbalおよびBgl[lフラグ
メントを、モしてpTG F −CIから残りの暗号配
タリを含r丁シている315 bpPsL l −5a
u3 A lフラグメントをili離した。、3個のフ
ラグメントをライダ 1・し):、 i’j白れたプラ
スミド、pTElは、開始コドンによって先行された暗
号配列を、Lrpプロモーターのコントロール下にある
、EcoRl −13g1 [1フラグメ/トとして含
f1゛シている。 更に、プラスミドpTI4で直接的に発現させるために
、この暗号配列をtrpリーダータンパク質のNH,−
末端部分との融合タンパク質として発現さけることを計
画した。そこで、350bp長さの′rGF−α特異的
Pstl−Bgl[I7ラグメノトをpTrシ4からI
ii離し、プラスミドpt”C2の大きいPsL−Ug
lrlフラグメノトにライダ=−)Lrこ。 iすられたプラスミドをpTE7と命名した。別法とし
て、pTElのTGF−α配りリを含¥J゛4−るEc
。 1i l −j3amH[フラグメントをpi” E
3の大きい1℃colt I −BamHlフラグメン
トにライゲートし、プラスミドpTE8を得た。プラス
ミドpT E 7およびpTE8はTGF αD N
A配タリを含有しており、しからその下流の暗号配列は
、それぞれ、L「pLE1413融合タンパク質(76
)の最初の1711・(口90個(ハアミノ酸に連結(
結合)(、ζいろ。 これらの配列のライゲーノジノはEcofj1部位で起
こり、この1Eco+?1部位の次にはメチオニ)の1
−めのコドン、A T Gが存在している。TGF−α
配グ11の先端にメチオニンが存在するので、この残居
の背後で融合タンパク質を特異的に開裂させることが可
能である。 制限酵素類はN ew E ngland B 1
olabsまたは、11t1th
ヒト形質転換発育因子−α前駆物質およびそのフラグメ
ント、特に成熟−ヒト形質転換発育因子α(’1’ C
F−α)1.11びにその新規な製剤ね10組成物、さ
らには、それらを治療および/または診断用に均一な状
態で大量に生産する方法に関する。 本発明は、望ましくないタンパク質を含んだ天然の物質
を、極く少量しか得ることができなかった従来の方法、
即ち、既存の細胞培養中で生産し、抽出する単離法と比
較して、高純度の物質を大量に生産することのできる方
法を堤供するものである。 本明細盲中で言及した文献およびその他の物質は詳細な
説明中に参照例として挿入し、更に、便宜上、記載順に
番号を付し、それぞれ文献目録中にまとめて示した。 発明の技術的背景 F3’lt転換発育因子類(TGFIllm)は、正常
細胞における表現型の(フエノティピカルな)形質転換
を可逆的な方法で支配する因子である。TGFを投与す
ると、正常細胞のコントロールされていない増殖が刺激
され、また軟寒天中の形質転換細胞の形成状態を測定し
た結果、アンカレッジ・インディベンダンス(anch
orage 1lIdependence)が増加する
ことが示された(l−3)。2種類のTGFが識別され
た。TGF−αは広範なヒトまたはゲブ歯類起源のU瘍
細胞から分泌される(4−7)。TGF−αおよび表皮
性発育因子(EGF)は同じ受容体を競合しく5.8.
9)、この受容体は、TGF−αまたはEGFの結合後
、チロシン残基の位置でリン酸分解される(10−11
)。TGF−αに特異的−他の受容体の存在を提示する
幾つかの証拠があろ(12)。TGF−αによるアンカ
レッジ・インディベンダンスな増殖はTGF−βによっ
て著しく補強される(13.14)。この後行のTGF
は多くの正常細胞および腫瘍細胞中に検出されており(
13〜+7)、しん腎臓(I8)、胎盤(I9)および
血小板(20)から精製されている。TGF−βはEG
F受容体と結合しないとされており、まf二、自身の形
質転換活性またはNRK細胞活性のfこめにEGFま几
はTGF−αを必要とする、と信しられている。 TGFIの生物学的な役割は未だ明瞭に解明されていな
い。多くの研究がTGPI[が形質転換1こおいて重要
な役割を果たしていることを示唆している。レトロウィ
ルス(21〜24)、S V 40 C25)またはポ
リオーマウィルス(26)における細胞形質転換におい
てTGF−αが分泌されていることが示された。細胞形
質転換におけろTGF分泌の密接な係り合いはポリオー
マウィルスDNAのトランスフェクション実験で示され
た。即ち、ミドルT抗原についてのDNAセグメントの
導入が、形質転換された表現型、およびTGF分泌の両
番を誘導するのに必要かつ十分な条件であることが示さ
れた(26)。K 1rstenのネズミ肉腫ウィルス
の熱感受性突然変異体を用いた形質転換に関する研究に
おいてら、表現型の形質転換が許容温度で起こった場合
にのみTGF−αが分泌されることが指示された(21
)。加えて、最近の研究によると、クローンされたT2
4膀胱がん遺伝子の導入でTGFの生産が誘導されるこ
とが示されている(27)。腫瘍の進行との生物学的な
関連性は、健常人χ・i照との比較にjjいて、11・
[!患との尿中に)ヱTGF−αの活性てあろ、と同定
される活性が削性することによって6暗示されている(
28〜30)。しかしながら、採用された分析法ではE
GFの如き池の発育因子の活性を区別し得なかっf二か
らしれない。これら、またはその他の観察の結果は、T
GF αが自己分泌(autosecrine)機構を
介して腫瘍形成に関与し、そのことによってTGFff
iが形質転換細胞から分泌され、そして同様の細胞集団
においてこれらの形質転換された特性を維持し、刺激す
る、ということを示唆している(31〜32)。しかし
ながら、腫瘍細胞がTGFαとβの両者を分泌するとい
うことから示唆される様に、TGF−βの増強作用か必
要からしれない(14)。この様に、TGF−αは腫瘍
の形成期間における極めて強力なエフェクター分子であ
り得る。 TGF−αのヘテロローガスな(異種の)分子種は、腫
瘍細胞からの抽出物および上澄み(5,12゜22.3
3〜34)並びに尿中(28〜30)のらのについて報
告されζいる。約7キしIクルトノUノ小さいものか、
ゲ、l歯類(27,35)およびヒト(24゜35)の
両細胞供給源に関して精製されfこ。このラットおよび
マウスのT G F−αについてのアミノ酸配列決定に
よって、これはEGFと幾分かのホモロノー(homo
logy)を示すことかねかっj二(27゜35)。報
告されたヒトTGF−αの部分的なポリペプチド配列は
、ラットおよびネズミ種のそれと強いホモロノー関係に
あることを示している(35)。 転移性の腎細胞腫患者では進行性の骨の脱仄か起こり、
それが体液性の高カルシウム血症に反映されていること
か観察された(36)。不純なタンパク質製剤を用いて
行なわれた最近の研究によると、形質転換発育因子(T
QF−αを含む)は組織培養系で骨吸収を若起すること
が示唆された(37)。 ウィルスによる細胞の形質転換では、TGF〜αは上記
の治療または診断用薬として用いるには非実用的な、限
られた量しか生産されない。 組換えDNA技術 ヘテロローガスなタンパク質、即ち、ある細胞か11゛
常状態ては産生しないタンパク質、は、外来性DNAに
よって形質転換された細胞によって生成される。これは
通常、外来性DNAをベクターの形で細胞内に導入する
ことによって達成される。 ベクターの構成要素、即ち、複製起源、1またはそれ以
上の表現型の選択特性、発現プロモーター、ヘテロロー
ガスな遺伝子挿入物およびベクターの残余部分、に関す
るDNA組換え操作は通常、宿1ミ細胞の外部で行なわ
れる。得られた複製可能な組みえ発現ビヒクル、または
プラスミド、を形質転換によって細胞に導入し、該形質
転換体を増殖さU゛て、大量の組換えビヒクルを得るこ
とかできる。遺伝子を、それが暗号化しているDNAメ
ッセーノの転写および翻訳を支配する部分に関して適切
に挿入することによって得られた発現ビヒクルは、挿入
した遺伝子か暗号化しているポリペプチド配列を実際に
生産するのに、また、発現の工程にとって、a用でd5
ろ。生産物は宿主細胞を溶解して該細胞内から得るか、
または分泌型生産物の場合には培地から得、しかる後適
当な精製法により不純物中から回収゛4′ることがてき
ろ。 魚吸Δ髪性 本発明は、組換えDNA技術を使用することにより、商
業化にとって必要な作業である動物実験および臨床実験
を開始し、行うのに充分な量の形質転換発育因子−α(
TGF−α)前駆体を得ることに成功したという発見に
基づいている。T G F’ −α前駆体およびそのフ
ラグメント(特に成熟TGF−αを乙含む)(所望によ
りヒト形質転換発育因子−βを併用する)は、例えばヒ
トにおけろ骨疾徹の治療および損傷の治癒の促進にfイ
用である。加えて、T G F−αは細胞培養の補助剤
として乙用いることかでき、その様にして培地中の自涜
の必要量を減少しくその結果、精製か何)りとなる)、
細胞培養内での細胞の増殖を刺激し、増大させることか
できる。また、TGF−α前駆体およびそのフラグメン
トの大組生産により、新生物その他の疾j、lを診断す
るための、体液中のTGF−α前駆体およびそのフラグ
メントの分計用試薬の製造か可能となる。 ′r G F n +iii駆体の完全なヌケレオチ
ドおよび対応するアミノ酸配列を第3図に示す。該前駆
体す)様々な主領域を同定するために、便宜上、3個の
ポリペプチド、即ち、成熟TGF−α(第3図において
、残基40から89までの、枠で囲んだ部分)、残基9
0〜160(主要部はC1n911からVa1160ま
での62残基からなるポリペプチド)のTGF−α末端
ポリペプチドであって、本明細書中てはTGF−αCと
弥するもの、並びにMe目DりらAla22までのTG
F−αN末端ポリペプチド(TGF−αN)、を定めた
。従って、TGF−α1ト1駆体は成熟TGF−αを含
むTGF−α担持ポリペプチドであり、TG’F−αと
その正常な非翻訳間pHとの融合によって得られるしの
である。更に、便宜上、本明細書中ではTGF〜α而駆
体お面びそのフラグメント(成熟TGF−α、TGF−
αCおよびTGF−αNを含む)を総括的にPRTGF
−α種(spec 1es)と呼称fる。TGF−aと
言うときは成熟TGF−αを意味することとする。また
、特に明記しない限り、PRTGF−α種という語句は
、以1・に、より詳1.<述へる様に、アミノ酸配列の
突然変異体の様なPRTGF−α種誘導体をも包含する
ものとする。本発明に包含される他のPRTGF−α種
フラグメントはTGF=αCと成熟’r G F−αか
ら成るらのである。このポリペプチド(TGF−amc
と呼称)は、残M20〜+60の間であって、TGF−
αN配列は信号としてのみ機能し、内質細網での処理の
間にTCP−amcから切離されると思われるので、該
TGF−αmCは吐乳類細胞内でのT G F−α前駆
体の発現の初期生産物であると信じられいてる。細胞内
での処理には幾分、変異があるので、これらの主領域は
インビボにおいては、アミノまたはカルボキノ末端と表
現される正確な状態では見出すことができないで李ろう
。 PRTGF−αフラグメントは通常、(a)一般にP
RT G F−αと共に何らかの生物学的活性、例えば
抗体交差反応またはアンカレッジ・インディペンダンス
の誘導、を表し、(b)PRTGF、αと実質的に相同
(homology)な領域を存し、そして、(C)少
なくと65個、通常は10〜130個のアミノ酸残基の
長さを有する。 本発明は、これまで同定されていなかった、TGF−α
Nおよび1’CF−αCの如きPRTGF−αのポリペ
プチドフラグメノトを分析する方法を提供する乙のであ
り、更に詳しくはこれらの配列の部分を包囲または包含
している他のペプチドの妨害を受けることなく分析を行
う方法を提供するしのでめろ。 本発明により、PRT’GF−α種のアミノ酸配タリを
知ることかできたので、予め決定されたPRT G F
−α唾のアミノ配列に対する抗体を生産さけろことか初
めて可能となったのである。PRTGF−α種フラグメ
ント(TGF−αを除く)を示すアミノ酸配列はタンパ
ク質と免役学的な共役関係で結合し、従って動物に免疫
を付与するのに用いられろ。その様な抗体はr’nTG
F−α種に特異的なイムノアッセイや受身免疫療法にお
いて有用でるる。 また本発明は実質上純粋なPlで1’GP−α種であっ
て、1ffi常、非組換え細胞雰囲気トては01(jL
。 ている不純物等を含まないPRTGF−α種を提供する
ものである。その様な不純物は天然に、正常な状態でT
GF−α七−緒に見出される物質、例えば、細胞内では
細胞滲出物や体液、さらにヒト血清アルブミン、ガンマ
グロブリノ、リポタンパク質、並びに表皮性発育因子(
EGF)を含む発育因子等である。PItTGF−αF
IiDNAの供給椋から得られる他のタンパク質ら本明
細書中に示すPRTGF−α種の組成物中に存在し得る
ものであり、それらは、例えばTGF−βおよび血小板
誘導性の発育因子(P D G F )であるか、ここ
では、これらは予め定めた量、存在することになろう。 例えば、非ヒト細胞内での組換え細胞培養により、1出
のヒトタンパク質を全く含まないTGFαを牛irする
ことができるからである。 本発明はまた、P It 1” G F a性を暗号
化したDNAを発現可能なして有する組換D N A発
現ヒヒクル、その槌なりNAで形質転換した微生物の株
または細胞倍径、・■びにそれら形質転換された菌株よ
l−は培貢物であ−で1月じl’ G l”−α種を生
産することができろ微生物または細胞培養、を鴇供する
ことを目的とするしのである。さらにまた本発明は、組
換え発酵法により、該微生物および!lI胞培毘内でP
RTGF・α種を製造する方法を提(共することを目的
とする乙のである。 本発明に係るDNAはPRTGF−α種を暗号化してお
り、組換えられた、または形質転換された培養物中で発
現することにより、PrtTGF−α種を大量に与える
。P R’r G f’ a種合成細胞からの5RN
Aの逆転写によって得られるcDNAはイントロン(介
在配列)を含まず、また、このDNAの供給源にとって
ホモローガスな他のタンパク質を暗号化している如何な
る非翻訳領域をも含んでいないので、上記のDNAは新
規なものといえろ。 PRTGF−α種を暗号化している染色体IT)NAは
、ゲノムDNAライブラリーを、PRTGF−α種を暗
号化しているcDNAでプローブすることにより得られ
るヵ染色体DNAは、それ自身の通常な染色体雰囲気を
1杓ない状聾で得られろ。 従って、それは、ヒトTGF−α前駆体のゲノム暗ぢ配
クリには6個の明瞭なエクソンか含まれている故に、最
初のエクソンの5゛末端より上流の非翻訳領域、あるい
はゲノムDNAの供給源にホモローガスな別のタンパク
質を暗号化している最後のエクソンの3°末端から下流
の非翻訳領域を含まないがイントロンは含むことになる
。その様なりNAは本明細書中で述べる様に、哺乳類の
細胞を形質転換し、PRTGF−αを生産するのに有用
である。 単離したPRTGP−α種のDNAはヌクレオチドの置
換、欠失または挿入(ヌクレオチドの置換の場合には暗
号化されたアミノ酸配列を変化しないことを要すン4こ
よって容易1こ修飾され、その結果、PRTGF−αを
暗号化している新規なりN、A配列または、その配列上
の突然変異体を得ることができる。アミノ酸配列を変え
ずに修飾を施されたDNA配列は、選択した宿主−ベク
ター系でのPRTGF−g発現を高めるのにa用である
(fp4入ば′ヒト コドンをft′tRの宿主細6〕
ことって好ましル^コドンに突黙変ilさせた場合)。 これらの新規なりNA配列またはその7ラグメントをラ
ベル(標識化)L、PRTGP−α種を暗号化している
遺伝物1t(D N Aまたは*RNA)のへイブリダ
イゼーシプン(雑種分子形成)分析に用いろ。 PRTGF−ttM(DIJ1ti方法ハ、PrtTG
F4種を暗号化しているDNAをFM製可能(再生産可
能)なベクターにライゲート(結合)し、このベクター
を用いて宿主細laを形質転換し、この宿主細胞を培養
して該培養からPRTGF−αを回収する工程からなる
。この様にして製造することのできるPRTGF’−α
種には、TGF−α前駆体およびそのフラグメント(’
l’Gl?−αCおよびTGF−α等)、並びにその誘
導体、これには以下の各物質が含まれろ:(a)P R
T G F −α種(成熟T G I” ・αを含む)
か、ヘテロローガスなタンパク質またはポリペプチドと
、TGF−αのアミノおよび/またはカルボキン末端の
アミノ酸の位置で、ペプチド結合を介して結合してなる
、−合タンパク質、(b) Iまたは1以上のアミノs
@gの挿入または置換によるPRTGF−α種の突然変
異体および(C)上記の融合物質、フラグメント類また
は突然変異体等の、メチオニルまたは修飾したメチオニ
ル(ホルミルメチオニルまたはその他の保護メチオニル
)のアミノ末端付加誘導体、が含まれろ。 ヘテロローガスな分泌型リーダー配41(通常、所望の
宿主微生物にホモローガスなタンパク質から得られる信
号)と機能的に結合している、PRTGF−α種を暗号
化したDNAを含むベクター類を宿主細胞の形質転換に
用いる。得られたPRTGF−α種融合物で宿主細胞を
処理することによって、アミノ−末端メチオニルまたは
保護メチオニルを含まないPRTGF一種が分泌される
。 アミノ酸配列以外の変異に係るPrtTGP−α誘導体
ら本発明の範囲に含まれる。その様な誘導体は化学的な
成分との共有または凝集的な会合によって生成されてい
ることが特徴である。この誘導体は通常3クラスに分け
られる。塩類、側鎖ま1=1未喘’Aに対・するJ(イ
1結合的な修飾産物、並びに吸着によるコノブレックス
である。 r’ RT G F−α種か直接、組換え原核生物の培
養物中に蓄積された後(原核生物の信号配列との融合物
以外の形で)、それらを、水不溶性の屈折性の物体とし
ての物理的な形状または、変性に対するかなりの安定性
、のいずれかに基づいて池のタンパク質から分離する。 通常、原核生物培養物から不溶性の物質を回収し、この
不溶性の細胞汚物から屈折性の物体(PRTGF−α種
を含む)を分離し、次いでこの屈折性物体を可溶化する
。タンパク質の適切なホールディング(再屈折)を増大
させるために、上記の段階の後にグルクチオン処理を適
宜、行ってらよい。組換え真核生物細胞からのPRTG
F−α種は水溶性であるため再溶解を要しない、この場
合は、従来天然起源からPRTGF−α種を単離するの
に用いられていた常法に従って精製する。 組換え細胞の培養物から精製したPRTGF−α種を治
療に使用するために、生理学的に無毒な安定剤および賦
形剤と合わせ、凍結乾燥し−ζ坊ヒノに入れた投与剤形
にJAI製するか、または好ましくは水性製剤中に貯え
る。後とのことは、PRTGF−α種が分子中に優勢な
ジサルファイド結合を有しているために熱変性に対して
極めて安定である故に可能となる。別法として、PRT
GF−α種をポリマーマトリックス中に組込んで、埴込
み投与するか、外科的部位の上に取り付け(例えば包帯
中)、そのことによってPR′rGF a任か局所的に
高い濃度勾配で好期に放出される様にすることかできる
。 PRTGF−α種−含有組成物は、動物、特に組織の増
殖の促進を必要とする@青、に治療a効量を投与される
。適当な用量は治療に係る技術者にとって自明であろう
。 図面の説明 第1図はヒトTGF−α前駆体に関するDNA配列を検
出するためのハイブリダイゼーノジンプローブとして用
いられるオリゴヌクレオチドの配列式を示す模式図であ
る。 第2図はヒトl″CF−αの最初の33個のアミノ酸を
暗号化しているエクソンを含む、プラスミドp′rGI
”α15−1CI′)180bpsau3Aフラグメン
トのヌクレオチド配列を示す模式図である。 推定のアミノ酸配列も示されている。大文字で示しに配
列はTGF−αボリベプヂドの部分であり、小文字でタ
イプしたらのは1111駆体中の前記TGF−αのアミ
ノ酸配列を示している。矢印はcDNA配刈と0比較で
決定した介在配列の受容および供与部位であることを示
している。幾つかの過当な制限部位か指摘されている。 第3図はプラスミドpTCiF C1中に含まれている
CDNAのヌクレオチド配列並びに推定のアミノ酸配列
を示す模式図である。cDNAの両側はG−CテールQ
ail)と接している。ライン上の数字は、単一のメチ
オニンがNH2−末端を構成すると推定した場合のアミ
ノ酸の位置を示している。 TGF−αのアミノ酸配列は枠内に囲まれており、その
両側は、Ala−Valに富む配列(オーバーラインで
示した残基)と結合している。幾つかの適切な制限部位
が指摘されている。 第4図はプラスミドpTE1.2.3.4,5.6゜7
.8の組立て経路を表した模式図である。 第5図はTGF−α発現プラスミド、pTE5およびp
TE6を表す模式図であって、TaF−α融合タンパク
質のアミノ酸の連結部をも示している。 第6図は発現プラスミドpTE2、pTE3、pTE5
またはpTE6を含む、E、coliの全細胞溶解物の
5DS−13%ポリアクリルアミドゲル(79)による
電気泳動の結果を示す状態図である。 矢印はTGF α融合タンパク質を示す。右側の値はタ
ンパク質マーカーの位置を表す。 第7図は酸−エタノールー法で豊富にした細菌性の短い
TGF−α融合タンパク質の5DS−ポリアクリルアミ
ドゲル上の状態図である。このゲル内で、68残基のT
GF−α融合タンパク質は幅の広いバンド(矢印)とし
て移動した。右側の値は参考用のタンパク質マーカーの
位置を示している。 第8図はラノオリセプターアッセイにおける細菌PIT
G F tχの短い融合タンパン質と1I51−ラヘ
ルI> CFとの競合状聾を11−4−グラフであり(
実線)、文献記載(5,14,27)の方法に従って行
い、図式的に表しLものである。EGFで得られfコ倹
量線は岐線で示されている。第8B図はEGF倹黴線を
示す。縦軸は115 (ラヘルEGFと細胞との結合を
示している。 第9図はネズミEGF、および臭化シアンによる開裂の
+iiL iUにおける細菌性1’ G F α融合タ
ンパン質の軟寒天コロニー形成活性を示すグラフて(’
5る。この分析実験はヒトTGF−βの存在下、NHK
細胞、クローン49Fを用いて文献記載の方法(14)
に従って行なわれた。縦軸は850μm2以上のコロニ
ーの数を、横軸はEGFまたは細菌性T G F−αの
濃度であって、EGF内で求めた如く、EGF当1k(
ny/aジ)として、それぞれ表されており、実線は臭
化シアンで処理する前(白丸)または後(黒丸)の細菌
性TGF−α融合タン融合タンパ重質結果を示している
。 第10図はTGF−αの酵母内での発現のためのプラス
ミド、I)y TE 2の役弐図で、jうろ1.このプ
ラスミドはTGF−α配列(斜線)と、それに先1jし
、α−因子プ[1モ〜ターの転写コントロール下にある
α−因子(MF α)プレプロ配列とを有する。 このTGF’−ci配列の後方には“Able”遺伝子
の3゜非翻訳領域およびポリアデニル化信号(枠で囲ん
だ部分)かある。TRP Iは酵母内で選択マーカーと
して機能する。酵母内での転写は、2μの転写起源の存
在により確実となる。APR・アンピノリン耐性。α−
因子プレプロ配列とTGF α配ダ11との連結(ju
nction)部分はプラスミド地図の右側に示されて
いる。 詳細な説明 本明細書においては、PRTGF−α種を、第3図に示
したTGF−α前駆体のアミノ酸配列に相同(ホモロノ
ー)で、機能的なアミノ酸に係る本質的な領域、または
そのフラグメントを有している、EGF以外のポリペプ
チドである、と定義する。候補(candidate)
ポリペプチドは、該侯捕内の残基の内、約35%以上が
、保存的(コンサーバティブ)なアミノ酸置換またはき
ずの導入を行イつなくとらPRTGF−α種配列内の配
列と対応している場合には、本明細書中で定義したPR
TGF−α種と実質上ホモローガスであるとする。 候補ポリペプチドは通常、その様な機能的ホモロノーに
加えて、それ自身が相同である、PRTGF−α幡と共
通した生物学的活性を表すことができろ。 あるポリペプチドをPRTGF−α種の定義範囲に入れ
るのに必要なアミノ酸配列におけるホモロノーの程度は
、該候補タンパク質とPRTGF−α種との間のホモロ
ノーかPRTGF−α種の生物学的活性に関与している
領域、即ち、(a)標的細胞内での形態学上の変化の誘
導、(b)非組換え供給ねで起こりiする様な、r’
It ’r G F−α種に対する抗血l、′?の免疫
学的交差反応、または(C)細胞表面の受容体との結合
、にとって臨界的な領域内であるか否かによって種々変
化し、定義範囲に含まれるLめには高度のホモロノーを
示す必要があり、これらの機能の維持と無関係な配列の
場合には、比較的低いホモロノーを示すことになる。加
えて、らし機能的に同様なアミノ酸側鎖を含有する残基
が置換されても、臨界的な領域がこれらの機能のIまた
はそれ以上を表すならば、本明細書で定義するホモロー
ガスに属することになる。機能的に同様であるというこ
とは、側鎖に優勢な特性(例えば塩基性、中性、疎水性
または酸性)、または立体的な塊(bulk)の存在ま
たは不存在を指す。 通常、PRTGF−α種と定義されるポリペプチドは、
図3で示したタンパク質またはそのフラグメントと、少
なくとら約10ないし25個のアミノ酸残基からなる連
続した領域にわたって実質的にホモローガスな領域を含
むものである。 あるポリペプチドがPRTGF−α種であることを確実
に同定する上で重要なファクターは、それと対応する非
組換え体と実質上結合し得る抗血清が、問題のポリペプ
チドの活性とし結合し得るということである。しかしな
がら、免疫学的な同一性とそれ以外の生物学的活性に関
する同一性とは、必ずしも同し範囲内であることを必要
と乙ない、とい・〕ごとは理解できるであろっ。例えば
、第3図の成熟T G F αの受容体結合活性に対
する中和抗体は、それが成熟TGF αの活性にとって
臨界的な部位に特異的に結合することを目的として生し
たらのでないので、候補タンパク質と結ffi L ’
jいかししれない。むしろ、この抗体は無害な領域に結
合し、その中和効果を立体障害によって表しているのか
らしれない。従って、その無害/、L 領域で突然変異
を生した蚊Aliタンパク質は中和抗体と結合しないか
、それにらがかわらず、このタンパク質は実質的なTG
F−αホモロジー、という意味においてTGF−αの定
義範囲内に含まれることになる。 生物学的な活性に関して“可能な(capable)”
という語句は、酵素的加水分解を受けて、チモーゲン類
似の不活性な状態から、所望の生物学的活性を表すポリ
ペプチドフラグメントに変換され得るポリペプチドであ
ることを意味する。通常、不活性な前駆体は、PRTG
F−α種タンパク質のいずれか一方の末端にヘテロロー
ガスなタンパク質またはそのフラグメントがペプチド結
合を介して結合している融合タンパク質である。このペ
プチド結合の配列は、インビボ、またはイノビトロでの
製造工程の一部としてのタンパク分解的加水分解に対し
て感受性を有する様、選択する。 PRTGF−α種は、通常ヒトPRTGF a唾を色
味するが、上記のホモローガス領域に関する居準と合致
する限り、ネズミ、ブタ、ウマまたはランの如き供給源
から得られたP RT G F α種らP It T
G F−α種の定義範囲内に含まれるものである。し
かしながら、あらゆる場合において成熟TGF−αはヒ
トTGF−αを意味する。 PRTGF−6種因子の誘導体もこの語句の範囲内に含
まれる。誘導体には、アミノ酸配列の突然変異体、グリ
コンル化された変種、並びに他の化学成分との共有結合
または会合による複合物等が含まれろ。共有結合成形誘
q体は、PRTGFα種アミノ酸側鎖に見出される基、
またはN6+)るいはC末端と、機能的な成分との結合
によって製造される。これらの誘導体には、例えば以下
、)乙のか3よれろカルボキノ末端またはカルボキン側
鎖を含む残基(例えばasp32または49)の晰肪族
エステルまたはアミド誘導体;ヒドロキノJJ−含有残
基(例えば5er31 、5er3.5er42.5e
r156または5er94)の0−アシル誘導体;およ
びアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基(例えば
リジンまたはアルギニン)のN−アシル誘導体。 アノル基を、アルキル類(C3〜CIOの直鎖アルキル
を含む)の基から選択することにより、アルカノイル種
が生成され、炭素環式または異項環式化合物を選択する
ことにより、アロイル(aroyl)種n・生成されろ
。反応性の基は、それ自体が反応性の側鎖を介して不溶
性のマトリックスを形成し、ン差結合タンパク質として
用い得る様な二機能性・)化合物であることか好ましい
。 共有結合または会合性の誘導体はイムノアッセ(f:j
LIよアフィニチイ精製法における試薬として自゛用で
ある。例えば、PRTGF−α種は、自体周′fi+の
方法で、臭化ンアンー活性化セファa〜スに共a結合さ
Uて不溶化することにより、またはポリオレフィンの表
面に(グルタルアルデヒ!・交差結合の存在または非存
在下で)吸着させることにより、抗−PRTGF−α種
抗体または細胞表面の受容体を分析または精製するのに
用いることができる。また、PRTGF−α種を検出可
能な紙でラヘル(例えば、クロラミンT法による放射性
ヨウ素化、希」1類キレートとの)(何結合、または池
の蛍光物質との兵役)し、診断的な分析法、特に競合型
イムノアッセイによる生物学的資料中のl) RT G
F−α種しベルの診断に用いることができる。 1’ CF −a NおよびTGF−αcはTGF α
前駆体の一部に対する抗体を精製さUoるので、免疫源
(単独またはへテロローガスなタンパク質との免;ン学
的な複合タンパク質として)として有用である。TGI
−α前駆体を成熟TGF α、TGFαNおよびTGF
−αCから識別するための両側サンドウィッチ法による
特異的受容体結合分FLにおいては、分析に先立ち、ま
たはその途中で抗−T G F−αN抗体を固定し、肢
検試料を抗体と)1、にrンギ、1ヘ トし一ζ1記1
111駆体をそれと結合させ、次いでこの結合した前駆
体を抗−TGF−αCとイノキュヘート4゛る。この抗
−TGF−αCはインキュベーンコンの前に例えば放射
性ヨウ素でラベルするか、または後に、この抗−TGF
−αCか高められている種のIgGに向けられた標JI
gGとイノキュヘートする。 予め定められたPRTGF−6種フラグメントに2.+
、+゛る抗血清は、そのフラグメントをアオガイのヘ
モンアニノ(KLH)または血711アルプミノの如き
免疫原性タンパク質と、グルタルアルデヒドや無水コハ
ク酸塩の如き共有結合剤を用いて交差結合させ、マウス
またはウサギ等の適当な動物に通常の賦形剤と一緒に皮
下注射して免疫を付与し、必要ならば追加抗原刺激を行
い、しかる後抗血清を回収することにより、得ることが
できる。モノクローナル抗体は、免疫を得たマウスの牌
細胞から、通常の方法(例えばEBウィルスまたは細胞
融合による不死化)によって調製される。 成熟TGF−αの妨害を受けずにTGF−αCまた(よ
i’ C,F αNを測定するには、T G F
α0支たは゛rGF−αN分子の相反する末端の、予め
定められたフラグメントに対する抗血清を高め、この様
にして得られた2個の抗血清を用いて’r G F −
α11り躯体に関して記述した如くサンドウィッチ法で
分析する。例えば、TGF−αCの場合ならば、式(C
ys)aArg His Glu Lys P
ro 5erAla Leu Leu Lys
Gly Arg ThrΔ1a(Cys)b(
式中、aまたはbのいずれが一方(両方ではない)はl
である)で示されろ配列をKLHとジスルフィド結合を
介して共役(conjugate)させ、この共役結合
物によってウサギを免疫化する。 抗血清をとり、保存する。同様に、KLHと結合したT
GF−αC配列、His Cys Gly Tr
pCys Arg Ala Leu Ile
Cys Argに対し、pH6において無水コハク
酸を用いてウサギを免疫化する。これら2つの抗血清は
競合的な、またはサンドウィッチ法に基づくイムノアッ
セイにa用である。別法として、全TGF−αNまたは
TGF−αCポリペプチドに対してウサギを免疫化し、
3ポリペプチドを分析・4°る丸めの2つの抗血清を、
それらが互いにTGF−αNまたはTGF−αCとの結
合に際して競合的に阻害し合わない、ということに基づ
いて選択する。競合的に阻害する抗血清は、それに対ず
ろ抗血清が高めらイ1ているフラグメントを囲むタンパ
ク質と、該フラグメントとの識別が容易でない場合に、
このタンパク質を競合的に分析するのにq用である。T
GF−αmCは、尿の如き体液試料を使用し、TGF−
αC抗体の内の1つと、抗−成熟TGF−α抗体とを共
に用いて行う連続的な、あるいは同時の、サンドウィッ
チイムノアッセイにより、最も好都aに分析し得る。 1) Ri’ G F−α種には、天然の対を遺伝子性
の変異かq在し、あるしのから池への変異が起こるとい
うことが理解されよう。この様な変異は1まf二はそれ
以上のアミノ酸の欠失、置換または挿入によって示され
る。池の突然変異体は、PItTGF αfiDNAに
おけるサイト指令(配向)性の突然変異により生成され
た、P RT G F−α種の定められた形での変異体
である。 サイト指令性突然変異の目的は、より改善された特性お
よび活性を表すPRTGF α種の暗号1) N A
を組立てることにある。突然変異体PRTGF−α種と
は、それが欠失、置換または挿入のいずれかの原因でP
RT G F−α種のアミノ酸配列と異なる配列を有
するという点を除けば、前述のPRTGF−α種とのホ
モロジーに関する定義にあてはまる様なポリペプチドを
指すしのと定義する。例えば、第96または97位のり
ノン残基かヒスチジンまたは他のアミノ酸残基に突然変
異的に置き換われば、このタンパク質はもはやこの位置
でタンパク分解的に開裂されろことはない。 同様に、システィン・17.55.60.71.73お
よび/または82はセリンに置換され得るし、P RT
G F−αのカルボキシまたはアミノ末端は欠失され
得る。突然変異体はPflTGF−α種の生物学的特性
の全てをaする必要はないが、PRTGF・α種の抗体
と交差反応を行い得るエビトビツク部位(抗原決定部位
)を少なくとら1個は保1、’Jlていることを要11
°1゜ 本発明におけるPRTGF−α種突然変異にお:する突
然変異部位は予め決定されているので、本質的な突然変
異部位を011らって定め)てお、ぐ必要はない。例え
ば、4・71.5.5・、60.71.73まr二::
j、 t 2位での突然変異を適切に実行するために、
ノスティノコドンの位置で無作為な突然変異の誘t’−
X@・し、発現したPRTGF’−α穫突然変異体を生
物学的な活性と原核生物!r)槻胞内条件との適合性(
町ち直接発現での溶解性)との鏝適な組合h・せに関し
てスクリーンする。既知の配列を有するD N A内の
予め定めたtI5位に置換的な突然変異を生成させる技
術は良く知られている(IFlえばM13プライマーの
突然変異生成)か、本発明のサイズの小さいPRTGF
−α種により、予め定めた突然変異をHする所望のDN
Aを化学合成することが容易となる。 突然変異の誘発は、通常約1〜IOアミノ酸残基数のア
ミノ酸を挿入、あるいは約1〜30のアミノ酸残基数の
アミノ酸を欠失させることにより実施される。k3 G
ち的へ組1λ−ζに1゛ろために、p”i′換、欠失、
挿入あるいは一次的な併用(sabcomhinaLi
on)等を組合わU・ろことかできる。挿入にはアミノ
またはカルボキン末端での融合(例えば成、′7!IT
GF−αのC−またはN−末端に疎水性の延長部分を付
加する、こと)をも含G゛。明ら・かに、暗号化された
D・N、 A内(で0突然変異′におい・では、配列が
解読フレームの・外部に位置″してはならず、また、m
11NAの・二次構造を生ぜしめるおそれのある相捕的
な領域をall造する乙の・でないことが・好ましい。 PRTGP−α饅を暗号化しているD′NAにおける突
然変異のすべてが最終生g:物を構成するものではない
。例えば、DNAの挿入#T突然変異体の主な種類は、
ヘテロローガスな分泌型リーダー、または信号、がPR
TGF−α種のN末端に結合した乙のである。別法とし
て、本発明においては、非分泌型へテロローガスポリペ
プチドとのPRTGF−α種のN末端における融合を、
例えば臭化シアンまたは酵素を用いてその様なポリペプ
チドをPRTGF−α種から切り離して非メチオニル化
1)1じrGF α種をirJろ、という目的の場合
に行っことを考慮している。例えば、原核生物での発現
ベクターを組立てる場合には、E、coliアルカリ性
ホスファターゼまたは熱安定性エンテロトキンン■リー
ダーをPRTGF−α種配列の5゛位に、その解読フレ
ーム内において配する。酵母インバーターゼ、アルファ
因子または酸ホスファターゼリーダー類も同様に非メチ
オニル化PrtTGF−α種の酵母内での発現に用いる
ことができる。 しかしながら、天然のTGF−α前駆体の分泌型リーダ
ーはそれ自身の供給源である細胞以外の宿主(より高等
な真核生物の細胞培養において、最らぎり得ることだカ
リによって認識されるかもしれない。分泌型リーダーか
宿主によって“認識”されると、PRTGF−α種とリ
ーダーから成る融合タンパク質は、通常、PRTGF−
α種と問題の信号(これはPRTGF−α種を分泌させ
るよう導く)とが結合しているペプチド結合の位置で開
裂される。かくして、突然変異PRTGF−α種DNA
を宿主の13質転換に使用し、かつ中間体として突然変
異体prcl’lじl’Gli’α種(融合物)/J”
1成されたとしても、得られるPRTGF−α種は融合
物ではないことになる。 本明細書において、形質転換発育因子−β(TGF−β
)とは天然に存在するTGF=βの表現型(例えば、’
r c rx−αまたはEGF(表皮性発育因子)のア
ンカレッノイノディペンダントな増殖効果を増強する)
を有する、β型の形質転換発育因子を指す。 P RTG F−α種を暗号化しているDNAは、蛍光
性基、放射活性元素または化学発光性基の如き検出可能
な物質により、自体周知の方法で共有結合的にラヘルさ
れる。しかる後、これを通常のハイプリダイゼーノヨン
(雑種分子形成)分析に用いる。この分析法は、実施例
で述へる如<PRTGF−α種ベクターおよび形質転換
体の同定、あるいは腫瘍細胞中のPRTGF−α←hR
N Aのディチクトンとして、インビトロでの診断にf
り用される。 0外なことにPRTGF−α種に関するIn[tNAQ
・(r白はかなり、3ド11てJ′うろ、、その結果、
何を探し出すかを指摘されていないとcl)NAを見落
し弓いことになる。しかしなから、本明細吉中で開示し
た様に、一度その存在か理解され、補助DNAを完全に
入手することかi’+J能になれば、PRTG F
a 種cD N A/”、!?、NJ hli 的r;
配列ヲRt ルフローブに用いて腫瘍細胞のcDNA
ライブラリーをスクリーンすることは、日常的な操作に
すぎない。 P R′I’ G F −a種はPR’l’GF a種
を暗号中しているDNAを含んでいる発現ベクターによ
って形質転換された宿主細胞により生成される。発現ベ
クターの中には、宿主細胞と一緒になって該ヘタター中
に含まれているDNA配列(この様な配711はそれを
発現させるための他の配列と機能的に結合している)を
発現させることのできる様なベクターら含まれる。それ
らのベクターは宿主微生物内でエピゾームとして、また
は染色体DNAの組込み部分として、のいずれかの形で
複製され得なければならない。一般に、発現ベクターは
環状1ン二本鎖D N Aループのノ杉のプラスミドで
あり、ベクタ の状態では染色体と結合1−l己1.プ
ラスミドかベクターとして最ら’L’fIIliに用い
ら(1ているのて、本明細中では“プラスミドと“ヘタ
ター”とを相互変換的に用いることとする。しかし戸か
ら、本発明はその他の彩の発現ベクター(例えば共形質
転換ベクターやウィルス等、同等の機能を示す乙の)を
も包含するものである。 DNA領域はそれらか相互に機能的に関連していれば、
機能的に結合しているしのとするっ例えばプレ配列(p
resequence)または分泌型リーダーのための
DNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタ
ノパク質として発現されるならば、ポリペプチドのため
のDNAに機能的に結合しており、プロモーターは、そ
れが配列の転写をコントロールするならば暗号配列と機
能的に結合しており:リボゾーム結合部位は、それが翻
訳を行わせる様な位置にあれば暗号配列と機能的に結合
していることになる。−・般に、機能的な結合とは相接
していること、分泌型リーダーの場合には相接しており
、かつ解読相内にあることを、0味する。 @I換え宿゛1゛細胞とは、1記のへタタ で形質転換
された宿主細胞てめろ。既に明らかにした様に、この形
質転換によって、非形質転換宿主では、前記の如く掻く
少量、または、より一般的には検出しiすない程少量し
か生産されなかっ)= p RT c F −α←lを
大量に生産することができる。その様な細胞によって生
産されたPRTGF αを、組換えP RT G P
a種と称する。 1d主細胞の培養お上びベクター類 ここに開示するベクター類および方法は広範囲に及ふ原
核性、および真核性の微生物に用いるのに好適でのる。 勿論、原核生物が本発明に(1用なベクター類を4硫で
ろためのDNA配列のクローニングに好適であるという
ことは当fこり前のことである。例えば、E、 col
i K I 2菌株294(ATCCNo。 31446)は殊にq用である。その他の使用しi?J
ろ微生物の菌株には、E、colir3およびE、co
liX I 776(A′rCCNo、31537)が
含ま−れろ。これらの例は単なる例示に1゛き゛ず、制
限的な乙のでないことは1、うよ°ζ乙ない、。 我々が行った実験では、P It T G F α種
配列は、通常原核細胞の細胞質に不溶性の屈折性物体と
して析出するか、原核生物らまた発現に用いることがで
きる。これらは容易に回収し、可溶化させることができ
る。上記の菌株、B、 coli W3110(F−λ
−1原栄養体、ATCC27325)、並びにBaci
llus 5ubtilisの如き大腸菌類、その他
、Salmonella Lyphimuriumよた
はS errak 1a11arcescensの如き
腸内菌や様々なP seudomonas種の菌株ら用
い得る。 一般に、宿主細胞に適合し得る←■から誘導されたレプ
リコンおよびコントロール配列を含むプラスミドヘタク
ーを、これらの宿主と一緒に用いる。 普通、ベクターは、複製部位、並びに形質転換細胞内で
表現型に基づく選択性を付与し1すろ標識配列を有する
。例えば、E、coliは一般にE、coli種から導
かれたプラスミドであるpH1t322を用いて形質転
換される(55)。pH1t322はアンピノリンおよ
びテトラサイクリン耐性遺伝子を5′η(i’して(・
ろ・)で、杉質転換細胞を?−11に同定で3る7段を
提供オろらのてめろ。このpBl(322プラスミド、
あるいは他の微生物プラスミドはよf−1微生物かそ(
−L自身のタンパク質を発現さ什るf二めに[11用し
得るプロモーターを含C丁シ、または、τ白(−ろ株に
食′5前Iされていなければならない。客■換ん[)\
A ))組立てに最ら普通に用いられるプロモーターに
は、β ラクタマーゼ(ベニンリナーゼ)およびラクト
ースプロモーター系(53,72,92)並びにトリプ
トファン(trp)プロモーター系(67,93)か含
まれる。これらが最も普通に用いられる乙のでのるか、
その池の微生物プロモーターら発見されて使用されてお
り、それらの詳細なヌタレオヂド配列ら公開され、当業
者はそれらをプラスミトヘタターと機能的にライゲート
する二とかできろ(80)。 京核生物に加えて、酵母培養の如き真核性微生物ら用い
られる。酵母の成熟TGF−αの発現および分泌は細菌
よりも低レベルであるが、そのポリペプチドはE、co
liからの直接的な発現生産物と5′+1な−・て弓溶
Y1てど5ろ1.(“E +Jit’l微11物U)内
、S accharomyces cercvici
aeまたは通祁のパノ酵母か最も一般的に用いられるか
、その池多改の菌株ら言過に用い得る。S accha
romyces内で発現させるためには、例えばプラス
ミドYRp7(81,82,83)か通常用いられろ。 このプラスミドは既にtrpl遺伝子を含有しているの
で、トリプトファン中で増殖する能力を持たない、酵母
の突然変5!411i(例えばATCCNo、4407
6またはPEP 4−1 (84))に選択マーカーを
与えろ。 酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてLrpl障害があると
いうことは、形質転換体をトリブトフ7ノ不在で増hα
させることによって形質転換体を検出するのに有効な状
況か与えられることになる。 酵母用へフグ−の好適なプロモーティング配列には、以
下のらのに対するプロモーターか含まれる 3−ホスホ
グリセレート・キナーゼ(85)まf二はエノラーゼ、
グリセルアルデヒド−3−ホスホグリセレート・ムター
ゼ、ピルベート・キナーゼ、トリオースホスフェート・
イソメラーゼ、ホスホ′!ル:I ス・イツメラ ゼ、
グルコキナ ゼおよびα−ファクター等の他の解糖酵素
類(86,87)。 適当な発現プラスミドを組立てるためには、これらの遺
伝子と関連した終止配列を、発現ベクター中に、発現さ
せるべき所望の配列の3゛とライゲートさせて入れ、m
RN Aの末端、およびポリアデニル化部位を提供す
る。 その池、増殖条件によって転写がコントロールされろと
いう111点をざらにa4゛るプロモーターとして、ア
ルコール・デヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC1
酸ボスフアタ−ゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、前記
グリセルアルデヒド−3ホスフェ〜 ト・デヒドロゲナ
ーゼ、並びにマルトースおよびラクトースの利用に与る
酵素類(87)等に関するプロモーター領域か含まれる
。酵母と適合し得るプロモーター、;に製起源および終
+L配列を含f丁するブラスミトヘタターの全てが適す
る。 微生物の外に、多細胞生物から得た細胞の培養物らまj
−宿主として用いることかできる。培養がiY H1i
動物上たはI++t ONu動物のいずれから得られた
にUoよ、Itif則的にはその様な細fla11の4
“へてか機能し得る。しかしなから、a准動物の細胞に
より大きい関心が寄せられており、最返ては培地(組織
倍径)中でを椎動物細胞を増殖さぜ・ろことは、通常の
操作となっている(75)。その様なf1用な宿主細胞
系(セルライン)にはVEROおよびl−1eLa細胞
、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系、並び
にW+38、BHK、CO5〜7およびMDCK!11
胞系等が含まれる。その様な細胞のための発現ベクター
には、I!!i當(必要ならば)複製起源および発現さ
れるべきPRTGF−α唾配列の11q方に位置してい
るプロモーターか、所望のりボゾーム結合部位、RNA
スプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終止配
列等と共に含有されている。 咄乳類細胞内で使用するための発現ヘタター用のコント
ロール機能は、しばしばウィルス性物質によって供給さ
れる。例えば、普通用いられているプロモーターはポリ
オーマ、アデノウィルス2、および最らV4繁にはノミ
アンウィルス40(SV1())かり棉かイする。5V
llOウィルスのす刀期および後期のプロモーターは、
いずれら該ウィルスからフラグメントとして容易に得る
ことができ、しからSV40ウィルスの複製起源を含a
しているので特に有用である(88)。ウィルス性複製
起H内の、ll1nd[[1部位からBg11部位に向
けて延びる約250bpの配列が含まれている限り、大
きいまたは小さいSV40フラグメントを用いることか
−ζさ/S、、さらに、正常な状態で所望の遺伝子配“
り41・を伴っているプロモーターまたはコントロール
配列、を用(する、ことらでき、またしばしば好ましい
といえる。、ただし、その様なコントロール配列か宿主
細胞1系に適合性を有することを条件とする。 複製起源は、外来性の起源、SV40その(医のウィル
ス性起源(例えばポリオ−7、アデノ、VSV、B、P
V″J)を含t、−tにベクターを組立てるか、みるい
は宿主Mr@の染色体性膜製機構によって与えるか、い
ずれかの方法で付与される。もし乙ヘタターか宿主細胞
染色体に組込まれるならば、後置はしばしば充分に働く
。 ウィルス性;(3A起源を含(1するl\クタ を用い
「に、選択可能なマーカーおよびP r? T G F
α種DNAを用いた共形質転換法によ−て咄乳類細胞
を形質転換することもてきる。適当な選択oJ t&な
マーカーにはノヒトロ葉酸還l己酵木(I) II I
” R)かめる。PflTGF α種とD I−I
Fllの両押をそ 。 れぞれ暗号化しているD N A &!刈を含むベクタ
ーでトランスフェクトするのに好適な哺乳M宿主細胞を
選択するに際しては、用いるD l(I” Itlタン
パク質タイプに鎚って宿主を選択するのか適当であ、る
、。野生型・D)(・lタンパク質を用いる場合には、
DH・FR欠胤宿主細胞を選択するのか好ましく、かく
してヒボキサンチン、グリッツおよびチミジンを欠く選
択用培地・内で、Iシ足のいくトランスフェクンヨンを
選択するマーカーとして[)H’ FR暗号配列を用い
ることができる。この場合に好適な宿主細胞はD)(F
R活、性を欠くチャイニーズハムスターの卵巣(C,H
,O)・細胞系であって、これはU rlaauhj5
よびCkatji(+ 980 、 P roc−Xa
tlAcat、 5cE−(tJ S A)77 :、
42 L 6 )の方l去に上−・てA要し、増幅さU
・ることかできる。Altl転質はアメリカ特許第4,
399,216号に記載されている。この方法をPRT
GF−α種の合成のために、上記特許中に用いられてい
るゲノムまた:よβ−グロブリンDNAを、所望により
過当な合成リンカ−類を用いてPRTGF−α種配列を
暗号化しているDNAに置き換えることによって適用す
ることができる。 池方、メトトレキセート(M’rX)に対する結合の親
和性の低い、DHPRタンパク質の暗号化DNAをコン
トロール配列に用いる場合には、DHF R耐性細胞を
用いろ必要はない。何故ならば突′!へ変%D HF
RはM T X耐性であるので、宕主細qa自身かMT
X感受性であることを条件として、M T X含角゛培
地を選択の手段として用いることがてさろからてめる。 Ml”Xを吸着することのできる只核細胞の大多数は、
メトトレキセート感受性でめろと思イつれる。その様な
有用な細胞系の1つはCHO系、CHOKl(A1’C
CNo、’CGし61)である。 細胞培養からP It ’rG F’ a樟を回収4
゛ろ方法は、それらが可溶性タンパク質または屈折性の
物体(不溶性の会合体)のいずれの杉で発現されろかと
いうことに依存する。後者は通常、バクテリア(細菌)
性発現の場合であり、大多数の細胞内タノバク質は可溶
性であるために、精製は容易である。 可溶性PRTGF−α種は、もしそれが分泌型の宿主−
ベクター系で発現されれば(例えば、それが細菌または
酵母の分泌型リーダーと結合しているか、通常の信号配
列を合釘している全TGF−α前駆体配列で形質転換さ
れたを椎動物細胞系である様な場合)、その細胞培養か
らの回収はより容易なしのとなる。 可溶性PRTGF〜α種は、アルキル−セファ0−スク
ロマトグラフイー、ゲル濾過、ケル電気泳動、または、
固定化した抗体、または受容体を用いた受容体−結合ア
フィニティクロマトグラフィーを用いて精製することが
できる。 Φとに投与するためのPRTGF−α挿合q組成物は、
所望の精?J度のPRTGF−α種と生理、!的に;r
’?i I−fすろ担体(叩肱採用しfこ川l+1お
よび濃度において叫毒な担体)とを混合することにL−
)でJJi製される。これは、通常、P rF 1’
G Fα種と、緩衝剤、アスコルビン酸の如き抗酸化剤
、低分子量(残基数的lθ以下)のポリペプチド、タノ
ペク質、アミノ酸、グルコースよf二はデキストリフ等
の炭水化物、E D T Aの如きキレート剤、並びに
その他の安定剤および賦形剤とを混合することて11−
+′ンれろ。 夫fこ、動物に投与するための組成物としては、PRT
GF−α種の免疫性の共役化合物、又はPRTGF
α種の兵役化合物とPRTGF−α種に結合し得る抗体
から成るものがあり、前者は、特に診断用キットに用い
るために、抗体を高めることを目的とし、後者は抗−抗
体抗血清を生成させることを目的としている。 その様な組成物の投与経路は既知の方法に従う、例えば
静脈内、腹腔内、筋肉内、または滅菌しr二治療用溶液
の病巣内注入または注射、あるいは以下に述べる、時期
調整放出ノステムにより、没1j4′る。 r’RTGF−α種の組成物は植え込みか可能な、放出
時期を調整した(L imed −release)物
質から投与することかできる。その様な適当な系には、
例えばし−グルタミン酸とガノマエチル化−グルタミノ
酸の共重合体(U、 Sidmanら、l983、”b
iopoly+ners”22(1):547〜556
)、ポリ(2ヒドロキンエチル−メタクリレートXR,
L angerら、1981、”J 、 Biosed
、 Maker 1jcs、 −15:167〜27
7並びにR,Langer、 l 932、”Che
w、 Tech、 ” l 2 :98〜+ 05)
またはエチレンビニルアセテート(R,Langerら
、同上)が含まれる。この物質は、外科的部位または創
傷の上に植え込まれる。別法として、この組成物を注射
のために、半透膜のマイクロカプセルかりボゾーム内に
封入してらよい。 該組成物の投与量は、例えば投与経路、標的である疾患
および患者の状況によって左右される。 病巣内への注射においては、体重を基準とする組成物の
必要量は、静注に比べて少ないであろう。 随・て、l′に師は所望の最適なllV性が得られ、か
つ例えば標的組織の生検や診断分析によって測定し得る
様、用量を検定(titer)L、投与経路を修正する
必要がある。 TGF−αは潜在的な骨吸収剤である。従ってこれはこ
の目的において治療上有用である。このものは、注射、
注入、また放出時期を調整した方法によって投与し、用
量を血漿中のカルンウムイオノ値に従って検定(Lit
er)することができる:骨11ノを収を誘導・1゛る
には高カルシウム血症をもたらず111槍について検定
4−る。める1、者にとっては、逆、〕治療が適合する
。その様な患者とは、がんにかかり、ある種の腫瘍の場
合における如く、lll1瘍細抱によるPRTGF−α
種の生成に伴う高カルシウム血症を発現している患者で
ある。この様な患ざは、尿、血清または可能ならば外科
的に切離して得た腫Iullla中に正常値以上のi5
度でTGF−αff1CまたはTGF−αh仔在してい
ることによって診断される。規定の治療法は、その様な
患n達に抗’I” CF−α(またはその抗原−持Sv
的Fab部分)の如きTGF α中和剤あるいはE
G I”受容体(またはそのTGF−α−結合性のアミ
ノ末端細胞外領域)の如きTGF−α受容体を投与する
ことを含む。その方法・χ、選択されたTGF−α領域
に対する抗血清の製造に関して前に述べた。欠いて、そ
の様な患者の高カルンウム血症を是正する抗体の能力を
注射、注入または放出時期を調整した投与法に関してス
クリーンする。別法として、TGF−αまたは前述の如
く、その選択された領域に対して患とを免役化するごと
により、抗体を自己の内部で生成させることらできる。 EGF受容体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は既知
である(A 、 U 1lrichら、198 ・1年
3月、”Nature”309 :4 l 8〜425
)。更に、EGF受容体はA431表皮がん細胞から得
ることができ、一般に入手できる細胞系はその表面に、
大多数の他の型の細胞の10〜50倍らのEGF受容体
を何する。A431細胞はまた、細胞外に結合領域を持
つ、先端に切断された受容体を分泌する(A 、 U
1lrichら、同上)。いずれかのEGF1゛/i体
を、IIc知のノj法(M、 WaLt!rfield
ら、!982”J、 Ce1l Biochem、
”2 l O:l 49−161)、または当栗番周
知の同等手段(例えば、臭化ファンで活性化したセファ
ロース上に結合したE G Fに関ずろアフィニティク
ロマトグラフィーノに従−て精製オろ。それらを、滅菌
食塩水の如ご実学的に許容し得る担体中に、Llz入時
に遊離のTGF−αと結合して血清中のカルシウム値を
下げろIIな、治療1イ1°効なie1隻で含白さU゛
ることにより、製剤化する。治療上のa幼性は、高カル
シウム血症の軽減、または遊離TGF−α結合TGF−
α比を今日、血漿中の遊離チロキノンの測定に利用され
ているイムノアッセイと類似の方法で測定することによ
り、監視する。EGF受容体または1’ G F α
受容体(またはそのT G F−α結合領域)の使用は
、製造か容易でめろ点で抗体の使用より乙好ましい。し
かしながら、抗体は、それらを天?へに生した受容体よ
り乙大きい親和性に基づいて選択し1する、という利点
を存する。 採用した方法 強L!71で手ごわい細胞壁障害のない細胞をM Ig
il+胞として用いろ時には、リン酸力ルノウム沈降法
によってトラノスフエクノヨノを行う(89)。しかし
なから、DNAを細胞内に導入するための他の方法、例
えば核内注入またはプロトプラスト融合等、し用いるこ
とかできる。 実質的な細胞壁構造を打する原核細胞を用(・る場合の
好ましいトランスフエクノヨノ法は塩化カルシウムを用
い!ニカルシウム処理である(90)。 所望の暗号配列およびコノトロール配列を含有する適当
なベクターの組立てには、標準的なライゲーノヨン技術
を用いる。単離したプラスミドまlこはD N Aフラ
グメントを開裂、修復し、所望のプラスミドにとって望
ましい形に1耳ライケートする。 開裂は、適当な緩衝液中で制限酵素(類)を用いて行う
。一般に、約1μ9のプラスミドまたはDNAフラグメ
ントに対して、約20μQの緩衝液中て約1単位の酵素
を用いる。(特定の制限酵素にとって適当な緩衝液およ
び基質のへlは製造楽音によって明らかにされている。 )インキュベーノヨンの時間は、37℃において約1時
間が有効であろう。インキユヘーノヨンした後、フェノ
ールおよびクロロホルムでタンパク質を抽出し、水性画
分をエタノール沈殿に付して核酸を回収する。 粘着末端を必要とする場合には、調製したらのをポリメ
ラーゼI(クレノー)10単位と共に15℃で15分間
処理し、フェノール性クロロホルムで抽出しL後、エタ
ノール沈殿に付す。 開裂したフラグメントのサイズ(大きさ)によるで・7
離は、しばしば6%ポリアクリルアミドゲルにkil、
行なわれる(Gocddclら、67)。 ラヂケーノヨノに際しては、正確に合致する様に末端を
適当に修復した所望の成分を、DNA05μ9に対して
T ll l) NΔリガーゼを約IO単位の割合てI
IILIて処理ずろ。(開裂されたベクターを成分とし
て用いる場合には、該開裂ベクターを細菌性のアルカリ
性ホスフγターゼで前処理し、再うイゲーノヨンを防止
しておくことか行用であろう。) プラスミド中に組立てられたiE確な配列を確認するに
は、ライゲーノヨノミゾクスを用いてEcoli K
l 2l株294(ATCC31446)を形質転換
し、満足すべき形質転換体をアンピノリンまたはテトラ
サイクリン耐性について適当なところで選択する。形質
転換体からのプラスミドをi−t、これを制限酵素法お
よび/または配列決定法により分計する(45.91)
。 好ましい@様の一般的な説明 及敷鯉 以下に示i−実施例は例示をLノ的としており、本発明
を制限するしのではない。二5う実施例においでは、店
主細胞培養としてE、coliの店主細胞培養を用いた
。しかしながら、本発明方法には池の真核および原核生
物の細胞ら同様に通出性を(=rする。 I。11訂府−α特51iiIyLゲノムDi’q−A
然〔l−)の単線 TGF−α遺伝子の!−1!離は合成オリゴヌクレオチ
ドを用いた特y4的ハイブリダイゼーノヨノに基ノと、
二(1らのブ〔l ブは第1[4に示、+如<、 ヒト
T G F αの(1定の部分的アミノ酸配列に基つ
いて定められている。 最近、特質的DNA配列を、多くの組合わせ上、)誤り
(ミスマツチ)を白°する長い合成オリゴヌクレオチド
を用いて、あまり厳r6てない条件下のハイブリグイゼ
ーノヨノによってcDNAよたはデフ1ムD N 、A
ライブラリーから単離し得ることか示s X=、 j:
、、この方法(よ、アメリカ特許出願番号第501.
351号、1983年6月6日出願(EPO出願番号第
84.3037847号)に記載の如く、ヒトーインン
ユリン様発育因子lの几めの遺伝j−の検出において成
功を収めた方法である。同じ方法を、ヒトTGF−αを
暗号化しているDNAの単離において試みた。この目的
のために、2藺の長いオリゴヌクレオチドを合成した(
第1図)。 ・117−(41ff1体)はアミノ酸12〜25の暗
号配列に相当し、他方487−(48徹体)はアミノl
i!21〜16の暗号配列に対して相捕的である。各ア
ミノ酸には数個の異なるコドンか対応し得るのて、この
1リゴヌクし・オチトノl 7’H1V’+いメケレ(
子1・は、ヒトml工NAに幅在して認められているコ
ドンを基に選択した(94)。なお、複数のCpGノヌ
クレオチトの存在は避けた。41マーと487−の3゛
末端はI5残括の長さにわたって相捕的てうろため、こ
れら両オリゴヌクレオチドを准種分子形成し、それらを
鳥類の骨髄性芽球症ウィルス(AMV)の逆転写酵素で
延長し、二重鎖747−を調製゛4゛ることかてきる。 これらの長鎖オリゴヌクレオチドに加えて、2個の14
7−も合成した。I4マーの4つの部分(ブール)、即
ら、IA、n、CおよびDと呼称される部分はアミノ酸
5〜9に関して可能なコドンの全てに一ノいて相捕的で
ある。同様に、147−の池の4つの部分(2A−Dと
命名)はアミノ酸15〜19に対応する。 第1図に示したこれらのオリゴヌクレオチドは、ヒトT
GF−αのためのDNA配列を検出する目的でハイブリ
ダイゼーション・プローブとして用いた。これらのオリ
ゴヌクレオチドはヒトTGFαのための部分的なアミノ
酸配列(35)と関連さUで設計されており、同相トリ
エステル法(38,39)を用いて合成された。 41マー、48マーおよびI47−を、反応ミックス(
7(1mM)リス−)1cI(叶■76)、10−MM
gCLおよび5IIIMノチオトレイトールを含有)中
、37℃において30分間、γ−”P−ATPとポリヌ
クレオチドキナーゼを用いて5゛位で標識化した。また
等モル量の4Iマーと48マーとを、z5μaのミック
ス(105mMトリス−HCI(pH83)、l=10
mMKCI、50mMMgcLおよび210mMβ−メ
ルカプトエタノールを合釘)中において70°Cで5分
間加熱し、その後30分1川をかけて室温まで徐々に冷
却することにより、74マーを調製しf二。次いで、こ
れらのアニールしたオリゴヌクレオチドに、dTTf)
とdGTPとを10mMになるまで、150μCiづつ
のa−32P−dl\′1゛Pわよびα〜”P−dCT
P、更に80単6γのA X4V逆転写酵素を加えて全
容外を70μeとずろことにより、二重鎖の放射l&性
−ラヘル747にしf二。37℃で30分間インキュベ
ーノジノした。次いでラベルされていない(iΔ1’P
および(ICTPを10mMになるまで加え、!5分間
反応を進行させた。5ephadex G50 5u
perfineとのクロマトグラフィーにより、この〕
1イプリダイゼーションプローブから、取り込まれなか
ったヌクレオチド・トリホスフェートを分離した。 当初は、ヒト黒色腫細胞系A2058(5,34)(こ
れは、TGF−αを精製するための供給源として用いら
れていた)からのmRNAから導かれたCDNAライブ
リーより、TGF−α特異的クローノを単離することに
Sl一点か合わされていた。14マー、41マーおよび
747−による広範囲に及ぶスクリーニングによってい
くつかの堆種分子彩成に係るcDNAを単離することか
てき、これらを配列決定に付したところTGF αと
無関係でめった。これか不成功であったので、λシャロ
ン4Aフアーノ(40)内に含有されているヒト−ゲノ
ムDNAライブラリー中にTGF−α遺伝子を捜すこと
を決定した。約7.5XIO’のファージを、5゛位を
tPでラベルした4Iマーとノ\イブ・1ノ(七 ノー
2)−(ろことによ姦)、スタリーノし、−ら+−−、
+5支験で(i、同数J)イII換え一ノフーノを、こ
、!−ら組換え人ファー7を二1・[Jセルロース−フ
ィルター(95)にの仕、レプリカOH製)牢板培にし
、孜射活性(票識化717 と)\イブリダイゼノヨノ
ー(る二と、こより、スリリ−)しf4c これ、−、
)ス々リーニンクの結果、lI lマーわよび/まr二
:よ74マーとw1種分子を形成した35個の組換K
A ’ ””/を検出、ljjl 11.、 357−
y−ノ全てD・らDNAを煩離しfこ。6♀1)換えλ
DNAについて、417−1747−1・187−4し
びに1・1マーのプールl A −Dおよび2 A −
oとのハイブリグイゼーノヨンを“ドツト−プロット”
法(13)(こより、調・\f−0こ1tらのEli離
ファーノDさ;Aの内、とれら明確には48マーまl二
はブールIA−Dと准種!アナ子を形成し戸かっrこか
、147−プーJし2\−Dの混合物と:よ、約1/2
のD N Aか幾′叶1)・、)ハイブリダイセーノヨ
ノを示しr二。 1!マー、487−および74マーを、5X(51=:
+s S C(l X S S C= O、l 5MN
acl、001′5\1り」゛/酸−Ij・リウム)1
.Iび)・1月・nhqr;It、′、二、I&(l<
l)t:nhardt溶子シー+1.1”61’icす
il、O1%ポリヒニルビu jl 1;/、01θ5
C゛1ノ皿ji7アルフミノ、20%ホルムアζ1・)
および50μ7/−QJ)超ご液処理しfこ鮭精(−D
N A中て准唾分子形戎)′こ付しl二。 フィルターを・12°Cて2時間、ブレバイブ!1グイ
ズしfこ後、熱変性さu′fニブローフを加え、42°
Cて15〜20時間ハイブリy(七 /:1)をイJ几
。フィルターを1xsscおよび01%5l)Sて順次
、広範囲に洗浄しf:(37”C)。147−をプロー
ブに用いた場合には、2時間のプレハイブリダイゼーノ
ヨノおよび15時間のハイブリダイセーノヨノを、6X
SSC,0,5%NPIO16mM EDTA、I X
Denhardk溶液および50μff/′マσ鮭***
DNA中、37°Cて行っr為次いて、GXSSC中で
、室温で敢回洗11トシた。 、117−および147−2ADと。)ハイブリグイゼ
ーノ3ノの程度を、ハイブリダイズ57−f二“トノト
ープロット”ニトロセルロースフィルター’i−,IV
i次厳シQ /J’ 1t11められろ条f’lドで洗
/T#4−ることにより評11i1i L rこ。この
ことは、後続の分(4jに適用セへき潜α的な候浦とし
て考慮されるファーツノ)改を、更に制限するためにイ
rなわ4を几。この評価に括ついて12個のファージを
配り11決定のLめ(こ8択しl二つこれらのファージ
D N AをBamHI、1−1 ind[I ′):
fこはこれら両酵素の併用、によって消化し、フラグメ
ントをアガロースゲル上で分離し117−または14マ
ープ〜ル21\−りとハイブリダイズしているファージ
D N Aをサザ〜ノ分lr I’、 44 )に付す
ことで、いずれかのプローブとハイブリダイズしている
配タリは、同一のD N Aセグメント1こ局在してい
ることかねかつf二。各ファージ[)\Aの、ハイブリ
ダイズしたBamHlまたは11ind[lIlフラグ
メント、次いてプラスミドpBR:322にサブクロー
ノしたつ二カキメラブラスミrを、エツトヌクレアーゼ
5au3Al、11sa[ま7: ! i両片、によっ
て順次開裂しf二。このフラグメントJ′)混合物をポ
リアクリルアミドゲルおよびアカ〔l スゲル1で分離
し、二1・(Iセル[7スーツイルター1−に序した。 ll lマーとのハイブリダイゼーノヨノにより、12
[AIのプラスミド全てに関し、2八イブリグイズした
小フラグメノトを同定しr為次いて、これらのフラグメ
ントを〜I13mp8またはmp9(45)にサブクロ
ーノし、それらのヌクレオチド配列をノデオキノヌクレ
オチド鎖末端決定法(4G)により、決定しf二。 ブラスミトノ内、p′rGF15 Iと命名5(1)
こプラスミドは、T G F αの最を月の33個の
アミノ酸の暗弓配列を有(2,180塩活村Q’)Sa
a3、八(フラグメント内に位置していることか明らつ
・i、= ii ッf二(第2図)。pT G F I
5−1 、’j#tl換ンフ7−ノλ15から導かれ
たlo、2Kbp(キロ塩基χ・t)BamHlフラグ
メントを含(1°している。:33番ト1のアミノ酸に
関するコトノの次にはさ3止コト/がある。その位置の
GT−7ヌタレオチトは、介住配刈の供与azbl−て
めろことを示、l′1,1′識てシ5ろ(=17)。I
−’ T G FIラ−1の制限的マノビノケ、および
それ以後の配シリ決定法(データーは記載りi’ i(
’、 1. i 、 S:+1: I A l
−ノラ ′fメ 、1・、ユii 7 (l b
pSaci frallフラグメノト1−に1v置し
、スプラ(X供与品位の下流におけるS au 3.A
I 1%i位はB281酵素の認識耶(1″Lでらあ
ることか小された。 ヒトTG F αの最初の331[/iのアミノ酸を
暗−j化しているエクソンを含わ゛、プラス(1・ll
TGF151ノ) l 80bpSaa37\−フラグ
メントのヌクレオチド配列11、および(1定のアミノ
酸配列をり+ 2 r<1に小4゛、K文′i、′ζ小
しIこ配り;1は′l″G12 αポリペプチドの一部
であり、小文字で示ヒr二配列(よ、前駆体においてT
GF αに先行しているアミノ酸配タリてうろ。矢印
は、cDhA配クリとの比較によ−・て決定された介α
配列の受容わよび供与部位を示している。、(下記参照
)。 二、)ヌクレオチド配列を綿密に検討することによ・〕
、1!マーがハイブリダイズし7J3の残基、よ、得ら
れたTGr” αD N A配列とホモローガスてめ
ろことかわD−ろ。14個のホモローブメスな塩基か連
続的に伸びている。48残梧の内37か十モローカスて
うろにら拘わら1′487−か顕著fコ’\(−/ I
I 7 (7: l−jir・戸・: /−f’l!I
ll:il’ll 、’+4−1: t、t: 1完全
なホモ〔1) (1111同性)を小・11・17−′
J)プールの内の1ってめる2Dは、明瞭すか極めて弱
いハイブリダイゼーノヨノを示しf二。14マーの′1
、八−1)とのハイブリダイゼ=7ヨノの欠如は、成、
訊′I″G F αの71ケに、最初に−F i++
1されていf二〇ツノでなくアスパラギン酸に関するコ
ト7ノノ・(T、在していたことに起因しているうこの
相違によって。 1・17−内に2−)の不適合(ミスマノチノヶ)/i
戊JII5か存在すること(こなっj=。 pTGF15−1の、単離されj二l 80bpSau
31〜1フラグメノトを、引き続き、111jに単離し
た35の組換えファージのドツトプロット分析(43)
におけるハイブリダイゼーノヨンプ〔J−ブとして用い
た。35のファージDNAの内5個かこのフラグメント
とハイブリダイズしr二。サザー7分析法によってそれ
ら全てか同一の、ハイブリダイズし+’=670bpS
acl −Bal lフラグメントを含有していること
が示されLo 2 約5000ヌクレオチド長さのTGF−αmRNA
1−1:己y−: ’61Hfuは、ヒト’I’ G
F +xを!’1′lXJ化しているケノム配タリか
介龜配クリによって中断されていることを、トシている
。完全な形の暗号配列をiする7こ0(二、i” G
F αエクソンを含むゲノム5acl−1(al17
ラグメノトを黒色腫細1泡系A 2058 j>\<Q
’)mlt\、\から導り−イーたcDNAライブラリ
ーのプローブに用いに。これらの試みら不成功てあっ、
rコのて、TGF αmRNAの供給源として、他の
細胞系を捜4゛ことか決定されノー。 広範囲に及ぶ種々の腫瘍a粗系D)ら抽出された佳々f
、h m It N 、+\のコレクノヨノを、ホルム
アルデヒI−7カロースゲル七の電気、水+J+(、l
l)およびTGF α特異的Sacl−Bgllフラ
グメントとの゛、ノ ザノ”ハイブリダイゼーノヨノ(
42)で調べた(デ ターは記載せず)。全ての細胞系
が、弱い、J、コらく非特異的な雑種分子形成にJみづ
くバット全、M にらこれらオリゴd′F−セルロース
選択mR\A山にll:αするリポブームRNAの28
Sの位置7に示しf−、′腎細胞腫から導かれた1つの
細胞系、1072F57:ま、288の位置に明瞭で強
いハ(ブリダイゼ ノジノLj’Lを小し、約・181
111〜5000のヌクレオチド長さの’rGlαnu
’tNAか(を在11゛ろことを示唆した。関連4°ろ
ポリペプチド、EGFらまた、約−t !! 00のヌ
クレオチド長さのm RN Aによって暗号化されてい
る(・18.49)。 このmRNAの一次の翻訳生産物はE G I−” :
’+:i駆体ポ躯体プチドで2うり、このものは、・;
1き続いて数個のポリペプチドへと処理されろか、そノ
)内の1−ノかE G I’である。 +(、TGF αを暗号化しているC D N Aの
手並ヒトTGF αに関する完全戸暗号配クリを含む
C11N Aを蛸離するfこめに、上記のa胞系かり1
1トAを単離した。ポリアデニル化m RN A分画を
、オリゴdT−セルロースクロマトグラフィーに吸収さ
せることによって単離しfこ(50)。常法通りcDN
AをA製しく5l−53)、dC−ホモポリマーで修復
しく54)、更にPSLIで線状化し、dG−テール化
(dG −La11ed)を行−1f41111311
322にアニールした(55)。E、co1i294(
54)における形質転換(56)を)fanahanの
高部−1111,法(58)・工)10・て行)ことに
、1、C)、:う1.)4のcl)NΔライブラリ を
得た。1つのライブラリーは、Ll’l’ l 2−1
8をプライマ〜とする(dT” l 2−18でプライ
ムされた)cDNAを含んでいたか、一方、池の2すの
ライブラリーは合成l67−dCATGCTGGCTT
GTCCTで、特異的にプライムされたcDNA合成法
によって、J^1製された。このオリゴヌクレオチドは
、pTGF15−lの長い180 bpSau3 A
I制限フラグメント内に含まれているTGF−αエクソ
ンから下流の領域(ヌクレオチF l 34〜149)
と相捕的である(第2図)。 プラスミドpTGF15〜1から調製した、放射活性−
標識TGF−α特異的5acl−Ball制限フラクメ
ノトを用いてQ性コσニーをスクリーンした(59)。 特異的にプライムされたcDNA合成によって調製され
た90.000の組換えEcoliクローンの内、唯1
111がこのプローブとハイブリダイズした。このプラ
スミド(pTGF−CIと呼称)を制限酵素分析に付し
たところ、そこには3IL!]のPst[フラグメント
が存在し、その内最短Ul 67 bp−/ラフl /
l−!1、p’s’ G l冒51.)1” G F
αエクソン中(ご乙1’+−(l’、 していろご
とか1引らかになった(第2図)。次いて約900bp
のcDNAの挿入を表している3個のPsclフラグメ
/1・を、M l 3mp8(45)にサブクローンし
、ノデオキノ鎖末端法(・16)による配列決定に付し
几。 プラスミドpTGF−CIのCDNA配?りとその推定
のアミノ酸配列を第3図に示t0 第3図はプラスミドpTGF−CI中に含まれているC
DNAのヌクレオチド配列並びに推定のアミノ酸配列を
示している。G−CテールがcDNAの両側に接して存
在する。ヌクレオチドは各ラインの下側に配されている
。ライン上の数字は、+11独のメチオニンかNH,−
末端を構成する七推定した場合のアミノ酸の位置を示し
ている。TGFαのアミノ酸配列は枠で囲まれており、
その両側にはAla−Valに富む配列(オーバーライ
ンで示した残基)か結合している。 ヌクレオチド配列を調べた結果、CDNAの合成はプラ
イマー(TGF−αエクソンの134〜11!I’ll
;°Ih1°ξ第2図)に特疋されろ1也NA配列てな
く、乙゛しろ、この特異的なオリゴヌクレオチドに泪当
する位置の下流から開始されていることが分かりた。さ
らに、cDNAの3゛末端の直ぐ下流にある遺伝子フラ
グメントを、組換えファージから単離しんところ、特異
的プライマーと似通った配列を有していなかった。従っ
て、このTGF−αcDNAは、ラノダム(無作為)な
cDNA合成開始状況下で生成したものであると推#1
l11される。TGF−αmRNAの二次構造かオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーノジノ、従って、特
異的なcDNAの合成開始を防げている可能性かめる。 CD N Aの配列およびpTGF15−1から得たゲ
ノムフラグメノトを直線状に示した図(第3図および第
2図)は、ゲノムD N A内にスプライス受容および
供与率位(47)が存在することを指摘している。l
80bpSauA Iフラグメント内に含ま利ているT
GF αエクソンの長さは、121bpでゐる(第2図
)。 認め得るTGF−αのアミノ酸配列から、cDNΔ配列
中の解読−ル ノ・か&1M !7さ41/、+ 、
lli’7 ’J配列は、1” OAを終止コドンとし
てヌクレオチド527で終わってJ5す、3゛非翻訳領
域の一部がこれに続いている。オープンリーディングフ
レームはcDNAの5°末端まて連続している。mRN
Aは約4800−5000のヌクレオチド長さを有する
ので、このcDNA上には、TGF−α11j駆体の暗
号配列の内、−1か存在していない可能性かある。しか
しながら、単独のメチオニン残基を指すATGコドコド
対して、Aか一3位で先行しており、また、その直後に
はGが続いているという点か重要である。この様な現象
は高等な真核生物の大多数のmRNA内の開始コドンの
特徴である(60)。更に、8位から18位までの配ク
リは、細胞からのタンパク質分泌に係る信号ペプチドの
疎水性中心(61)に題めて特徴的な配列である。、他
の信号配列(61−62)との比較により、ノブナルペ
プチダーゼによる開裂は、乙しこの配ソリか実際に信号
ペプチドを表しているならば、19位のAla、20位
のCysまたは22位の八laの後方て起ご・Sことが
小唆された。しかしなから、この単独のメチオニンをT
G F α前駆体の出発点に帰属することは、mR
NAの3°非翻訳配列が約4000ヌクレオチドという
通常でない長さを有する可能性のあることを意味する。 第3図のcDNA配列は、前駆体タンパク質のfこめの
より大きい暗号配列中にはめ込まれているヒトTGF−
αに関する完全なりNA配列を示している。ラット、マ
ウスおよびヒトのTGF−αに関する直接的なアミノ酸
分析により(27,35)、NH2−末端にVat−V
at配列のあることが明らかにされた。ポリペプチドの
長さが50アミノ酸長さであること、並びにラットおよ
びマウスの配列決定されたカルボキン末端に基づき、T
GF−αは88および89位のLeu−Ala残基で終
わっているといえる(第3図)。50アミノ酸長さのT
GF−αを生成さ仕るためには、アラニンおよびバリン
残基間のタンパク分解的な開裂が、アミノ−およびカル
ホキソー両末端で起こらなければならない。このNH,
−末端におけるAla−Valダイマ は、配列 V
、II Ala ΔI、1ノヘI、I V3
1Val中に位置しており、これはカルホキノ末端に見
られる配列+Ala−Val−Val−Ala−Ala
と非常によく似ている。この顕著な特異性に関連し、T
GF−α前駆体のタンパク分解的な処理に関与するプロ
テアーゼは未だ記載されていない。 ここに、腎細胞腫から導かれたcDN、Aおよび健常な
胎児の肝臓から導かれたゲノムライブラリーから単離し
た遺伝子フラグメント(40)において、TGF−αに
関する完全な暗号配列が決定された。両配列は同一であ
り、これら両供給源内でのTGF−α遺伝子間には暗号
の相違が無いことを示唆している。 また、TGF−αに関するDNA暗号配列が確立された
ことにより(第3図径照)、この遺伝子を文献記載(3
8,39)の常法を用いて合成することが可能である。 TGF−α前駆体に関する推定のアミノ酸配列から、5
0アミノ酸から成るTGF−αのカルホキノ末端から2
0アミノ酸下流を始点とする、非’7:’+に疎水性の
領域かあることが明らかになった。 これら103〜+21の残基は、その殆んどがロイノン
、イソロイノンおよびバリンで占められている。118
番目のアミノ酸から前駆体ポリペプチドのカルボキノ末
端までの配列は、著しくシスティンに富んでいる。この
42個のアミノ酸配列中には8個のシスティンが含まれ
ており、その内4個は集まって対になっている。このシ
スティンに富む配列は生物学的に活性なポリペプチドを
構成している可能性がある。今までのところ、どの様に
してこのペプチドが前駆体分子から開裂されるかという
ことは推測にしかすぎない。幾つかのポリペプチドホル
モンはより大きい前駆体として合成され、通常、対にな
った塩基性のアミノ酸で結合されている。96−97位
のLys−Lys残基は、プレプロエンケファリン(6
164)、カルノトニノ前駆K(65)およびコルテコ
トロ躯体−β−リポタンパク質前駆体(66)の場合の
様に、タンパク分解的な開裂の作用部位であるからしれ
ζい。 ゲル濾過分析により、概算の分子量か10〜23キロダ
ルトンである大きいTGF−αが数個存在することか示
された(1.5.22.28.29.30.33.34
)。これらの大きいTGF−αの本質は未知である。T
GF−αを暗号化している数個の関連遺伝子かゲノム内
に存在しているのからしれない。しかしながら、全ヒト
−ゲノムDNAと、pTGFI5−1のl 80 bp
Sau3 A lフラグメント並びに670bpSac
l−Ballフラグメノトとのサザーンハイブリダイゼ
ーノヨノ(44)によっては、曳数遺伝子の存在は明ら
かにされなかった。あるいは、これら大きいT G F
の内、幾つかに関してはその本質を、前駆体分子におけ
る翻訳後の処理型が異なることて説明することかできる
からしれない。また、TGF−αが他のタンパク質類と
凝集することによって、見かけ上の分子ら1が大きくな
る可能性らある。 4 、 E、 coli てのTGF−aの =−’
r G F−αは、多くの腫瘍細胞によって、少量が生
産される。実際、TGF−αの“オーバープロ−1”ユ
サ ”て−)ろとさ、!1.ている黒色腫細胞系A2
058 ;’)培養物から得rコLKJ、、&l 36
Qから1.5μ9の、小さいT G F α←lか
単離されたにオぎない(34)。この様に、細胞培養か
らのTGF’ α人丁釘か極めて低いことか、その生
物学的な確認を妨げている。これらの研究を容易にする
ために、E、coli内でのヒトTGF αの合成が
追求されて、ニア=、TGF−αを暗号化した配列は前
駆体の中にはy)込まれているので、我々は該N号配列
のl1Fi方に開始コドンを、後方に終止コドンを導入
しLo この開始コドンにはEcoR1認識部位が先行
し、終止コドンにはBglI[部位が後続しているので
、TGF−α配列はボータプルなEcoRI −BgI
I制限フラグメノトとして利用することか可能となる(
第4図)。 TGF αはE、coli中で、ヒトーソマトスタチ
ノ(72)、インツユリン(73)およびデスアセチル
チモノンーα[(74)と同様な方法で、異なる融合タ
ンペク質の一部として発現された。これら後との場合に
は、成熟タンパク質を臭化ファンを用いて融合タンパク
質から開裂さけろこと更で3た。この化学的処理によっ
て、融合タノバク質し)先端部分と成熟ポリペプチドと
を連結するために導入されたメチオニノ残括の後方で↑
+r異的な開裂か起きた(72)。TGF−αの暗号配
列およびそれに先行4−ろメヂオニノコトノが、trp
リーダーとLrpEの融合タンパク質(trp△LEI
=l13.76)の先端部分と、EcoRI部位で連結
されている様な2四のプラスミドか組立てらA−rこ。 この融合タンパク質の発現は、 trpリーダーのりポ
ゾーム結合配列を用いて、lrpブロモ〜ターのコント
ロール下に置かれている。発現プラスミドpTE6の場
合には、このTrpΔLE1413融合タンI・;り質
の最・初の190個のアミノ酸配列(数個の7ステイン
残基を含む)かフレーム内でTGF。 α配りリと連結され、終止コドンか後続している。 プラスミドpTE5ては、TGF αI) N A配
列に対して、このcrpLE融合タンベク質の最初の1
7個のアミノ酸のみについての暗号配列が先行している
。この17アミノ酸の延長部分にはノステイ7ノノ・1
)よれていないので、このN11.末端が、発現されf
ニタンパク質のノスルフイト結合に影響を峻は°ずこと
はおそらくないであろうといえる(第5a図)。いずれ
の場合にも、1” CF−αの暗号配711の先端にメ
チオニノット/カイを在しているので、臭化ファンによ
る開裂によって成熟TGF αが枚用されるっ 第4図は、TGF−α(第3図におけるアミノ酸1lO
−89)を、その下流の配列(第3図におけるアミノ酸
9(]−160)を伴って、あるいは伴わすに、発現さ
せるための、幾つかのプラスミドの’jll N7)て
方法を模式的に示す図である。制限的なマノビッグによ
って、pTc:FI5−1内で、TGF−αエク′ノン
を有するl 80bpSau3 A I −Bglil
フラグメントは、380bpPvull−5ma17ラ
グメノト内に含まれていることか明らかになった。 この後晋のフラグメントを単離し、変性した後、γ”P
−ATPで5゛標識化をijった合成オリゴヌクレオチ
ドd CA T G G T G G T G ’I’
CCCAT T ’r TとT4リガーゼのr7−α
下て復元させた。 この混合物にE、 coliDNAポリメラーゼ1クレ
ノーフラグメントを加え、thi合成を触媒さuf二(
67)。このプライマー修復法を用いることにより、C
ATG配列をT G F αの暗−吃配列の先端に桿
いた。次いでこの反応生成物をr3gllTで切断し、
ポリアクリルアミドケル電気泳動によって部分的なTG
F−α配列を含む130bpフラグメントを単離した。 ランFFN−β2DNA配列か短い合成りNAフラグメ
ントに置換されている外は発現プラスミドplFN−β
2 (pBo I F N β2)と本質的に同一であ
るプラスミドpYG12+を、そのj1i’−のEco
lj1部(Iγて切り開さ、E、coliDNAポリメ
ラーゼl(クレノーフラグメノト)でうめ、Bgl[l
で切断した。このヘタターに+3obpT” G F−
αフラグメントをライゲートオることにより、EcoR
l ffl!(nを回復した。こ1して得らイーたプラ
スシトはpTElと呼称された。 最?/Iの33個のアミノ酸を暗号化している配列を含
むl 30bpEcofll−I3glllillI限
7ラクメ:/トをp′l’ E +から単離し、テトラ
サイクリン耐性’r It’: l’、l’L: Jl
ilj 1:flすを+’; (1’ してし’ )’
a pF I F trp’69LJ 7 )、)35
0 bpRgl [1−13aIIlll iフラグメ
ント、「、よびl−:coltlわよびL3aml−1
iで切断しl二pINCv Pへl 3−33の大きい
ヘタタフラグメント(叩Zpl NCVC(78)、プ
ラスミノーゲン活性化CI)N、へ挿入体を含在してい
る)にライケートシ、・二。(1#らイtfコブラスミ
ドp’vE2は、111j記1rp几LE1413(7
6)融合タンパク質のN Hを末端、)I7アミノ酸を
暗号化している配列と、Ec。 It I imi位を介して連結しfこ、TGF α
の最初の33アミノ酸のr二めの配列を含有している。 TGF α配列を含有するl 30bpRI−Bg
l■フラグメノトを、まfこ、前記trpLE融合タン
パク質、7)最初の190のアミノ酸のための暗号配列
に連結しfこ。このプラスミド、pTE3は、pTEl
、)l 30bpRI−Bgl[lフラグメントをpF
IFtrpj69のBgl [1−Baaフラグメント
並びにpNC〜・151)のEcoRlおよびBamH
lで得た大きいフjのヘタターフラグメントにライゲー
ノジンする二と1こより1組立てられた。 、“1.:f、な”I’ G F α配シリを短し1
融合物として発現、1ろプラスミドを以トの如くにしで
得た。pTE2をその弔−のP SL I J’;よび
13g111部位で切断し、大きい方のフラグメントを
In離した。cDNAプラスミドpTGF−CI’rP
stl(第3図におけろ233位)jJよびAva[I
(第3図に才バする301位)てl/J l)開き、7
8bpTGl? α特異的フラグメントをit’llし
た。これら両フラグメノトを部分的に何1hli性を有
ずろオリゴヌクレオチドdGACCTCCT G G
CCT A AおよびdGATGTT、AGGCCAG
GAGの存在下においてライゲートした。これらのオリ
ゴマ〜はTGF α暗号配列の背後に終止コドンを導
入し、かつ、\wa11部位とBg1■部位とを連結す
る乙のである。得られたプラスミドはpTE5である。 プラスミドpTE6はtrpL[ε融合物の最初の19
0個のアミノ酸配列に関する完全な暗号配列を有してい
る。これは、TGF−aに特異的な520bp長さのE
coRl −Bam1−117ラグメノトを1)NCV
(51)のEcoRI−BamHlフラグメントの大き
い方にライゲートす・、lとに1.・てFjられた。ブ
ラスミF’ p TE 5およびpTE6からの短い、
または長い、TGF−α融合タンパク質の生成、並びに
Tea”遺伝子の発現は、trpプロモーターのコント
ロール下にある。 T G l” αのためのDNA配列を、その下流に1
i18結している暗号配列と一渚に、直接的に発現させ
るLめに、プラスミドXAP−PA2を単一のXba口
〕よび8g1111位て開裂し、大きい方のヘタターフ
ラグメントを単離した(図4d)。XAP−Pへ2:よ
、IFN βcDNA配列り叱ト組織のブラスミノ−ゲ
ノ活性化物質のためのcDNA配レリとしjj l’i
j Sれでいる外はpF I F trp69 (67
)と本質的に同様のプラスミドであり、プラスミドpt
PALIpI 2(70)内の如く修飾されており、
り・−ノ、′reLRIR伝子の下流のG −11bp
Ava I −pVしnフラグメントを欠失している。 更に、pTEl1ノ)ら、′r G F−α配列の始め
の部分を含む70bpXbalおよびBgl[lフラグ
メントを、モしてpTG F −CIから残りの暗号配
タリを含r丁シている315 bpPsL l −5a
u3 A lフラグメントをili離した。、3個のフ
ラグメントをライダ 1・し):、 i’j白れたプラ
スミド、pTElは、開始コドンによって先行された暗
号配列を、Lrpプロモーターのコントロール下にある
、EcoRl −13g1 [1フラグメ/トとして含
f1゛シている。 更に、プラスミドpTI4で直接的に発現させるために
、この暗号配列をtrpリーダータンパク質のNH,−
末端部分との融合タンパク質として発現さけることを計
画した。そこで、350bp長さの′rGF−α特異的
Pstl−Bgl[I7ラグメノトをpTrシ4からI
ii離し、プラスミドpt”C2の大きいPsL−Ug
lrlフラグメノトにライダ=−)Lrこ。 iすられたプラスミドをpTE7と命名した。別法とし
て、pTElのTGF−α配りリを含¥J゛4−るEc
。 1i l −j3amH[フラグメントをpi” E
3の大きい1℃colt I −BamHlフラグメン
トにライゲートし、プラスミドpTE8を得た。プラス
ミドpT E 7およびpTE8はTGF αD N
A配タリを含有しており、しからその下流の暗号配列は
、それぞれ、L「pLE1413融合タンパク質(76
)の最初の1711・(口90個(ハアミノ酸に連結(
結合)(、ζいろ。 これらの配列のライゲーノジノはEcofj1部位で起
こり、この1Eco+?1部位の次にはメチオニ)の1
−めのコドン、A T Gが存在している。TGF−α
配グ11の先端にメチオニンが存在するので、この残居
の背後で融合タンパク質を特異的に開裂させることが可
能である。 制限酵素類はN ew E ngland B 1
olabsまたは、11t1th
【!sda 1te
search LXIboratoriesから人手
した。またT4キナーゼはNev England N
uclear、T4DNAリガーゼはB ethesd
a ResearchL aboratories、
そしてE、 coli DNAポリメラーゼ1(クレノ
ーフラグメント)はN ew E nglandNu
clear またはBoehringer Man
nhcimからそれぞれ得た。全ての酵素類は製造者の
指示に実質」−従って用いた。 T44キナーゼ応は、70IIMトリスーHC1(pH
76)、lOaAMのMgCItおよび5mMmナノチ
オトレイトール中った0ライゲーノジンは、20mMト
リス−HCl(+)H7、s )、50mMのNαCl
、(imMu’、’MgcL、I Ol1M )・P
’4’ l・シrllLによび0.5mMのATP中で
行った。制限消化は、6mMhリスーHCL 6 mM
のlvlgcl、および6mMβ メルカプトエタノー
ル中で行ったが、DNA−ポリメラ一ゼ1(クレノーフ
ラグメント)を用いた“;】める(ri、ll in)
”ための反応は同し緩衝液に4種類のdNTP(各々2
0μM)を補足しl二液中で行った。 第5図はプラスミドpT E 5およびpTE6を表4
゛模式図であって、TGF−αとそれに先行するtrp
LE融合タン融合タンパ色質配列しているアミノ酸配列
を示している。 これらのプラスミドpTE5およびpTE6をEcol
i W3110に導入してtrpプロモーターを誘導し
、その結果高レベルでTGF−α融合タンパク質を生成
させる。プラスミドpTE6から発現した、長い融合タ
ンパク質は、全細胞溶解物中に圧倒的に多量に含まれろ
主要タンパク質である。 プラスミドpTE5に暗号化されている短い融合タンパ
ク質は、非常に多量生成されるという訳てはないか、I
・:、ct山溶解物中の潰勢なバンドとして検出し得る
(第6図)。 第6図は、発現プラスミドpTE2、pTE3、pTE
5またはpTE6を含んでいるE、C01iの全溶解物
について行ったSDS I 3%ポリアクリルアミドゲ
ル(79)中での電気泳動の結果を表した乙のでめる。 これらのプラスミドで彩質転換したIE、coli W
3110を、カサミノ酸およびテトラ4F(クリ:/
(5tt g/x(1)を含んだM9培地中、370C
でOD、、。=01になるまで増殖させた。trpプロ
モーターからの発現をインドール酢酸20μり/、1Q
の添加によって誘導した。まず、誘導面、0Dssa−
0,1の段階で細菌3x(lを採り、更に誘導後、p′
rE2およびpTE5の場合ハ0Dsso−1,0゜p
TE3およびpTE6の場合はOD s s。−0,7
の段階で同数の細菌を採取した。ベレット化した細菌を
307zRの10mMトリス−II CI(pH7、5
)、ll〜(EDTAおよび3μQの1Mβメルカプト
エタノール中に再慧劇し、6μeの10%SDSを加え
Loこの混合物を95℃で2分間加熱し、300 II
ジの冷アセトノを加えた。アセト)沈殿をベレット化し
、25μQのSO8・充填用1衝液(5%メルカプトエ
タノール、4%SDS、0.125MトリスーHCI(
+)l−16,8)および20%グリセリン)に溶かし
、95℃で2分間加熱した後、5DS−13%ポリアク
リルゲル上に詰めた。このゲルをクームノー・ブリリア
ント・ブルーで染めた。誘導の前後における細菌溶解物
を示す。矢印はT G F α融合タンパク質を指示
している。 マーカー分子の分子量を、この第6図の右側に示した。 次いで、pTE5て杉質転換したE、coliからの短
い融合タンパク質を、その生物学的活性を測定するため
に実質上、豊富化(enrichment) シた。 2トRの方法(カラムクロマトグラフィーを含まず)に
よって純度を80〜90%にした。1つの方法は、この
短い融合タンパク質か池の多くのタンパク質と異なり、
0 、4 MのNαClと05%NP40の(?、(1
[下で不溶であると思われろ、との観察に基づいている
。次いでこの沈殿を8Mの尿素に溶かし、1〜!酢酸に
χ・rして込tli’J°る。II工工性性11I9分
は大部分の′l″GF〜α融合タンパク質を含Hしてい
る。 別法として、HCI酸性の70%エタノール中で細菌を
超音波処理し、透明な上澄液からエーテル−エタノール
沈殿によってT G +”−α融合タンパク質を析出さ
仕、1M酢酸に溶かt’(18)。ゲル電気泳動分析に
より、これらの両方法で同等の豊富化効果か得られるこ
とが示された。(第7図)。 第7図は、酸−エタノール法でα富化した短い細菌性T
GF α融合タンパク質のS l) Sポリアクリル
アミドケル(79)中の状態を示している。 68アミノ酸長さのTGF α融合タンパク質は、この
ゲル内で幅の広いバンド(矢印)として多動しj為NP
40−NαC1法によってα富化したタンパク質も非常
によく以た状態を示す。 こうして得た細菌性の短いTGF α融合タンパク質
を2つの異なる方法で試験した。天然のTGF αは
EGFと同じ受容体を競合するということが示されてい
る(5.8.9)。このことが、1″l−標識EGFと
の競合に基づく、TGF−αす)迅速か−ノ定’J的な
カ折法の開発を乙ノこ吻しノー(5,14,27)。N
It K細胞を用いた結合実験(15、I9.27)
では明らかに、TGF’−α融合タンパク質は臭化シア
ンによる開裂で得たTGF−α(示されていない)と同
様に、EGF−受容体と結合ずろことか示された。しか
しながら、結合した短いTGF−α融合タンパク質は、
この実験条件の下てTGF−αとEGFとが同じ受容体
に対して量的に同等の結合性を有すると仮定して求めた
予測(/!の0.5〜1%にしかすぎない。この低い値
はヒトTGF αの結合に対する親和性が低いこと、異
常な立体配置をとっている分子が存在すること、あるい
は、採用した結合条件が細菌性TGF−αには不適当な
乙のであったことによるのからしれない。 ラジオリセプターアッセイにおける、細菌性の短いTG
F−α融合タンパク質と1251−標識EGFとの競合
状況を第8図のA面に示す(実線)、、EGFによる検
量線を破線で示した。B而は、EGF検量線の抜粋であ
る。 ′I’ G l・゛ αの生物学的な活性は、N1tK
細胞の様な非彩質転換細胞におけるアンカレッジ・イン
ディベンダンスの誘導能力によって測定し得る。 1’ G F−αまたはE G l”の存在によってコ
ロニーの形成が誘導される。これらのコロニーの敗およ
び大きさは]’ G F−βの存在によって強力に増大
される(13−14)。市I述の如く精製した細菌性の
i” CI” αのアンカレッジ・インディベンダン
ス誘導能力をNHK細胞を用いて調べた(140)。 第9図は、ネズミEGFと、臭化シアンによる開裂面お
よび後の細菌性TGF−α融合タン融合タンパクラとの
軟寒天コロニー形成活性を示tグラフでうろ。この分析
は、文献記載の如く、TGF−βの17:在下、NHK
細胞、クローン49ドを用いて行った(I4)。縦軸は
850μが以上のコロニーの数を示し、横軸は、EGF
受容体結合分針で求めノ二EGF当量(nl/zc)と
して表したEGFまたは細菌性TGF−αの濃度を示し
ている。破線はL: G l)、実線は細菌性T G
F−α融合タンパク質に関する結果であり、(○)は臭
化シアンで開裂する+1ij1(・)は開裂後の値をI
ドす。これらの結果は明らかに短いT G F−α融合
物がTGF−βの存在の下において、軟寒天中でのコロ
ニー形成の引き金となっていることを示している。これ
らの分析においては、ラジオリセブターアブセイの場合
と比較して、細菌性TGF−αがEGFよりら約20〜
30倍ら活性であることが注目される。この様なht的
な相違は、臭化シアンで開裂したTGF−α融合タンパ
ク質に関してら明白である。TGF−βの不存在下で細
菌性T G 1?−αによって誘導されるコロニーの敗
および大きさははるかに少なく小さいが、この様な分析
条件の下での細菌性TGI?−αとEGFとの間の量的
な差異は変わることなく保たれている。 これら2種類の分析の結果は、17個の−N[h末端ア
ミノ酸を’FTする細菌性TGF−α融合タノパク質、
およびその臭化シアンで開裂されたタンパク質が、EG
Fと競合し、N It K細胞のアンカレッジ・インデ
ィベンダンスを誘導し得ることを示している。軟寒天中
における20ニー形成の誘・i’71’r III +
J、−/ :/ iリセ−z ’i −r’ =+
セ(iコll1i−バPせIをはるかに上回−・て(・
ろ。老−この場合によ〕いて、1’ G F α:よ
軟寒天中では、ラノオリセプターアッセイの場合より乙
20〜30倍らI’+’i1い活性を示している(EG
’Fとの比較において)。 :vlassagaeら(12)は、′I’GF ば
かL’: G F受容体、)みζらず60kdTGF
α特異抗体と乙結合するということを提示した。後者の
受容体との結1”? 7戸1,1:公的に′l’ G
l’ イIによるYノ力しノノ−ディベノyノド性の
誘怪を媒介しているIlll性能ある。らしそうであれ
ば、E G Fラノオリセブタ−アノセイは軟寒天中で
のコロニー形成を予測する上で絶対的な色味を持たない
といえろ。また、二τ′、らの6受容体に対してTGF
αの結番性は同一でないからしれない。これに反して
、Carpe−nterら(8)は、最近、TGF
αによるアノカレッノインデイベノダノス誘導かEGF
受容体抗血清7)#在によって阻止され得ることを示し
、この受容体との結合が軟寒天中てのコロニーの発現に
とって必要であることを指摘した。更に、細菌性TGI
″ rrか、ラノ−i jlセブタ −I′Jセ(刀条
1’l= 1Ll)ら、軟’1% J分を斤の条件ドて
L it ((功に[> G l’ソ814と結合しi
Uる可能性らあり1、ニ5りこと:ま、こり、ら両分針
法において観察されたら1的八差vI8を説11月する
乙のといえろ。 5 漿朋刈1グエ旦F−m作多揚 酵母内で′I″GF αを発現させ、引き続きそれを
酵母培地中に分泌させることを[1的として1つ・7)
プラスミドを組)′してノラ この1」的の1こめに、
我IJi1酵母にわ(jろ、接合(交配)因子()、P
lター)αの111用性を追求した。このα因子は、酵
母5cerevisiaeから分泌され、接合過程で生
理的に重要な役割を果たす因子である。このα−因子に
関する遺伝子は既に単離Jれており、大きし1前駆体を
暗号化していることかわかっている。二のプレプロ−α
−因子ポリベプチトは、分泌過程に必要なアミノ末端の
信号ポリペプチドと、4つの同しα因子ペプチド単位か
ら成る。これらα−因子ベプチド類の放出時に′は、前
駆体の二塩基性l、ys−A「g残基(これらは信号ペ
プチドの下流、α因子単1、°Iい先端に位jMl 、
J−ろ)の117置におけろタノバク分解的開裂が起こ
ると思われる(j、 Kurjanら、1982、”C
e11”30:933:Simghら、1983、“N
uCl、、へC1ds Res、 ” l
I :4 0 4 9)。 TGF−α発現プラス
ミド(pyT E 2 )は、アミノ酸数50のTGF
−αの暗ぢ配列とそれに接する終止コドンとをフレーム
内の、酵81α−因子のLys−A「gノペプヂトに関
するコドンの直後に導入する様、組立てた。信号ペプチ
ドを含む、このプレプロ−α因子のアミノ末端部分の配
列はそのまま保持−、イーでいろ、この’I’ G l
” α融合ポリペプチドの発現(1α ファクタープ
ロモーターのコントロール下に3うろ。この様な、まノ
ニは同等の場合において適当な出発物質であるプラスミ
ドは、ヨーロッペ持許第123.544A号に記載され
ている。 発現プラスミドpyTE2(第10図)は、更に、2μ
プラスミド(J 、 l(art leyら、1980
、′\ature”286:860)から導かれた、酵
母の機能的に複製起源、”Able”遺伝子(J 、
)(artleyら、同上)から導かれた転写ターミネ
ータ−およびボリアデー/IJT1171、lliヒ1
QT11++ 1選択−t カ(GT schum
perら、1980、“Gene”l O:l 57−
166)を含灯している。 S 3ccharomyces cerevisia
e菌株20r3 112(E、、 Jones、
l 97 G、“Genetics” 85 : 23
)をpyTI’:2て形質転換した。形!1転換さイ
また酵U1の培地をラノオリセプクー分旨と軟寒天コロ
ニー形成法の両者で分析した。(+−d”れの分析法で
乙、酵母培地中に生物学的に活性なTGF−αが検出さ
れた。更に実験を重ね、培地lπQから約8n9の′I
″GF−αを回収できた。また、酵母内で生成5れた後
、この生物学的に活性なTGF αの90%以上か分
泌されろ、ということかわかった、、分泌されたTGI
−αは、その活性か表れる際にノスルフィド結合の再屈
折(refolding)を必要としないので、適切な
ノスルフfド枯合に基つく立体配置を存していると思わ
れる。最と、α因子に基づく同様な発現ベクターを用い
て酵母中でヒトEGFを発現、分泌させ得たとの報告か
ある(Brakeら、1984、”Proc、 Na
11. ACadSci lS、=t”8 l −
I +i I 2)、。 6TGF αCポリペプチドの発現 pTE1をBgllとBamHlてl白化し、TGFα
C含角゛フラグメントを回収した。Eco[t1部位、
メチオニノコトン、並びに前駆体中で、第115番If
7> l lI!から始まるTGF αCポリペプチ
ド5)最明の6個の残基、を表して(・る配列。 MetllelleThrCysValLeuGATC
G*へ6〜TTCATGATCATCACATGTGT
GCTGcoR1 、)オリゴヌクレオチドプライマーをコM製した。こ、
・)プライマーJ)5゛側におけるT G F αC
含有フラグメ/トは、通常の方法でプライマーを延長さ
せていく間に欠失されん。TGF−αCポリペプチドを
暗号化しているDNAを、EcoRIおよびr3gl[
I71’を化物のゲル電気泳動によって回収した。 別法として、このDNAは有機合成法で調製して乙よい
。 pTEsをEcoRlとBgl[で消化し、大きいベク
ターフラグメントを回収した。回収したpTE、1−t
−/:ノメ/1・ど1j11し〉1室階’i:i’J/
−L:cnlし目キ:111処理T G F αCフ
ラグメノトを′l゛1リカーゼてライゲートし、得られ
f二混合物を用いてi:、coliを形質転換し、この
細菌を1記の如く培養しf二つ′l″GF αCはE、
coliに対してかなりfT i!jで()−1に。A
’rG開始フトンの代イ)りにE col+sT1.
1上fこはアルカリ性ホスファターゼ信号を挿入4−ろ
等の方法でオリゴヌクレオチドを修飾するか、ししくは
このTGF−αCa伝子を、哺乳類細胞の形質転換宿主
〜ベクター系で発現さU゛れば収率の向上がみられるか
もしれない。 以下に本明細書中に引用した文献を列記する。 象醐址練 I 、 De Larcoら、Proc、 Na
11. 5cad、 5ci(USA)75(197
8) 2 、 Todaro、 G 、 J ら、J、 S
upramolec、 CellBiochem、
15.287(1981)。 3、 )jobertsら、Federation
Proceedings 42 。 2621(1983)。 5c−i4見5A)77.3494(1980)。 Sci、(:USA)77.5258(1980)ii
I’Jza++ne、[3ら、J、Ccil−1)hy
siol、IO5゜16:((1980) 7 Mozes、H,L ら、Canc(!r
ELes、 41.28・i2(+981) 8 、 Carpcnter、 G ら、Proc、
Na11. Acad。 Sci、 (LJSA)80.5627(1983)9
〜Iassague、J 、 、J 、 Biol、
CI+em、 258 。 10、 Reynolds、F、 H,Jr ら、N
aLure292 。 11 Pike、L、J ら、J、 Bjol、
Chem、 257゜12 NIassague、
J 、 、Proc、 Natl、 Acad、
5ci(L;S、、A)79.6822(1982
)13、へnzano、M、 A ら、 Cance
r l es、42゜$776(19f12)。 Sci、 (USA)80.6264(1983116
、Roberts、A 、 B ら、NaLure
295.4 l 7(1982)。 17、 、Anzano、M、A、ら、Anal、 B
iochet l 25 。 217(1982)。 18、 Roberts、、A、 B、ら、肋に駁畦5
try、印刷中 19、 Frolik、C,A、、Proc、 Na1
1. Acad、 Sci。 (USA)80.3676(1983)。 20、 As5oian、RK ら、J 、 Biol
、 Chem258 。 7 + 55(+ 983)− 21、0zanne、B ら、J、C:elf、 P
hysiol、 l 05゜163(+980)。 Conference6.5aLo、G、 I−1ら
′lXA(ColdSpring [1arbor、
New York)、 l l 3(1’+79) 23、 ’I’war+1zik、I)、1k ら、
5cience216,894(+982) 24、 Tvardzik、D Rら、Virolog
yl 24.20125、 Kal)lan、P、L
ら、Virology108.484(198+) 26、 Kaplan、P、L ら、Virol
ogyl 2 3,3 2 7(+980)。 27、 Massaguej 、、1. Bio
l、 Chem、 258゜+3606(1983
)。 2g、 S hervin、 S 、 A ら、
Cancer Re5earch43 。 403(+983) 29、 Kimball、E、 S ら、Cance
r Re5earch。 投稿中 30、 Cockley、に、 D、ら、Cancer
Re5earch。 投稿中 31、5porn、M、 B ら、NewEngl、
J、 Med303.878(1980)。 32、 Kaplan、P、 L、 ら、 P roe
、 Na11. Acad。 33、 ’rodaro、G、 J ら、Canc
er Ites、 38 。 4147(1978)。 34、 MarQuardt、Hら、J 、Biol、
Chew、 257 。 (1978)。 37、 Ibbotson、に、J ら、5cie
nce221 、 l 292(+983) 38、Crea、 Rら、Nucl、 Ac1ds
Res、 8゜39、 De Rooij、J、 F
、 M、ら、Reel、 TravChim、 Ra
ys−Bas98.537(1979)40、 Law
n、R,M、ら、Ce11. 15.1157(+97
8) Sci、(USA)77.5201(1980)43、
KarXILt+s、F、C,ら、Nucj、−
−Acids ryes。 7.1541(1979) +I4. 5ouLhern、E、 M、 、J 、
Mo1. Btol、 98゜503(+975) 45、 Messing、 J ら、 Nuclei
c Ac1ds Resジ、309(1981) 46、 Sm1th、A、 J 、 H,、MeLh、
E++zyi、 65゜560(1980)。 47、13rcaLhnach、lL、ら、Δnn、
rtcv、 Uiochet50.349(1981)
。 48、 Gray、A ら、Nature 303 、
722’(1983)。 49、5coLt、J ら、5cience 22
1.236う0. Aviv、Hら、Proc、
Natl、 Acad、 Sci。 (USA)69.1408(1972)51、 Goe
ddel、D、V、ら、NaLure287.411(
1980’) 52、 WickensoM、P ら、去」υo1.
chem、 253 。 2483(+ 978)。 53、 Goeddel、D、 V、ら、NaLure
28 l 、 544(1979)。 54、 Chang、A、C,Y ら、NaLure
275 、617(1979)。 55、 Bolivar、F、ら、Gene 2.9
5(1977)。 (USA)73.4174(1976) −5L
l1anahan、D、、J 、Mo1.Biol、
166,557(1983)。 59、 l−1anahan、D ら、Genel
O,63(1980)6G、 Kozak、M、、N
ucl、Ac1ds Res、 9.5233(+
981) 61、 Perlman、D、 らj 、 M
o1. Biol、 l 6 7 。 391(+983) 62、 B 1obel 、 G 、ら、Soc、 E
xp、 Biol、 Symp33.9(1979) 63、 Noda、M、ら、NaLure 295,2
02(19g2)64、 Gubler、U、 ら、N
ature 295,206(1982)。 b5 \nara、S、 Gツ、Nature 2
98.24066 \akXInishi、S ら
、Nature 278.42367、 Goedd
el、D 、 V ら、Nucl、 Ac1ds、
1ies。 8.4057(+ 980) 68、 Gray、P、 W ら、NaLure
295.503(+982) 69 〜IcG raLh、 J 、 l’ ら、N
aLure295.423(+982) 70、 Penn1ca、D ら、NatureA
」LL、 214(1983)。 71、 Seeburg、P、[−1ら、DNA2.3
7(1983)72、 I takura、K ら、
5cicnce 198.105673、 Goed
del、D、 V ら、P rOc、 Na11.
Acad(+980)。 75 Ti5sue Cu1ture、Academ
ic Press、KruseおよびP aLLcrs
on、著(+973)76、 Miozzari、G、
F およびY anofsky、 C、。 、1.13acLerio1. l 33,1−15
7−1466(+977) 77、ヨーロッパ特許出願公開番号第0088622号
78、 Y ansura、 D 、 ら、Elフ
0 006g693.3 a 章79、 Laea
ueli、U、 K、 、Na1ure 227
.680(ム970) 30、 S 1ebenlistら、Ce1120.
2(i9(1980)81、 Stinchcomb
ら、Na1ure282.39(1979)82、
Kingsaanら、Gene7,141(1979)
83、 T schumperら、Genel O,1
57(1980)84、 Jones、GeneLic
s85,12(1977)!15. HiLzema
nら、J 、 Biol、 Chew、 255
。 2073(1980)。 +!6. He5sらj 、Adv、 Enzy
me Reg、 7 .1 4 987、 H
o1landら、B iochemistry l 7
、49008g、 Fiersら、NaLure2
73 、 l l 3(l 978)89、 G r
ahamら、Virn1ogy52.546(1978
)90、 Cohenら、Proc、Natl、Ac
、Hd、Sci、 (USA)69.21 10(1
972) 91、 Maxamら、MeLhods in
lEnzymology65 。 449’(+980) 92、 Changら、NaLure275,615
(1979)。 93 ヨーロッパ特許出願公開番号第0036776
号94、 Granthai、Rら、Nucl、 Ac
1ds Res、 9゜r43(1981)。 95、 Benton、W、 D およびDavis
、R,W。 5cicnce196.180−182(1977)
search LXIboratoriesから人手
した。またT4キナーゼはNev England N
uclear、T4DNAリガーゼはB ethesd
a ResearchL aboratories、
そしてE、 coli DNAポリメラーゼ1(クレノ
ーフラグメント)はN ew E nglandNu
clear またはBoehringer Man
nhcimからそれぞれ得た。全ての酵素類は製造者の
指示に実質」−従って用いた。 T44キナーゼ応は、70IIMトリスーHC1(pH
76)、lOaAMのMgCItおよび5mMmナノチ
オトレイトール中った0ライゲーノジンは、20mMト
リス−HCl(+)H7、s )、50mMのNαCl
、(imMu’、’MgcL、I Ol1M )・P
’4’ l・シrllLによび0.5mMのATP中で
行った。制限消化は、6mMhリスーHCL 6 mM
のlvlgcl、および6mMβ メルカプトエタノー
ル中で行ったが、DNA−ポリメラ一ゼ1(クレノーフ
ラグメント)を用いた“;】める(ri、ll in)
”ための反応は同し緩衝液に4種類のdNTP(各々2
0μM)を補足しl二液中で行った。 第5図はプラスミドpT E 5およびpTE6を表4
゛模式図であって、TGF−αとそれに先行するtrp
LE融合タン融合タンパ色質配列しているアミノ酸配列
を示している。 これらのプラスミドpTE5およびpTE6をEcol
i W3110に導入してtrpプロモーターを誘導し
、その結果高レベルでTGF−α融合タンパク質を生成
させる。プラスミドpTE6から発現した、長い融合タ
ンパク質は、全細胞溶解物中に圧倒的に多量に含まれろ
主要タンパク質である。 プラスミドpTE5に暗号化されている短い融合タンパ
ク質は、非常に多量生成されるという訳てはないか、I
・:、ct山溶解物中の潰勢なバンドとして検出し得る
(第6図)。 第6図は、発現プラスミドpTE2、pTE3、pTE
5またはpTE6を含んでいるE、C01iの全溶解物
について行ったSDS I 3%ポリアクリルアミドゲ
ル(79)中での電気泳動の結果を表した乙のでめる。 これらのプラスミドで彩質転換したIE、coli W
3110を、カサミノ酸およびテトラ4F(クリ:/
(5tt g/x(1)を含んだM9培地中、370C
でOD、、。=01になるまで増殖させた。trpプロ
モーターからの発現をインドール酢酸20μり/、1Q
の添加によって誘導した。まず、誘導面、0Dssa−
0,1の段階で細菌3x(lを採り、更に誘導後、p′
rE2およびpTE5の場合ハ0Dsso−1,0゜p
TE3およびpTE6の場合はOD s s。−0,7
の段階で同数の細菌を採取した。ベレット化した細菌を
307zRの10mMトリス−II CI(pH7、5
)、ll〜(EDTAおよび3μQの1Mβメルカプト
エタノール中に再慧劇し、6μeの10%SDSを加え
Loこの混合物を95℃で2分間加熱し、300 II
ジの冷アセトノを加えた。アセト)沈殿をベレット化し
、25μQのSO8・充填用1衝液(5%メルカプトエ
タノール、4%SDS、0.125MトリスーHCI(
+)l−16,8)および20%グリセリン)に溶かし
、95℃で2分間加熱した後、5DS−13%ポリアク
リルゲル上に詰めた。このゲルをクームノー・ブリリア
ント・ブルーで染めた。誘導の前後における細菌溶解物
を示す。矢印はT G F α融合タンパク質を指示
している。 マーカー分子の分子量を、この第6図の右側に示した。 次いで、pTE5て杉質転換したE、coliからの短
い融合タンパク質を、その生物学的活性を測定するため
に実質上、豊富化(enrichment) シた。 2トRの方法(カラムクロマトグラフィーを含まず)に
よって純度を80〜90%にした。1つの方法は、この
短い融合タンパク質か池の多くのタンパク質と異なり、
0 、4 MのNαClと05%NP40の(?、(1
[下で不溶であると思われろ、との観察に基づいている
。次いでこの沈殿を8Mの尿素に溶かし、1〜!酢酸に
χ・rして込tli’J°る。II工工性性11I9分
は大部分の′l″GF〜α融合タンパク質を含Hしてい
る。 別法として、HCI酸性の70%エタノール中で細菌を
超音波処理し、透明な上澄液からエーテル−エタノール
沈殿によってT G +”−α融合タンパク質を析出さ
仕、1M酢酸に溶かt’(18)。ゲル電気泳動分析に
より、これらの両方法で同等の豊富化効果か得られるこ
とが示された。(第7図)。 第7図は、酸−エタノール法でα富化した短い細菌性T
GF α融合タンパク質のS l) Sポリアクリル
アミドケル(79)中の状態を示している。 68アミノ酸長さのTGF α融合タンパク質は、この
ゲル内で幅の広いバンド(矢印)として多動しj為NP
40−NαC1法によってα富化したタンパク質も非常
によく以た状態を示す。 こうして得た細菌性の短いTGF α融合タンパク質
を2つの異なる方法で試験した。天然のTGF αは
EGFと同じ受容体を競合するということが示されてい
る(5.8.9)。このことが、1″l−標識EGFと
の競合に基づく、TGF−αす)迅速か−ノ定’J的な
カ折法の開発を乙ノこ吻しノー(5,14,27)。N
It K細胞を用いた結合実験(15、I9.27)
では明らかに、TGF’−α融合タンパク質は臭化シア
ンによる開裂で得たTGF−α(示されていない)と同
様に、EGF−受容体と結合ずろことか示された。しか
しながら、結合した短いTGF−α融合タンパク質は、
この実験条件の下てTGF−αとEGFとが同じ受容体
に対して量的に同等の結合性を有すると仮定して求めた
予測(/!の0.5〜1%にしかすぎない。この低い値
はヒトTGF αの結合に対する親和性が低いこと、異
常な立体配置をとっている分子が存在すること、あるい
は、採用した結合条件が細菌性TGF−αには不適当な
乙のであったことによるのからしれない。 ラジオリセプターアッセイにおける、細菌性の短いTG
F−α融合タンパク質と1251−標識EGFとの競合
状況を第8図のA面に示す(実線)、、EGFによる検
量線を破線で示した。B而は、EGF検量線の抜粋であ
る。 ′I’ G l・゛ αの生物学的な活性は、N1tK
細胞の様な非彩質転換細胞におけるアンカレッジ・イン
ディベンダンスの誘導能力によって測定し得る。 1’ G F−αまたはE G l”の存在によってコ
ロニーの形成が誘導される。これらのコロニーの敗およ
び大きさは]’ G F−βの存在によって強力に増大
される(13−14)。市I述の如く精製した細菌性の
i” CI” αのアンカレッジ・インディベンダン
ス誘導能力をNHK細胞を用いて調べた(140)。 第9図は、ネズミEGFと、臭化シアンによる開裂面お
よび後の細菌性TGF−α融合タン融合タンパクラとの
軟寒天コロニー形成活性を示tグラフでうろ。この分析
は、文献記載の如く、TGF−βの17:在下、NHK
細胞、クローン49ドを用いて行った(I4)。縦軸は
850μが以上のコロニーの数を示し、横軸は、EGF
受容体結合分針で求めノ二EGF当量(nl/zc)と
して表したEGFまたは細菌性TGF−αの濃度を示し
ている。破線はL: G l)、実線は細菌性T G
F−α融合タンパク質に関する結果であり、(○)は臭
化シアンで開裂する+1ij1(・)は開裂後の値をI
ドす。これらの結果は明らかに短いT G F−α融合
物がTGF−βの存在の下において、軟寒天中でのコロ
ニー形成の引き金となっていることを示している。これ
らの分析においては、ラジオリセブターアブセイの場合
と比較して、細菌性TGF−αがEGFよりら約20〜
30倍ら活性であることが注目される。この様なht的
な相違は、臭化シアンで開裂したTGF−α融合タンパ
ク質に関してら明白である。TGF−βの不存在下で細
菌性T G 1?−αによって誘導されるコロニーの敗
および大きさははるかに少なく小さいが、この様な分析
条件の下での細菌性TGI?−αとEGFとの間の量的
な差異は変わることなく保たれている。 これら2種類の分析の結果は、17個の−N[h末端ア
ミノ酸を’FTする細菌性TGF−α融合タノパク質、
およびその臭化シアンで開裂されたタンパク質が、EG
Fと競合し、N It K細胞のアンカレッジ・インデ
ィベンダンスを誘導し得ることを示している。軟寒天中
における20ニー形成の誘・i’71’r III +
J、−/ :/ iリセ−z ’i −r’ =+
セ(iコll1i−バPせIをはるかに上回−・て(・
ろ。老−この場合によ〕いて、1’ G F α:よ
軟寒天中では、ラノオリセプターアッセイの場合より乙
20〜30倍らI’+’i1い活性を示している(EG
’Fとの比較において)。 :vlassagaeら(12)は、′I’GF ば
かL’: G F受容体、)みζらず60kdTGF
α特異抗体と乙結合するということを提示した。後者の
受容体との結1”? 7戸1,1:公的に′l’ G
l’ イIによるYノ力しノノ−ディベノyノド性の
誘怪を媒介しているIlll性能ある。らしそうであれ
ば、E G Fラノオリセブタ−アノセイは軟寒天中で
のコロニー形成を予測する上で絶対的な色味を持たない
といえろ。また、二τ′、らの6受容体に対してTGF
αの結番性は同一でないからしれない。これに反して
、Carpe−nterら(8)は、最近、TGF
αによるアノカレッノインデイベノダノス誘導かEGF
受容体抗血清7)#在によって阻止され得ることを示し
、この受容体との結合が軟寒天中てのコロニーの発現に
とって必要であることを指摘した。更に、細菌性TGI
″ rrか、ラノ−i jlセブタ −I′Jセ(刀条
1’l= 1Ll)ら、軟’1% J分を斤の条件ドて
L it ((功に[> G l’ソ814と結合しi
Uる可能性らあり1、ニ5りこと:ま、こり、ら両分針
法において観察されたら1的八差vI8を説11月する
乙のといえろ。 5 漿朋刈1グエ旦F−m作多揚 酵母内で′I″GF αを発現させ、引き続きそれを
酵母培地中に分泌させることを[1的として1つ・7)
プラスミドを組)′してノラ この1」的の1こめに、
我IJi1酵母にわ(jろ、接合(交配)因子()、P
lター)αの111用性を追求した。このα因子は、酵
母5cerevisiaeから分泌され、接合過程で生
理的に重要な役割を果たす因子である。このα−因子に
関する遺伝子は既に単離Jれており、大きし1前駆体を
暗号化していることかわかっている。二のプレプロ−α
−因子ポリベプチトは、分泌過程に必要なアミノ末端の
信号ポリペプチドと、4つの同しα因子ペプチド単位か
ら成る。これらα−因子ベプチド類の放出時に′は、前
駆体の二塩基性l、ys−A「g残基(これらは信号ペ
プチドの下流、α因子単1、°Iい先端に位jMl 、
J−ろ)の117置におけろタノバク分解的開裂が起こ
ると思われる(j、 Kurjanら、1982、”C
e11”30:933:Simghら、1983、“N
uCl、、へC1ds Res、 ” l
I :4 0 4 9)。 TGF−α発現プラス
ミド(pyT E 2 )は、アミノ酸数50のTGF
−αの暗ぢ配列とそれに接する終止コドンとをフレーム
内の、酵81α−因子のLys−A「gノペプヂトに関
するコドンの直後に導入する様、組立てた。信号ペプチ
ドを含む、このプレプロ−α因子のアミノ末端部分の配
列はそのまま保持−、イーでいろ、この’I’ G l
” α融合ポリペプチドの発現(1α ファクタープ
ロモーターのコントロール下に3うろ。この様な、まノ
ニは同等の場合において適当な出発物質であるプラスミ
ドは、ヨーロッペ持許第123.544A号に記載され
ている。 発現プラスミドpyTE2(第10図)は、更に、2μ
プラスミド(J 、 l(art leyら、1980
、′\ature”286:860)から導かれた、酵
母の機能的に複製起源、”Able”遺伝子(J 、
)(artleyら、同上)から導かれた転写ターミネ
ータ−およびボリアデー/IJT1171、lliヒ1
QT11++ 1選択−t カ(GT schum
perら、1980、“Gene”l O:l 57−
166)を含灯している。 S 3ccharomyces cerevisia
e菌株20r3 112(E、、 Jones、
l 97 G、“Genetics” 85 : 23
)をpyTI’:2て形質転換した。形!1転換さイ
また酵U1の培地をラノオリセプクー分旨と軟寒天コロ
ニー形成法の両者で分析した。(+−d”れの分析法で
乙、酵母培地中に生物学的に活性なTGF−αが検出さ
れた。更に実験を重ね、培地lπQから約8n9の′I
″GF−αを回収できた。また、酵母内で生成5れた後
、この生物学的に活性なTGF αの90%以上か分
泌されろ、ということかわかった、、分泌されたTGI
−αは、その活性か表れる際にノスルフィド結合の再屈
折(refolding)を必要としないので、適切な
ノスルフfド枯合に基つく立体配置を存していると思わ
れる。最と、α因子に基づく同様な発現ベクターを用い
て酵母中でヒトEGFを発現、分泌させ得たとの報告か
ある(Brakeら、1984、”Proc、 Na
11. ACadSci lS、=t”8 l −
I +i I 2)、。 6TGF αCポリペプチドの発現 pTE1をBgllとBamHlてl白化し、TGFα
C含角゛フラグメントを回収した。Eco[t1部位、
メチオニノコトン、並びに前駆体中で、第115番If
7> l lI!から始まるTGF αCポリペプチ
ド5)最明の6個の残基、を表して(・る配列。 MetllelleThrCysValLeuGATC
G*へ6〜TTCATGATCATCACATGTGT
GCTGcoR1 、)オリゴヌクレオチドプライマーをコM製した。こ、
・)プライマーJ)5゛側におけるT G F αC
含有フラグメ/トは、通常の方法でプライマーを延長さ
せていく間に欠失されん。TGF−αCポリペプチドを
暗号化しているDNAを、EcoRIおよびr3gl[
I71’を化物のゲル電気泳動によって回収した。 別法として、このDNAは有機合成法で調製して乙よい
。 pTEsをEcoRlとBgl[で消化し、大きいベク
ターフラグメントを回収した。回収したpTE、1−t
−/:ノメ/1・ど1j11し〉1室階’i:i’J/
−L:cnlし目キ:111処理T G F αCフ
ラグメノトを′l゛1リカーゼてライゲートし、得られ
f二混合物を用いてi:、coliを形質転換し、この
細菌を1記の如く培養しf二つ′l″GF αCはE、
coliに対してかなりfT i!jで()−1に。A
’rG開始フトンの代イ)りにE col+sT1.
1上fこはアルカリ性ホスファターゼ信号を挿入4−ろ
等の方法でオリゴヌクレオチドを修飾するか、ししくは
このTGF−αCa伝子を、哺乳類細胞の形質転換宿主
〜ベクター系で発現さU゛れば収率の向上がみられるか
もしれない。 以下に本明細書中に引用した文献を列記する。 象醐址練 I 、 De Larcoら、Proc、 Na
11. 5cad、 5ci(USA)75(197
8) 2 、 Todaro、 G 、 J ら、J、 S
upramolec、 CellBiochem、
15.287(1981)。 3、 )jobertsら、Federation
Proceedings 42 。 2621(1983)。 5c−i4見5A)77.3494(1980)。 Sci、(:USA)77.5258(1980)ii
I’Jza++ne、[3ら、J、Ccil−1)hy
siol、IO5゜16:((1980) 7 Mozes、H,L ら、Canc(!r
ELes、 41.28・i2(+981) 8 、 Carpcnter、 G ら、Proc、
Na11. Acad。 Sci、 (LJSA)80.5627(1983)9
〜Iassague、J 、 、J 、 Biol、
CI+em、 258 。 10、 Reynolds、F、 H,Jr ら、N
aLure292 。 11 Pike、L、J ら、J、 Bjol、
Chem、 257゜12 NIassague、
J 、 、Proc、 Natl、 Acad、
5ci(L;S、、A)79.6822(1982
)13、へnzano、M、 A ら、 Cance
r l es、42゜$776(19f12)。 Sci、 (USA)80.6264(1983116
、Roberts、A 、 B ら、NaLure
295.4 l 7(1982)。 17、 、Anzano、M、A、ら、Anal、 B
iochet l 25 。 217(1982)。 18、 Roberts、、A、 B、ら、肋に駁畦5
try、印刷中 19、 Frolik、C,A、、Proc、 Na1
1. Acad、 Sci。 (USA)80.3676(1983)。 20、 As5oian、RK ら、J 、 Biol
、 Chem258 。 7 + 55(+ 983)− 21、0zanne、B ら、J、C:elf、 P
hysiol、 l 05゜163(+980)。 Conference6.5aLo、G、 I−1ら
′lXA(ColdSpring [1arbor、
New York)、 l l 3(1’+79) 23、 ’I’war+1zik、I)、1k ら、
5cience216,894(+982) 24、 Tvardzik、D Rら、Virolog
yl 24.20125、 Kal)lan、P、L
ら、Virology108.484(198+) 26、 Kaplan、P、L ら、Virol
ogyl 2 3,3 2 7(+980)。 27、 Massaguej 、、1. Bio
l、 Chem、 258゜+3606(1983
)。 2g、 S hervin、 S 、 A ら、
Cancer Re5earch43 。 403(+983) 29、 Kimball、E、 S ら、Cance
r Re5earch。 投稿中 30、 Cockley、に、 D、ら、Cancer
Re5earch。 投稿中 31、5porn、M、 B ら、NewEngl、
J、 Med303.878(1980)。 32、 Kaplan、P、 L、 ら、 P roe
、 Na11. Acad。 33、 ’rodaro、G、 J ら、Canc
er Ites、 38 。 4147(1978)。 34、 MarQuardt、Hら、J 、Biol、
Chew、 257 。 (1978)。 37、 Ibbotson、に、J ら、5cie
nce221 、 l 292(+983) 38、Crea、 Rら、Nucl、 Ac1ds
Res、 8゜39、 De Rooij、J、 F
、 M、ら、Reel、 TravChim、 Ra
ys−Bas98.537(1979)40、 Law
n、R,M、ら、Ce11. 15.1157(+97
8) Sci、(USA)77.5201(1980)43、
KarXILt+s、F、C,ら、Nucj、−
−Acids ryes。 7.1541(1979) +I4. 5ouLhern、E、 M、 、J 、
Mo1. Btol、 98゜503(+975) 45、 Messing、 J ら、 Nuclei
c Ac1ds Resジ、309(1981) 46、 Sm1th、A、 J 、 H,、MeLh、
E++zyi、 65゜560(1980)。 47、13rcaLhnach、lL、ら、Δnn、
rtcv、 Uiochet50.349(1981)
。 48、 Gray、A ら、Nature 303 、
722’(1983)。 49、5coLt、J ら、5cience 22
1.236う0. Aviv、Hら、Proc、
Natl、 Acad、 Sci。 (USA)69.1408(1972)51、 Goe
ddel、D、V、ら、NaLure287.411(
1980’) 52、 WickensoM、P ら、去」υo1.
chem、 253 。 2483(+ 978)。 53、 Goeddel、D、 V、ら、NaLure
28 l 、 544(1979)。 54、 Chang、A、C,Y ら、NaLure
275 、617(1979)。 55、 Bolivar、F、ら、Gene 2.9
5(1977)。 (USA)73.4174(1976) −5L
l1anahan、D、、J 、Mo1.Biol、
166,557(1983)。 59、 l−1anahan、D ら、Genel
O,63(1980)6G、 Kozak、M、、N
ucl、Ac1ds Res、 9.5233(+
981) 61、 Perlman、D、 らj 、 M
o1. Biol、 l 6 7 。 391(+983) 62、 B 1obel 、 G 、ら、Soc、 E
xp、 Biol、 Symp33.9(1979) 63、 Noda、M、ら、NaLure 295,2
02(19g2)64、 Gubler、U、 ら、N
ature 295,206(1982)。 b5 \nara、S、 Gツ、Nature 2
98.24066 \akXInishi、S ら
、Nature 278.42367、 Goedd
el、D 、 V ら、Nucl、 Ac1ds、
1ies。 8.4057(+ 980) 68、 Gray、P、 W ら、NaLure
295.503(+982) 69 〜IcG raLh、 J 、 l’ ら、N
aLure295.423(+982) 70、 Penn1ca、D ら、NatureA
」LL、 214(1983)。 71、 Seeburg、P、[−1ら、DNA2.3
7(1983)72、 I takura、K ら、
5cicnce 198.105673、 Goed
del、D、 V ら、P rOc、 Na11.
Acad(+980)。 75 Ti5sue Cu1ture、Academ
ic Press、KruseおよびP aLLcrs
on、著(+973)76、 Miozzari、G、
F およびY anofsky、 C、。 、1.13acLerio1. l 33,1−15
7−1466(+977) 77、ヨーロッパ特許出願公開番号第0088622号
78、 Y ansura、 D 、 ら、Elフ
0 006g693.3 a 章79、 Laea
ueli、U、 K、 、Na1ure 227
.680(ム970) 30、 S 1ebenlistら、Ce1120.
2(i9(1980)81、 Stinchcomb
ら、Na1ure282.39(1979)82、
Kingsaanら、Gene7,141(1979)
83、 T schumperら、Genel O,1
57(1980)84、 Jones、GeneLic
s85,12(1977)!15. HiLzema
nら、J 、 Biol、 Chew、 255
。 2073(1980)。 +!6. He5sらj 、Adv、 Enzy
me Reg、 7 .1 4 987、 H
o1landら、B iochemistry l 7
、49008g、 Fiersら、NaLure2
73 、 l l 3(l 978)89、 G r
ahamら、Virn1ogy52.546(1978
)90、 Cohenら、Proc、Natl、Ac
、Hd、Sci、 (USA)69.21 10(1
972) 91、 Maxamら、MeLhods in
lEnzymology65 。 449’(+980) 92、 Changら、NaLure275,615
(1979)。 93 ヨーロッパ特許出願公開番号第0036776
号94、 Granthai、Rら、Nucl、 Ac
1ds Res、 9゜r43(1981)。 95、 Benton、W、 D およびDavis
、R,W。 5cicnce196.180−182(1977)
【図面の簡単な説明】
第1図は、ヒト′rGF αrIf1駆体のD躯体配列
検出のf二めにハイブリダイゼーションプローブとして
用いられるオリゴヌクレオチドの模式図である。第2図
はヒトTGF−αの最初の33個のアミノ酸を暗号化し
ているエクソンを含む、プラスミドpTGF−α15−
1のl 80 bpS au3 Aフラグメントのヌク
レオチド配列、・114びに推定のアミノ酸配クリを示
す模式図である。第3図はプラスミF’p’r G F
CI中に含まれているCDNAU>7タレオチド配列
および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。第4図
はプラスミドpTEl、2.3.4.5.6.7および
・8の組立て模式図である。第5図はプラスミドpTE
5およびpTE6の制限サイト地図であり、TGF
α融合タンパク質の連結部分のアミノ酸配列をも示す。 第6図はプラスミドpTE2、pTE3、pTE5また
はpTE6を含むE、coliの全細胞溶解物の5DS
−13%ポリアクリルアミドゲル中の電気体動針折の結
果を示す状態図である。第7図は酸−エタノール法で豊
富にした細菌性の、短いT G l) α融合タンパ
ク質の5DS−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動
の結果を示す状態図である。第8図はラジオリセプター
アッセイにおける短い細菌性TGF α融合タンパク質
と1!51−標識EGFとの競合状況を示すグラフであ
る。第9図は不ズミIεG+)および、臭化シアンによ
る開裂の前後におけろ細菌性TGF−α融合タノパク質
の軟寒天コロニー形成活性を示すグラフである。第10
図はl’ G l・r−タ酊1月Il−ご介jQ Q己
r−、14、V)Jブー;ンスミト、py’r’F2を
2〈す模式図で5うろっ特1;1゛出願人 ノエ不ノテ
ク、イノコーボレイテット代 理 人 弁理士 前出
保 41名唱ハψpしさゲυ(支)」1フ]ヒ一乙4
813本: 5’ GTTGTTTCTCACTT
CAACAAAT(41童停: 5’ ACCAG
GAAGCGGCAGGTGCCG−第1v!J ic CCA GACTCCCATACCCAG TT
CTGCrGGAAGCAGAACTGGGTATG第
5図 Met−Lys−Ala−11e−Phe−Val−L
eu−Lys−Gly−5er−Leu−Asp−Va
l−Val−、、、TG Fひ Met−Lys−、、、(1867ミノ資)0.。 Ala−Glu−Glu−Phe、−Met−EcoR
工
検出のf二めにハイブリダイゼーションプローブとして
用いられるオリゴヌクレオチドの模式図である。第2図
はヒトTGF−αの最初の33個のアミノ酸を暗号化し
ているエクソンを含む、プラスミドpTGF−α15−
1のl 80 bpS au3 Aフラグメントのヌク
レオチド配列、・114びに推定のアミノ酸配クリを示
す模式図である。第3図はプラスミF’p’r G F
CI中に含まれているCDNAU>7タレオチド配列
および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。第4図
はプラスミドpTEl、2.3.4.5.6.7および
・8の組立て模式図である。第5図はプラスミドpTE
5およびpTE6の制限サイト地図であり、TGF
α融合タンパク質の連結部分のアミノ酸配列をも示す。 第6図はプラスミドpTE2、pTE3、pTE5また
はpTE6を含むE、coliの全細胞溶解物の5DS
−13%ポリアクリルアミドゲル中の電気体動針折の結
果を示す状態図である。第7図は酸−エタノール法で豊
富にした細菌性の、短いT G l) α融合タンパ
ク質の5DS−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動
の結果を示す状態図である。第8図はラジオリセプター
アッセイにおける短い細菌性TGF α融合タンパク質
と1!51−標識EGFとの競合状況を示すグラフであ
る。第9図は不ズミIεG+)および、臭化シアンによ
る開裂の前後におけろ細菌性TGF−α融合タノパク質
の軟寒天コロニー形成活性を示すグラフである。第10
図はl’ G l・r−タ酊1月Il−ご介jQ Q己
r−、14、V)Jブー;ンスミト、py’r’F2を
2〈す模式図で5うろっ特1;1゛出願人 ノエ不ノテ
ク、イノコーボレイテット代 理 人 弁理士 前出
保 41名唱ハψpしさゲυ(支)」1フ]ヒ一乙4
813本: 5’ GTTGTTTCTCACTT
CAACAAAT(41童停: 5’ ACCAG
GAAGCGGCAGGTGCCG−第1v!J ic CCA GACTCCCATACCCAG TT
CTGCrGGAAGCAGAACTGGGTATG第
5図 Met−Lys−Ala−11e−Phe−Val−L
eu−Lys−Gly−5er−Leu−Asp−Va
l−Val−、、、TG Fひ Met−Lys−、、、(1867ミノ資)0.。 Ala−Glu−Glu−Phe、−Met−EcoR
工
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、ヒト成熟TGF−α、TGF−αC、 TGF−α
NまたはTGF−αmCを含有し、実質的に他のヒト−
タンパク質を含まない生産物。 2、第1項に記載の生産物を含浸させた包帯。 3、アミノ酸残基が挿入、置換または欠失されてなるヒ
トTGF−αmC、TGF−αC、TGF−αNまたは
成熟TGF−αの突然変異体。 4、主産物中のシスティン残基がセリンに置換されてな
る第3項に記載の突然変異体。 5、実質的に他のヒト−タンパク質を含まない、ヒトT
GF−α前駆体。 6、ヘテロローガスな組換え宿主細胞によって生産され
たTGF−α前駆体、またはそのフラグメントを含有す
る組成物。 7、TGF−α前駆体またはそのフラグメントが突然変
異体である第6項に記載の組成物。 8、TGF−α前駆体またはそのフラグメントを暗号化
している組換えDNAの供給源である微生物にとってヘ
テロローガスなポリペプチドと結合している第6項に記
載の組成物。 9、ヘテロローガスなポリペプチドが微生物からのもの
である第8項に記載の組成物。 10、微生物のポリペプチドが信号配列である第8項に
記載の組成物。 11、TGF−α前駆体またはそのフラグメントが、ヒ
ト起源のものであり、更に予め定められた量のヒトタン
パク質をも含有している第6項に記載の組成物。 12、検出可能な部分で標識されている第6項に記載の
組成物。 13、更に、薬学的に許容し得る担体、並びに治療有効
量のTGF−α前駆体またはそのフラグメントをも含有
している第6項に記載の組成物。 14、滅菌されており、かつ予め定められた量のTGF
−βをも含有する第13項に記載の組成物。 15、第13項に記載の組成物を動物に投与することか
らなる方法。 16、組成物を創傷部位に局所適用することからなる第
15項に記載の方法。 17、結合したヘテロローガスなタンパク質に対する免
疫応答性を有する動物を、第8項に記載の組成物で免疫
することからなる方法。 18、免疫した動物から抗血清を得ることを含む第17
項に記載の方法。 19、唯一のヒトPRTGF−αエピトープが、成熟T
GF−α以外の、TGF−αC、TGF−αmCまたは
これらのフラグメントのエピトープである様なタンパク
質で動物を免疫する方法。 20、TGF−α前駆体またはそのフラグメントを暗号
化したDNA配列であって、それが成熟TGF−αであ
るときは、ヒトの成熟TGF−αである、DNA配列。 21、フラグメントがTGF−αmCまたはTGF−α
Cである第20項に記載のDNA。 22、ヘテロローガスなタンパク質を暗号化しているD
NAにライゲートしている第20項に記載のDNA。 23、第20項に記載のDNA配列を含有している複製
可能なベクター。 24、プラスミドまたはウイルスである第23項に記載
のベクター。 25、第23項に記載のベクターで形質転換した細胞。 26、真核細胞である第25項に記載の細胞。 27、酵母である第26項に記載の細胞。 28、TGF−α前駆体またはそのフラグメントを含む
ポリペプチドの製造方法であって: (a)宿主細胞と一緒になって、該ポリペプチドを暗号
化しているDNA配列を発現させる様に作用し得る発現
ベクターを調製し; (b)該宿主細胞をこの発現ベクターで形質転換して組
換え宿主細胞を得; (c)この組換え宿主細胞を生産物が発現する条件の下
で培養し;次いで、 (d)宿主細胞の培養物中から生産物を回収することか
らなる方法。 29、生産物を不溶性の凝集物として回収した後、可溶
化させることを含む第28項に記載の方法。 30、生産物を宿主細胞から分泌させた後、宿主細胞の
培地から回収することを含む第28項に記載の方法。 31、TGF−αmCまたはTGF−αcの存在に関し
て、体組織または体液を分析することからなる診断方法
。 32、TGF−αmCを測定するための診断方法であっ
て: (a)体液試料をTGF−αmCのTGF−αC領域と
結合し得る抗体と接触させ; (b)体液試料をTGF−αmCの成熟TGF−α領域
と結合し得る抗体と接触させ; (c)(a)または(b)における抗体を検出可能な部
分で標識化し; (d)標識化されていない抗体を不溶化し;(e)可溶
性の相と不溶性の相とを分離し、次い(f)両相間にお
ける標識の分布を測定することからなる方法。 33、PRTGF−α種内の予め定められたアミノ酸配
列に対して高められた抗体。 34、検出可能な成分で標識された第33項に記載の抗
体。 35、第33項に記載の抗体を得る方法であって、該ア
ミノ酸配列と、ヘテロローガスなポリペプチドとを結合
させ、そのものにより動物を免疫することを含む方法。 36、第33項に記載の抗体を含有する組成物を動物に
投与することからなる方法。 37、TGF−α誘発性高カルシウム血症の患者にTG
F−α結合剤を投与し、細胞表面受容体に対するTGF
−αの活性化作用を阻害することからなる、該患者の治
療方法。 38、該剤がタンパク質である第37項に記載の方法。 39、該タンパク質が、抗TGF−αまたは細胞のTG
F−α受容体のTGF−α結合領域を含有するものであ
る第38項に記載の方法。 40、タンパク質が、実質的にTGF−α結合領域から
なるものであり、また受容体がEGF受容体である第3
9項に記載の方法。 41、抗−TGF−αの結合領域がFabフラグメント
であり、TGF−α受容体の結合領域がEGF受容体の
細胞外アミノ末端領域である第39項に記載の方法。 42、治療有効量のTGF−α結合剤と、薬学的に許容
し得る担体からなる、細胞表面の受容体に対するTGF
−αの活性化作用を阻止するための滅菌した治療用組成
物。 43、結合剤が抗TGF−αまたは細胞のTGF−α受
容体のTGF−α結合領域を含有するタンパク質である
第42項に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US58174384A | 1984-02-17 | 1984-02-17 | |
US581743 | 1984-02-17 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6163699A true JPS6163699A (ja) | 1986-04-01 |
Family
ID=24326395
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60031380A Pending JPS6163699A (ja) | 1984-02-17 | 1985-02-18 | ヒト形質転換発育因子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6163699A (ja) |
-
1985
- 1985-02-18 JP JP60031380A patent/JPS6163699A/ja active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4742003A (en) | Human transforming growth factor | |
CA2263890C (en) | Recombinant vascular endothelial cell growth factor d (vegf-d) | |
JPH06508031A (ja) | ヘレグリンの構造、生産および用途 | |
JPH0763378B2 (ja) | TGF−βをコードしているDNA | |
NZ218631A (en) | Single chain angiogenic factor protein and methods for its production | |
JP5099943B2 (ja) | ポリペプチド、ポリヌクレオチド及びその用途 | |
JPS6163699A (ja) | ヒト形質転換発育因子 | |
US7544485B2 (en) | Baldness related gene and the polypeptide encoded thereby, and uses | |
JP2001503255A (ja) | 胎盤から誘導された前立腺の成長因子 | |
JPH05509320A (ja) | 組織誘導型腫瘍成長抑制物質、その調製及び使用方法 | |
CN100415299C (zh) | 胚泡着床相关因子及其用途 | |
JPH03504796A (ja) | TGF―β3をコードしている核酸およびその使用 | |
JPH09182596A (ja) | ヒトインヒビンβ▲B▼鎖の合成方法 | |
JPS61501168A (ja) | 生長因子における改良 |