JPS6152299A - Preparation of glutathione by yeast - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To accumulate a remarkable amount of glutathione in yeast cells, by incorporating a recombinant plasmid of a gamma-glutamylcysteine synthetic enzyme gene in a yeast, and cultivating the resultant yeast in a nutrient culture medium. CONSTITUTION:A gamma-glutamylcysteine synthetic enzyme gene is recombined in a plasmid, and the resultant recombinant plasmid is incorporated in a yeast, e.g. Saccharomyces cerevisiae, having the ability to produce glutathione. The resultant yeast is then cultivated in a nutrient culture medium to give yeast cells. The glutathione is then extracted from the resultant yeast cells and purified. A plasmic vector, e.g. YRp7, YIp1, YEp13, etc. capable of multiplying replicating and multiplying together with the multiplication of the yeast of the genus Saccharomyces is used as the plasmid vector.

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規なグルタチオンの製造に関し、更に詳し
くはグルタチオンの生産に関与するγ−グルタミルシス
テイン合成酵素遺伝子をプラスミドベクターと組換え、
得られた組換えプラスミドをサツカロミセス属酵母に含
有せしめ、該酵母を栄養培地、もしくはＬ−シヌティン
、Ｌ−シヌチ７、Ｌ−システイン誘導体、Ｌ−グルタミ
ン酸ヲ単独もしくは混合して添加した栄養培地にて培養
し、得られた酵母菌体中からグルタチオンを抽出するグ
ルタチオンの製造方法に関する。Detailed Description of the Invention (Industrial Application Field) The present invention relates to the production of novel glutathione, and more specifically, the present invention relates to the production of novel glutathione, and more specifically, the present invention relates to the production of glutathione by recombining the γ-glutamylcysteine synthase gene involved in the production of glutathione with a plasmid vector.
The obtained recombinant plasmid was contained in yeast of the genus Satucharomyces, and the yeast was incubated in a nutrient medium or in a nutrient medium to which L-cynutin, L-cynutin 7, L-cysteine derivatives, and L-glutamic acid were added alone or in combination. The present invention relates to a method for producing glutathione, which involves culturing and extracting glutathione from the obtained yeast cells.

グルタチオンは酵母及び動物の肝臓等に広く分布してお
り、生体内の呼吸系、酸化還元に関与する他、解毒作用
、酵素賦活作用、補酵素としての作用等の重要な生理作
用を有するトリペプチドであり、近年、肝臓疾患治療剤
として重要視され、広く用いられている。Glutathione is widely distributed in yeast and animal livers, etc., and is a tripeptide that is involved in the respiratory system and redox in living organisms, and has important physiological effects such as detoxification, enzyme activation, and coenzyme action. In recent years, it has become important and widely used as a therapeutic agent for liver diseases.

本発明の目的は、このグルタチオンを発酵工業的に有利
に製造する方法を提供することにある。An object of the present invention is to provide a method for producing glutathione advantageously in the fermentation industry.

（従来の方法） グルタチオンを発酵工業的に製造する方法としては、従
来よシ、酵母を培養し、その菌体中から抽出する方法が
広く用いられている。それ故、この酵母菌体中のグルタ
チオン含量を高める試みが現在まで種々なされてきた。(Conventional Method) Conventionally, as a method for industrially producing glutathione by fermentation, a method of culturing yeast and extracting it from the cells has been widely used. Therefore, various attempts have been made to increase the glutathione content in yeast cells.

例えばグルタチオンを構成する３種のアミノ酸であるし
一システィン。For example, cysteine is one of the three amino acids that make up glutathione.

Ｌ−グルタミン酸、グリシンの単独あるいは混合添加に
よる方法（特公昭４７−２６８１４．特開昭４８−９２
５７９　、特開昭５３−９４０８９）、Ｌ−シスチン添
加による方法（特公昭５４−９９７）、メチオニン及び
その誘導体の添加による方法（特開昭４８−４４４８７
．特開昭４８−４４４８８．。Method by adding L-glutamic acid and glycine alone or in combination (Japanese Patent Publication No. 47-26814; Japanese Patent Publication No. 48-92
579, Japanese Patent Publication No. 53-94089), a method by adding L-cystine (Japanese Patent Publication No. 54-997), a method by addition of methionine and its derivatives (Japanese Patent Publication No. 48-44487)
．． Japanese Patent Publication No. 48-44488. .

特開昭４８−９２５７９　、特開昭５ｌ−８６３５７）
や突然変異処理により得たメチオニンアナログ耐性株に
よる方法（特公昭５６−４６８２６　）、メチオニンあ
るいはメチオニン・リジン要求株による方法Ｃ特開昭４
８−６１６８９）、Ｌまだはり。JP-A-48-92579, JP-A-5L-86357)
method using a methionine analog resistant strain obtained by or mutation treatment (Japanese Patent Publication No. 56-46826), method C using a methionine or methionine-lysine demanding strain
8-61689), L-shaped beam.

Ｌ−エチオニン感受性株による方法（特公昭５３−８１
９５６＞等が既に報告されている。また大腸菌を用いる
方法としてはグルタチオン合成に関与する酵素のクロー
ニングが行なわれ、グルタチオンの生産性を扁める研究
がなされている（特開昭５８−２０１８８　、特開昭５
８−２０１９６゜特開昭５８−２０１９７）。しかし々
から、これらの方法においてはグルタチオンの生産量が
必ずしも満足のいくものではなかった。Method using L-ethionine-sensitive strains (Special Publication No. 53-81
956> etc. have already been reported. In addition, as a method using Escherichia coli, enzymes involved in glutathione synthesis have been cloned, and research has been conducted to reduce the productivity of glutathione (Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-20188,
8-20196° Japanese Patent Publication No. 58-20197). However, in these methods, the amount of glutathione produced was not always satisfactory.

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、かかる状況に鑑み酵母菌体内に著量のグ
ルタチオンを蓄積せしめ工業的に有利な方法を見出すべ
く検討を重ねてきた。グルタチオン（Ｌ−γ−グルタミ
ル・システイニル・グ’Ｊシン）は、Ｌ−グルタミン酸
、Ｌ−シヌティンからγ−グルタミルシステイン合ｔｆ
ｆｉ酵素（Ｅ、Ｃ，６゜８．２．２．）で、捷ずγ−グ
ルタミルシステインが合成され、更にグルタチオン合成
酵素（Ｅ、Ｃ１６，８，２，８，〕の作用でγ−グルタ
ミルシステインにグリシンが付加されて生じるトリペプ
チドである。狭義には、この２つの酵素系がグルタチオ
ン合成系の酵素と考えられるが、広義にはグルタチオン
の前駆物質の合成系もグルタチオン合成酵素系に含まれ
ると考えられる。本発明者らは、このようなグルタチオ
ンの生産に関与する遺伝子を広く検索するとともに、染
色体遺伝子を制限酵素で切断し、プラスミドベクターに
つなぎかえた多数の組換え体プラスミドを作製し、該組
換え体プラスミドを酵母に形質転換することによって生
じる形質転換株中のグルタチオン含量を測定して、グル
タチオンの生産性を向上させる遺伝子を得るべく鋭意努
力を重ねてきた。その結果、グルタチオンの生産に関与
する遺伝子のうちγ−グルタミルシステイン合成酵素遺
伝子をプラスミドに組換え、該組換えプラスミドをサツ
カロミセス属酵母に含有せしめ、該酵母を栄養培地で培
養し、該酵母菌体中に著量蓄積せしめることに成功した
。さらに、Ｌ−シヌティン、Ｌ−シスチン、Ｌ−シヌテ
ィン誘導体、Ｌ−グルタミン酸を単独もしくは混合して
添加した栄養培地にて培養することによって該酵母菌体
中に更に著量のグルタチオンを蓄積せしめ、該組換えプ
ラスミドを有する酵母菌体からグルタチオンを抽出、精
製することに成功し、本発明を完成した。(Problems to be Solved by the Invention) In view of this situation, the present inventors have made repeated studies to find an industrially advantageous method for accumulating a significant amount of glutathione within yeast cells. Glutathione (L-γ-glutamyl cysteinyl g'J-syn) is a compound of γ-glutamylcysteine from L-glutamic acid and L-cynutin.
fi enzyme (E, C, 6°8.2.2.), γ-glutamylcysteine is synthesized without cleavage, and γ-glutamylcysteine is further synthesized by the action of glutathione synthetase (E, C16,8,2,8,). It is a tripeptide produced by the addition of glycine to cysteine.In a narrow sense, these two enzyme systems are considered to be enzymes of the glutathione synthesis system, but in a broader sense, the system for synthesizing the precursor of glutathione is also included in the glutathione synthase system. The present inventors conducted a wide search for genes involved in the production of glutathione, and created a large number of recombinant plasmids by cutting chromosomal genes with restriction enzymes and connecting them to plasmid vectors. We have made extensive efforts to obtain a gene that improves glutathione productivity by measuring the glutathione content in the transformed strain produced by transforming yeast with the recombinant plasmid. The γ-glutamylcysteine synthase gene among the genes involved in the production of Furthermore, by culturing in a nutrient medium supplemented with L-synutin, L-cystine, L-synutin derivatives, and L-glutamic acid, either alone or in combination, even more significant amounts were accumulated in the yeast cells. The present invention was completed by successfully extracting and purifying glutathione from yeast cells containing the recombinant plasmid.

（問題点を解決するだめの手段及び作用効果）即ち本発
明は、γ−グルタミルシステイン合６酵素遺伝子の組換
えプラスミドを酵母に含有せしめ、該酵母を栄養培地、
さらにはＬ−システイン。(Means and Effects for Solving the Problems) That is, the present invention involves containing a recombinant plasmid of the γ-glutamylcysteine hexazyme gene in a yeast, and injecting the yeast into a nutrient medium,
Furthermore, L-cysteine.

Ｌ−シスチン、Ｌ−シフティンｍ導体。ｐ−グルタミン
酸を単独もしくは混合して添加した栄養培地中で酵母菌
体を培養し、得られた酵母菌体中からグルタチオンを抽
出し、精製してグルタチオンを製造する方法である。L-cystine, L-shiftine m conductor. In this method, yeast cells are cultured in a nutrient medium to which p-glutamic acid is added alone or in combination, and glutathione is extracted from the resulting yeast cells and purified to produce glutathione.

本発明を実施するにあたって、γ−グルタミルシステイ
ン合成酵素遺伝子の供与酵母としては、グルタチオン生
産能を有する酵母であればいづれでも適用できるが、特
にグルタチオン生産性が高いサツカロミセス−セレビシ
ェ、キャンデイダ・ユテイリヌ等の酵母があげられる。In carrying out the present invention, any yeast capable of producing glutathione can be used as the donor yeast for the γ-glutamylcysteine synthase gene, but yeasts such as Satucharomyces cerevisiae and Candida uteilinus, which have particularly high glutathione productivity, can be used. Yeast can be given.

これらのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の供
与酵母は野生株でもよいが、変異処理によりγ−グルタ
ミルシステイン合成酵素のグルタチオンによるフィード
バック阻害の解除された酵母を使用することにより更に
良い結果を得ることが期待できる。The yeast that provides these γ-glutamylcysteine synthetase genes may be a wild strain, but even better results can be obtained by using yeast in which the feedback inhibition of γ-glutamylcysteine synthetase by glutathione has been removed through mutation treatment. You can expect it.

プラスミドベクターとしては、サツカロミセス属酵母の
増殖とともに複製、増殖できるプラスミドであればいづ
れでもよく、例えばＹＲｐ　７　、　ｙｒｐｉ。The plasmid vector may be any plasmid that can replicate and propagate along with the growth of yeast of the genus Satucharomyces, such as YRp 7 and yrpi.

ＹＥｐ６　、ＹＥｐ　１３　、ｐＪＤＢ２１．９　、ｐ
ＹＣ−１。YEp6, YEp13, pJDB21.9, p
YC-1.

ｐＭＰ７８−１　、ｐＭＰ８１．２μｍＤＮＡ　、ｐｓ
Ｒｌ　。pMP78-1, pMP81.2 μm DNA, ps
Rl.

ｐＳＲ２等のプラスミドベクターが挙げられる。Examples include plasmid vectors such as pSR2.

組換えプラスミドの受容酵母としてはγ−グルタミルシ
ステイン合成酵素遺伝子の供与酵母が通常用いられる。As the recipient yeast for the recombinant plasmid, a yeast that provides the γ-glutamylcysteine synthetase gene is usually used.

また変異処理によりγ−グルタミルシステイン合成酵素
を欠損した突然変異株を用いてもよいし、通常にグルタ
チオンを生産する野生株を用いてもよいが、変位処理に
よりグルタチオン生産能の向上した酵母を用いることに
より更に良い結果が期待できる。Furthermore, a mutant strain that lacks γ-glutamylcysteine synthetase through mutation treatment may be used, a wild strain that normally produces glutathione may be used, but yeast whose glutathione-producing ability has been improved through mutation treatment may be used. By doing so, even better results can be expected.

本発明の組換えプラスミドを得るには、以下に述べる方
法を用いればよい。即ち、前記供与酵母から染色体遺伝
子を抽出し、適当な大きさの断片となるまで制限エンド
ヌクレアーゼで処即し、切断する。プラスミドベクター
としてはエシェリヒア・コリ菌体内及びサツカロミセス
・セレビシェ菌体内で発現可能ないわゆるシャトル・ベ
クター（５ｈｕｔｔｌｅ　　Ｖｅｃｔｏｒ　）であるこ
とが望ましいが、該プラスミドベクターを酵母染色体遺
伝子と同じ切断断片を有する制限エンドヌクレアーゼで
処理し、開裂したプラスミドベクターを得る。かくして
得られたプラスミドベクターと酵母染色体遺伝子断片を
混合し、リガーゼにより連結せしめることによって酵母
染色体遺伝子断片とプラスミドベクターの組換えプラス
ミドが得られる。以上の方法により得られた染色体遺伝
子断片とプラスミドベクターとの組換えプラスミドは、
いったんポリバーらの形質転換法〔ジーン（Ｇｅｎｅ　
）２巻９５頁（１９Ｔ’７年）〕によってエシェリヒア
・コリに導入、前記供与酵母染色体のエシェリヒア・コ
リを宿主としたシーンバンク（Ｇｅｎｅ　　ｂａｎｋ　
）を作製する。該シーンバンクからのγ−グルタミルシ
ステイン合成酵素遺伝子の選択法は、まず前記組換えプ
ラスミド受容酵母を突然変異処理することによってγ−
グルタミルシステイン合成酵素を欠損し、菌体内にグル
タチオンを生産できない酵母を作成し、該酵母を受容酵
母として前記シーンバンクから抽出した酵母染色体遺伝
子とプラスミドベクターの組換えプラスミドをヒネンら
の形質転換法〔プロシーディンゲス・オブｅナショナル
アカデミ−・オブ・サイエンヌ（Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ。The method described below may be used to obtain the recombinant plasmid of the present invention. That is, the chromosomal gene is extracted from the donor yeast, treated with restriction endonuclease, and cut into fragments of an appropriate size. The plasmid vector is preferably a so-called shuttle vector that can be expressed in Escherichia coli cells and Satucharomyces cerevisiae cells. to obtain a cleaved plasmid vector. By mixing the thus obtained plasmid vector and the yeast chromosomal gene fragment and ligating them using ligase, a recombinant plasmid of the yeast chromosomal gene fragment and the plasmid vector is obtained. The recombinant plasmid of the chromosomal gene fragment and plasmid vector obtained by the above method is
Once the transformation method of Polliver et al.
) Vol. 2, p. 95 (19T'7)], the donor yeast chromosome was introduced into Escherichia coli using Escherichia coli as a host.
). The method for selecting the γ-glutamylcysteine synthase gene from the scene bank is to first mutagenize the yeast that has received the recombinant plasmid.
A yeast lacking glutamylcysteine synthase and unable to produce glutathione within the bacterial body was created, and the yeast was used as a recipient yeast to transform the recombinant plasmid of the yeast chromosomal gene and plasmid vector extracted from the scene bank using the transformation method of Hinen et al. Proceedings of the National Academy of Sciences (Pro, Natl., A.
cad.

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　７５巻１９２９頁（１９７８年）〕
によって導入し、グルタチオンの生産を回復させる組換
えプラスミドを選択する。かくして得られたγ−グルタ
ミルシステイン合成酵素遺伝子を有するプラスミドは、
そのままでも本発明の組換えプラスミドとして使用する
ことができるが、必要に応じて適当な制限エンドヌクレ
アーゼで切断し、酵母染色体遺伝子断片中のγ−グルタ
ミルシステイン合成酵素遺伝子部分を切り出し、通常の
組換えＤＮＡ技術を適用して所望のプラスミドベクター
と連結し、新たな組換えプラスミドを作製しても何らさ
しつかえない。得られた組換えプラスミドは前記組換え
ＤＮＡ受容酵母に形質転換法によって導入し、所望の形
質転換体を得ることができる。Sci, USA) Vol. 75, p. 1929 (1978)]
and select recombinant plasmids that restore glutathione production. The thus obtained plasmid containing the γ-glutamylcysteine synthase gene is
Although it can be used as it is as a recombinant plasmid of the present invention, if necessary, it can be cleaved with an appropriate restriction endonuclease to cut out the γ-glutamylcysteine synthase gene portion in the yeast chromosomal gene fragment. There is nothing wrong with creating a new recombinant plasmid by applying DNA technology and ligating it with a desired plasmid vector. The obtained recombinant plasmid can be introduced into yeast receiving the recombinant DNA by a transformation method to obtain a desired transformant.

以上の組換えプラスミド及び形質転換株の作製法につい
ては、その代表的な方法の１例を示したにすぎず、必ず
しもこの方法に限定されるものではない。例えば組換え
プラスミドの作製法に関して、染色体遺伝子を物理的方
法により切断する方法や染色体遺伝子断片と開裂したプ
ラスミドベクターをデオキシアデニル酸とデオキシチミ
ジル酸、またはデオキシグアニル酸とデオキシシチジル
酸をそれぞれ付加したのち混合し、アニーリングにより
連結せしめる方法、捷だ酵母染色体遺伝子とプラスミド
ベクターの組換えプラスミドをシーンバンクを作ること
なく直接グルタチオン生産能を有スる酵母、又はγ−グ
ルタミルシステイン合成酵素を欠損した酵母に導入し、
γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を選択する方
法等も当然用いることができる。The methods for producing recombinant plasmids and transformed strains described above are merely examples of typical methods, and are not necessarily limited to these methods. For example, regarding methods for producing recombinant plasmids, methods include cutting chromosomal genes by physical methods, adding deoxyadenylic acid and deoxythymidylic acid, or deoxyguanylic acid and deoxycytidylic acid to the chromosomal gene fragment and the cleaved plasmid vector, respectively. A method in which the recombinant plasmid of the yeast chromosomal gene and plasmid vector is subsequently mixed and ligated by annealing is used to directly produce yeast capable of producing glutathione without creating a scene bank, or yeast lacking γ-glutamylcysteine synthase. introduced in
Naturally, a method for selecting the γ-glutamylcysteine synthase gene can also be used.

本発明によって得られたγ−グルタミルシステイン合成
酵素遺伝子をプラスミドに有する酵母を培養してグルタ
チオンを生成、蓄積せしめるには特別の手段は必要でな
く、通常の炭素源、窒素源および酵母の必要とする無機
ならびに有機栄養源を含む培地で培養を行えばよい。γ
−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を含む組換えプ
ラスミドを導入された酵母は、γ−グルタミルシステイ
ン合成酵素活性が高められている。それ故、一般にグル
タチオンの、とくにγ−グルタミルシステインの構成ア
ミノ酸の生合成が、グルタチオン合成の律速因子となっ
ている。Ｌ−システインあるいは生体内で容易にＬ−シ
ステインに変換されうるシスチン、Ｎ−アセチルシヌテ
イン、グルコーヌシヌテイン等のし一シヌテイン誘導体
及びγ−グルタミルシステインの基質となるし一グルタ
ミン酸を単独もしくは混合して栄養培地に添加すること
によって更に含量が向上する。No special means are required to produce and accumulate glutathione by culturing the yeast having the γ-glutamylcysteine synthase gene obtained in the present invention in a plasmid, and it uses ordinary carbon sources, nitrogen sources, and the needs of yeast. Culture may be carried out in a medium containing inorganic and organic nutrient sources. γ
- Yeast into which a recombinant plasmid containing the glutamylcysteine synthetase gene has been introduced has enhanced γ-glutamylcysteine synthetase activity. Therefore, biosynthesis of the constituent amino acids of glutathione in general, and γ-glutamylcysteine in particular, is the rate-limiting factor for glutathione synthesis. L-cysteine or cystine that can be easily converted into L-cysteine in the body, N-acetyl synutein, glucone synutein derivatives such as glucone synutein, and monoglutamic acid that serves as a substrate for γ-glutamylcysteine, singly or in combination. The content can be further increased by adding it to the nutrient medium.

炭素源としてはグルコーヌ、フラクトーヌ、澱粉加水分
解物、糖蜜等の糖類：グリセロール、エタノール等のア
ルコール類；酢酸、クエン酸、α−ケトゲルタール酸等
の有機酸類が使用できる。As carbon sources, sugars such as glucone, fructone, starch hydrolyzate, and molasses; alcohols such as glycerol and ethanol; and organic acids such as acetic acid, citric acid, and α-keto gel tar acid can be used.

窒素源としてはアンモニア水、硫酸アンモニウム。Nitrogen sources include ammonia water and ammonium sulfate.

塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、尿素等が使用で
きる。培養は通常ｐＨ８，０〜８．０、温度は１０°Ｃ
〜４５°Ｃ１好ましくは２５°Ｃ〜３５°Ｃにて好気的
に培養する。Ammonium salts such as ammonium chloride, urea, etc. can be used. Culture is usually pH 8.0-8.0 and temperature 10°C.
Cultivate aerobically at ~45°C, preferably 25°C to 35°C.

かくして得られた酵母菌体からグルタチオンを製造する
には何ら特別な方法は必要ではない。例えばグルタチオ
ンは酵母菌体内から熱水抽出等の方法によって抽出し、
イオン交換樹脂処理法、あるいは銅塩沈澱法等の公知の
方法にて精製することができる。No special method is required to produce glutathione from the yeast cells thus obtained. For example, glutathione is extracted from yeast cells using methods such as hot water extraction.
It can be purified by a known method such as an ion exchange resin treatment method or a copper salt precipitation method.

（実施例） 本発明の有用性は以下の実施例によって示すが、これに
よって本発明が制限されるものではない。(Example) The usefulness of the present invention is illustrated by the following example, but the present invention is not limited thereby.

実施例１ （１）遺伝子供与酵母からの染色体遺伝子断片の調グル
タチオンを菌体内に生産するサツカロミセス・セレビシ
より１８−ＩＡ株（ａ　、　ｈｉｓ　８゜ｔｒｐｌ　、
　ｇａ１２　）　（米国スタンフォード大学Ｒ１Ｗ、Ｄ
ａシｉｓ博士より分与していただいた）（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−８０８）を酵母エキス１％、ペプトン２係、グル
コース２係からなる１１の液体培地にて対数増殖後期ま
で培養し、集菌後、１Ｍソルビトール−０，ＩＭ　　Ｅ
ＤＴＡ緩衝液ｐＴ（７，５に懸濁、ザイモリエース（Ｚ
ｙｍｏ＋ｙａｓｅ　）６００００にて３０°Ｃ，１時間
処理してスフェロプラストの状態にした。得られたスフ
ェロプラストを０．１５Ｍ　　Ｎａ１ｌ　−０、ＩＭ　
　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）溶液に再懸濁し、プロテイナ
ーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　’Ｋ　）にて処理後、
ＳＤＳにて溶菌すせ、同量のクロロホルム−イソアミル
アルコール（２４：１）と激しく混合し、混合液を遠心
処理後、上層液に２倍量の冷エタノ−）Ｉｉを加えて、
ガラス棒により不溶化した染色体ＤＮ’Ａ約１０ｍ、９
を採取した。得られた染色体ＤＮＡ　　１００μｇを制
限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａ−Ｉと混合し、３７°
Ｃ１分、５分寸たけ１０分反応させ、部分的に切断した
後、６５°Ｃ５分間の熱処理を行った。アガロースゲル
電気泳動法にて泳動後、分子量２　Ｘ　１０６ダルトン
から１×１０７ダルトンの断片画分をアガロースから抽
出し、フェノール処理を行った後、２倍量の冷エタノー
ルを加えて染色体遺伝子断片を沈澱。Example 1 (1) Preparation of chromosomal gene fragments from gene donor yeast 18-IA strain (a, his 8°trpl,
ga12) (R1W, D, Stanford University, USA)
Kindly provided by Dr. A.S.) (FERM
BP-808) was cultured in 11 liquid media consisting of 1% yeast extract, 2 parts peptone, and 2 parts glucose until late logarithmic growth, and after harvesting, 1M sorbitol-0, IM E
Suspended in DTA buffer pT (7,5), Zymolyase (Z
ymo+yase) 60,000 at 30°C for 1 hour to form spheroplasts. The obtained spheroplasts were treated with 0.15M Na1l-0, IM
After resuspending in EDTA (pH 8,0) solution and treating with proteinase K,
Lyse the bacteria with SDS, mix vigorously with the same amount of chloroform-isoamyl alcohol (24:1), centrifuge the mixture, and add twice the amount of cold ethanol II to the upper layer.
About 10 m of chromosomal DNA'A insolubilized with a glass rod, 9
was collected. 100 μg of the obtained chromosomal DNA was mixed with restriction endonuclease 5au3A-I and incubated at 37°
After reacting for 1 minute and 5 minutes at C for 10 minutes, it was partially cut and then heat treated at 65°C for 5 minutes. After agarose gel electrophoresis, a fragment fraction with a molecular weight of 2 x 106 Daltons to 1 x 107 Daltons was extracted from the agarose, treated with phenol, and then added with twice the amount of cold ethanol to extract the chromosomal gene fragments. precipitation.

採取した。Collected.

（２）　　プラスミドベクターの調製 ＹＲｐ　７をプラスミドとして保有しているエシェリヒ
ア−コリＨＢＩＯＩをアンピシリン２０　ｍｇ、テトラ
サイクリン１５ｍ、ｉ７を含む１１のＬ培地（ペプトン
１％、酵母エキス０．５％、クルコーヌＯ，ｔｑ６．食
塩０．５係、ｐＨ７，２に調整）にて対数増殖期捷で培
養した後、クロラムフェニコールを１７０μｇ／ｍｌｌ
になるように添加、さらに１７時間、３７°Ｃにて培養
を行なった。集菌後。(2) Preparation of plasmid vector Escherichia coli HBOI carrying YRp 7 as a plasmid was transferred to 11 L medium containing 20 mg of ampicillin, 15 m of tetracycline, i7 (1% peptone, 0.5% yeast extract, Courcone O, After culturing in the logarithmic phase with tq6.table salt (0.5 part) and pH adjusted to 7.2, chloramphenicol was added at 170 μg/ml.
The cells were added so that the following amount of cells was added and cultured at 37°C for an additional 17 hours. After collecting bacteria.

リゾチーム処理、ブリッジ（Ｂｒ１ｊｉ　）５８−デオ
キシコール酸処理によって溶菌し、４８，０００×ｇ、
３０分の遠心分離を行ない上清を得た。Lysed by lysozyme treatment, bridge (Br1ji) 58-deoxycholic acid treatment, 48,000 x g,
A supernatant was obtained by centrifugation for 30 minutes.

この上清からフェノール処理、冷エタノール沈　。This supernatant was treated with phenol and precipitated with cold ethanol.

澱によりプラスミドＤＮＡを濃縮し、セシウムクロライ
ド−エチジウムブロマイド平衝密度勾配遠心法によって
精製ＹＲｐ７を得た。The plasmid DNA was concentrated using the sediment, and purified YRp7 was obtained by cesium chloride-ethidium bromide density gradient centrifugation.

（３）酵母染色体遺伝子のジ−パンクの作製（２）で得
られたプラスミドベクターＹＲｐ７に制限エンドヌクレ
アーゼＢａｍＨ１を３７°Ｃ，２時間作用させ、６５°
Ｃ，５分間の熱処理を行なって完全に切断した。この開
裂したプラスミドＹＲｐ７　１μｇに（１）で得だ染色
体遺伝子断片５μｇを加えて混合し、ＡＴＰ及びジチオ
スレイトール、塩化マグネシウム存在下、Ｔ４ファージ
由来のＤＮＡ！Ｊガーゼを５°Ｃ９２０時間作用せしめ
プラスミドベクターと染色体遺伝子断片の連結反応を行
なった。反応終了後、６５°Ｃ，５分間熱処理を行い、
２倍量の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させ、遠心
操作により回収した。連結後のＤＮＡを　１００ｍＭ塩
化カルシウム処理によってコンピテントにしたエシェリ
ヒア・コリＣ６００（ｒ　、　ｍ　、ｌｅｕ　、ｔｈｒ
−、ｔｈｉ−）細胞懸濁液に加え、０°Ｃ１時間反応さ
せた後、４２°Ｃ７７５秒間の処理を行い、その後り培
地を加え３７°Ｃで２時間培養した。形質転換株はアン
ピシリンを２０μ９／ｍｌＪ含むＬ固形培地及びテトラ
サイクリンを１５μｇ／ｍｌＪ含むし固形培地を用い、
アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性株として選
択した。以上の実験を繰り返すことにより、約１万株の
形質転換株を得、エシェリヒア・コリを宿主とした酵母
染色体シーンバンクを作製した。(3) Preparation of yeast chromosomal gene G-Punk The plasmid vector YRp7 obtained in (2) was treated with restriction endonuclease BamH1 at 37°C for 2 hours, and then
C. Heat treatment was performed for 5 minutes to completely cut the sample. To 1 μg of this cleaved plasmid YRp7, 5 μg of the chromosomal gene fragment obtained in (1) was added and mixed, and in the presence of ATP, dithiothreitol, and magnesium chloride, the T4 phage-derived DNA! A ligation reaction between the plasmid vector and the chromosomal gene fragment was carried out by applying J gauze at 5°C for 920 hours. After the reaction was completed, heat treatment was performed at 65°C for 5 minutes.
DNA was precipitated by adding twice the amount of cold ethanol and recovered by centrifugation. The ligated DNA was transformed into Escherichia coli C600 (r, m, leu, thr) made competent by treatment with 100 mM calcium chloride.
-, thi-) was added to the cell suspension and reacted at 0°C for 1 hour, then treated at 42°C for 775 seconds, after which a medium was added and cultured at 37°C for 2 hours. The transformed strain used L solid medium containing 20 μg/ml J of ampicillin and solid medium containing 15 μg/ml J tetracycline.
The strain was selected as ampicillin resistant and tetracycline sensitive. By repeating the above experiment, about 10,000 transformed strains were obtained, and a yeast chromosome scene bank using Escherichia coli as a host was created.

（４）　　γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の
選択 サツカロミセス・セレビシより１８−ＩＡをニトロソグ
アニジン（Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグ
アニジン）にて処理し、ニトロプルジッド発色反応とア
ロキサン法〔メソッド・オブ・バイオケミカルｅアナリ
シス（Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
　　Ａｎａｌｙｓｉｓ）　２巻２７３頁（１９５４年）
〕によりグルタチオンを菌体内に蓄積できない株を選択
し、丈にマイスター（Ｍｅｉｓｔｅｒ　）　　らの方法
〔ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル−ケミストリ
ー（Ｊ、Ｂｉｏｌ。(4) Selection of γ-glutamylcysteine synthetase gene 18-IA from Satucharomyces cerevisi was treated with nitrosoguanidine (N-methyl-N'-nitro N-nitrosoguanidine), followed by nitropurgide color reaction and alloxan method. [Methods of Biochemical e-analysis
Analysis) Volume 2, page 273 (1954)
[The method of Meister et al. [The Journal of Biological Chemistry (J, Biol.

Ｃｈｅｍ、）　２４６巻７０９５頁（１９７１年）〕に
て〕γ−グルタミルシステイン合成酵素活を測定し、該
酵素を欠損しグルタチオンを菌体内に蓄積できない株Ｋ
ＮＤＩＩ株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８０７）を得た。Chem, Vol. 246, p. 7095 (1971)] γ-glutamylcysteine synthetase activity was measured, and strain K, which lacks the enzyme and cannot accumulate glutathione in the bacterial body.
NDII strain (FERM BP-807) was obtained.

一方（３）で得られたエシェリヒア・コリを宿主とした
染色体遺伝子シーンバンク株９６株を１単位として混合
培養し、その培養菌体から組換えブラフミドを抽出し、
前記γ−グルタミルシステイン合成酵素を欠損したＫＮ
ＤＩＩ株に次の方法で形質転換した。即ち、ＫＮＤＩＩ
株を酵母エキス１チ、ペプトン２％、グルコース２チか
らなる１００ｍ１培地で６１０ｎｍでの濁度が１になる
まで培養し、集菌する。１００ｍＭクエン酸−１０ｍＭ
　　ＥＤＴＡ−１，２Ｍ７＃ビトール緩衝液ｐＨ５，８
に懸濁した後、ザイモリエース６００００で処理し、ス
フエロプラヌトを形成させた。得られたスフェロプラス
トを集菌、洗浄後、１．２Ｍソルビトール−１０ｍＭ　
塩化カルシウム−１０ｍＭ）リス緩衝液ｐ　Ｈ７，０に
懸濁し、酵母染色体のシーンバンクから（２）の方法で
油量精製した組換えプラスミドＤＮＡを混合して室温で
１５分間反応させた後、終濃度が３０係となるようにポ
リエチレングリコール４０ＱＱを加えて室温で３０分間
放置した。その後、１Ｍソルビトール、０．６７％　Ｂ
ａｃｔｏ　−ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅ　
ｗｌｏ　　ａｍｉｎｏ　　ａｃｉｄ　（Ｄｉｆｃｏ社製
）、２９１８グルコーヌ、２０ｐｐｍヒスチジンを含有
する３係の寒天培地に懸濁包埋し、３０°Ｃ，５〜７日
間培養して形質転換株を得た。形質転換株を２チグルコ
−ｙ−、、０，６７％　　Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔｎｉ
ｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗｌｏ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉ
ｄ　、　２０ｐｐｍ　　ヒヌチジンからなる寒天培地で
培養し、ニトロプルジッド・アンモニア法によってヌク
リーニングを行ない、グルタチオンの生産性を回復した
株ＫＮ１０２０株を得た。ＫＮ　１０２０株のもつ組換
えプラスミドを同株の選択に用いた酵母染色体のシーン
バンクから選択し、γ−グルタミルシステイン合成酵素
遺伝子を有する組換えプラスミドＫｐＮ　１０２を得た
。Ｋ　ｐ　Ｎ１０２は約６．４　Ｘ　１０６　ダルトン
の分子量からなるプラスミドであり、プラスミドベクタ
ーＹＲｐ７の制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの切断
部位に約８．２　Ｘ　１０６ダルトンの酵母遺伝子を含
んでおり、この酵母遺伝子中にγ−グルタミルシステイ
ン合成酵素遺伝子を含んでいる。またこの約８．２　Ｘ
　１０６ダルトンの酵母遺伝子の制限エンドヌクレアー
ゼＥｃｏＲＩ、　Ｈｉｎｄ　Ｉ　。On the other hand, the 96 chromosomal gene scene bank strains obtained in (3) using Escherichia coli as a host were mixedly cultured as one unit, and the recombinant brahmids were extracted from the cultured cells.
KN lacking the γ-glutamylcysteine synthase
The DII strain was transformed by the following method. That is, KNDII
The strain is cultured in a 100 ml medium containing 1 g of yeast extract, 2% peptone, and 2 g of glucose until the turbidity at 610 nm becomes 1, and the bacteria are harvested. 100mM citric acid - 10mM
EDTA-1,2M7# Bitol buffer pH5,8
The suspension was suspended in water and then treated with Zymolyase 60,000 to form sphaeroplanutes. After collecting the obtained spheroplasts and washing, 1.2M sorbitol-10mM
Calcium chloride - 10mM) Lys buffer (pH 7.0) was mixed with recombinant plasmid DNA purified by method (2) from yeast chromosome scene bank, reacted for 15 minutes at room temperature, and then reacted for 15 minutes. Polyethylene glycol 40QQ was added so that the concentration was 30 parts, and the mixture was left at room temperature for 30 minutes. Then 1M sorbitol, 0.67% B
acto-yeast nitrogenbase
The suspension was embedded in a 3-part agar medium containing wlo amino acid (manufactured by Difco), 2918 glucone, and 20 ppm histidine, and cultured at 30°C for 5 to 7 days to obtain a transformed strain. The transformed strain was transformed into Bacto-yeastni, 0.67% Bacto-yeastni.
trogen base wlo amino aci
d. The strain KN1020, which had recovered glutathione productivity, was obtained by culturing on an agar medium containing 20 ppm hinutidine and performing nuclear cleaning using the nitropurgide-ammonia method. A recombinant plasmid possessed by strain KN 1020 was selected from the yeast chromosome scene bank used for selection of the same strain, and recombinant plasmid KpN 102 having the γ-glutamylcysteine synthase gene was obtained. K p N102 is a plasmid with a molecular weight of about 6.4 x 106 daltons, and contains a yeast gene of about 8.2 x 106 daltons at the restriction endonuclease BamHI cleavage site of plasmid vector YRp7. contains the γ-glutamylcysteine synthase gene. Also, this approximately 8.2
106 Dalton yeast gene restriction endonuclease EcoRI, HindI.

ＢａｍＨＩにおける切断部位数はそれぞれ１゜１．３で
あった。第１図にプラスミドＫｐＮ１０２の遺伝子及び
制限酵素の切断部位を示した。The number of cleavage sites in BamHI was 1°1.3, respectively. FIG. 1 shows the gene and restriction enzyme cleavage site of plasmid KpN102.

（５）　　γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の
導入によるグルタチオン生産能の向上 γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を有するプラ
スミドＫｐＮ１０２を（３）の方法に従って通常にグル
タチオンを蓄積するサツカロミセス・セレビシより１３
−ＩＡｉ及びγ−グルタミルシステイン合成酵素を欠損
し、グルタチオン生産鮨を次損し大Ｄ　１３−　Ｉ　Ａ
株Ｏ変異株サツカロミセス−セレビシェＫＮＤ　１１株
Ｋｉ質転換し、それぞれ形質転換株サツ力ロミセヌ自セ
レビシよりｌ３−ＩＡ（ＫｐＮ　１０２１０２）（ＦＥ
Ｒ”３１０）及びサツカロミセスセレビシエＫＮＤ　　
１１（ＫｐＮ　１１０２）（ＦＥＲＢＰ−３０９）を得
た。これらの形質転換株及び形質転換の宿主として用い
た受容酵母を２係グルコース。(5) Improving glutathione production ability by introducing the γ-glutamylcysteine synthase gene Plasmid KpN102 containing the γ-glutamylcysteine synthetase gene was obtained from Satucharomyces cerevisi 13, which normally accumulates glutathione, according to the method in (3).
- Deficient in IAi and γ-glutamylcysteine synthetase, resulting in secondary loss of glutathione-producing sushi. 13- IA
Strain O mutant strain Satucharomyces cerevisiae KND 11 strain Ki was transformed, and each transformed strain Satucharomyces cerevisiae was transformed with l3-IA (KpN 102102) (FE
R”310) and Satsukaromyces cerevisiae KND
11 (KpN 1102) (FERBP-309) was obtained. These transformed strains and the recipient yeast used as hosts for transformation were treated with 2-glucose.

０．６７　％　Ｂａｃｔａ　−ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏ
ｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｖＪ／１０ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　
、、　２０　ｐｐｍ　ヒヌチジンから々る培地１１で３
０°Ｃ２定常期まで培養した。0.67% Bacta-yeast nitro
gen base vJ/10amino acid
,, 20 ppm Hinutidine Karagaru Medium 11 and 3
The cells were cultured at 0°C until the stationary phase.

形質転換に用いた酵母Ｄ１８−ＬＡ株及びＫＮＤＩＩ株
には２０ｐｐｍのトリプトファンを添加して培養し、グ
ルタチオンはアロキサン法で定量した。結果を第１表に
示した。The yeast D18-LA strain and KNDII strain used for transformation were cultured with the addition of 20 ppm tryptophan, and glutathione was quantified by the alloxan method. The results are shown in Table 1.

第　　　１　　　表 実施例２ 実施例１に使用した受容酵母及び形質転換酵母を実施例
１に用いた同じ培地に更に第２表に示したアミノ酸及び
アミノ酸の誘導体を各々１００μｇ／ｍｌとなるように
添加して、３０°Ｃ１定常期まで培養し、グルタチオン
含量をアロキサン法にて測定した。結果を第２表に示し
だ。Table 1 Example 2 The recipient yeast and transformed yeast used in Example 1 were further added to the same medium used in Example 1 with the amino acids and amino acid derivatives shown in Table 2 at 100 μg/ml each. The cells were cultured at 30°C until the stationary phase, and the glutathione content was measured by the alloxan method. The results are shown in Table 2.

実施例３ 実施例１及び２で使用したサツカロミセス梼セレビシよ
り７１・８−ＩＡ（ＫｐＮ　１０２）株、ＫＮＤＩＩ（
ＫｐＮ　１０２）　　株をそれぞれ２ヂグルコース、０
．６７％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　
ｂａｓｅ　ｗ／。Example 3 71.8-IA (KpN 102) strain, KNDII (
KpN 102) strain with 2 diglucose and 0
．． 67% Bacto-yeast nitrogen
base w/.

ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　、　２０　ｐｐｍヒヌチジン及
びＬ−グルタミン酸、Ｌ−シヌティン各５０ｐｐｍを含
む１１の培地で３０°Ｃ２０時間培養した。グルタチオ
ン含量はＤ１３−ＩＡ、（ＫｐＮ　１０２）株で３５．
６ｍ９　／　ｌ（１２，：９　ｍ　ｊｊ／ｆｊ乾燥菌体
）、ＫＮＤ　１１（ＫｐＮ１０２）株で８４．８ｍ、！
？／ｌ（１１，４ｍｇ／ｇ乾燥菌体）であった。それぞ
れ２０１の培養液を集め、遠心分離にて充分に蒸溜水で
洗浄した。洗浄後５００ｍ１の蒸溜水に懸濁し８０°Ｃ
にて抽出を行なった。遠心分離にて上澄を集め、濃縮し
て５０ｍｌにメスアップした後、硫酸を０．６規定と々
るように加え、酸化第−鋼をグルタチオンの等モル量加
えて３５°Ｃ５分間撹拌して反応ぎせ、更に１時間放置
後、遠心分離して沈澱を採取し、水洗を２回行なった。The cells were cultured at 30°C for 20 hours in 11 media containing amino acid, 20 ppm hinutidine, and 50 ppm each of L-glutamic acid and L-synutin. Glutathione content was 35.
6m9/l (12,:9 mjj/fj dry bacterial cells), 84.8m for KND 11 (KpN102) strain!
? /l (11.4 mg/g dry bacterial cells). 201 culture fluids were collected for each, centrifuged, and thoroughly washed with distilled water. After washing, suspend in 500ml of distilled water and heat at 80°C.
Extraction was performed at The supernatant was collected by centrifugation and concentrated to a volume of 50 ml, then sulfuric acid was added to a volume of 0.6 N, and steel oxide was added in an equimolar amount of glutathione, and the mixture was stirred at 35°C for 5 minutes. After allowing the mixture to react for an additional 1 hour, the precipitate was collected by centrifugation and washed twice with water.

この沈澱を蒸溜水４０ｍ１にサスペンドし硫化水素ガス
を２０分間吹き込んで脱銅した後、窒素ガスを１時間吹
きこんで硫化水素と置換し、遠心分離を行なって上清を
集め、濃縮後、４０％となるようにエタノールを加えて
グルタチオンの沈澱を得、更にエタノールによる再結晶
を行なった。その結果、Ｄ１３−ＩＡ（ＫｐＮ　１０２
）株から２８０ｍｇ（収率３２，３％）、ＫＮＤ　１１
　（ＫｐＮ１０２）株から２１２ｍ、！？　（収率３０
．９係）のグルタチオンを採取することができた。This precipitate was suspended in 40 ml of distilled water, hydrogen sulfide gas was blown in for 20 minutes to remove copper, nitrogen gas was blown in for 1 hour to replace the hydrogen sulfide, the supernatant was collected by centrifugation, and after concentration, % of glutathione to obtain a precipitate of glutathione, and further recrystallization with ethanol was performed. As a result, D13-IA (KpN 102
) strain 280 mg (yield 32.3%), KND 11
(KpN102) 212m from the stock! ? (Yield 30
．． We were able to collect glutathione (Section 9).

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図は組かえプラヌミドＫｐＮ１０２の遺伝子及び制
限酵素の切断部位を示す説明図である。FIG. 1 is an explanatory diagram showing the genes and restriction enzyme cleavage sites of recombinant planumid KpN102.

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）グルタチオンの生産に関与するγ−グルタミルシ
ステイン合成酵素遺伝子と受容酵母中で複製可能なプラ
スミドとの組換えプラスミドで形質転換された酵母を栄
養培地で培養し、該酵母菌体からグルタチオンを採取す
ることを特徴とする酵母によるグルタチオンの製造方法
。(1) Recombinant plasmid with the γ-glutamylcysteine synthase gene involved in glutathione production and a plasmid capable of replicating in recipient yeast. Yeast transformed with the plasmid is cultured in a nutrient medium, and glutathione is extracted from the yeast cells. A method for producing glutathione using yeast, the method comprising collecting glutathione. （２）栄養培地がＬ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−
システイン誘導体、Ｌ−グルタミン酸を単独もしくは混
合添加した培地である特許請求の範囲第１項記載の製造
方法。(2) The nutrient medium is L-cysteine, L-cystine, L-
The production method according to claim 1, which is a medium to which a cysteine derivative and L-glutamic acid are added alone or in combination. （３）グルタチオンの生産に関与するγ−グルタミルシ
ステイン合成酵素遺伝子の供与体が酵母である特許請求
の範囲第１項もしくは第２項記載の製造方法。(3) The production method according to claim 1 or 2, wherein the donor of the γ-glutamylcysteine synthase gene involved in the production of glutathione is yeast. （４）γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の供与
体がサツカロミセス属の酵母である特許請求の範囲第１
項もしくは第２項記載の製造方法。(4) Claim 1, wherein the donor of the γ-glutamylcysteine synthase gene is a yeast of the genus Satucharomyces.
2. The manufacturing method according to item 2 or item 2. （５）γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の組換
えプラスミドの受容酵母がグルタチオン生産能を有する
酵母である特許請求の範囲第１項もしくは第２項記載の
製造方法。(5) The production method according to claim 1 or 2, wherein the yeast receiving the recombinant plasmid of the γ-glutamylcysteine synthase gene is a yeast having the ability to produce glutathione. （６）γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の組換
えプラスミドの受容酵母がγ−グルタミルシステイン合
成酵素欠損酵母である特許請求の範囲第１項もしくは第
２項記載の製造方法。(6) The production method according to claim 1 or 2, wherein the yeast receiving the recombinant plasmid of the γ-glutamylcysteine synthase gene is a γ-glutamylcysteine synthetase-deficient yeast. （７）γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の組換
えプラスミドの受容酵母がサツカロミセス属酵母である
特許請求の範囲第１項、第２項、第５項もしくは第６項
記載の製造方法。(7) The production method according to claim 1, 2, 5, or 6, wherein the yeast receiving the recombinant plasmid of the γ-glutamylcysteine synthase gene is a yeast of the genus Satucharomyces. （８）γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を含む
酵母染色体遺伝子が、分子量約３．２×１０＾６ダルト
ンで、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ I 、Ｈｉｎｄ
III、ＢａｍＨ I における切断部位数がそれぞれ、１，
１，３である遺伝子断片の１部あるいは全部を含む特許
請求の範囲第１項、第２項、第３項もしくは第４項記載
の製造方法。(8) The yeast chromosomal gene containing the γ-glutamylcysteine synthase gene has a molecular weight of approximately 3.2 x 10^6 Daltons and contains restriction endonucleases EcoR I, Hind
The number of cleavage sites in III and BamH I is 1,
1, 3, or 4.