JPS6152297A - 組換え遺伝子利用によるタンパク質の製造方法 - Google Patents
組換え遺伝子利用によるタンパク質の製造方法Info
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- JPS6152297A JPS6152297A JP59172387A JP17238784A JPS6152297A JP S6152297 A JPS6152297 A JP S6152297A JP 59172387 A JP59172387 A JP 59172387A JP 17238784 A JP17238784 A JP 17238784A JP S6152297 A JPS6152297 A JP S6152297A
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- Japan
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- salt
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- heterologous gene
- gene
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-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業−ヒの利 ′
この発明は、枯草菌等の高プロプアーゼ活性を有する宿
主に異種遺伝子を導入ｌハこの宿主を培養して目的とす
る異種タンパク質を分泌生産させるに際し、異種タンパ
ク質を効率よく安定に分泌生産させることができる組換
え遺伝子利用によるタンパク質の！！１造方法に関する
。
主に異種遺伝子を導入ｌハこの宿主を培養して目的とす
る異種タンパク質を分泌生産させるに際し、異種タンパ
ク質を効率よく安定に分泌生産させることができる組換
え遺伝子利用によるタンパク質の！！１造方法に関する
。
従来技術及びその。
最近における遺伝子操作技術の進歩にＪ：す、異種遺伝
子を宿主に導入し、この宿主を培養することによってそ
の遺伝子の産物として有用な物質を製造することが可能
になっている。この異種遺伝子を導入する宿主としては
、当初大腸菌が主として用いられていたが、近年、枯草
菌、酵母、好熱性細菌、放射菌などの種々の宿主も使用
されるようになり、それぞれ大腸菌にはない特性を有す
ることが認められ、異種遺伝子導入のための宿主として
注目されるようになってきた。
子を宿主に導入し、この宿主を培養することによってそ
の遺伝子の産物として有用な物質を製造することが可能
になっている。この異種遺伝子を導入する宿主としては
、当初大腸菌が主として用いられていたが、近年、枯草
菌、酵母、好熱性細菌、放射菌などの種々の宿主も使用
されるようになり、それぞれ大腸菌にはない特性を有す
ることが認められ、異種遺伝子導入のための宿主として
注目されるようになってきた。
これらの宿主の中で、枯草菌は、宿主と１ノでの安全性
が高く、またアミラーゼなどの酵素を菌体外に分泌する
という特性を有し、このためこの特性を利用して導入し
た異種遺伝子の産物である有用物質を菌体外に分泌生産
させることができるので、宿主として非常に有用なもの
である。しかしながら、枯草菌を培養し、これに導入し
た異種遺伝子の産物として異種タンパク質を分泌生産さ
せた場合、枯草菌はそのプロテアーゼ活性が高いことな
どが原因して、分泌生産された異秤タンパク質の安定性
が悪く、異種タンパク質を効率よ（安定に製造できない
問題がある。
が高く、またアミラーゼなどの酵素を菌体外に分泌する
という特性を有し、このためこの特性を利用して導入し
た異種遺伝子の産物である有用物質を菌体外に分泌生産
させることができるので、宿主として非常に有用なもの
である。しかしながら、枯草菌を培養し、これに導入し
た異種遺伝子の産物として異種タンパク質を分泌生産さ
せた場合、枯草菌はそのプロテアーゼ活性が高いことな
どが原因して、分泌生産された異秤タンパク質の安定性
が悪く、異種タンパク質を効率よ（安定に製造できない
問題がある。
１」へ」」
本発明者らは、上記事情に鑑み、枯草菌等の高プロテア
ーゼ活性を有する微生物（宿主）に異種遺伝子を導入し
、これを培養して有用な異種タンパク質を分泌生産させ
るに当り、異種タンパク質を安定して効率よく分泌生産
させる方法につき種々研究を行なった結果、異種遺伝子
を導入した微生物を培ｉする培地に有機酸又はその塩を
添加することが有効であることを知見した。
ーゼ活性を有する微生物（宿主）に異種遺伝子を導入し
、これを培養して有用な異種タンパク質を分泌生産させ
るに当り、異種タンパク質を安定して効率よく分泌生産
させる方法につき種々研究を行なった結果、異種遺伝子
を導入した微生物を培ｉする培地に有機酸又はその塩を
添加することが有効であることを知見した。
即ち、本発明者らは、大腸菌β−ラクタマーゼ遺伝子を
枯草菌分泌系ベクター１１ ＴＵＢ４にり［ｌ−ン化し
、これをプロテアーゼ活性の高い枯草菌ＮＡ６４株に導
入し、これを培養する場合に、有機酸、特にカルボン酸
又はその塩を培ｊ１すに添加づると、β−ラクタマーゼ
の生産昂が増大し、β−ラクタマーゼを効率よく安定に
分泌し１ｑ１従って異種遺伝子をラリ人したプロテアー
ゼ活性の高い宿主を有機酸を添加した１８地で培養する
ことが異種タンパク質の安定１）だ分泌生産にとって非
常に１１効であることを知見し、本発明をなすに至った
ものである。
枯草菌分泌系ベクター１１ ＴＵＢ４にり［ｌ−ン化し
、これをプロテアーゼ活性の高い枯草菌ＮＡ６４株に導
入し、これを培養する場合に、有機酸、特にカルボン酸
又はその塩を培ｊ１すに添加づると、β−ラクタマーゼ
の生産昂が増大し、β−ラクタマーゼを効率よく安定に
分泌し１ｑ１従って異種遺伝子をラリ人したプロテアー
ゼ活性の高い宿主を有機酸を添加した１８地で培養する
ことが異種タンパク質の安定１）だ分泌生産にとって非
常に１１効であることを知見し、本発明をなすに至った
ものである。
従って、本発明の目的は、異種遺伝子を導入（）た高プ
ロテアーゼ活性の宿主から巽秤タンパク質を効率よく安
定にブｙ泌４］産させることができる組換え遺伝子利用
ににるクンバク質のｒＩＡ造方法を提供するものである
。
ロテアーゼ活性の宿主から巽秤タンパク質を効率よく安
定にブｙ泌４］産させることができる組換え遺伝子利用
ににるクンバク質のｒＩＡ造方法を提供するものである
。
以下、本発明につき更に詳しく説明づる。
１吐些」肱
＝ ４ 一
本発明は、異種遺伝子を導入した高プロテアーゼの宿主
を１８養し、異種遺伝子に基づくタンパク質を分泌生産
させる方法において、宿主を培養する培地に有機酸及び
／又はその塩を添加することを特徴とするものである。
を１８養し、異種遺伝子に基づくタンパク質を分泌生産
させる方法において、宿主を培養する培地に有機酸及び
／又はその塩を添加することを特徴とするものである。
本発明において、宿主としては枯草菌が有効に使用でき
、本発明方法は枯草菌を宿主として用いるタンパク質の
生産に好適に採用される。この場合、枯草菌は通常用い
られるものがいずれも使用でき、−例を挙げるとＢａｃ
ｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓＮＡ６４を挙げること
ができる。本菌株は微工研に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−４２３として寄託されている。
、本発明方法は枯草菌を宿主として用いるタンパク質の
生産に好適に採用される。この場合、枯草菌は通常用い
られるものがいずれも使用でき、−例を挙げるとＢａｃ
ｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓＮＡ６４を挙げること
ができる。本菌株は微工研に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−４２３として寄託されている。
上記宿主に導入する異種遺伝子は、目的とする異種タン
パク質を生産し得るものが選択される。
パク質を生産し得るものが選択される。
この場合、異種タンパク質としては、特に制限されない
が、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ
−インターフェロン、人の成長ホルモン、人のウロキナ
ーゼ、人のインシュリン、末＠基がアミドである人のカ
ルシトニン等のベプチドホルモン、β−ラクタマーゼ、
アミラーゼ、イソメラーゼ等のタンパク酵素などが挙げ
られる。
が、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ
−インターフェロン、人の成長ホルモン、人のウロキナ
ーゼ、人のインシュリン、末＠基がアミドである人のカ
ルシトニン等のベプチドホルモン、β−ラクタマーゼ、
アミラーゼ、イソメラーゼ等のタンパク酵素などが挙げ
られる。
異種遺伝子を上記宿主に導入する方法としては公知の方
法が採用でき、例えば異ｍ 遺伝子がクローン化されて
いるプラスミドを公知の形質ｖｉ操法［Ｃｈａｎｇ、
Ｓ、 ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ、 Ｓ、 Ｎ、 Ｍｏ１
ｅｃ。
法が採用でき、例えば異ｍ 遺伝子がクローン化されて
いるプラスミドを公知の形質ｖｉ操法［Ｃｈａｎｇ、
Ｓ、 ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ、 Ｓ、 Ｎ、 Ｍｏ１
ｅｃ。
Ｇｌｎ、Ｇｅｎｔ、、１６８，１１１ （１９７９）］
に従って宿主に導入することができる。
に従って宿主に導入することができる。
異種遺伝子を宿主に導入し、異種タンパク質を分泌生産
させるには、宿主に安定に保持される公知のベクターに
公知の方法に従って目的遺伝子をクローン化し、導入す
ればＪ：い。使用するベクターの一例として、例えば枯
草菌を宿主とする場合であれば、枯草菌分泌系ベクター
であるｌ） ＴＵＢ４ ［Ｔａｋｅｉｃｈ、 Ｙ、 ｅ
ｔ ａｔ、 Ａ＜１ｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ 。
させるには、宿主に安定に保持される公知のベクターに
公知の方法に従って目的遺伝子をクローン化し、導入す
ればＪ：い。使用するベクターの一例として、例えば枯
草菌を宿主とする場合であれば、枯草菌分泌系ベクター
であるｌ） ＴＵＢ４ ［Ｔａｋｅｉｃｈ、 Ｙ、 ｅ
ｔ ａｔ、 Ａ＜１ｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ 。
Ｃｈｅｍ、、±７，１５９ （１９８３）：Ｙａｍａｚ
ａｋｉ 、 ｌ−１，ｅｔ ａｌ、 Ｊ、３ａｃｔ
ｅｒｉａｌ、 。
ａｋｉ 、 ｌ−１，ｅｔ ａｌ、 Ｊ、３ａｃｔ
ｅｒｉａｌ、 。
１Ｊ」し工」つ−，３２７（１９８３）７を挙げること
ができる。
ができる。
なお、導入する異種遺伝子としては、真核細胞−〇
− 或いは原核細胞より常法ににってクローン化したものの
いずれをも使用することができる。
− 或いは原核細胞より常法ににってクローン化したものの
いずれをも使用することができる。
本発明は、このようにして異種遺伝子を導入した宿主を
培養することにより、目的とする異種タンパク質を製造
するものであるが、この場合本発明においては、有機酸
及び／又はその塩を添加した培地で宿主を培養するもの
である。ここで、有機酸としてはカルボン酸が好）沓に
使用でき、特にコハダ酸、マレイン酸、フマール酸、酢
酸等が効果が高く、好ましく用いられる。また、塩とし
てはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等が使
用し得る。なお、本発明はこれら有機酸及びその塩の１
種又は２種以上を相合せて添加することができる。
培養することにより、目的とする異種タンパク質を製造
するものであるが、この場合本発明においては、有機酸
及び／又はその塩を添加した培地で宿主を培養するもの
である。ここで、有機酸としてはカルボン酸が好）沓に
使用でき、特にコハダ酸、マレイン酸、フマール酸、酢
酸等が効果が高く、好ましく用いられる。また、塩とし
てはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等が使
用し得る。なお、本発明はこれら有機酸及びその塩の１
種又は２種以上を相合せて添加することができる。
有機酸或いはその塩の濃度は、添加する有機酸或いはそ
の塩の種類、培地の種類等によってＲ適温度が相違する
が、一般に０．１〜１Ｍの範囲であることが好ましい。
の塩の種類、培地の種類等によってＲ適温度が相違する
が、一般に０．１〜１Ｍの範囲であることが好ましい。
有（幾酸又はその塩を培地に添加する時期は、通常培養
開始時であるが、培養途中で添加することもできる。な
お、有機酸又はその塩を培地に添加した際、培地の州が
酸性の場合は、苛性ソーダ等を用いてＰｌ−１を７付近
に調整し、使用することができる。
開始時であるが、培養途中で添加することもできる。な
お、有機酸又はその塩を培地に添加した際、培地の州が
酸性の場合は、苛性ソーダ等を用いてＰｌ−１を７付近
に調整し、使用することができる。
また、本発明では、上記の有機酸又はその塩に加えてプ
ロテアーゼ田害剤、例えばフェニルメチルスルホニルフ
ルオライド（ＰＭＳＦ）などを添加することができ、こ
れにより異種タンパク質を更に安定に生産することがで
きる。この場合、プロテアーゼ閉害剤の添加桁はＰＭＳ
Ｆの場合であれば０．０１〜０．１ｍＭとすることが好
ましい。
ロテアーゼ田害剤、例えばフェニルメチルスルホニルフ
ルオライド（ＰＭＳＦ）などを添加することができ、こ
れにより異種タンパク質を更に安定に生産することがで
きる。この場合、プロテアーゼ閉害剤の添加桁はＰＭＳ
Ｆの場合であれば０．０１〜０．１ｍＭとすることが好
ましい。
培養に用いる培地としては、通常用いられる天然培地或
いは合成培地のいずれで−ｂよく、培養する宿主の種類
に応じて適宜な培地が選択される。
いは合成培地のいずれで−ｂよく、培養する宿主の種類
に応じて適宜な培地が選択される。
例えば、枯草菌を宿主とする場合は、糖源として澱粉、
マルトース、サッカロース、グルコース等。
マルトース、サッカロース、グルコース等。
窒素源として醇母抽出物、硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム等を含む培地が好適に用いられる。
モニウム等を含む培地が好適に用いられる。
１ｍ条件も通常の条件が採用され、特に制限されるもの
ではないが、一般に１５〜４５℃、好ましくは２５〜４
０℃で１０〜６０時間振掃培養もしくは通気撹拌培養す
る方法が好適である。
ではないが、一般に１５〜４５℃、好ましくは２５〜４
０℃で１０〜６０時間振掃培養もしくは通気撹拌培養す
る方法が好適である。
異種遺伝子を導入した宿主を有機酸及び／又はその塩を
添加した培地で培養することによって分泌生産された目
的異種タンパク質は、公知の方法により培地から分離、
採取される。
添加した培地で培養することによって分泌生産された目
的異種タンパク質は、公知の方法により培地から分離、
採取される。
１１臥１」
而して、本発明の組換え遺伝子利用によるタンパク質の
製造方法は、異種遺伝子を導入した宿主を有機酸及び／
又はその塩を添加した培地で培養させるようにしたーこ
とにより、宿主が高いプロテアーゼ活性を有していても
目的とする異種タンパク質が安定に分泌生産され、効率
よく大量にタンパク質を製造することができる・ｂので
ある。
製造方法は、異種遺伝子を導入した宿主を有機酸及び／
又はその塩を添加した培地で培養させるようにしたーこ
とにより、宿主が高いプロテアーゼ活性を有していても
目的とする異種タンパク質が安定に分泌生産され、効率
よく大量にタンパク質を製造することができる・ｂので
ある。
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本
発明は下記の実施例に制限されるものではない。
発明は下記の実施例に制限されるものではない。
［実施例］
枯草菌分泌型ベクターｐ ＴＵＢ４を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化し、４．９キロベースと１．９キロベースのＤ
ＮＡ断片をアガ「１−スグル電気泳動にかけてそれぞれ
精製した。、４．９キロベースのＤＮＡ断片はＤＮＡポ
リメラーゼ■（クレノーフラグメント）処理し、付着末
端を平滑末端とした。
Ｉで消化し、４．９キロベースと１．９キロベースのＤ
ＮＡ断片をアガ「１−スグル電気泳動にかけてそれぞれ
精製した。、４．９キロベースのＤＮＡ断片はＤＮＡポ
リメラーゼ■（クレノーフラグメント）処理し、付着末
端を平滑末端とした。
この断片とリン酸化ｔｌｉｎｄｌＴＩリンカ−をリガー
ゼ反応液中でＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
ゼ反応液中でＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
連結後、ｌ−１ｉｎｄＴ［［で潤化し、再度Ｔ４ ＯＮ
Ａリガーゼを用いて連結し、これを枯草菌に導入し、約
０．２キロベースが自然に欠失した４、７キロベースの
プラスミドを４９だ。一方、１．９キロベースのＤＮＡ
断片は更にＡｌｕ丁で消化し、４２４ベースの断片を精
製したくこの断片には枯草菌α−アミラーゼ道伝子のプ
ロモーター、ＳＤ配列、シグナル配列に相当するＤＮＡ
塩基配列が含まれている）。この４２４ベースの断片と
リン酸化１−（ｉｎｄｌ［リンカ−をＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した後、ｌ−１ｉｎｄｌで消化し、こ
れと先に冑た４、７キロベースのプラスミドを１ｌｉｎ
ｄｌｌ［で消化したものとをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結
した。これを枯草菌に導入し、５．１キロベースのプラ
スミドを１４だ。
Ａリガーゼを用いて連結し、これを枯草菌に導入し、約
０．２キロベースが自然に欠失した４、７キロベースの
プラスミドを４９だ。一方、１．９キロベースのＤＮＡ
断片は更にＡｌｕ丁で消化し、４２４ベースの断片を精
製したくこの断片には枯草菌α−アミラーゼ道伝子のプ
ロモーター、ＳＤ配列、シグナル配列に相当するＤＮＡ
塩基配列が含まれている）。この４２４ベースの断片と
リン酸化１−（ｉｎｄｌ［リンカ−をＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した後、ｌ−１ｉｎｄｌで消化し、こ
れと先に冑た４、７キロベースのプラスミドを１ｌｉｎ
ｄｌｌ［で消化したものとをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結
した。これを枯草菌に導入し、５．１キロベースのプラ
スミドを１４だ。
Ｌ）ＢＲ３２２よりβ−ラクタマーゼ渭伝子部分を含む
断片を精製し、この断片にリン酸化１−ｆｉｎｄ■を連
結した後、これと先に得た５、１キロベースのプラスミ
ドを）ｌｉｎｄｌｌｌで消化したものとをＴ４ ＤＮＡ
リガーゼで連結し、枯草菌ＮＡ６４株に導入した。ニト
ロセフインを用いる検定方法［０’ Ｃａｌｌａｇｈａ
ｎ、 Ｃ，Ｈ，ｅｔ ａｔ。
断片を精製し、この断片にリン酸化１−ｆｉｎｄ■を連
結した後、これと先に得た５、１キロベースのプラスミ
ドを）ｌｉｎｄｌｌｌで消化したものとをＴ４ ＤＮＡ
リガーゼで連結し、枯草菌ＮＡ６４株に導入した。ニト
ロセフインを用いる検定方法［０’ Ｃａｌｌａｇｈａ
ｎ、 Ｃ，Ｈ，ｅｔ ａｔ。
△ｎｔｉｍｉｃｒｏｂ 、 Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｃｍ
ｏｔｈｅｒ、。
ｏｔｈｅｒ、。
上、２８３ （１９７２）］により］β−ラクタマーゼ
遺伝がクローン化されたプラスミドを有する菌を選択し
た。
遺伝がクローン化されたプラスミドを有する菌を選択し
た。
次に、このようにして得られた大腸菌β−ラクタマーゼ
遺伝子をクローン化したプラスミドを保有する枯草菌Ｎ
Ａ６４株の培養を下記方法により行なった。
遺伝子をクローン化したプラスミドを保有する枯草菌Ｎ
Ａ６４株の培養を下記方法により行なった。
鹿１プロ劃
下記に示す組成の培地ＬＯＯｙ、ｆを５００７１１容肩
付きフラスコに入れ、１２１℃で１５分間殺菌した。
付きフラスコに入れ、１２１℃で１５分間殺菌した。
３ ａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ １
％３ ａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ
０ 、５％ＮａＣア
０．５％グルコース ０．２％Ｐ
Ｈ７，２ これに硫酸カナマイシン（明治製菓社ｇＡ）を１０１１
’；＆／、ｉとなるように添加し、更に上記のβ−ラク
タマーゼ遠伝子をクローン化したプラスミドを保有する
枯草菌ＮＡ６４株を一白金耳接種し、３７℃で一夜振需
Ｊ８差１ノだ。これを５００ Ｏｒｐｍで１０分間遠心
し、沈殿した菌体を１００ ｙＲの殺菌した新鮮な上記
組成の培地に懸濁し、接種菌液とした。
％３ ａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ
０ 、５％ＮａＣア
０．５％グルコース ０．２％Ｐ
Ｈ７，２ これに硫酸カナマイシン（明治製菓社ｇＡ）を１０１１
’；＆／、ｉとなるように添加し、更に上記のβ−ラク
タマーゼ遠伝子をクローン化したプラスミドを保有する
枯草菌ＮＡ６４株を一白金耳接種し、３７℃で一夜振需
Ｊ８差１ノだ。これを５００ Ｏｒｐｍで１０分間遠心
し、沈殿した菌体を１００ ｙＲの殺菌した新鮮な上記
組成の培地に懸濁し、接種菌液とした。
上記組成の培地に第１表に示す有機酸をそれぞれ０．５
Ｍとなるように添加し、苛性ソーダを用いて１−４１を
７．２に調整し、この２００ ｘｌを５００厭容肩付き
フラスコに入れ、１２１℃で１５分間殺菌した。殺菌後
、硫酸カナマイシン及びＰＭＳ Ｆ （Ｓ ｔｇｍａ社
製）を第１表に示す濃麿となるように添加した。これに
上記接種菌液４藪を加え、３７℃、１００往復／分で振
盪培養し、所定時間毎に培養液１厭をサンプリングした
。この培養液につぎ、６６０ ｎｍの吸光度及び培養上
清のβ−ラクタマーゼ活性をＯ’ Ｃａｌｌａｇｈａｎ
等の方法を用いて測定した。その結果を第１表に示す。
Ｍとなるように添加し、苛性ソーダを用いて１−４１を
７．２に調整し、この２００ ｘｌを５００厭容肩付き
フラスコに入れ、１２１℃で１５分間殺菌した。殺菌後
、硫酸カナマイシン及びＰＭＳ Ｆ （Ｓ ｔｇｍａ社
製）を第１表に示す濃麿となるように添加した。これに
上記接種菌液４藪を加え、３７℃、１００往復／分で振
盪培養し、所定時間毎に培養液１厭をサンプリングした
。この培養液につぎ、６６０ ｎｍの吸光度及び培養上
清のβ−ラクタマーゼ活性をＯ’ Ｃａｌｌａｇｈａｎ
等の方法を用いて測定した。その結果を第１表に示す。
第１表の結果より、コハク酸、酢酸、マレイン酸、フマ
ール酸を０．５Ｍ添加することによってこれら有機酸無
添加のものくコントロール）に比べそれぞれ最大１１倍
、２．３倍、７．４倍。
ール酸を０．５Ｍ添加することによってこれら有機酸無
添加のものくコントロール）に比べそれぞれ最大１１倍
、２．３倍、７．４倍。
２．２倍のβ−ラクタマーゼを生産し得ることが知見さ
れる。
れる。
一 １４ −
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、高プロテアーゼ活性を有する宿主に異種遺伝子を導
入し、この宿主を培養して上記異種遺伝子に基づくタン
パク質を分泌生産させる方法において、上記宿主を有機
酸及び／又はその塩を添加した培地で培養することを特
徴とする組換え遺伝子利用によるタンパク質の製造方法
。 ２、宿主が枯草菌である特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ３、異種遺伝子が大腸菌β−ラクタマーゼ遺伝子である
特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４、有機酸がカルボン酸である特許請求の範囲第１乃項
至第３項いずれか記載の方法。 ５、カルボン酸がコハク酸、マレイン酸、フマール酸又
は酢酸である特許請求第４項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59172387A JPS6152297A (ja) | 1984-08-21 | 1984-08-21 | 組換え遺伝子利用によるタンパク質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59172387A JPS6152297A (ja) | 1984-08-21 | 1984-08-21 | 組換え遺伝子利用によるタンパク質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6152297A true JPS6152297A (ja) | 1986-03-14 |
| JPH0575391B2 JPH0575391B2 (ja) | 1993-10-20 |
Family
ID=15940977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59172387A Granted JPS6152297A (ja) | 1984-08-21 | 1984-08-21 | 組換え遺伝子利用によるタンパク質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6152297A (ja) |
-
1984
- 1984-08-21 JP JP59172387A patent/JPS6152297A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0575391B2 (ja) | 1993-10-20 |
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