JPS61502097A - 尿素を完全酵素的に測定する方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 尿素を完全酵素的に測定する方法及び試薬本発明は、尿素、特に体液例えば血清 、血漿及び尿中の尿素を酵素的に測定する方法及び試薬に関する。

分析化学の範囲内で、尿素の定量的測定は臨床化学的診断において特に重要な役 割を演じる。体液例えば血清又は派内の尿素濃度は腎臓機能に関して、更に透析 患者においては体外又は体内血液洗浄の作用度に関する重要な結論を与える。

純化学的又は部分酵素的光度分析による測定法〔例え、は特にひんばんに使用さ れるフェアロン試薬又はウレアーゼ／ペルテｐット反応を使用した方法（文献に 関シテハ１例えばへｙｌＪ　−（Ｒ，Ｊ、Ｈｅｎｒｙ）、　キーｙノｙ　（Ｄ　 、Ｃ、Ｃａｎｎｏｎ　）　、　ビｙ　ケ＃　−＝ｒ　ｙ　（Ｊ　、Ｗ、Ｗｌｎｋ ｌｒｒｅｎｎ３（編集者）、”クリニカルΦケミストリー：プリンシゾルズ・ア ンド・テクニックス（Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉ−ｓｔｒｙ　：　Ｐｒ１ｎ ｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　）、第２版、ハルパー・アンＹ 　ｅ　ｌ：！　＋−，バーガスタウン、マーリーランド、ＵＳＡ（１９７４）、 ５０３〜５２６頁）〕Ｋ比して、完全酵素的分析法がますます重要になって来た 。該分析法の前記方法に比較した利点は、高い特異性１例えば薬物影響、温度及 び−変動に対する不感性、腐食性、強酸性もしくはアルカリ性又は毒性試薬との 併用の回避、手動的試験及びまた種々異なった自動的分析のための普遍的使用可 能性並びに基準を併用せずに測定結果を正確に規定された換算率を用いて評価す ることができる可能性（この場合には、ランベルト・ベールの法則の条件が原理 的に光度計で利用可能な全ての吸光範囲において有利あることが立証されている ）Ｋある。

従来、完全酵素的尿素測定のためには２つの異なった方法が公知である。

その一方の方法では、尿素はウレアーゼ、Ｅ、Ｃ，３゜５．１．５　を用いて２ 分子のアンモニア及び１分子の００２に加水分解的に分解され、生成したアンモ ニアからアルファーケトグルタラード、ＮＡＤＨ及びグルタメートデヒドロゲナ ーゼ、Ｅ、Ｃ，１，４，１，３の存在下にグルタメートが形成される。測光法で ３３４．３４０又は３６５　ｎｍで測定することができる、反応混合物中のＮＡ ＤＨ濃度の低下は、使用尿素量に比例する〔ベルクマイヤー（Ｈ，Ｕ、Ｂｅｒｇ ｍｅｙｅｒ　）　（ＩＩ集者）、′メトーデン・デアーエンツィマチッシェン・ アナリーゼ（Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　ｅｎｚｙｍａｔｉｓｃｈｅｎ　Ａｎａ ｌｙｓｅ　）、第３版、第■巻、ケミ−出版社（Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｌｅ　 ）、ワインハイム在（１９７４年）、１８４２頁〕。第２の方法（米国特許第３ ，６５５，５１６号明細書）Ｋよれば、尿素は尿素−アミドヒト四ラーゼ、Ｅ、 Ｃ，６，３゜４．６を用いたＡＴＰ依存反応で加水分解され、この際反応した尿 素１分子当り１個のＡＤＰ分子が生成する。

該分子はホスホエノールピルノ々−ト及びピルノζ−トーキナーゼ、ｌ：、（： 、２．７．１．４０でＡＴＰに戻されかつ遊離したピルパートはＮＡＤＨ及びラ クテート−デヒドロゲナーゼ、Ｅ、Ｃ，１，１，１，２７の存在下にラクテート に還元される。この場合も、第１に挙げた方法におけると同様に、測定／ｅラメ ータは反応混合物中のＮＡＤＨ濃度の低下である。

両者の方法のうちでは、先に挙げた方法のみが今日まで常用分析に広範に採用さ れて来た。

しかしながら、純化学的又は部分酵素的分析法に比較して完全尿素的測定がもた らす明らかな進歩性にもかかわらず、前記両者の酵素的方法はなお多数の、十分 に一致した欠点を有する。−面では、ＮＡＤＨは水溶液では、中性−範囲にあっ ても比較的不安定である、従って使用準備のできた試薬溶液の保持性は短い時間 帯、すなわち室温貯蔵では約１日間又は２〜８℃での保管では３日間が保証され るにすぎない。更に、試験パッチは試料／試薬空位測定法によれば、混濁した又 は３３４〜３６５の範囲内で強度に吸収する試料材料で操作しなげればならない か又はいつもは微量で血清又は尿中に存在する物質、アンモニア又はピル・々− トが比較的高い濃度で存在する場合には、時折誤って高まった尿素値を生じる。

従ってこの場合には、正確な尿素測定のためには、別の試料空位）ζツチの併用 が必要である（ウレアーゼ又は尿素−アミドヒドロラーゼ不含の試薬）、このこ とは少なくとも手動試験実施を著しく複雑にする。確かに、この種の支障は原理 的に動的測定技術を使用することにより排除されるが、しかしながら該測定技術 は十分な精度をもっては自動分析においてのみ実施可能でありかつ逆に手による 試験操作をほとんど排除する。

最後に、両者の場合には指示薬反応の特性に基づき、−面では試料混濁又は着色 の障害を十分に排除すると見なされかつ更にＵｖ範囲内での測定のための装置を 有しない、視覚的に測定する光度計の使用を可能にする呈色可視化系を連結する 可能性は付与されない。

従って、前記欠点、すなわち分析試薬の強度に制限された貯蔵性並びに有害な試 料成分の連行を回避しかつまた可視波長範囲内での測定の実施を可能にする、比 尿素測定用の完全酵素的方法及び試薬を見い出す必要性が生じた。

この課題は本発明により酵素的尿素測定法により解決され、該方法は尿素とグリ オキシレートとを（Ｓ）−ウレイドグリコラート−シンテターゼの存在下は反応 させて（Ｓ）−ウレイドグリコラートを形成させかつ該化合物なＮＡＤＨ又はＮ ＡＤＰ＋、有利にはＮＡＤＨ、並びにウレイドグリコラート−デヒドロゲナーゼ 、Ｅ、Ｃ，１，１，１，１５４で醸化して、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの化学量論 的形成下にカル・々モイルオキサメートとすることにより解決される。

尿素の濃度測定は直接的に、すなわち形成されたＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの３３ ４〜３６５ｎｍでの測定を介して、又は有利にはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性の酵素性 色素指示薬系を介して行うことができる。

特に有利であるのは、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから濃度に依存する形式でテトラ ゾリウム塩からジアホラーゼ、Ｅ、Ｃ，１，６，４，３の存在下にフォルマザン 色素を形成する系である。

本方法の基礎とした酵素反応（フレイドグリコ２−トーシンテターゼー又はクレ イドグリコラートーデヒドログナーゼ反応）は、はとんど２０年来、“ジャーナ ル・オブ、Ａクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）”第９０巻、１ ５３１〜１５３６頁（１９６５年）から公知である。しかしながら、該文献には 、ウレイドグリコラート合成は著しく緩慢に進行しかつ尿素及びグリコキラート ２０μｍｏｌ当り１時間後に１０％が反応したにすぎないと示唆されている。従 って、それにもかかわらず本発明による測定法゛が実施可能であることは驚異的 なことである。

（Ｓ）−フレイドグリコラート−シンテターゼは“ジャーナル・オブ・ノぐクテ リオロギー、第９０巻、１５２５〜１５３０頁（１９６５年）に記載された方法 に基づき十分な純度及び活性度で得ることができる。

酵素の存在は既に多くの微生物に対して記載されている、例えばサツカロミセス ・ケレピシアエ（Ｓａｃｃｈａ−ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）、 カンジダ・ウチリス（Ｃａｎｄｌｄａ　ｕｔｌｌｉｓ　）及びストレゾトコクセ ７　（５ｔｒｅ−ｐｔｏｃｏｃｃｅｎ　）。出発物質としては、ストレゾトコク セス・アル２ントイクｘ　（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｌ　１ａｎｔｏｌ −ｃｕｓ　）、ＤＳＭ　２９６５が有利である。

本発明のもう１つの対象は、尿素を測定するための試薬であり、該試薬はグリオ キシラー）、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰ＋、（Ｓ）−ウレイドグリコラート−シンテ ターゼ及びクレイドグリコラートーヂヒドロゲナーゼ並びに有利には付加的にＮ ＡＤ　（Ｐ　）　Ｈ依存性色素指示薬系を含有する緩衝した水溶液から成ってい ることを特徴とする特に有利であるのは、付加的にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性色素指 示薬系としてジアホラーゼ及び還元的にホルマザン色素に転化可能なテトラゾリ ウム塩を含有する試薬である。

水溶液のμ値は好ましくは７〜９、有利には７．５〜８．５、特に極めて有利に は７．７〜８．３である。μ値を調整するためには、そのμ値がＰＨ６，５〜９ ．５である全ての緩衝剤が該当する。特に適当であるのは、燐酸塩及びトリス緩 衝剤である。緩衝剤の濃度は好ましくは２０〜２００　ｍｍｏｌ　／ｌ、有利に は５０〜１５　ｏｍｍｏｌ／ｌである。グリコキシラードのためには０．１〜１ ゜ｒＩＬｍｏｌ／／、有利には０．５〜５　ｍｍｏｌ　／　ｌ　、特に極めて有 利には１〜３　ｍ　ｍｏ　ｌ　／　ｌ　の濃度が該当する。補酵素ＮＡＤ＋及び ＮＡＤＰ＋のうちでは、ＮＡＤＨであり、該補酵素の濃度は望ましくは１〜２０ 　ｍｍｏｌ　／ｌ　、有利には５〜１０　ｍ　ｍｏ　ｌ　／　ｌである。（Ｓ） −ウレイドグリコラート−シンテターゼのためＫは、好ましくは１〜３゜Ｕ　／ ｄ、有利には３〜２０１Ｊ／１１７、特に有利には５〜１０Ｕ／ｄの濃度である 。ウレイドグリコラート−デヒドロゲナーゼに関しても同じである。

シア７オラーゼ濃度は、一般に０．１〜ＩＯＵ／ゴ、有利には０．５〜５　Ｕ／ ｉｕ、特に有利には１〜２Ｕ７Ｗである。テトラゾリウム塩のうちでは、３−（ ４’、５’−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，４−シフェニルテトラゾリ クムブロミド（ＭＴＴ）及び２，２′−ジー（ｐ−ニトロフェニル）−５，５’ −ジフェニル−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４′−ジフェニレン） −ジテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）が有利であり、特にＮＢＴが有利である 。別の適当なテトラゾリウム塩の例は、ＩＮＴ（２−（Ｐ−ヨー−フェニル）− ３−（ｐ−二トロフェニル）−５−フェニルテトラソリクムークロリド）、ＴＮ ８Ｔ　（２，２’、　５．５’−テトラ−（ｐ−ニトロフェニル）−３，３’− （３−ジメトキシ−４−ジフェニレン）ジーテトラゾリクムクロリＰ）、ＮＴ（ ２，２’−ｐ−ジフェニレン３ｅ　３／、　ｓｐ　ｓ’−テトラフェニルジテト ラゾリウムクロリド）及びＴＴ（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロ リド〕である。これらの試薬における濃度は、一般に０．０５〜１　ｍ　ｒｎｏ ｌ／　ｌ、有利には０　、１〜０．６　ｍ　ｍｏ　Ｉ　／Ａｔである。また、形 成されたフォルマザンの早期の沈殿を避けるためＫ、試薬に非イオン性界面活性 剤例えばトリトン（ＴｒｌｔｏｒｎＸ　−１，ＯＯを、０，１〜０．５％、特に ０．２〜０゜４％の濃度で添加するのが有利である。

以下に実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１ 尿素を測定する試薬及び方法 Ａ）ウレイドグリコラート−デヒドロゲナーゼを製造するためＫ、ゾロテラス・ レットゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓｒｅｔｔｇｅｒｌ　）、ＤＳＭ２９６４（孔気薗） を、水道水１１当りシフ　：Ｉ　（Ｄ＋ｆＣＯ）酵母エキス１．　Ｏ、？、アル ラントイン７１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１８ｇから成る媒体中に通気性で接 種し、菌体を遠心分離しかつトリ、Ｘ　−ＨＣＩＣＰ！（７，０）　ｏ、ｏ　ｓ 　ｍｏｌ／ｌ　中で超音波により分解した。酵素精製のために、粗製抽出物をプ リエチレンイミンＧ３５を介して分別しかつ引続フィー きフェニルセファローゼを介してクロマトグラフ寛Ｎｕ、次いで第１回目の硫酸 アンそニウム分別、セファローゼＳ−２００でのクロマトグラフィー及び最後に 第２回目のＡＳ−分別Ｋかげた。精製した酵素は蛋白質ＩＩｎｇ当り１４４Ｕの 比活性を有しかつ５η／コノ濃度テＡ　Ｓ　（ｐＨ８，１）　３．２　ｍｍｏｌ ／Ｊ　中の懸濁液として保管した。

尿素の測定のために使用する前に、硫酸アンモニウムを酵素製剤からトリス・Ｈ ＣＩ　ｏ；１ｍｏｌ／ｌ　Ｋ対して透析により除去するのが望ましい。

Ｂ）呈色試薬 成分　試薬中の濃度 トリス−Ｈ（Ｊ（ｐＨ８，０）　１００　ｍｒｒｏｌ／／）！Ｊ）ｙＸ−Ｚｏｏ 　０．３％ Ｎａ−グリコシレート　３　扉ｍｏｌ／ＪＮＡ”　５　ｍｍｏｌ／　１ ＮＢＴ　Ｏ，２ｍｍｏｌ／１ （Ｓ）−ウレイドグリコラート−シンテターゼ　ｘｏＵ／ｄウレイドグリコラー ト−デヒドロゲナーゼ　７ＬＪ／ｒｄジアフオラーゼ　ＩＵ／ＩＩＬｔ Ｃ）試験実施 波長５４６ｎｍ、Ｔ＝２５℃、層厚さ１０ｍ試薬空値空僅して測定 キュベツトで滴定： ＊測定列当り１つの試薬９僅の・マツチで十分である。

＊＊Ｏ，Ｓ〜１１　ｍｏ　ｌ　／　ｌ　の濃度を有する尿素の水溶液使用した試 料中の尿素の濃度に対する△Ｅの依存性は添付図面の第１図に示されている。

味 国際調を報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　’１：ｄ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＺＯＮＡｒ：、　５ＥＡＲＣＨ ＲＥＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．尿素を酵素的に測定する方法において、尿素をグリコシラート（Ｓ）−ウレ イドグリコラート−シンテターゼの存在下に反応させて（Ｓ）−ウレイドグリコ ラートを形成させかつ該化合物をＮＡＤ（Ｐ）＋及びウレイドグリコラート−デ ヒドロゲナーゼで酸化してカルバモイルオキサメートを形成させかつ形成された ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを直後的に又は色素指示薬系を介して測定することを特徴とする 、尿素を酵素的に測定する方法。
2. ２．ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとテトラゾリウム塩とをジアフオラーゼの存在下に反応させ てホルマザン色素を形成させかつ該色素を測定する請求の範囲第１項記載の方法 。
3. ３．プロテウス・レツトゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、ＤＳＭ２ ９６４から成るウレイドグリコラート−デヒドロゲナーゼを使用する請求の範囲 第１項又は第２項記載の方法。
4. ４．尿素を酵素的に測定する試薬において、グリコキシラート、ＮＡＤ（Ｐ）＋ 、（Ｓ）−ウレイドグリコラート−シンテターゼ、ウレイドグリコラート−デヒ ドロゲナーゼ及び緩衝剤を含有することを特徴とする尿素を酵素的に測定する試 薬。
5. ５．付加的にジアフオラーゼ及びテトラゾリウム塩を含有する請求の範囲第４項 記載の試薬。
6. ６．（Ｓ）−ウレイドグリコラート−シンテターゼ及びウレイドグリコラート− デヒドロゲナーゼ１〜３０Ｕ／ｍｌ、ジアフオラーゼ０．１〜１０Ｕ／ｍｌ、テ トラゾリウム塩０．０５〜１ｍｍｏ１／ｌ及び緩衝剤ｐＨ７〜９２０〜２２０ｍ ｍｏｌ／ｌ当りグリコキシラート０．１〜１０ｍｍｏｌ／ｌ、ＮＡＤ（Ｐ）＋１ 〜２０ｍｍｏｌ／ｌを水溶液の形で含有する請求の範囲第５項記載の試薬。
7. ７．（Ｓ）−ウレイドグリコラート−シンテターゼ及びウレイドグリコラート− デヒドロゲナーゼ３〜３０Ｕ／ｍｌ、ジアフオラーゼ０．５〜５Ｕ／ｍｌ及びテ トラゾリウム塩０．１〜０．５ｍｍｏ１及びｐＨ７．５〜８．５用緩衝剤５０〜 １５０ｍｍｏｌ／ｌ当りグリコキシラート０．５〜５ｍｍｏｌ／ｌ、ＮＡＤ＋５ 〜１０ｍｍｏｌ／ｌを含有する請求の範囲第６項記載の試薬。
8. ８．非イオン性界面活性剤０．１〜０．５重量％を含有する請求の範囲第４項か ら第７項までのいずれか１項記載の試薬。
9. ９．燐酸塩緩衝剤又はトリス緩衝剤を含有する請求の範囲第４項から第８項まで のいずれか１項記載の試薬。
10. １０．テトラゾリウム塩として３−（４′，５′−ジメチルチアゾール−２−イ ル）−２，４−ジフエニルテトラゾリウムプロミド（ＭＴＴ）又は２，２′−ジ −（Ｐ−ニトロフエニル）−５，５′−ジフエニル−３，３′−（３，３′−ジ メトキシ−４，４′−ジフエニレン）ジテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）を含 有する請求の範囲第４頂から第９項までのいずれか１項記載の試薬。