JPS61502027A - ヒトｔ細肪増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （７）請求の範囲第２項記載の伝達ベクターでトランスフェクトされている哺乳 類細胞。

（８）請求の範囲第１項記載の伝達ベクターで形質転換されている微生物細胞。

（９）本質的に第Ａ表の２０−１５３の番号で示されるアミノ酸から成る蛋白質 。

（１０）本質的に第Ａ表の２１−１５３の番号で示されるアミノ酸から成る蛋白 質。

（１１）請求の範囲第９項記載の蛋白質および成熟ａＴ　ＣＧ　Ｆ蛋白質から成 る蛋白質の混合物。

（１２）ａＴＣＧＦのｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ、。

（１３）　ａＴ　ＣＧ　Ｆを暗号化している配列を含んでいる組換え体オペロン の発現を宿主中で誘発することを含むａＴ　ＣＧ　Ｆの生産方法。

（１４）ａＴＣＣ；ＦのｍＲＮＡからｃＤＮＡを作成し、少なくともａＴＣＧＦ 暗号配列を、伝達ベクターに含まれている組換え体オペロンの転写調節のもとに 上記ｃＤＮＡから上記伝達ベクターへ組込み、上記暗号配列の宿主内における発 現を誘発することを含む、請求の範囲第１３項記載のａＴ　ＣＧ　Ｆの生産方法 。

明　細　書 ヒトＴ細胞増殖因子 Ｔ細胞増殖因子（ＴＯＣＦ）は、またインターロイキン−２（ＩＬ−２）として も知られており、哺乳動物において、レクチン活性化または抗原活性化Ｔ細胞に よって産生されるリンホカインの１種である。

ヒトｍＲＮＡから組立てられたクローン化遺伝子によりＴＣＧＦを暗号化してい る前駆体蛋白質の構造とその発現が、タニグチ等によって報告された［ネーチャ ー、３０２巻、３０５−３１０頁（１９８３年３月コ。

この発明は、従来報告されているものとは全く異なるヒトＣＧＦの発見およびそ の提供に基づいている。

本明細書においては、以下、当該技術分野の専門家にとって周知の、従来報告さ れているヒトＴＣＧＦおよびこの発明の提供に係るヒトＴＣＧＦの何れか一方、 またはその双方のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を包括する系、またはこ れに関連する系について説明を行なう。このような系を、本明細書ではｒｍＴｃ ＧＦＪの名称で示す。本明細書で「ａＴＣＧＦＪの名称は、この発明によって発 見され、提供されるヒトＴＣＧＦを特に指示する場合に用いられる。

必要な説明を明確化および／または筒略化するため、本明細書を通じ、下記の定 義を用いる。

クローニング・ビヒクル、ベクター、伝達（トランスファー）ベクター等は、何 れも非染色体性のＤＮＡ（特に明示しない限り２本鎖）であり、例えば動物細胞 または微生物等の宿主内で複製が可能なもの（無傷のレプリコンを含んでいるか ら）である。ただしクローニング・ビヒクルの語は、目的が、主としてクローニ ング（増殖）にあって発現ではない場合に繁用され、一方、伝達ベクターの語を 用いる場合は、一般にヘテロローガス（外来性）なりＮＡを含んでいる組換え体 構築物（より詳細には、その発現が究極的に所望される暗号配列の全部またはそ の１部）であって、この発明の目的達成のために調製されるものを示している。

ベクターの語は、プラスミド、バクテリオファージ、その他、同様に出発物質と して用いられる有用なビヒクルを包含する一般的な概念を含んで用いられるが、 また同時に、それらの組換え体誘導物を指して用いることもある。したがってこ れらの用語は、通常その用途を強調しようとする場合の上記特定の意味と関連し て、相互に交換し、時には重複して使用することができる。

転写調節系−ベクターは、転写ベクター等に含まれている組換え体ビヒクル構造 を言い、所望により、宿主内の翻訳可能なリポソームｍＲＮＡの転写調節に必要 な２本鎖ＤＮＡ領域、または少なくともＤＮＡ構築体を含んでいる領域群を含ん でいる。またこの語は、転写を制御し、調節し、促進す４ことを目的とする固有 の系に含まれる可能性のあるすべての要素を包含しようとするものである。この ような要素には、プロモーターおよびオペレーター（プロモーター・オペレータ ー系をも含む）、ＣＡＰ結合部位、リポソーム性結合部位配列、いわゆる「ナツ ト部位」およびエンハンサ−として周知の要素を、非限定的に含んでいる。言う までもなく、効率的に転写を行なうのに最低必要な要素は、さまざまな因子、と りわけ転写が行なわれる宿主次第で決まる。例えば、オペレーターは調節遺伝子 によって作り出されるリプレッサーにより支配されるが、調節遺伝子は伝達ベク ターが加えられる宿主の染色体に局在していることもあり、（例えば、形質転換 によって）、その場合、定義により、このような調節遺伝子はベクターの転写調 節系の１部を構成しなくなる。同様に、翻訳可能な１ＲＮＡを作成すべくリポソ ームの結合部位を暗号化している配列は、ある種の宿主（一般に細菌性の宿主） の場合に限って必要である。

組換え体オペロンは、転写調節系、およびその系の制御下にａＴＣＧＦを暗号化 している配列を含んでいる２本鎖ＤＮＡセグメントを示す。

発現は、転写および翻訳の独立したプロセス、即ち、ｍＲＮＡの作成および、そ のｍＲＮＡからの蛋白質の作成を一般的に示す場合に用いる。

この発明の、上記およびその他の対象は、下記の説明および添付図面から明らか である。

第１図は、単離したポリ（Ａ）−ｍＲＮＡを酵素的に処理して２本＠ｃＤＮＡへ と変換し、この組換え体をプラスミドｐＢＲ３２２へ組込み、複数個のクローニ ング・ビヒクルｐＢＲ３２２−ｃＤＮＡを作成し、これを細菌へ導入してクロー ン・ライブラリーを得、次いでこれをスクリーニングしてｍＴｃＧＦメツセンジ ャーのｃＤＮＡを含有するクローニング・ビヒクル、即ちりＢＲ３２２−ａ＋Ｔ ｃＧＦとも呼ばれる所望のクローニング・ビヒクルが導入されたクローンを見付 は出すことがら成るクローン化ストラテジーの全体を示す。

第２図は、Ｍ１３ジデオキシ−配列決定法によって配列を決定するため、ＤＮＡ 分解１：、にりＩ）ＢＲ３２２−ｍＴｃＧＦから１ＴＣＧＦのｃＤＮＡ２本鎖セ グメントを得るストラテジーである。この方法によって得られる５個のセグメン トのうちの４個は、第３図に示す如く配列が決定された（第３図参照）。

第３図は、制限酵素切断によりｐＢＲ３２２−ｍＴｃＧＦ’からｍＴｃＧＦのｃ ＤＮＡ２本鎖を得て、その塩基配列をＭ１３ジデオキシ−配列決定法により決定 するストラテジーである。また第３図には、５’−１７量体プライマーを用いて 得られた別のセグメントの配列決定をも示す。

さらに第３図には、第２図に示した方法で分解して得られたｃＤＮＡ断片の５個 のうちの４個の配列決定を図示している。

第４図は、マクサム−ギルバート法によって塩基配列を決定するため、制限エン ドヌクレアーゼ切断により、ｍＴ　ＣＧ　ＦのｃＤＮＡ２本鎖を得るストラテジ ーである。

第５図は、動物細胞内でａＴ　ＣＧ　Ｆを産生させるために、伝達ベクターｐＣ ＶＳＶＬ−ａＴＣＧＦの塩基配列を決定することより、判明したｐＢＲ３２２− ａＴｃＧＦの組立てを示す。

第６図は、転移ベクターｐＥＶＰＬ−ａＴＣＧＦ（下記第７図）の組立てに有用 なａＴＣＧＦ暗号化セグメントの組立てを示す。この伝達ベクターは、細菌内で ａＴ　ＣＧ　Ｆを産生させるのに有用である。

第７図は、プラスミドｐＥＶＰＬから誘導される伝達ベクターｐＥＶＰＬ−ａＴ ＣＧＦの組立てと、細菌内におけるそのａＴ　ＣＧ　Ｆ生成能を示す。

第８図は、プラスミドｐＥＶＰＬの組立てを示す。

下記の第Ａ表は、ａＴＣＧＦのアミノ酸配列と、そのｃＤＮＡセグメントのヌク レオチドを図示したものであって、具体的には、該ヌクレオチドは成熟蛋白質を 暗号化している領域、シグナルペプチド領域、および天然遺伝子によって暗号化 されている上流部分（５′）および下流部分（３“）の翻訳されない領域を含ん でいる。アミノ酸は慣用略記法で表わし、それらの記号の上に間隔をおいて番号 を打った。配列中のヌクレオチドは、ヌクレオチドの１０個おきにその表示の下 に点を打ち、さらに５０個毎の位置に番号を付して示した。また、配列中にある 幾つかの制限部位の位置も明らかにした。

赤十字より入手可能なヒトのプラスマフニレシスで得られる４本の副生成物の混 合物をｍＴｃＧＦのｍＲＮＡの供給源物質として使用した。

下記実施例に示す如く、プラスマフニレシス副生酸物試料をインビトロで培養し 、***誘発因子で誘発し、それによってｍＴｃＧＦおよびそのａ＋ＲＮＡ濃度を 増すことができる。次いで、細胞を酵素分解して細胞質膜ＲＮＡ内容物を遊離し た後、オリゴｄＴセルロース・カラムを用いてｍＲＮＡを単離することができる 。採取したｍＲＮＡ混合物中に所望のｍＴｃＧＦのｍＲＮＡが存在することは、 標準ゼノパス・ラエビス（アフリカッメガエル）翻訳システム、および好適なＴ 細胞増殖因子活性測定を用いて確かめることができる。採取したｍＲＮＡ混合物 中にかなりの量のｍＴ　ＣＧ　ＦのｍＲＮＡが見いだされれば、それらの混合物 はｍＲＮＡからＤＮＡ２本鎖を作成するｍＴ　ＣＧ　Ｆの組立て、単離および同 定を試みるのに有用である。この試みは、混合物中にある全ｍＲＮＡからまず２ 本１１ｃＤＮＡを作成することによって達成することができる。第１図に概要を 示したように、ｍＲＮＡ混合物を逆転写酵素で処理しくｍＲＮ　Ａ／ｃＤＮＡを 作成）、次いで、塩基（ｃＤＮＡを分離）およびＤＮＡポリメラーゼＩの巨大断 片（フレノウ断片）で処理することによってＣＤＮＡの２本鎖ヘアピン・ループ 折れ曲がり構造を生じ、このヘアピン・ループは更にＳｔ−ヌクレアーゼによっ て効果的に切断することができる。次いで、得られた２末鎖ｃＤＮＡを種々のベ クター（例えばプラスミド等）の任意の１つに組込むことによって、クローン化 することができる。例えば、第１図に示したように、プラスミドｐＢＲ３２２を 使用して複数個のクローニング・ビヒクルｐＢＲ３２２−ｃＤＮＡを作成するこ とができる。制限酵素切断によって線状にしたクローニング・ベクターへの構造 未知のｃＤＮＡの組込みは、ｃＤＮＡ末端のホモポリマー尾部と、これに相捕的 な、予め制限酵素切断で線状化した該クローニング・ベクター末端のホモポリマ ー尾部とにより容易にできるが、この尾部はｃＤＮＡを線状化ベクターへ組込み の際に、制限部位を再構成するのに好都合なように選択する。即ち、第１図に示 すように、制限酵素ｐｓｔｌで切断し、付着末端を生じたｐＢＲ３２２へのｃＤ ＮＡの組込みは、得られたｃＤＮＡの３′末端のホモポリマーｒＣ（シトシン） 」尾部およびこれと相捕的なプラスミドｐＢＲ３２２の３′末端のホモポリマー ｒＧ（グアノシン）」尾部とによって行なわれる。ＰｓｔＩ切断によって３“末 端に生じたｒＧＪ尾部は、ｃＤＮＡの「Ｃ」尾部が線状プラスミドにｒＧＪ尾部 へ組込まれることによって生じる伝達ベクター内で、ＰｓｔＩ切断部位の修復を もたらし、これによって、挿入されたｃＤＮＡ（Ｉｌ＋ＴｃＧＦ）セグメントを 所望の如くクローニング・ビヒクルｐＢＲ３２２−ｃＤＮＡ（ｐＢＲ３２２−ｍ ＴｃＧＦ）群から取り出すことができる。

得られたクローニング・ビヒクルｐＢＲ３２２−ｃＤＮＡ混合物を用い、エシェ リキア・コリ（例えばＭＣ１０６１株）のような好適な複製宿主へこれを導入す る。標準的な方法にしたがい、得られた形質転換株をフィルター上に分散させ、 抗生物質の存在下にこれを培養しく形質転換されていない細菌を除去するため） 、独立したクローン群のライブリーを得る。そのようなライブリー（レプリカ培 養して）を用い、所望の暗号配列を有するｃＤＮＡ挿入体を含有している候補ク ローン（群）をスクリーニングすることができる。

所望の候補クローン（群）のスクリーニングは標準的なコロニー・ハイブリダイ ゼーション法を用い、併せて候補クローンをつきとめることができる好適な同定 手段を用いることによって実施することができる。そのような同定手段としては 、その中の各ヌクレオチドが、探索の対象である該ｃＤＮＡセグメント中の相補 的塩基対ヌクレオチドと水素結合によって結合できるという理由で、プローブと して有用な適当鎖長の０ｐ−標識オリゴヌクレオチドを用い得る。但しこの場合 必要なことは、その構造が事実上、全鎖長にわたって完全に相捕的であるという ことである。そのような、何れも１７個のヌクレオチドから成り、それぞれｄ（ Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−＾−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−＾−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ）、お よびｄ（Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ− Ｇ）の構造を有する２つのヌクレオチド・プローブが、実施例１に詳述したコロ ニー・ハイブリダイゼーションの実験によって、これらを約４０゜０００個のコ ロニーの中から選ばれた６個の異なったコロニーによってハイブリッド化（結合 ）することにより見いだされた。

この発明に包含される発見は、配列決定の結果、上記のようにして同定された６ 個の候補の中の４個において、そのｐＢＲ３２２−ｍＴｃＧＦに含まれているｃ ＤＮＡ挿入体のヌクレオチド配列を解明したことに由来している。後段に詳しく 述べるように、これらの４つのｐＢＲ３２２−＋ｍＴＣＧＦのｃＤＮＡ挿入体の 配列は、ジデオキシＤＮＡ配列決定法とマクサム・ギルバートの特異的化学分解 ＤＮＡ配列決定法の２つを組合わせた方法を用いて決定した（信頼性を保証する ため）。第２図（ＤＮＡ分解）および第３図（制限切断）に示したストラテジー は、何れもジデオキシ配列決定法に用いるｃＤＮＡ断片を入手するために使用し た。第４図は、マクサム・ギルバートの配列決定法に用いる断片を得るためのス トラテジーである。これらの配列決定の結果を、下記の第Ａ表に示す。

その結果、これら４個のｃＤＮＡ挿入体のうちの１つに現在知られているＴ細胞 増殖因子とは明らかに異なった成熟蛋白質（これをａＴ　ＣＧ　Ｆと命名する） を暗号化している配列を含んでいるという発見が提供された。

明らかに異なったａＴＣＧＦを暗号化しているこの配列を含んでいる伝達ベクタ ーｐＢＲ３２２−＋ｎＴＣＧＦを、発明者らはｐＢＲ３２２−ａＴＣＧＦと命名 する。また実施例に記載のようにして得た、上記ｐＢＲ３２２−ａＴＣＧＦで形 質転換したエシェリキア・コリＭＣ］０６１は、アメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクションにＡＴＣＣ３９６７３の評価番号で寄託した際、エシェリキア ＭＣ１０６１−ｐＴＣＧＦｌ　１と命名された。

上記の第Ａ表において、メチオニンを暗号化している１番目のヌクレオチド・ト リプレットを１番と定め、直後に停止シグナル対（ＴＧＡおよびＴＡＡ）が続い ていることから、１５３５３番目レオニン・コドンをアミノ酸末端として確認し 、番号を定める。予期していた通り、配列分析から、ａＴ　ＣＧ　Ｆ遺伝子領域 によって転写されたｍＲＮＡのヌクレオチド鎖は、成熟ａＴ　ＣＧ　Ｆ蛋白質を 暗号化している暗号領域のヌクレオチド鎖長より°もはるかに長いことが判明し た。その結果、最初の分析では、成熟ａＴ　ＣＧ　Ｆ蛋白質が１５３に及ぶアミ ノ酸を有し得ることを示したが、その後、さらに後述の如く検討の結果、成熟ａ Ｔ　ＣＧ　Ｆ蛋白質よ、第Ａ表の２１番目から１５３５３番目の連続したアミノ 酸から構成されていることが判明した。またこの配列は、最初のメチオニン・コ ドンから始まる上流部からＴＡＡ終止シグナルまで、最初のメチオニン・コドン と同調していることを示しており、したがって、得られたｃＤＮＡはａＴ　ＣＧ 　Ｆの全配列を含んでいることが判明した。それ故に、ｃＤＮＡに見いだされる ａＴ　ＣＧ　Ｆ遺伝子領域は、上流部（５゛）の翻訳されない４２塩基対に始ま り、以下これに続いて６０塩基対のシグナル・ペプチド配列、４５９塩基対から 成る成熟蛋白質暗号配列、合計６塩基対力・ら成る成熟蛋白質暗号配列、合計６ 塩基対から成る１対の終止コドンおよびその下流部（３°）にある翻訳されない 部分から構成されてし）る。ま六；、第八図には、多くのエンドヌクレアーゼ制 限部位を、その顕すれる配列によって示している。

このように、この発明はａＴ　ＣＧ　Ｆを暗号化している暗号配列を含み、それ によってその配列をクローン化することができる伝達ベクターを提供する。また 、この発明はａＴＣＧＦ暗号配列を含み、それによってその配列を発現し、ａＴ 　ＣＧ　Ｆ蛋白の産生を達成することができる伝達ベクターを提供する。そのよ うな伝達または発現ベクターは、少なくともベクター内にａＴ　ＣＧ　Ｆの暗号 配列を備え、その暗号配列が伝達ベクター内で転写調節系の転写調節下に配置さ れるようにすることによって、基本的に作成することができる。得られるビヒク ルは、ａＴＣＧＦの暗号配列を含んでいる組換え体オペロンを含んだ伝達ベクタ ーとなる。そのレプリコンが無傷であることから、伝達ベクターはまた、複製に 好適であると同時に、あらかじめ選ばれた宿主、例えば、動物細胞また（よ酵母 、細菌等の微生物中での発現に好適に通用される。多くのベクターがそのような 発現ベクターを組立てるのに利用できる。一般に、用し１られる個々のベクター は、宿主の問題以外にも他のさまざまな既知因子によって左右されるが、普通、 発現に関する総合的なストラテジーに従ってきめられる。また一般に、そのよう なベクターの多くは、他のベクターの組換え体誘導物であり、例えば、２または それ以上のプラスミド類から断片を組合わせ、またはプラスミド類およびバクテ リオファージ類からの断片を組合わせ、一方、特殊な目的にあまりそぐわないと 考えられる断片を除き、所望の特性を備えさせることができる。転写調節系およ び／またはそれらのさまざまな要素は、主に特定の宿主内における発現を向上さ せようとする努力によって、伝達ベクターの他の断片の供給源と異なる各種の供 給源から入手することができる。多くのプロモーター、プロモーター・オペレー ター系、リポソーム結合部位配列、およびその他の要素が知られており、この目 的のために使用できる。

一般に、成熟蛋白質の開始点である２１−アラニンのコドンに先立つ配列、即ち 、上流部の発現ベクター配列は、発現に使用する宿主を含めて目的とするａＴｃ ＧＦ産主に関する総合的にストラテジーの如き、ある種の因子によって変化する 。成熟ａＴＣＧＦは、翻訳開始コドンＡＴＧをメツセンジャーＲＮＡに備えるメ チオニン（Ｍｅｔ）でなくアラニン（２１−Ａ４ａ）で始まるので、読取り相の 上流部および読取り相中のＡＴＧコドンにａＴＣＧＦ暗号配列を備えるのが適切 となる。２ｌ−ＡＮａから上流位置にＡＴＧコドンを備えることは、ａＴＣＧＦ 暗号配列（例えばａＴＣＧＦｃＤＮ・Ａ挿入体等）を含んでいる配列（こ既にあ るＡＴＧを用いることによって実施できるが、あるいは、別法として、この２ｌ −ＡＱａコドンの前に最初に現われるＡＴＧが２ｌ−Ａｉ２ａコドンによる読取 り相内にある場合、発現に用いるプラスミドのような外来性の供給源から、これ と同じものを提供することができる。一般に、ａＴ　ＣＧ　Ｆ暗号配列の後には 、ａＴ　ＣＧ　Ｆ蛋白の作成を成熟蛋白質の最後のアミノ酸（第Ａ表の１５３− Ｔｈｒ）で終わらせるｌまたはそれ以上のコドンが続く。この目的は、ｃＤＮＡ で解明された配列に示されたようにａＴｃＧＦ暗号配列の直後に統くｌまたはそ れ以上の翻訳終止コドンによって成就することができる。

クローニング・ベクターｐＢＲ３２２−ａＴＣＧＦの形で利用可能なａＴＣＧＦ 暗号配列を含んでいるｃＤＮＡ挿入体は、ａＴ　ＣＧ　Ｆを作成するため切り出 して、そのまま、または他の方法を介して使用できる。配列分析の結集、このｃ ＤＮＡは、ａＴＣＧＦ暗号配列から上流部のヌクレオチド領域を含んでいること が判明しているので、この上流部分の１４１５または全部を取出すことが可能で ある。それ故に、翻訳されない４２塩基対内外の領域め全部または１部を取出す ことができる。ここに示した特殊態様は、ａＴｃＧＰの作成に好適な転移ベクタ ーを組立てるためｃＤＮＡ挿入体を利用する方法を、単に例示的に示したもので ある。

動物細胞内における発現は、見かけのシグナル・ペプチド配列が存在する（第Ａ 表の１−２０アミノ酸）ことから、ａＴｃＧＰ蛋白の配列を究極的に解明するた めの発現が最初の目的であったが、それは、動物細胞においては配列によって暗 号化された蛋白質が生産される際に、該細胞系によって、任意のリーディングシ グナル・ペプチドを前駆体蛋白生産物から切り取る機会が提供されるので、成熟 蛋白質を得ることができるからである。

このようにして、第５図に示す如く、クローニング・ビヒクルｐＢＲ３２２−ａ ＴＣＧＦはエンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化されることによって、線状となる と同時に、クローニング・ビヒクルからａＴ　ＣＧ　Ｆ挿入体を放出する。こう して得られたａＴＣＧＦ−ｃＤＮＡセグメントは約８００塩基対を含んでおり、 各末端に付着Ｐｓｔｌ末端を有している。

同じく第５図に示す如く、この約８００塩基対のａＴＣＧＦ−ｃＤＮＡは、唯一 のＰｓｔＩ部位の切断によって線状にしたプラスミドｐＣＶＳＶＬへこれを組込 むことにより、発現伝達ベクターの作成に用いられる。

プラスミドｐＣＶＳＶＬは既知であり、ｐｃｖｓｖｔ、の構造および性質に関し てはある程度しか説明しないが、例えば、カウフマンらの記載［モレキュラー・ アンド・セルラー・バイオロジー（１９８２年１１月）、１３０４−１３１９頁 コに記載があるので、ここに引用して説明に含める。

プラスミドｐＣＶＳＶＬはアデノウィルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ） の左方向の読取り領域（第５図の組換え体プラスミドＩ）ＣＶＳＶＬ−ａＴＣＧ Ｆに矢印で示す）からほぼ直ぐ下流部にｐｓｔｌを含んでいる。

ＰｓｔＩ部位から直ぐの下流部はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）の遺伝 子部分であり、またこのプラスミドは２つの動物細胞レプリコン（ＳＶ４０ｏｒ りを、その３つのＸｈｏ１部位の領域に有している。また第５図から明らかな如 く、このプラスミドは５゛−３゛接合部位（ＳＳ）を有する。

したがって、プラスミドｐｃｖｓｖｔ、は、所望の暗号配列をＡｄＭＬＰプロモ ーター領域へ正しい読取り方向１こ組込むことによって、動物細胞に発現するの に特に好適である。ａＴ　ＣＧ　Ｆ配列を含有しているセグメントをｐＣＶＳＶ 、ＬプラスミドのＰｓｔ１部位へと組込むことによって、伝達ベクターｐＣＶＳ ＶＬ−ａＴｃＧＦを作成する（エシェリキア・コリヘクローニングした後で同定 する）、４８〜７２時間の誘導機関を経て、ｐＣＶＳＶＬ−ａＴＣＧＦをサルの Ｃ０９−７細胞へトランスフェクションすることによって、発現蛋白質生産物が 導かれ、この蛋白質のＴ細胞増殖因子活性を測定したところ陽性であった。この 蛋白質の精製および配列分析により、このものが成熟ａＴ　ＣＧ　Ｆ生産物であ り、第Ａ表に示した２１〜１５３のアミノ酸配列と、遊離のＮ−末端およびＣ− 末端を有するポリペプチドであることが確かめられた。

細菌内にａＴ　ＣＧ　Ｆ配列を発現し、ａＴＣＧＦを生産する態様を、第６図お よび第７図に示す。第６図および第７図に示した態様では、ストラテジーは、所 望のＡＴＧコドンを上流部に配置し、その直後に近接して２ｌ−Ａ４ａコドンを 配置している暗号配列を使用することによって、細菌内の好適な伝達ベクターに 発現する際に、順当に暗号化された前駆体蛋白質（−１）Ｍｅｔ−ａＴ　ＣＧ　 Ｆの少なくともＩｍが生産され、これを蛋白分解して成、＠ａＴＣＧＦ蛋白質生 産物に変換する。第６図および第７図のストラテジーを実施する１方法は、成熟 ａＴ　ＣＧ　Ｆ蛋白質の最初のアミノ酸（２１−Ａ１２ａ）に対応するコドン（ ＯＣＡ）を最初の上流コドンとするａＴＣＧＦの暗号化セグメントの作成から始 める。第６図に示したように、そのような暗号化セグメントは、ｐＢＲ３２２− ａＴＣＧＦクローニング・ビヒクルのｐｓｔＩ挿入部位から入手できるａＴ　Ｃ Ｇ　ＦのｃＤＮＡ挿入体から生産することができる。ｐＢＲ３２２−ａＴＣＧＦ をまずＰｓｔＩで切断するとａＴＣＧＦ−ｃＤＮＡ（約８００塩基対）挿入体が 得られる。次いで、１本鎖（ｓｓ）バタテリオファージＭ１３ベクターでエシエ レキャ・コリを形質転換して生成する２本鎖（ｄｓ）形を採取することによって 得られるｄｓＭ１３ベクター（例えばＭＩ３ｍｐ９）のｐｓｔ１部位に、これを 挿入する。得られた伝達ベクターｄｓＭ１３−ａＴＣＧＦを、既知の方法により エシエレキャ・コリに導入すると該ベクターのクローニング（増殖）と、それに 伴う放出が生じ、これを、ａＴ　ＣＧ　Ｆ挿入体の暗号鎖が取出された事実上１ 本鎖となった環状ＤＮＡ（第６図の５５Ｍ１３−ａＴＣＧＦ１制限切断部位を再 建した部位に残っている１本鎖部分を括弧で示す）の上清から回収する。ベクタ ーのこのような１本鎖を２ｌ−Ａ１２ａに対応するコドンで始まるａＴ　ＣＧ　 Ｆ暗号化セグメント合成の鋳型として使用する。この目的のため、２ｌ−Ａ１２ ａのコドンで始まる非暗号績と相補的な配列を持つ好適な鎖長の１本鎖オリゴヌ クレオチド、例えば１７量体（第６図の２ｌ−ＡＩ２ａプライマー−５°−１７ 量体）を合成する。このオリゴヌクレオチドは、その１つ１つのヌクレオチドが 連続して、鋳型のヌクレオチドと相補的になるように調和的に組立てられる。従 って、好適な１７量体は５’ｄ（ＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣ）の構造 を有するものである。このオリゴヌクレオチドを前記の１本鎖鋳型（ｓｓＭ１３ −ａＴｃＧＰ）と混ぜ合わすと、オリゴヌクレオチドは、最初のヌクレオチドが ２ｌ−Ａ（！ａコドン・ヌクレオチドと相補的なヌクレオチドで姶まるａＴ　Ｃ Ｇ　Ｆの暗号配列と対応した、鋳型の最初の１７ヌクレオチド鎖へハイブリッド 化される。そのようなハイブリダイゼーションは、、フレノウ断片で既知の如く 処理する方法によって、新たに鋳型と相補的な部分を付は加えて合成するプライ マ一部位を効果的に提供する。その上うな相補的鎖の合成は十分に行なわれ、あ るいはＭ１３によって提供されるＢａｓｍＨＩ部位を越えて続けられる。得られ た生成物をヌクレアーゼＳｌで処理して残っている１本鎖部分を除き、線状とし て得られたＤＮＡを、フレノウ断片で処理し４個のデオキシヌクレオチドをすべ て付加することによって、正確に２１−Ａ、（ｌａを暗号化している平滑末端で 始まりａＴＣＧＦの暗号を含んでいる２本鎖が確実に作成される。この線状ＤＮ ＡをＢａｍＨＩで切断することによって、ａＴＣＧＦのｃＤＮＡをｄｓＭ１３ベ クターに挿入して再建されたＰｓｔｌに隣接している、いわゆるＭ１３ポリリン カ一部分で切断することにより、目的とするａＴ　ＣＧ　Ｐ−ＤＮＡ２本鎖（第 ６および７図のａＴＣＧＦ遺伝子セグメントＢＥ）が得られる。従って、目的と するａＴＣＧＦ暗号化２本鎖は、一方にＡｅａコドンで始まる平滑末端を有し、 また他方ＢａｍＨＩ切断によって生じた付着末端を有している。

第６図および第７図に示したストラテジーで、成熟ａＴ　ＣＧ　Ｆ暗号配列の冒 頭にＭｅｔを暗号化している開始トリブレットＡＴＧを具備するという目的は、 細菌性宿主を形質転換するための組換え体発現ベクターの作成に用いるプラスミ ドからＡＴＧを入手して作成することによって達成される。所望のＡＴＧは、第 ７図に示すように、ｐＥＶＰＬのようなプラスミド（詳細は第８図に示す）を使 用することによって、ａＴ　ＣＧ　Ｆを作成する究極的な発現伝達ベクター内に 具備することができる。このプラスミドは、ＫｐｎＩ部位に終結するヌクレオチ ド部分が直ぐ後に続いているａｌｌリポソーム結合部位配列の上流部に、λＰＬ プロモーター・オオベレターを持っている。この部分はｃｌＩ暗号配列（別の場 合は除去された）のＡＴＧ翻訳開始コドンで始まり、Ｋｐｎ１部位は、この所望 のＡＴＧ配列（下図の下線部分）と部分的に重なり合っている。この部分の実際 のＫｐｎｌ切断位置は、矢印で示される。

ｐＥ　Ｖ　Ｐ　ＬをＫｐｎｌで切断すると３°ＧＴＡＣの突出部ができ、これは ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片を用いることによって容易に修復され、所望 のＡＴＧコドンの平滑末端化されたＧ−Ｃ塩基対末端となる。

またプラスミドｐＥＶＰＬは、都合よい位置に配置されているＢａｍＨＩ部分を 含んでおり、これは切断されて、プラスミドの平滑末端ＡＴＧを遺伝子セグメン トＢＥの平滑末端ＯＣＡ（２１−Ａｆ２ａ）へ結合する（Ｔ、リガーゼ）ことζ コより、目的とするａＴ　ＣＧ　ＦセグメントＢＥを線状ｐＥＶＰＬへ組込むこ とができ、対応する部分の相捕的付着ＢａｍＨＩ末端を結合（Ｔ、リガーゼ）す ることができる。このようにして得られた伝達ベクター（ｐＥＶＰＬ−ａＴＣＧ Ｆ−その読取り方向は第７図に矢印で示される）は、修飾されて温度感受性のリ プレッサー配列を有し、細菌性溶菌を欠いているラムダ（λ）溶原を保育してい るエシェリキア・コリのような好適な細菌性宿主（エシェリキア・コリｗｓ　ｔ 　ｉ　ｏλＹ１３９等）へ、通常の方法で導入するのに使用される。このように して得られた形質転換株は、通常の方法で単離することができ、１部は、本明細 書の実施例日に記載の如く、３５Ｓ−メチオニン標識細胞を使用する発現試験を 行なう。所望の蛋白質発現陽性の指標が得られたら（実施例Ｂ）、３０℃で細胞 を数世代にわたって培養し、次いで、発現を実現するため、１時間３８℃に温度 を上昇することにより、この形質転換株の残りも発現させることができる。細胞 を音波処理して得た抽出物の検定によって、ＴＣＧＦ活性が顕われるが、作成し たａＴ　ＣＧ　Ｆの大部分は細胞質に不溶性であることが判明した。不溶性の活 性蛋白質を除去し、遠心により更に濃縮し、得られもベレットを水性緩衝液で洗 滌し、５ＤＳ（０，１％）に溶解する。この方法で得られた蛋白質の約５０〜７ ０％（例えば６０％）は、ａＴＣＧＦ配列を含んでいる配列の発現による生産物 である。調製的ＳＤＳゲル電気泳動によって分別し、既知の標準蛋白質に対応し 、同じ分子量のバンドを切り出して、溶出した後、気相微量アミノ配列分析装置 を使用して配列決定を行なうことができる。この方法でゲルから溶出した高い割 合の蛋白質、例えば８５〜９８％が、ａＴ　ＣＧ　Ｆ配列を含んでいる配列の発 現による生産物であった。このような発現生産物の少なくともかなりの割合（典 型的には２０〜５０％）は、第Ａ表に示す如く、ＡＱａ　−Ｐ　ｒｏ　−ｔｈｒ −で始まる１３３アミノ酸のａＴｃＧＦ構造と一致する。

残り（典型的には５０〜８０％）は、不完全にプロセスされたＭｅｔ−４１２ａ ・−Ｐｒｏ−ｔｈｒ−で始まる１３４アミノ酸から成る前駆体である。λＰＬ　 −プロモーター・オペレターの影響下に、特にプラスミドｐＥＶＰＬの転写調節 系、とりわけｃＩＩ遺伝子リポソーム結合部位配列を含んでいる転写調節系によ って提供される他の調節要素を用いて、ａＴ　ＣＧ　Ｆ暗号配列の細菌内発現を 行なうと、所望の発現生産物の高い生産鳳を挙げることができる。例えば、小規 模（１０１２）の発酵槽でＷ３１１０λＹ１３９株の場合、乾燥重量１０ｇ／１ ２の比較的低い細胞密度で、発現生産物の収量は、発酵混合物全体の少なくとも １００　ｘｇ／Ｑ程度、更に典型的には約２００ｘｇ／Ｑ程度まで達成できるこ とが判明している。細胞密度は乾燥重量２０〜３０９／Ｑ程度まで増量すること が可能であるから、所望の発現生産物の生産は、更に少なくとも４００〜６００ 　ｚｇ／Ｑ程度の高水準にまでさえ高めることができる。

従って、エシェリキア・コリＷ３　ｔ　ｉ　ｏのλＹ１３９にｐＥ　Ｖ　Ｐ　Ｌ を発現することは、この発明の、宿主細菌染色体内に発現ベクター・オペレータ ーのリプレッサー蛋白の調節遺伝子配列を組込むという実施態様の代表的な例で ある。このような方法で細菌を修飾する手法は既知である。例えば、λＹ１３９ 溶原［Ｎ　Ｉ　Ｈλファージ・コレクションから入手できる］を用い、マニアナ イスらの記載［モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル・ コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１（１９８２年）コの方法によ って、エシェリキア・コリｃ６００内にファージ・ストックを作成することがで きる。エシェリキア・コリｗｓｉｉ、、ｏを、１０ｉＭ　Ｍｇ５Ｏ，および０． ５％マ）Ｌｔドース含有Ｔ−フロスで３ＸｌＯ’細胞数／３＋１２の細胞密度と なるまで増殖し、ファージ・ストックと感染多重度５で混合する。感染細胞を室 温で３０分間静置し、Ｔ−ブロス試験管に連続希釈し、各試験管毎に試料を採取 してＴ−ブロス平板に移植し、コロニーが見いだされるまで３０℃でインキュベ ートする。所望のコロニーは、野性型λの増殖を４２℃で維持できるが、３０℃ では維持できないものである。

プラスミドｐＥ　Ｖ　Ｐ　Ｌおよび既知のプラスミドからの作成は、実施例Ａに 第８図を引用して詳細に記載しである。

この発明によって作成されたａＴ　ＣＧ　Ｆは、哺乳動物種の活性Ｔ細胞の複製 促進能を有する従来公知の哺乳動物Ｔ細胞因子に関する文献（タニグチら、前掲 ）に記載されている多くの既知用途に、同様に使用することができる。これらの 用途には、動物細胞の培養でその増殖を促進する用途のほか、その他のイン・ビ トロの適用を含み、また種々の状態の処理における治療的用途が含まれる。特に 興味深い治療用途は、認められているリンフ才力インの免疫調節特性に基づくも のであって、特に重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤＳ）、後天性免疫不全症候 群（ＡＩＤＳ）、高齢者の免疫不全前、および先天性免疫不全等、各種免疫不全 に由来する疾病処置にこれを使用することである。但し、ａＴＣＧＦは更に、サ イトメガロウィルス感染症およびヘルペスウィルス感染症のようなさまざまなウ ィルス疾患の処置や結核およびハシセン病のような細菌感染の処置に抗菌剤とし て使用できる。その上うなａＴＣＧＦの治療的用途に必要な投与量は、処置を行 なう疾病や、その状態の重篤度等のような既知の要因によって変わる。然し、一 般に哺乳動物、例えばヒトの患者に０．１μ９〜３０μ９／に９＜体重）を投与 すると、満足すべき結果を得るこしい。

ａＴ　ＣＧ　Ｆの多くの用途の中で、特に培養時のＴ細胞増殖促進能に基づくも のは診断および治療処置の補助的応用に関するものである。診断的用途は、リン ホカインを添加後イン・ビトロで、Ｔリンパ球の増殖の程度を放射性チミジンの 細胞内への取り込みを指標として用いて測定することによる、ある種の疾患の存 在を検出する既知の能力に基づいている。抗腫瘍処置のような治療補助的処置と しては、患者または他の適合し得る供血者から得られたＴリンパ球の増殖をａＴ ＣＧＦを用いてイン・ビトロで促進し、次いで増殖したリンパ球を再び患者に注 入し、疾病の制圧を助けることができる。一般に、培養および他のイン・ビトロ の適用においてＴ細胞の増殖促進に使用するａＴＣＧＦの量は、このような方式 における従来既知のヒ）ＴＣＧＦと同様であって、日常的な検討により最適化す ることができる。（−１）−Ｍｅｔ−ａＴＣＧＦ蛋白質と成熟ＡＴＣＧＦ蛋白質 との混合物は、（−１）−Ｍｅｔ−ａＴ　ＣＧ　Ｆ蛋白質が成熟ａＴ　ＣＧ　Ｆ 蛋白質の活性とほぼ同水準の活性を育しているという指摘に基づき、成熟ａＴ　 ＣＧ　Ｆと同じ態様で、同様の要領または濃度で使用することができる。

下記の実施例は例示的なものであり、この発明の態様を実施し得る方法を詳細に 説明しようと意図したものである。理解されるように、実施例に記載した実験は 極く小規模で実施しており、しばしば混合物を含んで、得られた成果を確かめる のに典型的に確立則および精密検出分析に依存しており、またある場合では、特 に天然の供給源、または使用物質または生産物質が生きているという性質のため に、すべての詳細にわたって全く正確に繰り返すというわけには行かなかった。

従って、この分野において、所望の実験を成功させる目的を再現させるには正し い方法を妥当な範囲で、ある程度繰り返すことが必要であるということも理解さ れよう。温度は、特に明記しない限り摂氏である。実施例中、他に特定しない限 りＴＣＧＦの検定は、増殖が完全にＴＣＧＦに依存しているマウス細胞（ＣＴＬ Ｌ−２）系を用いるチミジン取り込み検定を使用する。

この検定は、９６ウエルの平底マイクロプレートで、１００μσの２％ウシ胎児 血清加ＰＲＭＫ１６４０に、４０００個のＣ，ＴＬＬ−２細胞を加え、これに連 続希釈した測定試料１００μｅを加える。３７℃で２０時間インキュベート後、 ０，５μＣの３Ｈ−チミジンを適用して４時間培養し、自動細胞ハーベスタ−を 用いてガラス繊維フィルターストリップに捕集し、取り込まれた放射活性を液体 シンチレーション計数法で計測する。

実施例１ ［Ａ段階コ末梢血リンパ球から得られるｍＲＮＡ試料４本のグラ２マフニレジス 副生成物（赤十字から購入）をフィコ−・ル／ハイバーク（Ｆ　１ｃｏｌｌ　− Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配で分別した。低密度の細胞を勾配から採集し、ＰＲＭＩ− １６４に５％ウシ胎児血清、０．１７％フイトヘマグルチン、１０ｎｇ／ｘＩ２ ホルボール・ミリステート・アセタート（ＰＭＡ）の存在で、２Ｘ１０”細胞／ １．Ｑの密度でこの細胞を２４時間培養した（合計６Ｘ１０”の細胞が得られた ）。遠心（１０００ｒｐｍ、　５分間）によって細胞を回収し、燐酸緩衝食塩液 （ＰＢＳ）で１度洗滌し、遠心により細胞を採集した。細胞を、冷トリトン（Ｔ 　ｒｉｔｏｎ）溶菌バッファー［１４０＋Ｍ　ＮａＣ４，１，５ｗ＋Ｍ　ＭｓＣ Ｑｚ、１０１！１Ｍ　トリス（ｐＨ８，６）、０．５％トリトンｘ−ｉｏｏコ５ ０ｙＱに、１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＤＴ）および５０単位／婬ＲＮＡ５ ｉｎ［ビオチック（Ｂ　１ｏｔｅａ）から購入〕と共に浮遊する緩和な溶菌処理 によって、細胞質ＲＮＡを作成した。この溶菌物質を２等分し、各部分をそれぞ れ２０％スクロース含有溶菌バッファ一層１．ＯｘＱ上に石化した。冷時遠心に よって細胞核を除去した（４℃、４０００ｒｐｍ、５分間）。上層を注意深く取 り、採集濃度が１％となるようにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えた。

この溶液を等容量のフェノール・クロＣホルム（１：１）混合物で２回抽出し、 ２．５容量の冷エタノールを加えることによりＲＮＡが沈澱した。沈澱したＦＬ ＮＡを遠心によって採取しく１５分間、４０００ｒｐｍ）、これを０．０１Ｍ） リス（ｐＨ７゜５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．２５Ｍ　ＮａＣｆ２（，２５ＭＮａ Ｃ４加ＴＥ緩衝液）に再浮遊し、２．５容量の冷エタノールを加えて再沈澱した 。最後に、遠心によってＲＮＡを採取し、５ｘＱのＨｔＯに再浮遊した。採集収 量７゜５１１９であった。オリゴＤＴ（デオキシチミジン）セルシースで選び出 すことにより、全細胞質ＲＮＡからメツセンジャーＲＮＡを単離した。２５ｔ９ の全ＲＮＡを６５６で５分間加熱した。これにＮａＣＱを加えて０゜５Ｍとし、 放冷してＲＮＡを室温まで冷却した。このＲＮＡを、ＴＥ＋０．５Ｍ　ＮａＣＱ （結合バッファー）で安定化したオリゴｄＴセルロースのｉｘＱカラムに通した 。カラム結合バッファーで十分洗滌することによって結合しないＲＮＡを除去し た。結合しているメツセンジャーＲＮＡをＨｖ０３ｚＱで溶出し、これに０　、 ２　ｘ（ｌの４ＭＮａＣ（２および２．５容量の冷エタノールを加えることによ り、沈澱させた。沈澱したｍＲＮＡを遠心により採取した（２５，０００ｒｐｏ ＋、３０分間）。目的とするペレット（約１００μＶ）をａｔｏ５０μりに再浮 遊した。目的とする生物学的活性ｍＴＣＧＦのｍＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡ試 料の確認は、標準ゼノバス・ラエビス卵母細胞翻訳システムを用いて行なった。

即ち、雌性アフリカッメガエル（ゼノパス・ラエビス）から新たに分離した１０ 個の卵母細胞に、末梢血（ＰＢＬ）＋ｎＲＮＡ４０ｎ１２（ｎｉ２当たり、ｎｆ ２＝ナノリットル、ｍＲＮ　Ａ　１　ｎ９）づつをそれぞれミクロ注入した。対 象の卵母細胞にはＨ，Ｏをミクロ注入した。これらの卵母細胞を１００μＱバー ス培地（マニエテイスら、前掲３５１頁）で２０℃で２４時間インキュベートし た。この間に、ＰＢＬのｍ　ＲＮ　Ａを注入した卵母細胞は翻訳を行ない、ｍＴ ｃＧＦを生産し、究極的に培地内へこれを分泌するはずであり、一方、水を注大 した対照群では何も生産しないはずである。標準検定プロトコールを用いてＴＣ ＧＦ活性を測定し、ＰＢＬのｍＲＮＡを注入したゼノパス卵母細胞は著しい量の ＴＣＧＦ活性を産生じたのに対し、水を注入した対照群では何も生じないことが 判明した。

［Ｂ段階コ第１鎖ｃＤＮＡ反応 Ｈ，０１０μＣ中、ＰＢＩ、のｌｌｌＲＮＡ２０μ２を０．１Ｍメチル水銀で１ ０分間室温で処理した。ｌｏＯ＋ａＭＢ−メルカプトエタノール１０μＱを添加 することによりメチル水銀を不活性化した。この変性ＲＮＡをＣＤＮＡ合成反応 液１００　μ１２［１００ａ＋Ｍ　トリス（ｐＨ８，４）、１４０ｍＭＫＣＱ、 Ｉ　ＯｍＭ　ＭｇＣ４ｔ、ｌ　ＯｍＭ　Ｂ−メルカプトエタノール、ｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ％ｄＴＴＰそれぞれ５００μＭづつ、プライマーとしてオリ ゴｄＴ５μ９（平均サイズ１２〜１８）、”Ｐ−ｄＣＴＰ　７５μＣ１（４００ Ｃｉ／ミリモル）および２０単位のりボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮＡ５ｉｎを含む ］に加えて希釈した。４０単位の逆転写酵素を３７℃で加えることによって反応 を開始し、４２℃で３０分間インキュベートした。

６８℃で１０分間にＥＤＴＡを４０ｍＭ、ＮａＯＨを０．１Ｍまで加えることに よって反応を停止した。トリス・ＨＣρ（１）Ｈ７，５）０．１Ｍおよび当量の ＨＣｌ２を加えて塩基を中和した。次に、反応混合物を、水を飽和したフェノー ルとクロロホルムとの等量混合物（５０：５０）で抽出した。

フェノール層を、更に５０μＱのＴＥバッファーで抽出した。水層をプールし、 この混合物を１０ｍＭ）リス、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）で安定化した５ｘ ｆｆのセファロースＣＬ、−４Ｂカラムに通すことによって、１末鎖ｃＤＮＡを 単離した。溶出する画分を２５０ｍＭ　ＮａＣ４液に加え、２゜５容量の冷エノ ールをこれに加えることによりｃＤＮＡが沈澱した。遠心（２５，００ＯＲＰＭ 、３０分間）によりｃＤＮＡを採取した・目的のベレツト（ｃＤＮＡ２μｇ）を ５０μＱのＨｔＯに再浮遊した。

［Ｃ段階］第２鎖反応 ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片を用いて第２鎖ｃＤＮＡを合成した。２μ ７のｃＤＮＡ、５０１Ｍ燐酸カルシウム（ｐＨ７，４）、ｌＯａ＋ＭＭｇＣｉ２ ｔ、４種類の３燐酸デオキシヌクレオチドをそれぞれ２５０μＭ１１０ｉＭの２ −メルカプトエタノールおよび６単位のフレノウ酵素を含んでいる反応混合物（ ２００μｅ）を用いた。この混合物を３７°で１時間インキュベートした。ＥＤ ＴＡを５０ｍＭまで添加することによって反応を停止し、等容量のフェノール： クロロフェノールで抽出した。水除去した。前記（Ｂ段階）と同様に、溶出した 両分をエタノール沈澱によって濃縮した。

［Ｄ段階］Ｓｌ−ヌクレアーゼ消化 ｃＤＮＡの）Ｉ＜−ブをヌクレアーゼＳ、ｌこよって切断し、ループ折れ曲がり ｃＤＮＡをクローン化可能な形態に変換した。これを実施するため、２本Ｍｉｃ ＤＮＡ０．７５ｔｔ９を酢酸ナトリウム（ｐＨ４、５）、１ｍＭ酢酸亜鉛おヨヒ ０．Ｉ　Ｎａ（Ｊ！から成る反応液３ｏｏｕ１２中”ｉ？１２単位１７）Ｓｌと ３０″で３０分間インキュベートした。等容量のフェノールで抽出することによ り、反応を停止した。フェノール層を５０μＱのＴＥで更に抽出し、プールした 水層を前記と同様に５μｅのセファロースＣｆ２−４　Ｂカラムに通した。１５ ０μρづつ分別して採取し、最初の３分画（溶出するＣＤＮＡ画分）をプールし 、これにＮａＣｌ２をｏ、２５モルまで加え、更に２゜５容量のエタノールを加 えることにより、核酸を沈澱させた。ｃＤＮＡを遠心（２５，００Ｏｒｐｍ、　 ３０分間）によって採取し、４５μｇのＨｌＯに再浮遊した。ｃＤＮＡの最終収 率は３４０ｎ９となった。

［Ｅ段階］組換え体ｃＤＮＡ試料 １００ｎＳＦのｃＤＮＡを、Ｂ−メルカプトエタノール０．１ｍＭ、ＣｏＣＱｘ １＋Ｍおよび６単位のターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラー ゼを含んでいる反応混合物５０μｇ中で緩和に加熱することにより、ｃＤＮへの 末尾にホモポリマーＣ「尾部」を付加した。ＥＤＴＡを加えた４０ｍＭとし、６ ８℃で１０分間加熱することにより反応を停止した。ｐＢＲ３２２を、１０ｍＭ ）リス（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡおよび１００ｍＭ　ＮａＣＱの溶液５０ μｇ中において制限酵素ＰＳｔＩで消化することによって、線状化しく前記のｃ ＤＮＡのＣ−尾部化と同様に、ｄＧＴＰで尾部化し）たＧ−尾部化ＰＢＲ３２２ ２５０ｎ９と、先のＣ−尾部化したｃＤＮＡ５０ｎｇとアニーリングした。アニ ーリング反応は、６８℃５分間ブレインキュベートした後、５０℃で２時間実施 した。

これまでのＢ−Ｅ段階を第１図に示す。

［Ｆ段階］細凹の形質転換 ｃＤＮＡのアニ・−リング反応生産物を、直接エシェリキア・コリＭＣ１０６１ 株の形質転換に使用した。細菌細胞の新たなコロニーを５０Ｒρのし一ブσスに 接種に使用し、５５０ｎｍにおける光学密度０，２５となるまで数時間増殖した 。細胞を水上で冷凍し、遠心により回収した（４０００ｒｐｍ、１０分間）。ベ レツトを冷０．ＩＭＣａＣＱｘ液１０ｘＱ中に再浮遊し、１０分間氷上で静置し た。遠心（４０００ｒｐｍ、５分間）により細胞を採取し１，０．ｌＣａＣ４ｔ ２．５ｚｆ２に再浮遊した。次いで、ｃＤＮＡ７二−リング反応液２０μσをＣ ａＣ４ｚ処理細菌４００μＱと氷上で３０分間、次いで３７℃で２分間インキュ ベートシ、更に、Ｌ−ブロス１．６ｘＱを加えて、３７℃で３０分間インキュベ ートした。アニーリングしたｃＤＮＡをすべて使用して、この形質転換を１０回 実施した。これらの形質転換混合物を、１０μｇ／ｘＱのテトラサイクリンを標 準１％寒天り一ブロス平板（直径ｉｏａｍ）の表面においたニトロセルロース・ フィルター上に、１個づつ直接塗布した。１０個の形質転換から、合計１００個 のそのような平板を作り、３７℃で１夜インキユベートした。各平板毎に平均約 ４００個の細胞コロニーが発育し、合計４０，０００個のクローンを得た。

［Ｇ段階コレプリカ培養 標準的なレプリカ培養方法により、各フィルター（上記、Ｆ段階）からそれぞれ ２枚づつの同じレプリカを作成した。即ち、もとのライブラリーの各フィルター （マスター・フィルター）を注意深く寒天器からはがし、正方形のガラス片上に 置いである正方形の滅菌濾紙［（ワットマン（Ｗｈａｔ−ｍａｎ）　３　Ｍ　Ｍ 　ｌ上にコロニー側を上にして置いた。新しい、あらかじめ慮らしたニトロセル ロース・フィルターをマスター・フィルターに重ねて置き、この上に第２の正方 形の濾紙をかぶせ、次いで、この完全なサンドイッチを更に第２のガラス片でし っかりと互いに押さえつげた。サンドイッチにしたフィルターにナンバーをうち 、将来、それらを再び正確に重ね合わせることができるように、それぞれ非対照 的に３個づつピンホールを開けた。次いで、レプリカをマスターからはがし、テ トラサイクリンを含有するし一ブロス寒天平板上にコロニー側を上にして置いた 。続いて直ぐに、同じ方法で第２のレプリカを作成した。マスター・フィルター はれぞれ対応するもとのベトリ皿へ戻し、すべての平板を、細菌コロニーの直径 が約１ｍｍとなるまで３７°で数時間インキュベートした。この時点で、テトラ サイクリンｌＯμｙ／ｘｃおよびクロラムフェニコール１５０μ９／ｌ（ｌを加 えたし一ブロスを含んでいる新しい寒天平板へ、すべてのレプリカ・フィルター を移した。これらの平板を３７℃で１夜インキユベートシ、それぞれプラスミド を増幅させた。もとのマスター平板は４℃で保存した。

［Ｈ段階］ハイブリダイゼーション用フィルターの作成０．５Ｍ　ＮａＯＨ，ｌ 　、５Ｍ　ＮａＣＱに浸した濾紙（ワットマン３　ｍｌｌ＋）上に、レプリカ・ フィルター（Ｇ段階）を置いた（コロニー側を上向けて）。

フィルターを中和濾紙［（Ｍトリス（ｐＨ７、５）、１．５Ｍ　ＮａＣＱに浸漬 コに２分間移し、更に第２の中和濾紙に５〜１０分間移した。最後にこれらのフ ィルターをＳＳＣバッファー［０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１５ＭＮ ａＣ（（ｐＨ７，４）］に浸したフィルター上に５分間置き、空気乾燥し、真空 で８０℃で１〜２時間高温乾燥した。

［’Ｉ段階］ハイブリダイゼーション・プローブの作成既知の固相ホスファイト ・トリエステル法を用いて、２個の独立したヌクレオチド・プローブを化学的に 合成した。第１のプローブはｄ（Ｇ　−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ− Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ）の構造から成る５′−プローブであり、第２のプ ローブはｄ（Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ− Ｇ−Ｇ）の構造から成る３°−プローブとなるように作成した。これらの１７オ リゴヌクレオチドはγ”Ｐ−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを用い、１ ０ｐＭのオリゴヌクレオチド、１０ｐＭγ”Ｐ−ＡＴＰ（３００Ｃｉ／ミリモル ）、５０ｍＭトリス（ｐＨ７，６）、Ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣＱｚ、５ｍＭＤＴＴお よびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位を含む反応混合物（２５μＱ）を作 成することによって、それらの５′末端を標識した。反応混合物を３７℃で３０ 分間インキュベートし、次いでＴＥ＋０．１Ｍ　ＮａＣ（２を１００μａ加え、 更に等容量のフェノール：ＣＨＣ（！ｓ（１−１混合物）を加えることによって 反応を停止した。水相を、ＴＥで安定化した５順のセファクリルＳ−２００［フ ァルマシアから購入］を通して未標識物質を除去した。

［Ｊ段階］ｃＤＮＡライブラリー・フィルター群のスクリーニング２枚づつ組に なった各複製フィルターを、プレハイブリダイゼーション混合物［４ＸＳＳＣ， １００μ９／ＩＩ（ｌのニシン***ＤＮＡ、５ｘデンハート（Ｄ　ｅｎｈａｒｄ ｔ’　ｓ）溶液（０，２％フィコール液（シグマから購入）、０，２％ポリビニ ール・ピロリドン、０．２％ウシ血清アルブミン）および０゜１％ＳＤＳ］中で それぞれ６８℃で１時間インキュベートした。プレハイブリダイゼーション終了 後、組織（ｔｉｓｓｕｅ）で拭くことにより各フィルターから細菌性残層を除去 した。１組のフィルター毎に、一方では５゜を特異的に３！Ｐ−標識したプロー ブでアニーリングし、もう一方は３′を標識したプローブでアニーリングした。

アニーリング反応は１００゜０００　ｃｐｍ／ｚＱの標識プローブを添加したハ イブリダイゼーション混合物（前記）中で実施した。各組のフィルターは３０℃ で１夜ゆるやかに振盪しつつインキュベートして、この反応を行なった。次いで 、フィルターは４ＸＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳを数回交換して、室温で１時間洗滌 し、次にインテンシファイイング・スクリーンを用いて一７０℃で６〜１２時間 、Ｘ線フィルムに感光させた。複製フィルターを感光させたｘＩ！フィルムを整 理することによって、何か一方のハイブリダイゼーション・プローブをハイブリ ッド化した多くのコロニーが認められたが、両方のプローブでハイブリッド化さ れたのは僅かに６個のプローブだけであった（約４０，０００個のコロニーから ）。この配列から、これらのフィルターのフィルムを生菌コロニーを含んでいる もとのマスター・フィルターと揃えた。両方のプローブでハイブリッド化されて いる各クローンを選び出し、２０μｙ／ｚＱ、のテトラサイクリンを加えたし一 ブロス２ｘ（ｌ中でそれぞれ１夜増殖させた。

［Ｋ段階コクローン類の分析 標準迅速ＤＮＡｆｆ製法を用いて１夜培養した６個の小培養から、それぞれプラ スミドＤＮＡを作成した、これを行なうために、細菌細胞を遠心により回収しく ２分間、微量遠心）、０．２５ｘｇのリゾチームを含んでいる５０１Ｍグルコー ス、２５ａ＋Ｍ）リス（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡの１００μ（２溶液ニＯ ′′テ３０分間再浮遊した。次に、０．２ｕ（ｌ　ＮａＯＨ。

１％ＳＤＳの液２００μｅを加え、０°で５分間、菌を破砕した。溶菌物質に３ Ｍ酢酸ナトリウム（１）Ｈ４，８）１５０μｅを加えて中和し、氷上に１５分間 静置した。遠心（微量遠心、４℃で１０分間）により、変性蛋白質および染色体 ＤＮＡの沈澱を除去した。上清をフェノール／クロロホルム（１：１混合物）で １度抽出し、冷エタノール２．５容量を加えることにより、核酸が沈澱した、遠 心（微量遠心、１０分間）によって核酸を採取し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、５ ０ｍＭ）リス（ｐＨ８）溶液２５０μ（に再浮遊し、冷エタノール２．５容量を 加えて再沈澱した。目的のプラスミドＤＮＡをＴＥ５０μａに再浮遊し、その一 部を０．０５Ｍトリス（ｐおよび２単位の制限酵素ＰｓｔＩを含んでいる反応混 合物（１５μｉ２）の作成に使用した。３７℃で１時間後にブロムフェノール（ 追跡用色素）０゜００５％を加え、各反応混合物を臭化エチジウム１μ９／１１ （ｌを含んでいるＴＢＥ（５０ｍＭ）リス−はう酸（ｐＨ８、３）、１ｍＭＥＤ ＴＡ］アガロースゲル上を１００ボルトで２時間電気泳動させた。紫外光線でゲ ルを照射することによってＤＮＡを目視可能にし、照射したゲルのポラロイド写 真をとることによって結果を記録した。ｃＤＮＡクローンはＣ−尾部化ＤＮＡを Ｇ−尾部化ｐＢＲ３２２ベクター（Ｐｓｔ１部位で線状化）へ挿入することによ って組立てられているので、Ｐｓｔｌによる各プラスミドの消化は、ｃＤＮＡ挿 入体の大きさを測定するため、プラスミド・ベクターから挿入体を切り出す。６ 個のＰｓｔｌ切断プラスミドのアガロースゲル電気泳動により、６個のクローン のうちの５個は約８００の塩基対を有する挿入体であり、６番目のクローンは１ １００ヌクレオチド挿入体を育することが明らかとなった。それらの６個の各ク ローンがコロニー・ハイブリダイゼーションによって同定されたものと同じもの であることを確かめ１．るために、Ｐｓｔｌ消化によるＤＮＡをサザーン・プロ ット・ハイブリダイゼーション手法によって分析し、もとの１７量体オリゴヌク レオチド・プローブであることを確かめた。そのような手法は、このアガロース ゲルを０．５Ｍ　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣＱで３０分間室温で処理し、ゲル 中のＤＮＡを変性して行なわれた。ゲルは、過剰のＭトリス（ｐＨ７，５）、１ ．５ＭＮａＣｌ２中でゆるやかに振盪して中和した。２枚のニトロセルロース・ フィルターをゲルの大きさに切り、２ＸＳＳＣで湿らし、ゲルの両側に注意深く 当てた。２枚のフィルターに挟まれたゲルを積み重ねた紙タオル（高さ約２　ａ ｍ）の上部に置き、更にその上に新たな祇タオルの層（高さ約２　ｃｍ）を置い た。最後に、この組立て物全体を約５００９の重さの正方形の小さいガラス板で 被覆し、ｌ夜装置した。

この方法によって、液はゲルから祇タオルの両方向へ向かって浸透した。

ゲル中に存在しているＤＮＡもゲルから運ばれるが、ニトロセルロース・フィル ター上に保持される。次いで、これらのフィルターを／％イブリダイゼーション 実験に使用した。即ち、フィルターを空気乾燥し、真空中で高温乾燥しく８０℃ 、１時間）、プレハイブリダイゼーション混合物中（前記Ｊ段階）で３７℃で１ 時間インキュベートし、次いで、もとの化学的に合成したプローブ（１０”ｃｐ ＩＩ／ｘＱ　”Ｐ−標識オリゴヌクレオチドを加えたフレハイブリダイゼーショ ン混合物）をいずれか一方で各フィルターをハイブリッド化した（３０℃、２時 間）。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、４ＸＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ で３０分間すすぎ、Ｘ線フィルムに感光させた。６個のＰｓｔｌ挿入体は、いず れも両プローブでハイブリッド化された。

［Ｌ段階コ ロ個のｃＤＮＡクローンのうちの４個の配列決定において、そのうちの１クロー ンが現在知られているＴ細胞増殖因子のアミノ酸配列と異なりた配列を有するこ とが確かめられた。このクローンの挿入体（ｐＢＲ３２２−ａＴＣＧＦ）の配列 決定は、次に示すａ）ジデオキシＤＮＡ配列決定法およびｂ）マクサム・ギルバ ート配列決定法の２つの手法により実施した。ジデオキシＤＮＡ配列決定法によ るａ）法の詳細およびその手法はＭ１３クローニング・ジデオキシ・シーフェン シング・マニュアル［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・インコーボレーテ イツド、ベセスダ（１９８０年）刊行コに記載されている。Ｍ１３ベクターにサ ブクローニングする挿入体は、ａ−１）ヌクレオチド欠失（分解）と、ａ−２） 制限酵素切断の２つの方法によって作成される。もう１つのジデオキシ配列決定 法は、下記のａ−３）に記載する超らせん構造を変性されたｐＢＲ３２２−ａＴ ＣＧＦについて実施した。

第２図に示したａ−１）法では、クローン化したＤＮＡ　（ｐＢＲ３２２−ａＴ ＣＧＦ）をＰｖｕｌで切り（即ち、ｃＤＮＡ挿入体ｐ＜ｐＢＲ３２２へ組込まれ るｐｓｔ１部位から１２６個のヌクレオチド）、ＰｖｕＩで線状にしたＤＮＡの ５μ７を５０ｅＭ）リス（ｐＨ８）、１０°Ｍ２−メルカプトエタノールおよび ５ｍＭ　ＭｇＣＱ＊を含む１００μｇの液中でエキソヌクレアーゼ■６００単位 と３０″でインキュベートした（２本鎖Ｄ　Ｎ　Ａの各鎖をその３′末端で、逐 次分解するため）。次いで、１４μｅの反応物試料を１分後、２分後、３分後、 ４分後および５分後に分取し、これを３゜ＯｕＱのＥｘｏｍ停止液（２０ｍＭＥ ＤＴＡ、０　、５　Ｍ　ＮａＣ１りを含有する試験管に加えた。分解し、エタノ ールで沈澱させたＤＮＡを、次いで、３０ｍＭ酢酸＋　ト’Ｊ　ラム（ｐＨ４， ６）、２００ｏ＋Ｍ　ＮａＣＱ、１ｍＭ　Ｚｎ５Ｏ。

と４０単位の、５１ヌクレアーゼを含んでいる１００μｅの液中でインキュベー トした。３０°で約３０分間反応後、０．５ＭトリＸ−ＨＣｌ２（１）Ｈ８゜０ ）、ＩＭ　ＮａＣＱを含む１０ｄの液を加えて反応を停止した。エタノール沈澱 ５）、ｄＡＴＰ％ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ％ｄＴＴＰのそれぞれ１００μＭ、１ａ＋ Ｍ　ＤＴＴ、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣｌ２ｔ、５単位のＤＮＡポリメラーゼＩクレノ ウ断片を含む１６０μＱの溶液中で、約１５分間３７°でインキュベートした。

ＮａＣｆ２（４Ｍ）を最終０　、２　Ｍｉ１度となるまで加えることによって反 応を停止し、フェノール／クロロホルムで抽出した。得られた平滑末端化ＤＮＡ の長さの異なるセグメント（第２図、５本のセグメントで表わされる）をエタノ ール沈澱によって採取し、３００μＭの１１１体をＴ４ポリヌクレオチドキナー ゼと１ｍＭＡＴＰで処理し、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽 出することによって反応を停止し、３００μＭの１５ｆｆｉ体を加え、次いでエ タノール沈澱することによって作成した１３°ｍＨｉアダプターへこれを結合し た。１５量体＋１１１体を、１０ＩＩＭトリス（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ、０．２ＭＮａＣｌ２を含む３０μａの液に再浮遊し、１５°で２時間アニー リングした。

アダプターの構造は次の通りである。

５゛■０−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ３’ ３・Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇｐ　５・次いで、分解し平滑 化したＤＮＡとアダプター（１５ｐＭ）とを、１５＋ＭトリスＨＣｆ２（ｐＨ７ ，５）、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣ＆ｔ、１０ａ＋Ｍ　ＤＴＴ、１００μＭＡＴＰおよ び０．１単位のＴ４リガーゼを含む３０μＱの溶液中で、１５°で９０分間イン キュベートした。６８″で１５分間加熱することによって反応を停止した。ｌＢ ａｍを適合させたＪＤＮＡは、次いでＮａＣ４を６６ｍＭまで加えた後（最終容 ｆｉ３１μの、Ｐｓｔｌ（２０単位）で、３７℃で４時間消化した。好適な大き さの断片を単離するために、ｐｓｔＨＲ化反応物全反応物エチジウムの存在下に １％トリス−酢酸塩ｒＯ、０４Ｍトリス−酢酸塩（ｐＨ８，３）、０．００１Ｍ 　ＥＤＴＡ］アガロースゲルによる電気泳動によって分別した。硝子粉末分別法 プロトコール（下記）を用い、２００〜８００塩基の間の５つの異なる領域を注 意深く切って分けることによって、５種類の大きさの欠失ＤＮＡを単離した。第 ２図に示すように１．ＢａｍＨ１１５０単位およびＰｓｔ１１５０単位で消化す ることによって、バクテリオファージＭ１３ベクターｍｐ９（１００μｇ）を作 成した。反応混合物（１００μｆｆ）を、１０ｍＭ）リスＭＣｌ２（ｐＨ７，５ ）および１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ＴＥ）で安定化した２ｘＱのゲル濾過カラム（セフ ァロースＣＬ−４Ｂ）に通すことにより、生成したオリゴヌクレオチド小断片か ら線状化したｍｐ９ベクターＤＮＡを分離した。溶出した画分をプールし、Ｎ　 ａ　ＣＱを０　、４１ｖｉとなるまで加え、エタノールで沈澱させ、得られた沈 澱を１００μＱのＴＥに再浮遊させた線状化Ｍ１３＋ａｐ９ベクター試料を、更 に２５倍に希釈した（４０ｎｇ／μ（１’）。第２図に示したように、分解した ｃＤＮＡ断片の５つのプールのそれぞれ５μＱづつを、この線状化したＭＩ３ｍ ｐ９ベクター（２０μρ）と２０μσのライゲーション混合物として結合させた 。１５°で９０分間反応後、６８″で１５分間加熱して反応を停止した。Ｓ０８ Ｍ培地（ｌａ当たり、２ｏ９）リプトン、５７酵母エキス、０．５８９ＮａＣσ および０．１１９ＫＯＨ，，１０１Ｍ　Ｍｇ５０４）中で指数増殖させたニジエ リギア・フ’）　Ｊ　Ｍ　Ｉ　Ｏ１株を、遠心によって（２５０Ｏｒｐｍ、４℃ で１０分間）採取した。このベレツトを３　、　Ｉ　ｘ（ｌのＴｆｂ（１００ｍ Ｍ　ＲｂＣ＆、４５ｍＭ　ＭｇＣ＆−１５０ｍＭ　ＣａＣＱｚ、１０ｍＭＭＥＳ （２−［Ｎ−モルホリンクエタンスルポン酸〕カリウム）に再浮遊さ・せ、第２ 図に示したように、０″で１０分間インキュベートした。次いで、先に示したラ イゲーション反応混合物を、このカルシウム処理を行なった菌と００で３０分間 インキュベートした。この形質転換混合物を短時間（９０秒）４２°で加熱し、 ＪＭＩ　０１飽和培養１００μ（，０，１ＭｒＴＰＧ（イソプロピルチオガラク トシド）１０μｆ２，２５％Ｘ−ギャル（５−ブロモ−４−クロロ−３−インド リル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含有している融解トップ寒天（ルリア・プロス ＋０．９％寒天）のアリコート４ｘＱを加え、この混合物をルリア・ブロスを含 んでいる０、９％寒天平板表面に塗布した。この平板を３７°で１夜インキユベ ートし、フ１−ノ・プラクを発育させた。Ｍ１３ベクターはエシェリキア・コリ のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を保有しているので、組換え体でないファージか ら生じたプラグは、平板混合物に含まれているＩＰＴＧおよびＸ−ギャルによっ て、すべて青くなるはずである（プラグは、バクテリオファージによって、平板 上の増殖菌叢中で透明である）。然し、もしβ−カラクトシダー、ガ遺伝子が他 の１個のＤＮＡの組込みによって妨害されるならば、β−ガラクトシダーゼは発 現せず、ファージ・プラグは無色（または白色）となるはずである。各形質転換 体は、２０〜１３０個の白色プラグを生産した。ＴＣＧＰ−ＤＮＡを保有してい る所望のファージ・クローンを確かめるため、８５ＩＩ１ｍの円形ニトロセルロ ース・フィルターを寒天表面に注意深く置き、各平板のインプリントを作成した 。平板表面に対する方向をフィルターに印を付けた後、フィルターを注意深く平 板から持上げた。それぞれのプラグの位置で少量のファージを拾い上げているこ のフィルターを、０　、５　Ｍ　トリス（１）Ｈ７，５）、１．５Ｍ　ＮａＣ１ ！、次いでｌＸ５ｓｃで単時間づつゆすぎ、最後に、真空中８０°で２時間高温 乾燥した。６８″でインキュベージコンを行なう標準的なハイブリダイゼーショ ン手法を用いて、このフィルターをａＴ　ＣＧ　ＦのｃＤＮＡ組込み体へとハイ ブリッド化した［ニックトランスレーションによって３ｔＰで標識した（ラフビ ーら、ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイオロジー、１１３巻、２３７頁） コ。標識プローブへハイブリッド化したプラグを、配列決定のために、各種の大 きさのもとの断片からそれぞれ２つづつ拾っ旭陽性を示すプラグをそれぞれパス ツール・ピペットで拾い、Ｓ０８Ｍブロスで新たに１００倍に希釈しＪＭＩ　Ｏ ｔの２村へ移した。感染させた培養は３７°で、それぞれ４．５〜６時間激しく 振盪し、増殖させた。次いで、遠心によって（微量遠心、５分間）細菌を各培養 から除去した。ファージを含有している上滑を採取し、２０％ポリエチレングリ コールおよび２．５Ｍ　ＮａＣＱから成る１５０μＱの液をこれに加え、室温で １０分間、ファージを沈澱させた。すべての上清を注意深く除去して、それぞれ 沈澱を採取した（＠量遠心、５分間）。ペレツトをそれぞれＴＥ　Ｉ　ＯＯμＣ １０，３Ｍ酢酸ナトリウムに再浮遊し、フェノールで抽出し、水相からエタノー ルでＤＮＡを沈澱させた。各ＤＮＡペレットを９５％エタノールでゆすぎ、真空 で乾燥し、３０μＣのＴＥ／（ツファーに再浮遊した。採取した４つの１本鎖鋳 型から得られたＤＮＡ配ｙｌｌを第３図に示す。第３図において、実線部分（よ 実際（こ配７７１ｊ決定を行なった範囲を表わし、点線部分は配列決定を行なわ な力）つた。

ａ−２）の制限切断の方法では、ｐＢＲ３２２−ａＴＣＧＦＩ　Ｏｕ９をＩＩ限 醇素の組合わせで切断しく竿３図）、この断片をゲル精製し、前記の欠失の項で 記載、シたように（ａ　−１法）、これらを好適なＭ１３ベクターと結合するこ とによって、ジオキシ配列決定の鋳型力（生成した。これらの断片には、ｍｐｉ ｏおよびｍｐＨのＳｍａ１２ｐｅをＸｂａＩ部位との間ζこクローン化された配 列の５°末端のＲｓａｌからＸｂａＩまでの２３０塩基女中の断片（両方向へ向 かって）、およびＭｐＨのＸｂａｌとＰｓｔＩとの間（こクローン化された配列 の３′末端で、ＸｈａｌおよびｐｓｔＩの切断ζこよって生じた５２０塩基対の 断片が含まれる。これらのクローンカ）らマ尋られた配列を第３図に示す。

ａ−３）５’−１，７量体をプライマーとして用０、迅速調製ｐＢＲ３２２−ａ ＴｃＧＦ　ＤＮＡを用いて、更に新しし）ジデオキシ配ｒ／１ｊをマ辱た。これ を行なうため、１夜培養した。ｐＢＲ３２２−ａＴＣＧＦの５μσの培養を遠心 （ツルポール・ローター、８．００Ｏｒｐｍ、５分間）によって回収し、リゾチ ームで処理［５０ｍＭ）リスＨＣｆ！（Ｐ）１８．０）、５０ｍＭグルコース、 １０国Ｍ　ＥＤＴＡ、および２　、５１９７Ｒ１２リゾチームとを含む１００μ りの液、室温でＩＯ分間］した。１％ＳＤＳの０．２Ｍ　ＮａＯＨ溶液２００μ ａを加えて細胞を溶解した。生成した液に５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）液 ｌ、５０μσを加えて中和した。１０分間、氷上に放置した後、試験管を微量遠 心（エプペンドルフ）で、１℃で１０分間回転した。上清を採り、フェノールで １度抽出した。水相を採取し、これに室温で９５％エタノール８００μｇを加え ることによって沈澱させた。遠心（微量遠心、５分間によってＤ　Ｎ　Ａを採取 し、ベレットを７０％エタノール５００μｌで洗滌し、痕跡のフェノールを除去 した。このＤＮＡを、リボヌクＬ、７−ゼ（２０ｕ９／ｘＱ）を含有する５０ｍ ＭトリスＨＣ（１（Ｊ）Ｈ７、５）、０．１ｍＭＥＤＴＡの４００μρ溶液に再 浮遊させ、室温で２０分間インキュベートし、混入しているＲＮＡを分解した。

この反応液をフェノールで１度抽出し、３回エタノール沈澱を行ない、目的のベ レットを７０％エタノールで洗滌後、２０μ（の水に再浮遊した。このＤＮＡの 半分（約２μｇ）を配列決定反応に使用した。この２本鎖ＤＮＡについてジオキ シ配列決定を行なう・ため、ＤＮＡ（１０ｄ）を、２ＭＮａＯＨ，２ｍＭＥＤＴ Ａの２μｇおよび水８μＱと混合し、２本鎖を解きほぐした（変性）。４ＭＮＨ −ＯＡＣ（ｐＨ４，５）１０μ（ｌおよびｘ）；ｔ）−Ｊｌ　００ｔｔＱを加え て、この混合物を中和し、ドライアイス・エタノール浴でこの混合物を急速冷却 した。変性ＤＮＡを３分間回転（エッペンドルフ）によって回収した。

このベレットを乾燥し、Ｈ２Ｏ３μＣに再浮遊させた。５［）Ｍの５’−１７量 体をプライマーとして用いる標準Ｍ１３ジデオキシ反応により、このＤＮＡの配 列決定を行なった。このプロトコールにより得られた配列を第３図に示す。

ｂ）標準マクサム・ギルバート配列決定を用いて、クローンの両末端における配 列を得た。第４図に示す如く、ｐＢＲ３２２−ａＴＣＧＦをＰｓｔＩで消化し、 ターミナル・トランスフェラーゼおよび３２Ｐ−コルジセピンを用いてａＴＣＧ Ｆ組込み体の末端を標識した［チュ、Ｃ，−Ｐ、Ｄ、およびコーエン、Ｓ、Ｎ、 　、ジーン、１０巻、１７７〜１８３頁（１０００年）］、このＤＮＡをＸｈａ ｌで切断し、１．０％アガロース・ゲルによる電気泳動で、得られた断片を互い に分離し、硝子粉末プロトコールによってゲルから単離した。このプロトコール では、まず紫外線を照射したアガロース・ゲルから所望の断片を切り出す。この アガロース・ゲル切片をゲル切片１ｇ当たりＬｘ１２のＮａｌ溶液（９０％Ｎａ Ｉ、１．５％ＮａｔＳＯ，）を用いて、ゲルをこの溶液に溶解する。次に、酸で 洗滌した硝子粉末（３２５メツシユのシリカ）の５０％スラリー５μｌに、氷上 で１５分間、ＤＮＡを吸収させる（５μＱにＤＮＡ２０μ９が巻き付く）。遠心 （微量遠心、１分間）によって硝子粉末を回収し、Ｎａｌ溶液１００μりで２回 洗滌する。痕跡のＮａｌを除去するため、硝子粉末ベレットを０．１ＭＮａＣＱ 、１０ｍＭトリスＨＣ４（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡを含有する５０％冷エ タノールで２回洗滌する。最後に、ｌＯｍＭ）リスＨＩＪ（ｐＨ７゜５）、ＩＩ ＩＩＭＥＤＴＡからなる溶液で３７°でインキュベートすることによって、ＤＮ Ａを硝子から溶出させる。次いで、標準的な化学的分解方法によって断片の配列 を決定する。決定された配列の長さは、第４図の実線で示される。

この方法によって配列が明らかとなったＩ）ＢＨ３２２−ａＴＣＧＦがらの挿入 体の全配列の結果を、第八図（前掲）に示す。また、ｐＢＲ３２２−ａＴＣＧＦ で形質転換されたエシェリキア・コリＭＣ１，０６１−ｐＴＣＧＦ−１１と命名 され、この命名は、先に記載の如く、ＡＴＣＣでもこれと同じ名前を用いて登録 された（受付番号３９６７３）。

［Ｍ段階］動物細胞発現のための伝達ベクター２５μ２のｐ、ＢＨ３２２−ａＴ ＣＧＦ、および２５　μ９Ｑ’）ｐＣＶＳＶＬをそれぞれ別々に２５単位のＰｓ ｔｌで消化した［０．０１Ｍトリス（ｐＨ７。

５　）　１０　ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ（ｌｘ、２５ｍＭ　ＮａＣ１２を含む液１００μ ／！］。各反応混合物を加熱して不活性化し、ＳＤＳをｏ、１％、ブロモフェノ ールブルーを添加した１％アガロースゲルに直接付加した。ブロモフェノールブ ルー色素をゲルの下端へ向かって電気泳動した後、長波長の紫外光線を照射して ＤＮＡを目視化し、線状化したｐＣＶＳＶＬ断片およびａＴ　ＣＧ　Ｆ挿入体断 片をゲルから切り出し、粉末硝子と結合させることによって精製した（Ｌ段階参 照）。ｌ　ＯｍＭ）’Ｊス（ｐＨ７，５）、１０ＤＩＭ　ＭｇＣ（ｂ−ＩＭＭＡ ＴＰ、ＩｍＭ　ＤＴＴおよび０．２単位のＴ４リガーゼを含む１゜Ｍｇの溶液中 、１６°Ｃて２時間、このベクター２５ｎ９と遊離させたａＴＣＧＦ挿入体５ｎ ｙとを結合した。この反応物の半分をコンピテント株エシェリキア・コリＭＣ１ ０６１（Ｆ段階に記載）２００μρの形質転換に使用した。形質転換反応物を５ 枚の（Ｌ＋テト）平板上に拡げた。複製（レプリカ）フィルターを作成し、５° 　１７ｆｉ体とハイブリッド化した。標識した１７℃体でハイブリッド化された ６個のコロニーを採取し、次の分析に用いるため増殖した。ベクター・セグメン ト中のアデノ・メジャー後期プロモーター（遺伝子）に対する挿入体の方向を調 べるため、制限酵素ＸｂａｌおよびＸｈｏＩを使用して迅速調製ＤＮＡの地図作 成を行なった。

ａＴＣＧＦ挿入体を保有している両方向性のクローンが同定された（第５図参照 ）。これらのクローンの１ｅ培養から平衡密度勾配遠心法によって、下記の如く 、ＤＮＡを調製した。

Ｉ２細菌を含んでいる１ｆ２のプラスミドをＬ−ブロス（１０〜１５μ９／１ｔ ｉテト）を１夜増殖する。

２、細胞を回収する（ベックマンＲ−６３、−４０００ｒｐｍ、１０分間）３、 冷ＴＥ［ｌＯｍＭ）リスＨＣＱ１１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８）２５０ｘ（ｌ中で 細胞を洗滌する。

４．２５％スクａ−スＩ　０〜２０ｍｇ［０，０５ＭトリスＨｃｃ（ｐＨ７，５ ）、０℃］に細胞を再浮遊する。

５．１／１０容員のリゾチーム（１，５〜２岐）を加える（スクロース溶液中１ ０　ｔｎ／ｘ（１）。氷上で１０分間インキュベートする。

６．１１５容量の０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（３〜４ｘＱ、ｐＨ８）を加える。氷上で ５分間イン２キユベートする。

７、浮遊液を冷トリトン溶液［０，１％トリトンＸ−１００，６０ｍＭＥＤＴＡ 、５０ｍＭ）リドンＨＣＣ（ｐＨ８）コでｌ＝１に希釈する。氷上で１０分間イ ンキュベートする。

８、ツルポール５Ｓ３４・ローターで、３０分間１８にで回転する。

９、上清を傾斜して取る。０．９５９／ｒＱＣｓＣＱおよび１／１０容量の１０ １９／１１２臭化エチジウムをこれに加える。屈折率は１．３９０〜１．３９６ の間にある。

！０．５０．２Ｔｉ（ベックマンローター）で２日間４５にで回転する。

１１、長波長ＵＶ光線を用いて試験間を照射し、勾配からプラスミドＤＮＡ（下 方のバンド）を注意深く回収する。等量のＴＥで飽和させたブタノールで、３回 抽出することによって、ＤＮＡから臭化エチジウムを除去する。最後に、これを Ｉ：３の割合の水で希釈し、２．５容量のエタノールを加え（−２０℃、３〜４ 時間）ることによりＤＮＡを沈澱させる。遠心（ベックマンＲ６Ｂ、　４０００ ｒｐｍＳ１５分間）によって沈澱を採取する。これをＨ，０２００μＱに再浮遊 する。

［Ｎ段階］　ｐＣ＃５ＶＬ−ａＴＣＧＦの動物細胞での発現ソンベイラックら［ プロシージングズ・才ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・才ブ・サイエンシズ・ オフ・ジ・ニー・ニス・ニー、７８巻、７５７８〜７５７８（１９８１年）］が 記載しているＤＥＡＥ−デキストラン法に従い、正方向性のｐＣＶＳＶＬ−ａＴ ＣＧＦまたは逆方向性クローンから得られたＤＮＡ、またはｐｃｖｓｖｔ、単独 から得られたＤＮＡのそれぞれ８μ７で、１０ｃｍの皿に亜集密的増殖をしたサ ルのＣＯ５−７細胞をトランスフェクトした。各トランスフェクションはＤＥＡ Ｅ−デキストラン溶液４ｘＱを１０時間用いて達成した。ＤＭＥ（ギブコから購 入）でゆすいだ後、より詳細にはルスマンらの記載の如く〔ヌクレイツり・アシ ッヅ・リサーチ、１１巻、１２９５〜１３０８頁（１９８３年）］、０．１＋ｎ Ｍクロキンを含有しているＤＭＥで細胞を処理した。３７℃まで２，５時間後、 この培地をＤＭＥ＋加熱不活性処理したウシ胎児血清に置き換えて、この皿を４ ８時間インキュベートした馴らし培地（８頭）を回収し、細胞は５ｚ（ｌの燐酸 緩衝性冷食塩液中へ投入した。次いで、遠心（ベックマン・モデル６Ｂ、１５分 間）によって細胞を採取し、ＴＣＧＦ依存性のマ、！ｊス細胞系ＣＴＬＬ−２を 使用して馴らし培地を検定した［スタルら、ジャーナル・才ブ・イムノロジー、 １２６巻、１６８０〜１６８３（１９８１年）］。この検定では、１０’ＣＴＬ Ｌ−２細胞を測定すべき資料の連続倍数希釈系列とマイクロ滴定ウェル中で２４ 時間インキュベートする。次いで、マウス細胞に０．５μＣ／ウエルの３Ｈ−チ ミジンを４時間適用する。自動細胞回収装置を用いて、細胞をグラスファイバ紙 上に採取し、細胞の放射能活性を測定する。ＲＰＭＩ−１６４０＋２％ＦＣＡの ２０μρ中で１０４細胞を用いる最高取り込みの５０％が得られる実験室標準品 の希釈物を、１ｘ（ｌ当たりのＴＣＧＦ活性の１単位と定める。この測定により 、正方向の挿入体を保有している伝達ベクターｐＣＶ’５ＶＬ−ａＴｃＧＦでト ランスフェクションしたサルのＣＯＳ　−７細胞だけが、測定可能なＴＣＧＦ活 性をもちらすことが判明した。この一過性の系において、１ｘＱ当たり５〜１０ 単位のａＴ　ＣＧ　Ｆが生成した。この活性な発現生産物をサルのＣＯ５−７細 胞培地から単離し、この蛋白質の配列決定を行うことによって、ａＴ　ＣＧ　Ｆ が、第Ａ表（前掲）に示されるアミノ酸配列２１−１５３を完全に有し、正常な Ｎ−末端および遊離酸０．７末端を有するポリペプチド構造に適合していること が確かめられた。

実施例２ ａＴｃＧＦの細菌での発現およびその伝達ベクター［Ａ段階］ｐＥＶＰＬへ組込 むため平滑末端化したａＴ　ＣＧ　ＦセグメントＥＩＥの作成 プラスミドｐＥ　Ｖ　Ｐ　ＬにａＴＣＧＦを発現するストラテジーは、第６図お よび第７図に示す如く、平滑末端化したａＴ　ＣＧ　Ｆセグメント（ＢＥ）の作 成を含んでおり（第６図）、ここにおいて天然構造で解明されたシグナル・ペプ チド領域が正確に取出される。これを行うため、まず、操作に一層都合のよい暗 号領域の１本鎖形を得るために、ａＴ　ＣＧ　Ｆ挿入体をバクテリオファージＭ １３ベクターへサブクローンした。第６図に示す如く、Ｍｌ　３＋ｎｐ９（ＤＮ Ａ３０ｔｔ９）を、２５ｍＭ）リスＨＣｆｆ（ｐＨ７，５）、Ｉ　Ｏ＋ｎＭ　Ｍ ｇＣＱｔ、２５ｍＭ　ＮａＣＱを含む５０μ（の溶液中、３７℃で１時間、５０ 単位のＰｓｔｌで切断し、またｐＢＲ３２２−ａＴＣＧＦのＤＮＡをこれと同じ 酵素で切断した（同一消化条件）。フェノール抽出およびエタノール沈澱を行っ た後、２つのＰｓｔＩ切断ＤＮＡを互いに結合して［Ｍ１３ｍｐ９ＤＮＡ１００ ｎｆ＋およびｐＢＲ３２２−ａＴｃＧＦ２０Ｏｎ９．５０ＩＩＩＭトリス（ｐＨ ７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２ｔ、１ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭジチオレイトール 、Ｔ４リガーゼ０．５単位を含むＩＯμｇ溶液、１６℃で２時間］ｄｓＭ　１３ −ａＴ　ＣＧ　Ｆを作成し、次いでこれを、エシェリキア・コリＪＭＩ　Ｏｌの 形質転換に使用した。正方向のａＴ　ＣＧ　Ｆの存在について、元来ｍＴｃＧＦ クローンの同定に使用される５°　１７量体（ＧＣＡＣＣＴＡＴＴＣＡＡＧＴＴ Ｃ）にハイブリダイゼーションすることによって、１つ１つのプラグを試験した 。そのようなプラグのＩっを採取し、ＪＭｌｏｌの１００ｚ（ｉ培養の感染に使 用した。１２時間後、このファージ試料から組換え体ファージ（ｓｓＭ　１３− ａＴ　ＣＧ　Ｆ）を単離し、下記の操作に使用した。５゛−末端が成熟ａＴＣＧ Ｆの第１コドン（ＡＩ２ａ−２１）の第１塩基であるから５゛　１７量体を、１ 本鎖鋳型ｓｓＭ　１３−ａＴＣＧＦの第２！Ｉ合成開始のプライマーとして使用 した。合成は、所望のスポット（Ａｈａ−２１のコドン）で正確に始まる。この プライマ一部位で始まる暗号領域を複写し、次いですべての１本鎖領域をＳｌ− ヌクレアーゼで消化す、２ることによって、それぞれ平滑末端で始まり（ＡＱａ −２１コドンの位置で）、ａＴ　ＣＧ　Ｆの暗号領域を越えてＭ１３ｍｐ９ベク ター・セグメントの任意の位置で停止する線状ＤＮＡ分子の集団を生じることが できる。最初の反応は、２５μ９の５５Ｍ１３−ａＴＣＧＦと２ＱｐＭの１７量 体（２１−ＡＩ２ａプライマー）とを、１０＋Ｍトリス（ｐＨ７，５）、１ｍＭ 　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ２，５ｍＭ　２−メルカプトエタノール、それ ぞれ１００μＭづつのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰ、およびＤ ＮＡホペリメラーゼのフレノウ断片８単位を含む溶液ＤＮＡポリメラーゼのフレ ノウ断片８単位を含む溶液２５μσ中で、室温で３０分間混合することによって 達成された。この反応を６５°で１０分間インキュベートすることにより停止し 、次いでＳｔバッファー［３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，６）、２００ｍＭ Ｎａ（ｊ）および１ｍＭ　Ｚｎ５Ｏ，］で１００μｇに希釈し、これをヌクレア ーゼＳｌ　２５単位と３０°で３０分間インキュベートした。次いで、得られた 線状ＤＮＡを、１０＋ｎＭ）リス（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭ　 ＮａＣｆ２，１．０ｍＭ２−メルカプトエタノール、それぞれ０　、　Ｉ　ｍＭ づつのｄＧＴＰ１ｄＣＴＰ％ｄＡＴＰおよびｄＴＴＦ！、およびフレノウ断片５ 単位を含む溶液０　、１　ｚ（ｌ中で、６５℃で１０分間処理した。６５°で１ ０分間インキュベートすることにより、反応を停止した。反応混合物を、フェノ ールで１回、クロロホルムで２回抽出し、エタノールで沈澱させた。最後に、エ タノール沈澱を行ったＤＮＡを２５単位のＢａｍＨＩで切断した［２５ｍＭ）リ スＨＣ４（ＰＨ７５）、ｌ　ＯｚＭ　ＭｇＣＱｔ、２５ｍＭ　ＮａＣ（！、５０ 　μｒｌ中、３７″で１時間］。このようにして得られたａＴＣＧＦ暗号領域を 含んでいる約６００塩基対の断片を、アガロースゲル電気泳動によって単離し、 これをａＴＣＧＦセグメントＢＥと命名した。

［Ｂ段階］伝達（発現）ベクターｐＥＶＰＬ−ａＴＣＧＦの作成第７図に示す如 く、プラスミドｐＥＶＰＬ（１００ｕｇ）を、２５ｍＭトリスＨＣＣ（ｐＨ７， ５）、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣＬおよび２　ＳｌＩＩＭ　ＮａＣ＆を含む溶液２５０ μｅ［実施例Ａ（後記）と同様に調製コ中で、Ｋｐｎ１１００単位を３７°で１ 時間作用して消化した。上記説明において示した如く、ＫｐｎＩが１度Ｊ）Ｅ　 Ｖ　Ｐ　Ｌを切断すると、ただちにｃＩ［開始コドンへ隣接する。

得られた３′のＧＴＡＣ突出部は、ＫｐｎＩで切断したｐＥＶＰＬ（ｌ　ＯＯμ ｇ）を、１０ＪＩＩＭトリスＨＣｆｆ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｆｆｚ およびそれぞれ１００ｍＭづつのｄＡＴＰ、ｄｃＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ を含む１００μａの溶液中で、室温で３０分間、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノ ウ断片で処理することによって、ＡＴＧコドンの平滑末端化されたＧ−Ｃ塩基対 へと修復される。フェノールで抽出し、次いでクロロホルムで２回抽出すること によって反応を停止し、エタノールで沈澱させることによりＤＮＡを採取した。

最初にクローニングし畢い付着末端を作るため、平滑末端化ＤＮＡを制限酵素Ｂ ａｍＨＩ　［ＤＮＡ　１００　μ９．２５ａ＋ＭトリスＨＣｌ２（１）Ｈ７，５ ）、１０ｍＭ　ＭｇＣ１２ｚ、２５ａ＋Ｍ　ＮａＣｌ２．ＢａｍＨ■１００単位 の溶液１００μａ］で３７″、１時間インキュベートして切断した。得みれたベ クター断片をアガロース・ゲル電気泳動によって精製し、ついでこのベクター断 片５０ｎ９にＴ４リガーゼ０．５単位を用い、１０ｍＭ）リスＨＣ（！、１０ｍ Ｍ　ＭｇＣ１２ｔ、１ｍＭ　ＡＴＰ、１．ｍＭノチオトレイトールを含む溶液１ ０μρ中で、ｌ夜１６℃で処理し、この断片を６００塩基対のａＴ　ＣＧ　Ｆ暗 号領域断片（ａＴ　ＣＧ　ＦセグメントＢＥ）１００ｎ９へ結合した。ライゲー ション混合物をエシェリキア・コリＷ３１１０−λ−Ｙｌ、、３９株の形質転換 に用いた。５ａｐ−標識１７量体を用いたハイブリダイゼーションによって、所 望のｐＥＶＰＬ−ａＴｃＧＦ組換え体を含んでいるコロニーを同定した。これら のクローンの数個から得られた組換え体プラスミドは、Ｉ）ＥＶＰＬのｃＩｒ遺 伝子の最初のＡＴＧが成熟ａＴ　ＣＧ　Ｆの最初のコドン（Ａ１２ａ−２１に対 応するＧＣＡ）と正確に連合していることを確かめるため、ＤＮＡ配列決定によ り分析した。

［Ｃ段階］　ｐＥＶＰＬ−ａＴＣＧＦの細菌での発現的１００ｇｇのＷ３１１０ −λ−１３９ｐＥＶＰＬ−ａＴＣＧＦを、ブロス中３０℃で２時間１０’細胞／ ｘＱの密度となるまで増殖させた。温度を３８℃まで上げ、１時間保った。遠心 （５０００ｘｙ、５分間）によって細胞を回収した。細胞ペレットを５＋（の５ ０ｍＭ）リスＨＣρ（ｐＨ７゜５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　２−メルカ プトエタノール溶液に再浮遊し、音波処理によって細胞を破砕した。ＳＤＳポリ アクリルアミド・ゲル電気泳動（１５％ポリアクリルアミド・ゲル）によって得 られたこの細胞抽出物の分析により、細胞蛋白質合計の５〜ｌＯ％がａＴ　ＣＧ 　Ｆであることが判明した。この物質の生物検定では、抽出物は少なくとも１ｏ 、ｏｏｏ単位／Ｉｆ２の活性を含んでおり、強化した微生物を使用してＴ細胞増 殖因子活性を有する蛋白質（ａＴｃＧＦ）を有効に生産できることが判明した。

音波処理した抽出物の検定で、大部分のａＴＣＧＦ蛋白質は細胞質に溶解１．な いことが判ったので、不溶性の活性蛋白質を遠心によって更に濃縮し、そのペレ ットを水性バッファー［１ｏＩＩＩＭトリスＨＣ（（ｐＨ７、５）オよび１ｍＭ 　ＥＤＴＡ］で洗滌し、コレを５ＤＳ（０，１％）に溶解した。得られた蛋白質 生産物の約６０％は発現生産物であり、これを調製的ＳＤＳゲル電気泳動法によ って分別し、既知の分子量の類似の蛋白質標準に対応するバンドを切り出し、溶 出した。溶出した蛋白質を気相微量アミノ酸配列分升装置を用いて配列決定し、 その約９０％が発現蛋白質生産物であった。このようにして、発現生産物の約２ ５〜４０％がａＴ　ＣＧ　Ｆの１３３アミノ酸配列（第Ａ表、前掲）に適合して おり、一方、残りの６０〜７５％はＭｅｔ−Ａ（ａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒで始まる１ ３４アミノ酸から成る不完全プロセス前駆体（第Ａ表、２０〜１３３のアミノ酸 ）であることが判明した。このヒトａＴ　ＣＧ　Ｆ蛋白質混合物の比活性は、同 じ態様で発現した、タニグチらによって開示されたアミノ酸配列を有する既知の ヒ、）Ｔ細胞増殖因子の比活性と近似している。

［実施例Ａ］プラスミドｐＥＶＰＬの作成プラスミドＩ）ＥＶＰＬの組立てを第 ８図に示す。出発物質として使用したのはプラスミドｐＫｃ３０−ｃＵであって 、このプラスミドに関しては、シマタケおよびローゼンベルグ［ネーチャー、２ ９２巻（１９８１年）１２８−１３２頁］が開示しており、またマニアナイスら ［モルキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル・コールド・ス プリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２年）、第１２章、４０３〜４３３ 頁］によって論じられており、ｐＫｃ３ＱｃＩＩの構造および特性に関してはこ こに引用したこれら２つの文献に詳細に開示されている。このプラスミドは、そ のＰＬ−プロモーター・オペレーターに続く下流に、順次、抗転写終結認識部位 （％ｕｔ　Ｔ、）、Ｎ遺伝子領域ＣＮ／２）、抗転写終結認識部位（Ｎｕｔ　Ｒ ）、転写終結信号（ｔ　Ｒｊ）、リポソーム結合部位　配列（ＲＢＳＳ）および ＡＴＧ翻訳イニシエーターによって先行される暗号配列を含んでいるｃＩｒ遺伝 子領域、０遺伝子領域の半分（０／２）、および転写終結信号（ｔＬ）等、第８ 図に示しである多くの領域をすべて含んでいる。プラスミドｐＫＣ３０−ｃｌＩ （１０ｔｔ９）をまず制限醇素ＢａｍＨＩ　２０単位で２５ａ＋Ｍ）リス（ｐＨ ８）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２ｆｆ１．１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、５０ ｍＭ　ＮａＣｌ２およびｔｏｏｌ／ｉ＋ｃＢｓＡのｉｏ。

μｇ溶液中、３７℃で１時間消化し、抽出［フェノール／クロロホルム、クロロ ホルム（２回）次いでエタノール沈澱コして、線状化されたプラスミドが得られ る（第８図）。次いで、ＢａｍＨＩ末端から、ｃＩＩによる暗号配列を暗号化し ている蛋白質のＡＴＧ翻訳開姶コドンに達する約１０００ｂ、ｐ、を切り戻すの が目的である。このため、線状化プラスミドｌＯμ７を、１２００単位のエキソ ヌクレアーゼ■とエキソ■バッファー［５０ｍＭ’ｐリス（ｐＨ８）、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５ａ＋ＭＭｇＣ（！、］２００μρ中、３０℃でイ ンキュベートした。この処理条件によって、１分間当たり約１５０塩基対が除去 されることを期待して、６．７および８分間口にそれぞれアリコート（６５μの を採取した。４０ＩＩＩＭＥＤＴＡとＩＭＮａＣ（！を加えである試験管にアリ コートをプールし、エタノールで沈澱した。ＥＸＯＩ［［処理物から過剰の５° −突出残留物を除去するために、このようにして得られたプールした３゛−分解 ＤＮＡセグメントを、次いで、３０単位のヌクレアーゼｓｌでＳｌバッファー中 ［３０ｍＭ　ＮａＡｃ（ｐＨ４，６）、２００ａ＋Ｍ　ＮａＣ（および１ｍＭ　 Ｚｎ５Ｏ，］で、３０″　３０分間インキュベートシタ。０．５ＭｌスＨＣ（（ ｐＨ８，０）４０μａおよびＩＭ　ＮａＣ（ｌを加えてヌクレアーゼｓ１の作用 を停止し、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出した後、エタノ ール沈澱によって処理したＤＮＡを採取した。次いで、このＤＮＡセグメントを 、１０ｍＭ）！ｌスＨｃｆ２（ｐＨ７，５）、それぞれ１００μＭづツ（７）ｄ ＡＴＰ％ｄＣＴＰＳｄＧＴＰお上びｄＴＴＰ、１＋ｎＭジチ、ｉ＜Ｌレイ）−／ ｌ、、１０ｍＭ　ＭｇＣ（ＩｔおよびＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片５単 位を含む１００μｅ溶液中、３７°で１５分間インキュベートすることによって 平滑末端化した。ＮａＣσを０．２Ｍ加えることによって反応を停止し、混合物 をフェノール／クロロホルムで抽出し、更にクロロホルムで数回抽出し、エタノ ール沈澱によってＤＮＡを採取した。上記の反応によって、各アリコートから第 ８図に示した３本のセグメントで表わされる長さの異なった種々のセグメントが 生産される。第８図においては、一層詳細に示すため所望の単一なセグメントに よって以下の処理を表わしている。得られた平滑化末端化ＤＮＡセグメントを、 １０量体および１４量体から作成した下記の配列を有する独自のＢａｌ１１旧ア ダプターへ結合した。

５’ＣｒＴＡＣＣＴＡＴＧＧ３’ ３’ＣＡＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＡＧ３・ｒＭ１１０−ニング・ジデオキシ・シー フェンシング・マニュアル」（前掲）５頁Ｂａｍ）ＴＩアダプターに関する記載 の通り、ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼを用いて、このアダプタ ーを燐酸化した。このアダプターはＢａｍＨＩ付着末端を具備してい−ると同時 に、Ｋｐｎ１部位に必要な６個のヌクレオチドの５で始まり、Ｃ■配列のＡＴＧ コドンへ結合すると、この部位が生成するはずである。従って、アダプター（３ ０μＭ）を、２５　ｍＭ　トリスＨＣＣ（ｐＨ７，５）、Ｉ　ＯｍＭ　ＭｇＣ（ ｔｔ、ｌＯｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１００μＭＡＴＰおよび０２単 位のＴ４リガーゼを含む６０７ｔＱの溶液中、７５°で９０分間インキュベート することによって、平滑末端ＤＮＡへ結合した６６８℃で１５分間加熱すること によって反応を停止した。生成した、独自のＫｐｎ−ＢａｍＨＩアダプター（Ｋ ｐｎ−ＢＡ）を具備するＤＮＡセグメントを第８図に示す。アダプター結合（ラ イゲーション）を行なったＤＮＡを１００μｇに希釈し、ＮａＣＱを最終濃度０ ．１Ｍとなるまで加えた。この反応混合物を、制限酵素ＥｃｏＲＩ　（２０単位 ）と３７°で６０分間インキュベートした。反応混合物をフェノール／クロロホ ルムおよびクロロホルムで抽出し、エタノール沈澱を行ない、１％トリス酢酸ア ガロースゲルで電気泳動を行なった。ゲル生成を行なった２５００〜３０００ｂ ｐの大きさの部類のＤＮＡセグメントを硝子粉末プロトコールによりゲルから単 離した。

引続いて、ｐＢＲ，３２２ＤＮＡ（ｆ　Ｏｕ９＞を１ｏａｄのＢａｍＨＩバッフ ｙ−［、’１０ｍＭ　トリスＨＣＣ（ｐＨ７，５）、５０ｍＭ　ＮａＣｆ２，１ ｍＭ　ＤＴＴ］中、制限酵素ＢａｍＨＩ　（２０単位）３７℃１時間消化するこ とにより、ｐＢＲ３２２プラスミド・セグメントを作成し、次いでＮａＣｒ１ｍ 度を０゜１Ｍまで上昇して制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した。フェノール／クロロ ホルムで抽出することによって反応を停止し、更にクロロホルムで２回抽出し、 エタノールで沈澱させた。トリス酢酸ゲルで電気泳動に掛け、次いで硝子粉末に よるＤＮＡ単離を行ない、３９８５塩基対のベクター断片を精製した。

このようにして作成したｐＢＲ３２２プラスミド・セグメント（５０ｎ９）、先 にゲル精製して選んだＤＮＡセグメント（２５００〜３０００ｂｐ）２５ｒ＋９ と、２５ｍＭトリスＨＣｆｆ（ｐＨ７，５）、２５ｎ９と、２５ｍＭトリスＨＣ ｆ２（ｐＨ７、５）、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣＱｔ、ｌ　ＯｍＭ　ＤＴＴ、ｌ　００ μＭＡＴＰ。

および０６１単位のＴ４リガーゼを含む反応混合物（２５μの中で結合した（１ ５’１夜）。この反応物を、ＰＬプロモーターを止めることができる温度感受性 のλ−リプレッサー蛋白質を保育している（細菌染色体のλ−リプレッサー蛋白 質を保有している（細菌染色体のλ尊属上に）エシェリキア・コリＷ３１１０− λ−Ｙ１３９の形質転換に使用した。この形質転換は１０μσのライゲーション 物質を２００μＱの形質転換コンピテント細菌（Ｃａ　ＣＱ　２衝撃）と、氷上 で３分間、３７６で２分間インキュベートと、次いで、ＩＪＩ＋２のＬ−ブロス で希釈して３０’Ｃで３０分間インキュベートすることによって実施された。形 質転換した菌は、２５　ｘ（１／ｘ（ｌのアンピシリンを加えた寒天平板を含ん でいるし一ブロス上の４枚の二）・ロセルロース・フィルターに直接塗布した。

３０℃で１夜インキユベーシヨンした後、２枚のレプリカを、更にＩ　００ｘＱ ／ｘ（ｌｋクロラムフエニコーを含有しているし一ブロス寒天平板上で１夜イン キユベージタンすることによって増幅した。これらのフィルターはコロニー・ハ イブリダイゼーシヨンを行なうため、塩基による標準処理を行なった。１組のフ ィルターは、３２ｐ−標識を行なったアダプターからの１４ｊｉ体１００，００ ０　ＣＰ　Ｍ／ｘＱと３７°で１夜インキユベートした。他の組みのフィルター は、アダプターの接合がｃＵ配列のＡＴＧにまで及び、また配列：ＡＣＡＴＡＴ ＧＧＴＡＣＣＴＡ （ここで、ＡＣＡＴＡＴＣはｃＵ配列の最初のＡＴＧへ導く配列であり、ＧＴＡ ＣＣＴＡはＢａｍＨＩアダプターの開始である）を有する１４１体である接合オ リゴヌクレオチドへハイブリッド化される。この両プローブとハイブリッド化さ れる。この両プローブとハイブリッド化した数個のコロニーは、プラスミドＤＮ Ａを分析量調製するのに使用した（迅速調製法）。このＤＮＡについてただ１つ のＢａｔｎＨ１部位およびただ１つのＫｐｎＩ部位が存在することを試験した。

そのようなプラスミドの１個について、更にマクサム・ギルバート配列決定法に よってこれを確かめ（Ｔ４キナーゼ反応によって、ＢａｍＨＩ１位を標識する） 、その結果、これが所望の反応を有していることが判明した。このプラスミドを ｐＥＶＰ、−Ｌと命名した。

［実施例Ｂ］ ｐＥＶＰＬ−ａＴＣＧＦのａＴＣＧＦの”Ｓ−Ｍｅｔ標識エシェリキア・コリＷ ３１１０−λ−Ｙ１３９ｉ６：、発現ｐＥＶＰＬ−ａＴＣＧＦを導入したエシェ リキア−）すＷ３１１０λＹ１３９を、２５μ９／１１（ｌのアンピシリンの存 在するＭ６３培地および５％Ｌ−ブロス中で、３０°で１夜増殖する。次いで１ ．細胞をアンピシリン天かＭ６３培地で１：５０に希釈し、３００で２時間植え 継ぐ。次いで、細胞集団の温度を４２°に１０分間上昇し、３７°に冷やし、細 胞を培養５　ｖ＝Ｑ当たり標識していないメチオニン（ｏ、５％）３０’Ｏμｅ で追跡しながら、３５Ｓ−メチオニン）２０μＣ／ｘ１２）で２〜３分間標識し た。標識後、時間を置いて（例えば、１Ｏ１３０，６０，１２０および１５０分 ）数回、アリコート（０，５〜１．Ｏｚのを採取する。各アリコートから細胞を 採取しく微量遠心、５分間回転）、これを１００μｆｆ５Ｄｓゲル試料バツフ７ 　［２５ｍＭ）リスＥ（Ｃｆ２（１）８６．８）、２％ＳＤＳ、２０％グリセロ ール、０．００２％ブロモフェノール・ブルー、１００ｍＭ２−メルカプトエタ ノール］に再浮遊させて試料を作成する。次いで、ラエムリ［ネーチャー、２２ ７巻、６８０頁（１９７０年）コの記載に従い、試料から得られる蛋白質を１５ ％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル上で分別する。この方法により、エシェリキア ・コリＷ３１１０−λ−Ｙ１３９におけるｐＥＶＰＬ−ａＴｃＧＦの発現によっ て、約１５，０００ダルトンの分子量を有するＴＣＧＦの蛋白質生産物の相当量 が生産されることが判明した。この実施例日において、Ｍ６３培地は、１５９・ ＫＨｌＰ　Ｏ４，３５１に、ＨＰＯ，，１０ｆ−（ＮＨ，）、ＳＯ，および２． ５ｘ（ｌ　Ｆｅ５Ｏ４（１ｘ９／ｘ１２＞のＩＱ水性混合液の１＝５に水で滅菌 希釈した溶液１００ｚ（！と、２０％グルコース１０ｚ（！および１ＭＭｇ５Ｏ ，ｌ、ｗ１２の滅菌混合液とを混合することによって調製する。

この発明は、ある特定の５様に関して開示してきたが、この発明の結果およびそ の総凹円において、その実施に際し、ベクター、転位ベクター、プローブ、発現 を行なう細胞系および微生物、並びに組立ておよび分析の手法等の修飾であって 、何れも当該技術の専門家にとって自明な多数の修飾を含むが、それに限定され るものではない。これら多数の修飾のうち、あ、３製造条件に好ましいものとし て、抗生物質ネオマイシン耐性の配列を、既知の方法によって挿入し細菌に発す る転位ベクターの修飾（例えば、ｐＥＶＰＬ−ａＴＣＧＦ）がある。同様に、遺 伝暗号の多様性から考えて、ａＴ　ＣＧ　Ｆを暗号化しているｃＤＮＡ配列も、 例えば部位特異性突然変異誘発等の既知の手法によって修飾し、これと同じａＴ ＣＧＦ蛋白質を暗号化している異なったヌクレオチドの配列を生産することがで きる。

この発明のａＴＣＧＦは、既に示したように、従来タニグチら［ネーチャー、３ ０２巻、３０５〜３１０頁（１９８３年）］によって報告されたヒ）ＴＣＧＦと は構造的に異なっている。きわめて注目すべき点は、その構造において、僅かに 唯一個のアミノ酸が異なっているだけであり（ａＴＣＧＦは、２５位にロイシン の変わりにセリンを有する）、その生物学的特性は近似しているようであるにも かがわらず、ａＴ　ＣＧ　Ｆは物理学的特性においてかなり異なっており、例え ば、遥かに簡単な方法で精製できることが判明している。より詳細には、例えば 、コントロールされた多孔性硝子（ＣＰ　Ｇ）を用いるクロマトグラフィーにお いて、天然のロイシン形は、既に報告されているようにほとんどこれに吸着する が、この発明のａＴ　ＣＧ　Ｆは僅かに５０％程度までしか吸着せず、残りは単 量体の生物活性形として溶出される。従って、ロイシン形の場合には物質を脱着 する必要があり、所望の単量体の生物活性形を含んで種々の集合段階のＴＣＧＦ の混合体が得られる。単量体のＴＣＧＦを更に精製を行なう（例えば、塩酸グア ニジン中でセファロース−６８ＣＬによってゲル濾過する）場合、収量および純 度は、既に単量体の形になっているＣＰＧからの溶離物質について直接操作する ことができるこの発明のａＴＣＧ　Ｆに比較して、かなり低い。

国　際　ｉｌ　苓　韻　先 ；ＩＮＮＥＸ　Ｔｏ　Ｔｈｘ、ＩＮτＥＬＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＳＥ！’−Ｑ’： ｉ　ＲＥＰＯＦ、Ｔ　ＯＡＶ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ａＴＣＧＦを暗号化しているＤＮＡ配列を含んでいる伝達ベクター。 （２）ａＴＣＧＦを暗号化している配列を含んでいる組換え体オベロンを含んで いる請求の範囲第１項記載の伝達ベクター。 （３）ａＴＣＧＦを暗号化している配列、およびその配列をもつ読み取り相の上 流および中にＡＴＧコドンを含み、またその配列の下流末端に上記配列に直ぐ続 いて１またはそれ以上の翻訳終止コドンを含んでいる組換え体オペロンを含んで いる請求の範囲第２項記載の伝達コドン。 （４）ａＴＣＧＦを暗号化している配列の上流末端の直前にペプチド配列【配列 があります】を 暗号化している配列が先行している請求の範囲第３項記載の伝達ペクタ（５）ａ ＴＣＧＦを暗号化している配列の上流末端においてＡＴＧコドンが先行している 請求の範囲第５項記載の伝達ベクター。 （６）請求の範囲第２項記載の伝達ベクターでトランスフェクトされている動物 細胞。 （７）請求の範囲第２項記載の伝達ベクターでトランスフェクトされている哺乳 類細胞。 （８）請求の範囲第１項記載の伝達ベクターで形質転換されている微生物細胞。 （９）本質的に第Ａ表の２０〜１５３の番号で示されるアミノ酸から成る蛋白質 。 （１０）本質的に第Ａ表の２１〜１５３の番号で示されるアミノ酸から成る蛋白 質。 （１１）請求の範囲第９項記載の蛋白質および成熟ａＴＣＧＦ蛋白質から成る蛋 白質の混合物。 （１２）ａＴＣＧＦのｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡ。．（１３）ａＴＣＧＦを 暗号化している配列を含んでいる組換え体オペロンの発現を宿主中で誘発するこ とを含むａＴＣＧＦの生産方法。 （１４）ａＴＣＧＦのｍＲＮＡからｃＤＮＡを作成し、少なくともａＴＣＧＦ暗 号配列を、伝達ベクターに含まれている組換え体オペロンの転写調節のもとに上 記ｃＤＮＡから上記伝達ベクターへ組込み、上記暗号配列の宿主内における発現 を誘発することを含む、請求の範囲第１３項記載のａＴＣＧＦの生産方法。