JPS6147189A - 粒状澱粉から直接グルコースを生成する方法、同方法に用いる酵素製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 澱粉は無水グルコース単位で縮合したグルコースから成
る高分子量ポリマーである。澱粉ポリマーの完全な加水
分解はデキストロース（グルコース）を生ずることにな
る、′！２九澱粉はそれ自身の末端部としであるいは、
フラクトース及びその他の生成物を製造するための原料
としてデキストロースを生成するのに用いられる。

澱粉は周囲温度において本質的に水忙不溶な個々の顆粒
として、現実に多くの植物中に生成する。

一部には不溶性であるために、「粗」澱粉（その本来の
顆粒形の澱粉）からデキストロース溶液まタハグルコー
スシロップへの営利的転換は高エネルギーを消費するプ
ロ七゛スである。

現在用いられている営利的プロセスの笛一段階では、非
イースト状澱粉の水性スラリーを、酸または熱に安定な
酵素製剤による澱粉の糊化温度以上の温度に加熱する。

この目的は澱粉の顆粒構造を破壊しくすなわち、糊化さ
せ）、澱粉を水和させ、澱粉を部分的に加水分解するこ
とによって、その粘性を減することである。このことは
、粘性、水分除去費用及び好ましくない副生成物の形成
の釣合いを保たせるために選択した、適当な濃度で操作
するために必要である。他の方法で操作するための提案
が多くなされているが、「希釈」と呼ばれる、この第一
段階の部分的加水分解は七の費用と欠点にも拘°らず依
然として用いられている。

希釈の後に、澱粉は糖化型酵素グルコアミラーゼ（ＥＣ
３，２，１ｊ３）の存在下での加水分解によって、デキ
ストロースに転化する。通常は１２０℃のオーダの温度
における酸による澱粉の希釈は澱粉フラグメントを再重
合生成物を生ずるが、これらはグルコアミラーゼによる
加水分解に対して耐性であシ、収率を減する。このよう
な副生成物は濾過を困難にし、デキストロースの結晶を
妨げ、特にクロマトグラフィ濃縮法を用いた場合には、
デキストロースから高フラクトースシロップへの転化を
妨げる。着色体１、ヒドロキジメチルフルフラール及び
その他の分解生成物も生成するので、これらは精製によ
って除去しなければならない。

酵素希釈（α−アミラーゼ、　ＥＣ３、２、１−１によ
る）は通常８５℃〜１１０℃の温度及び糖化反応に用い
るｐＨよシも高いｐＨにおいて実施されるが、澱粉の完
全な分散を保障し、次に行う濾過を改良するために、１
２０℃以上での加熱段階も通常含まれる。

酵素希釈は前記種類の好ましくない副生成物の形成を排
除しないとしても減する。グルコアミラーゼばかなシ低
温の最適条件を有しているので、全ての方法において希
釈後に冷却を行うことが必要である。１９８０年１１月
２５日に発行された、Ｗａ　１　ｏ　ｎの米国特許第４
，２３５，９６５号にはこれらの問題の幾つかが述べら
れている。

希釈プロセスの他の欠点は、ｐＨまたは酸性度を調節す
る必要があることである。広く用いられているグルコア
ミラーゼの最適ｐＨ条件は５．０以下、最も一般的には
４．０〜４．５である。澱粉の希釈に酸を用いる場合に
は、ＰＨをアルカリによってこのレイルにまで高めなけ
ればならない。α−アミラーゼは５．０以上の最適ｐＨ
条件を有しているので、ｐＨをグルコアミラーゼの最適
条件にまで下げなければならない。いずれの場合にも、
ｐＨの変化がイオンを誘発し、このイオンを後に除去し
なければならない。

本発明は粒状澱粉の直接の転化、すなわち水性スラリー
（懸濁液）状態の粗澱粉から溶液状態のデキストロース
（グルコース）への転化を可能にするものである。この
ことは、独特の複合性質を有する新規な酵素製剤の使用
によって達成される。

この酵素製剤は、すでに発見され同定されている多くの
好熱性及び中温性の真直類によって生成される。この酵
素製剤は、営利的なグルコース製造のための充分に高い
澱粉濃度での澱粉の膨潤温度以下の温度において不溶性
澱粉を直接デキストロースに転化させる能力のために注
目に値するものである。

本発明の目的は粒状澱粉を値接デキストロースに転化さ
せる酵素製剤を提供することである。

本発明の他の目的は、澱粉から直接に、中間の希釈また
は溶解化段階なしに、または澱粉のａ−スト化または膨
潤、化を行わずにデキストロースを製造する新しい方法
を提供することである。

本発明のさらに他の目的は新しい澱粉〜グルコース転化
プロセスのエネルギー消費量を減することである。

本発明のさらに他の目的は新しい澱粉糖化型酵素製剤の
製造方法を提供することである。

本発明の他の目的は、新しい澱粉糖化型酵素を産生ずる
好熱性蕗、特にフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属の菌
の突然変異体の生物学的に純粋な培養物を提供すること
である。

本発明は粗澱粉を溶解化し、加水分解して、主としてグ
ルコースである炭水化物組成物を製造することを意図す
るものである。この方法は、約ｐＨ８，０またはそれ以
上の等電点を有するグルコアミラーゼ酵素（ＥＣ３”、
２．１．３）及び、グルコアミラーゼに協力して粒状澱
粉の可溶化を触媒する。グルコアミラーゼ相乗活性を有
する蛋白質物質を含むことを特徴とする酵素混合物含有
の何発酵ブイヨンの製造を含む。この酵素混合物はさら
に、グルコアミラーゼがカルボキンメチルセルロースゲ
ルに付着するが、相乗物質（以下では「相乗因子」ト呼
ぶ）はカルボキシメチルセルロース陽イオン交換体に吸
収されないことを特徴とする。この酵素製剤は、例えば
水中の１５％澱粉固体懸濁液を加水分解して、加水分解
を最適ｐＨである約５．０〜７．０のｐＨにおいて行っ
た場合に、分析切断酵素の不在下またはαアミラーゼの
添加なしに、本質的に澱粉残渣を含まず、三糖類と高Ｒ
無水グルコースポリマーの含量が１％未満であシ、乾燥
固体ベースで少なくとも９７％のデキストロースヲ含ム
糖溶液を生成する能力を有する。

この酵素混合物は特定の蕗、特にフミコーラ属の菌によ
る細胞外酵素製剤として表される。酵素混合物を単離す
るフミコーラ属の好ましい種属はフミコーラ・グリシ−
・変種・サーモイデア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓｅ
ａ　Ｖａｒ、　ｔ、ｈｅｒｍｏ、＄ｄｅａ　）である。

野生型の活性を充分に凌駕する粗澱粉加水分解活性を有
する。この種属の突然変異体が誘発されている。

特に１．フミコーラ・グリシ−変種サーモイデアＮＲＲ
ＩＪ　１　ｓ　２１９　；　ＮＲＲＬ　１　ｓ　２２０
　；　ＮＦｔＲＬ　１５２２１　；ＮＲＲＬ　１５２２
２　；　ＮＲＦｔＬ　１５２２３　；　ＮＲＲＬ　１５
２２４及びＮＲＲＬ　１５２２５の菌株の突然変異体の
純粋な培養物が誘発されている。これらの中で特に好ま
しい種属はＮＲＲＬ、１５２１９である。これらは、免
疫学的に同一である酵素製剤を製造し、単離したグルコ
アミラーゼ分画を強化因子分画も対応する分画に免疫学
的に適合する。

例えば少なくとも約１５％の固体澱粉を含む水性懸濁液
中でα−アミラーゼまたは分枝切断酵素を添加せずに粒
状澱粉を加水分解して乾燥物質イースで９５％以上のデ
キストロースを含むシロップを製造するために、発酵ブ
イヨンの有効量を用いる。

本発明の酵素製剤中に存在するグルコアミラーゼ酵素は
、粒状澱粉から誘導される種々な中間生成物の加水分解
にも有効である。グルコアミラーゼは一般に、希薄な澱
粉加水分解物を加水分解してグルコースを生成するため
に用いられる。本発明のゲルコアミラー゛ゼは公知のゲ
ルコアミラーぜと同様な方法で、希薄な澱粉加水分解物
を加水分解してグルコースを生成する。しかし、一般に
広く用いられているグルコアミラーゼ製剤の最適ｐＨが
５．０未満、最も一般的には４．０〜４．５であるのに
比べて、本発明のグルコアミラーゼの最適ｐＨは５．０
〜７．０の範囲である。この酵素製剤のグルコアミラー
ゼの最適声Ｈが高いために、希薄な澱粉からグルコース
への転化プロセスに必要なｐＨ調節の手間が減する。ま
た、酵素製剤のグルコアミラーゼ分画を用いると、希薄
な澱粉からグルコースへの加水分解が終了した後のイオ
ン除去の必要性も減する。

あらゆる公知の先行技術方法では、澱粉の加水分解はグ
ルコースの溶解性中間体ポリマー、デキストリンまたは
オリゴマーの形成を通して進行する。意外なことに、本
発明の酵素製剤は、可溶性中間体または溶解したデキス
トリン様澱粉加水分解生成物を最初に生ずることなく、
通常不溶性の粒状澱粉を、溶解したグルコースに直接加
水分解する能力を有している。中間加水分解生成物が生
成した場合には、顆粒中に残留するように思われ、固溶
体中のデキストロース含量は最初実質的に１００％であ
シ、経時的に幾らか減少するが、非常に高い初期澱粉濃
度においてもまだ９０％以上残留する。固体澱粉１６％
の初期濃度では、グルコース濃度が溶解した糖類の９９
％以上を占めている。典型的に固体２５％においても、
２４時間後にグルコース含量は９８％以上であシ、７２
時間後に澱粉の８０％以上が加水分解した後に９５％に
減少し、二糖（Ｄ、Ｐ、２無水′グルコースポリマー）
が徐々に増加する。このことは、溶解している固体のデ
キストロース含量が連続的に徐々に増加し、可溶性の中
間体多糖類またはオリゴ糖類連鎖が初期に形成される先
行技術の方法とは完全に異なるものである。

本発明の酵素製剤はフミコーラ・グリシ−・変種サーモ
イデアＡＴＣＣ１６４５３（１９８２年カタログ。

３８９頁）の菌株から量初罠単離されたものである。こ
の有機体は、ＣｏｏｎｅｙとＥｍｅｒｓｏｎによるｒＴ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ　Ｆｕｎｇｉ　（好熱性菌類）
Ｊ　（１９６４年、Ｆｒｅｅｍａｎ出版、サンフランシ
スコ）に述べられている。望ましい培養培地（ＡＴＣＣ
カタログ、上記参照）は可溶性澱粉を含むエマーリンＹ
ｐＳｓ寒天であった（ＣｏｏｎｅｙとＥｒｎｅｒｓｏｎ
　、　１３頁）。本発明の酵素は最初は、この培養物を
コーン浸せき液、無機塩、ｋ−セト伏澱粉０．１％及び
、ジエチルエーテル下で一晩貯蔵することによって無菌
化した粒状澱粉１〜２％から成る液体培地で増殖させる
ことによって得られた。は−ストａ澱粉は有機体の増殖
のために実質的に最適とはいえないが、増殖を開始させ
るのに充分であった。粒状澱粉が分解しているのが認め
られた。

この方法で製造された酵素は先ず最初に、増殖培地１部
に対して添加インプロパツール２部を用いて沈殿させて
分離した。この単離した酵素は粒状澱粉を急速に分解し
て、ｐＨ４，５において及び意外なことには、グリコア
ミラーゼが一般に不活性になると考えられるＰＨ６，０
においても主としてグルコースを生成した。粒状澱粉を
含有する培地中で産生した酵素を、イースト状澱粉のみ
を含有する培地中で産生じた酵素と比較した。後者の酵
素は粒状澱粉を約９２％のデキストロニスに転化させた
が、前者の尊崇は９６％までのデキストロースに転化さ
せた。

澱粉をその顆粒形状からデキストロース（グルコース）
へ直接転化させるという好ましい方法は、％にグルコー
スシロップと結晶性デキストロースの世界的に主要な原
料であるコーン（もろこし）からの澱粉に適用するため
に、多くの研究の目的であった。最近の特許は、１９７
５年１１月２５日に発行された、Ｌｅａｃｈ等の米国特
許第３，９２２，１９６号と第３，９２２，１９７号及
びＭａｒｓｈａｌｌの１９８０年１１月１８日に発行さ
れ念米国特許第４，２３４，６６６号及び１９８２年３
月９日に発行された米国特許第４．３１８，９８９号で
ある。Ｌｅａｃｈ等は細菌性αアミラーゼをグルコアミ
ラーゼを加えてまたは加えずに用いて、グルコアミラー
ゼによってデキストロースに転化させることのできる可
溶性の一部加水分解物を得ている。Ｍａｒｓｈａｌｌは
プルラナーゼ活性を有する酵素ならびに分校切断または
デキストリン化活性を有する他のアミラーゼを用いてい
る。

他方では、希薄な濃度において多少アカデミツクな研究
が多く行われている。次のような研究を参照することが
できる： １）　　Ｊ、Ｊ、Ｍａｒｓｈａｌｌによって編集された
（１９８０年）ＭｅＣｈａｎｉｓｍｘ　　ｏｆ　　５ａ
ｃｃｈａｒｉｄｅ　　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎａ
ｎｄ　Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｎｎ　　５５′７
２頁のＶｅｄａ等によるｌＲａｗ　５ｔａｒｃｈ　　Ｄ
ｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｂｙ　ＭｏｌｄＧｌｕｃｏａｍｙｌ
ａｓｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ　Ｅｎｚｙ
ｍｅｓＪ　；’ｒｒｅｎｄｓ　　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ（ＴＩＢＳ）（１９８１年９
月）８９〜９０頁；　５ｔａｅｒｋｅ　３３（１９８１
年）３１３〜３１６頁；同誌３２（１９８０年）１２２
〜１２５頁；同誌と（１９７９年）３０７〜３１４頁：
同誌且（１９７６年）２０〜２２頁；同誌２７（１９７
５年）１２３〜１２７頁 ２）　　Ｈａｙａｓｈｉｄａ等によるＡｇｒｉｃ　＆　
Ｂｉ、コｌ　Ｃｈａｍ。

４６、（１９８２年）８３〜８９頁；同誌３９（１９７
５年）２Ｉ）９３〜２０９９頁； ３）　　Ｍａｒｓｈａｌｌによる上記刊行物、７３〜１
００頁のＩＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖａｒｉｏ
ｕｓ　Ｓｔ、ａｒｃｈＧｒａＬ〕ｑｌｅｓ　ｂｙ　Ａｚ
ｙｌａｓｅｓＪ及びその他多くの研究者による文献。

これらの文献は粒状澱粉の、多くのグルコアミラーゼ製
剤による加水分解に対する感受性を示しているが、高度
な転化は低澱粉濃度においてのみ生ずる。

グルコアミラーゼによる粒状澱粉の転化を促進するため
に用いる１ｆｆＸは、例えばマルトース、マルトトリオ
ース及びデキストリンのような、短鎖オリゴ糖類を加水
分解中に形成することを特徴とする。最近の論文（Ｗａ
ｎｋｈｅｄｅ等、　５ｔａｅｒｋｅ　、　３４（１９８
２年）３０９〜３１２頁）は粗澱粉の消化中のグルコア
ミラーゼに対するα−アミラーゼまたはプルラナーゼ（
ＥＣ３，２，１，４１）の「強化」効果をとシ挙げてい
るが、非常に希薄なＳ濁液における条件下でも、６０時
間内に澱粉の７０％未満が転化したにすぎない。

上記ＴＥＢ６の１９８１年のＶｅｄａ　Ｃ１１／ヴユー
は、酵母の存在下で粗澱粉を消化してアルコールにする
ためのグルコアミラーゼ製剤のレヴユーである。

少なくとも希薄な濃度において粗澱粉消化性を有すると
いわれているカビ力）ら得たグルコアミラーゼ製剤が参
照されており、またフミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍ
ｉｃｏｌａ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）が参照されている
が、これのグルコアミラーゼ活性には有意差が認められ
ていない。このレヴユーはまた、グルコースとマルトー
スが粗澱粉の消化及び粗澱粉に対する酵素の吸着ケ抑制
することを結論している。

フミコーラ・ラヌギノー丈によって製造されるグルコア
ミラーゼばＴａｙｌｅｒ等の研究対象であシ（Ｃａｒｂ
ｏｒ：ｈｙｄｒａｔｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　６　１
　　（１９７８年）３０１〜３０８頁）、フミコーラ属
の他の菌、すなわちフミコーラ・グリシ−・変種・サー
モイデア及ヒフミコーラ・インソレンス（Ｈ・１ｎｓｏ
ｌ＋ｎｓ）ノ性質についてはＥｌｌｉｓが述べている（
Ｔｒａｎｓ　、Ｂｒ　。

Ｍｙｃｏｌ、ｓｏｃ、　７８　（１９８２年）、１２９
〜１３９頁）。

好熱性菌類の幾つかの性質のレヴユーは、ｐＨ及び温度
の最適条件に重点をおいて、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇによっ
てＣａｎ、Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２１　（１９７５
年）１５３５〜１５４０頁に述べられている。この論文
はフミコーラ属の直に関するデータを含んでおシ、フミ
コーラ・ラヌギノーサ（ＡＴＣに　１６４５５　）がサ
ーモマイセス１ラヌギノーサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ
　ｌｏｎｕｇｉｎｏｓａ）と同じものであることが認め
られる。これらの論文は粒状澱粉をデキストロースに転
化させるためのグルコアミラーゼの使用を開示していな
い０ｊ９３１１Ｅ１月２７日にＷａｌｏｎに付与された
米国一１寺２午第４，２４７，６３７号では、フミコー
ラ・ラヌギノーサによって？Ｊ　Ｐされる酵素と、タラ
ロマイセス（Ｔａｌａｒｍｙｃｅｓ）種請株によって製
造される、この特許で特許権を請求する、この発明の７
素との比較を行っている。この特許はサーモマイセス・
ラヌギノーサ有磯体のグルコアミラーゼが肖時の最も熱
に安定なグルコアミラーゼ製剤であるが、ｐＨ６，０，
７０℃において急速に不活化されることを開示している
。この特許で特許権を請求する酵素の最適ｐＨと最適温
度はそれぞれ、４．０と７５℃であると述べられておシ
、フミコーラ属酵素の最適ｐＨと最適温度はそれぞれ、
６．５と６５℃であった。

Ｂａｒ、ｂｅｓｇａａｒｄ等に１９８４年３月６日付与
された米国特許第４，４３５，３０７号では、フミコー
ラ・インソレンスからのセルロース酵ｚＢ剤、　ＤＳＭ
１８００が開示されている。電子顕微鏡検査に基づいて
述べているＥｌｌｉｓによる上記刊行物に基づくと、フ
ミコーラ・インソレンスとフミコーラ・クリシー変種・
サーモイデアの分類学的な区別は「明確ではない」と云
われている◎ＣｏｏｎｅｙとＥｍｅｒｓｏｎばＴｈｅｒ
＋ｕｏｐｈｉｌｉｃ　Ｉｉ’ｕｎｇｉの中で、色とフミ
コーラ拳インンレンスには小胞子のないことによって両
者を区別している。Ｅｍｅｒｓｏｎの分類は、フミコー
ラーグリ７−変種す−モイデアの厚壁；胞子が短い側在
性粉壮胞子上にのみ生じ、部間胞子としてはめったに存
在しないという観察に明らかに基づくものである。本発
明の７ミコーラ・グリンー変種す−モイデア真菌のテス
トは、末端粉状庶子と部間厚壁胞子の両方を示し、Ｅｍ
ｅｒｓｏｎの意見を確証した。

「部間」なる用語はカビのフィラメントすなわち笛糸内
に発生する胞子に適用される。

本発明によると、特定の菌類、特にフミコーラ属の繭は
発酵ブイヨン中で蛋白質の酵素混合物（酵素製剤）を分
泌し、この酵素混合物は直鎖または分枝鎖澱粉を含めて
粗澱粉すなわち粒状澱粉を加水分解し、澱粉を実質的に
完全にグルコースに加水分解する。この酵素混合物はＰ
Ｈ８，０よ）高い等電点を有するグルコアミラーゼ酵素
（ＥＣ３、２。

１．３）と、グルコアミラーゼに協力して粒状澱粉の溶
解？触媒するグルコアミラーゼ強化活性を有する蛋白質
物質とを含むことを特徴とする。この酵素混合物はさら
に、グルコアミラーゼがカルボキシメチルセルロースに
付着するが、強化物質（以下では「強化因子」と呼ぶ）
はカルボキシメチルセルロースゲルに吸着されないこと
を特徴とする。この酵素混合物は例えば水中の１５％澱
粉固体懸濁液を加水分解して、この加水分解を最適ｐＨ
である約５．０〜６．５のｐＨにおいて実施する場合に
は、分校切断酵素または添加α−アミラーゼが存在しな
くとも、乾燥固体イースで少なくとも９７％のグルコー
スを含み、本質的に澱粉残渣を含まず、１％未満の三糖
類及び高Ｒ無水グルコースポリマーを含むにすぎない糖
溶液を生成する。

粗澱粉を加水分解する酵素活性は最初野生型のフミコー
ラ種で発見されたが、公知の野生型に比べて粗澱粉加水
分野（Ｒ３Ｈ）酵素活性量を高める種々の突然変異体が
人工的に誘発されている。突然変異体菌株を以下で述べ
るように発芽させて発酵に用りた場合に生ずるブイヨン
は、以下で述べるように分析したときに１２０単位／ｍ
１以上のＥ（ＳＲ酵素活性を有する。突然変異体菌株に
よって生ずるブイヨンの酵素活性増加は、発芽及び酵素
条件下での個々の有機体による酵素生成量の上昇及び／
または種属増殖上昇によって生ずると考えられる。

このように非常に開発された突然変異体の大部分では、
酵素分泌量の増加は有機体の迅速な増加というよりもむ
しろ個々の有機体による酵素生成量の増加によって生じ
たように思われる。ブイヨンを生成する発源中に、同量
の炭水化物フィードストック、例えば澱粉を用いて高い
酵素生成量が得られるので、これは好運であったと考え
られる。

Ｒ８Ｈ活性の上昇したブイヨンを生成する突然変異体菌
株は、本発明の方法が完全に営利化できる可能性を高め
ている。野生型の菌類は、Ｒ８Ｈ活性を有するブイヨン
を生成するが、生成量は大規模の澱粉加水分解用に望ま
しい量には一般に及ばない。ＦｔＳＨ酵素混合物を製造
するのに用いる菌類は２５０単位／ｍ１以上の活性を有
するまでブイヨンを生成するものであることが望ましい
。

突然変異は、突然変異誘発性化学薬品及び種々な種類の
照射への暴露を含めた、公知の種々な方法によって誘発
される。幾つかの宵月なフミコーラ種突然変異体はこの
ようにして開発されたものである。突然変異体種は高力
価のＲ８Ｈ活注を生ずるためならびにその他の望ましい
特性のために突然変異本種が選択される。さらに、明ら
かに有効な突然変異体は少なくとも３回継代して、それ
らの獲得された遺伝特性の安定性を確実にする。

高力価の酵素？生ずる他に、菌種が比較的高温で増殖す
るのが好ましく、中でも３７°Ｃ〜４０°Ｃの温度で増
殖する中等温度好性菌及び４０°〜５０℃の温度で増殖
する好熱性菌がＲ８）！酵素混合物を生成する好ましい
種である。耐熱性直の重要な利点は、比較的高温で増殖
するときにこのようペン温度で生存することのできない
ような夾雑帖類及びその他の夾雑有機体が除か五ること
である。高温で増殖することの他の利点は有機体がより
迅速に増殖する傾向があるため、高力価のＲ６Ｈ酵素製
剤が得られるということである。

上述のよりなＲ８Ｈ活性を有する酵素混合物が粗澱粉か
ら直接デキストロースを製造する方法に用いられる。こ
の方法は呵胞子の発芽、発芽した直を用いる発酵、培養
した有機体から発酵ブイヨンの分離及び分離したブイヨ
ンを用いる粗澱粉の加水分解から成る。Ｒ３Ｈ酵素酵素
中を生成する直によって粗澱粉を発酵させるとデキスト
ロースが生成するが、おそらく生成するデキストロース
が培養によって消費されるために、デキストロースの収
率は低い。従って、粗澱粉の加水分解に用いる酵素的に
活性なブイヨンの分離が、デキストロースの収率を良く
するために必要であると思われる。

さらに、ぽか中等温度好性または好熱性であシ、比較的
高温で増殖するとしても、酵素混合物は有機体の増殖を
促進する温度以上の温度（例えば５５°Ｃ）において最
大触媒活性を有する。ブイヨン製造発簿段階を酵素加水
分解段階と分離することによって、温度を発酵段階なら
びに酵素加水分解段階のそれぞれに対して最適化するこ
とができる。

さらに、この分離処理は、生成するデキストロースフロ
ップの色及び質に影響を与えるような有機体、胞子及び
その他の夾雑物の分離を可能にする。

この処理は胞子からの菌の発芽から始まって、実質的な
発酵を行うための接種物を製造する。例えば、希薄な澱
粉のような炭水化物源を含む蕪直基質を供給する。炭水
化物は基質の約１叶七４８重量％を占める。培地のｐＨ
ｋ約４．５〜約７．５、好ましくは約５．０〜約６．５
に調節する。培地１　ｒｎｌにつき５０．０００〜５０
０，０００胞子を充分に与えるほどの接種物を基質に接
種する。個々の閑種または彊株の発芽を促がすような温
度において、数日間、典型的には約３日〜約７日間胞子
を発芽させる。発芽した胞子は使用するまで凍結保存す
ることができる。

炭水化物基質を含む発酵培地の接種物として、発芽した
胞子を用いる。典型的には、無呵液体発酵培地に発芽し
た菌を接種する。液体培地は、例えば低濃度のイースト
状澱粉のような炭水化物基質と、蛋白質及びビタミン類
を含む他の栄養物源と？与える。液体培地は窒素をも与
える。コーン浸せき液は比較的安価な好ましい栄養物源
である。

この液体培地を、菌増殖に都合の良い無機塩によって約
４．５〜約７．５、好ましくは約５．０〜６．５のｐＨ
に緩衝化する。さらに、例えばペニシリンＧ及びオキシ
テトラサイクリンのような抗菌剤を加えることができる
。全発酵培地は少なくとも若干の粗澱粉を含むのが好ま
しい。液体培地に接種した後に、粗澱粉を液体培地に加
えることができる。

発酵培地に腑える粗澱粉はＲ８Ｈ酵素混合物の産生を透
見するように思われる。すなわち、少なくとも若干の粗
澱粉が発酵培地中に存在する場合には、全く存在しない
場合よシも、同じ菌種または菌株が高力価のＲ８Ｈ活性
を生ずる。

菌の増殖を促進させるような温度において発酵を実施し
、温度は特定の菌種または菌株に合わせて最適化するの
が好ましい。発酵混合物を絶えず攪拌し、通気するのが
好ましい。発酵は培養物が実質的な力価の酵素混合物を
ブイヨン中に分泌するのに充分な時間、典型的には約２
４〜約８４時間実施する。

発酵後に、ブイヨンを例えば直系のような個体から分離
する。この分離は濾過、遠心分離、または液体から固体
を分離するために適した先行技術で公知の他の方法によ
って行うことができる。分離した酵素ブイヨンはさらに
精製することなく、粗澱粉の加水分解に適している。発
酵が約４８時間道行した場合に酵素産生が最大に達する
傾向のあることが発見された。発酵がさらに長時間進行
した場合には、酵二素−゛生・−成°、１が横ばい状態
になシ、低下することもある。

分離した発酵ブイヨンはさらに精製することなく、粗澱
粉の加水分解に用いることができ、粗ブイヨンを精製す
ることなく用いることが、一般に最も経済的である。粗
澱粉は水性スラリー伏で供給され、グルコースを効果的
に製造するためには、粗澱粉含量は少なくとも約１５重
量％の乾燥物質澱粉であシ、好ましくは少なくとも約２
５重量％の乾燥物質澱粉であるが、約６０重量％までの
乾燥物質澱粉であシ得る。加水分解のための最適ｐＨは
約６．０であるが、５．０〜７．０の範囲のｐＨにおい
て加水分解を行うことができる。Ｒ８ｆ（酵素混合物に
よる加水分解のための最適温度は約５５℃であるが、ひ
素活性は約６０℃以上の温度で失われる。

０℃までの低温でも加水分解は生ずるが、低温になれば
なるほど、加水分解率は低下する。しかし、効果的にグ
ルコースを製造するためには加水分解を４０℃以上で実
施するべきであると一般に考えられる。このスラリーに
ブイヨンを加えると、澱粉ＩＩにつき約１０〜約３００
単位の酵素活性、特に澱粉１！！につき約２５〜約１０
０単位の酵素活性を生ずる。低力価の酵素は半熱かなシ
緩慢にグルコースを生成する。他方では、酵素１単位あ
ｌ）のグルコース生成量は直線状になるとは思われず、
高力価の酵素のデキストリン生成量は、中等力価の酵素
に比べて比較的少ない。従って、かなり迅速な速度で、
しかも酵素１単位につき一般に最適の生成率でグルコー
スを生成するような酵素力価を選択すべきである。

酵素の特性 本発明の酵素製剤は、単離状態、乾燥粉砕生成物状態ま
たは植物組織のマトリックス内の粒状澱粉の加水分解を
触媒する。この酵素製剤はコーン湿式粉砕プロセスで分
離されたコーンのからから残留澱粉をとシ出すのに用い
られる。この酵素は、例えばコーン（もろこし）、小麦
、米のような穀類澱粉、及び例えばジャガイモ、サツマ
イモ、タピオカのような根・塊茎澱粉、ならびに直鎖及
び分枝鎖澱粉分子、すなわちアミロース及びアミロペク
チンを、単離分画としてまたはろう状澱粉もしくは高ア
ミロース・コーンスターチとして、加水分解するのに有
用である。本発明の酵素は、そのグルコアミラーゼ活性
のために、ペースト秋澱粉、溶解性澱粉、低り、Ｅ、澱
粉加水分解物（例えば、２〜２０のり、Ｅ、）及びその
他の澱粉様のグルコースポリマーの加水分解に用いられ
る。

酵素の回収と分画化 本発明の独特な面は、グルコアミラーゼに加えて粒状澱
粉の加水分解を可能にするように思われる強化因子の存
在である。精製した酵素製剤から分画されるような強化
因子は、酵素活性によって確認される成分とともに、構
造が決定されていない蛋白質を含む混合物である。

本発明の酵素製剤は発酵培地から濾過または遠心分離に
よって、菌糸、破片及びその他の残留物を除去して回収
される。溶液を濃縮する場合には、Ｆ液のｐＨを６に調
節し、真空蒸発または限外濾過によって濃縮する。酵°
素製剤を濃縮する代シに、４℃においてアセトン（等量
）または硫酸ジアンモニウム（５０％飽和）によって沈
殿させ、遠心分離によって回収することもできる。アセ
トンによる沈殿が望ましい。酵素製剤を回収するために
他の方法もあることは、当業者にとって明らかである。

粗澱粉加水分解（Ｒ８Ｈ）活性を研究用に精製するため
に、アセトン沈殿した酵素をジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）セルロースによって処理する。

本発明の酵素製剤は、他の全てのグルコアミラーゼ製剤
と実質的に異なシ、ＤＥＡＥセルロー・２（Ｗｈａｔ、
ｍａｎ前膨潤しｆｃ　ＤＥＡＥ　セルロー　ス、ＤＥ−
５２を用いた）に吸着されない；その代シに、不活性蛋
白質が除去され、溶離液中の望ましい活性（グルコアミ
ラーゼと強化因子）がこれによって濃縮される。この処
置はｐＨ約５．０〜７．０（好ましくは６．５〜７．０
）においてカラム式またはバッチ式のいずれで実施して
も同じ様に効果的であり、比活性（単位／Ｉまたは単位
／　ｍＡ！　）が２〜４．５倍に増加する。この増加の
少なくとも一部は不活性蛋白質が除かれることに帰因す
る。この生成物を「精製酵素製剤」と呼ぶ。

強化因子を含む分画を分離するために、精製酵素製剤に
対して吸着剤としてカルボキシメチルセルロースを用い
る陽イオン交換クロマトグラフィを行う。グルコアミラ
ーゼ薄紫は単独の蛋白質吸着帯として強く吸着され、希
ＮａＧ１１によって溶離されるが、強化因子を含む分画
は吸着されない。

「強化因子」は次のような条件下でのカルボキシメチル
セルロースイオン交換物質を用いたカラムクロマトグラ
フィによって、精製酵素製剤から吸着されない、酵素製
剤の分画である：カラム：　　１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液ｐＨ６，８と平衡させたＷｈａｔｍａｎ　ＣＭ
　−５２カルボキシメチルセルロース２．５ｃＩｒＬＸ
　１３．４ｃ＆サンプル：精製酵素製剤５０−１蛋白質
０．４３４包。

４０単位／ｄま念はこれと等価のもの 洗浄：１０ｍＭリン酸ナトリウＡＰＨ６，ｓ、ｘｌｏｍ
ｇずつ 直線勾配：１０ｍＭリン酸ナトリウムＰＨ６−８，４０
０ｍ１．Ｑ〜０．５Ｍ塩化ナトリウム、洗浄後に開始。

流量”、２ｍ１１分。

分画量：９〜１２ｍ１゜ 強化因子はカラム洗浄中に溶離するが、グルコアミラー
ゼは塩化ナトリウム５０ｍＭ〜２００ｍＭの直線勾配に
よって溶離する。回収は蛋白質約０．１り／ｍｌの濃度
においてグルコアミラーゼ単位８０％以上である。各分
画は凍結または凍結乾燥によって保存することができる
。

「クロマトフオーカツシングＪ　（’：’ｌ’Ｃｈｒｏ
ｍａｔ、ｏ−ｆｏｃｕｓｉｎｇ　ｗｉｔｈ　Ｐｏ１ｙｂ
ｕｆｆｅｒ　ａｎｄ　ＰＢＥＪＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆ
ｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　、　１９８０年１１月号
）と呼ばれる技術による強化因子分画の蛋白質成分の分
離とテストは、これが次の活性を有することを示した：
α−グルコシダーゼ、セルラーゼ。

グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ及びキシラナーゼ。

次の成分は検出されなかった：β−アミラーゼ、ゾルラ
ナーゼ、インアミラーゼ、プロテアーゼ、デ午ストラナ
ーゼ、イソマルターゼ、フラクトフルトランスフェラー
ゼ、インバターゼ及びα−１，６−ガラクト７ダーゼ。

α−アミラーゼ活性が比較的低レベルであることも、カ
ルシウムイオンの増進効果、ＥＤＴＡによる抑制、ｐＨ
が５以下に低下した場合の活性損失（変性α−アミラー
ゼ）及びアミロはクテン（ろう状澱粉）に対する活性に
よって推論されｆｃ、しかし、強化因子のみの作用によ
って澱粉から生じた糖は、α−アミラーゼによって生じ
た糖とは全く異なるものである：すなわち、デキストロ
ースが約％、多糖類（Ｄ、Ｐ、ＩＱ以上）が約％であシ
、及びり、Ｐ、３糖含量がり、Ｐ、２糖（α−１，６−
結合存在せず）含量よりも多い。α−アミラーゼはデキ
ストロース金生じない。さらに、単独で測定されたα−
アミラーゼ活性は非常に低いため、可溶性短鎖多糖類を
実質的に形成することなく、顆粒状の澱粉を加水分解す
る本発明の酵素製剤の能力をとても説明できるものでは
ない。これについては後にさらに説明する。

強化因子が一般の炭水化物酵素でないことは、強化因子
をα−アミラーゼ、プルラナーゼ及びインアミラーゼな
らびにグルコアミラーゼと比較した表１のデータによっ
て明らかである。使用した基質はＬｉｎｔ、ｎｅｒの（
可溶性）澱粉、Ｓ　ｉ　ｇｍａプランドのジャガイモの
アミロペクチン、ジャガイモのアミロースとプルランで
あった。酵素はＴｈｅｒｍａｍｙｌ　１２０　Ｌ細菌性
α−アミラーゼ、ＨａｙａＳｈｉｂａｒａイソアミラー
ゼ及びＮｏｖ６プルラナーゼＳＰ　２４７であった。加
水分解は全て、基質濃度１％、ｐＨ５，５及び５０℃に
おいて３０分間実施したが、但しアミロペクチンは、供
給した生成物がかなり高い還元糖ブランク値を示したの
で、０．５％濃度で用いた。還元糖はソモジーネルソン
法（Ｓｔａｒｃｈ　ａｎｄ　ｃｌｔｓ　Ｄｅｒｉｖａｔ
ｉｖｅｓ編集者Ｒａｄｌｅｙ　、第４版、４３１頁）に
よって測定し、デキストロースはＹＩＢＩＩＯＷ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｊｎｓｔｒｍｅｎｔ社の工業用分析器によっ
て定量した。デキストロースに対する還元糖の比は、澱
粉に対するグルコアミラーゼに関して１．０であるべき
である。アミロースまたはアミロペクチンを用いた場合
にはデキストロースが検出されないこと、及びプルラン
を用いた場合には還元糖が検出されないことを、表中の
ブランク値は示している。

表　　１ 強化因子分画　　　　２．１　　２．２　　２．０　０
．７４グルコアミラ一ゼ分画　　０．９４　　１．３　
　０．７７　０．７０α−アミラーゼ　　　　１００　
　−−−　　１８　　〜−−イソアミラーゼ　　　　１
１０　　−−−−−−１．８ゾルラナーゼ　　　　　　
　６．３　１２０　−−−　　１．８最適ｐＨ及びｐＨ
の安定性 本発明の酵素製剤の粒状澱粉加水分解におけるｐＨ範囲
は５．０〜７．０であシ、ｐＨ５，５〜６．０において
最大活性が得られる。数値は、ｐＨ６，０以下の酢酸ナ
トリウム緩衝液中及びＰＨ６，０以上の　リン酸ナトリ
ウム緩衝液中において、４９°Ｃで１時間、１７％（Ｗ
／Ｖ）コーン粒状澱粉と０６６９及び２．５酵素活性単
位／ｍ７！を反応させたことによって測定した。

不溶な澱粉は遠心分離によって除去し、希釈し上清を沸
とうさせることによって反応を抑制した。

本発明の酵素製剤のｐＨ安定性を、２５℃において１時
間及び５０℃において２０分間、２〜８のＰＥ（レベル
に維持することによって測定した。両温度において、活
性の９０％以上が５〜８のｐＨ範囲では保留され、最も
安定な範囲はＰＨ６〜７である。

希薄な澱粉（ＤｙＥ、１０マルトデキストリン）中での
本発明の酵素の活性は、ｐＨ４，５においてクロカビ（
Ａ−ｎｉｇｅｒ　）　、コウジカビ（Ａ、　ｏｒｙｚａ
ｅ）またはクモノスカビ（Ｒ，ｎ１ｖｅｕｓ）からのグ
ルコアミラーゼに比べて低い。ｐＨ５，０以下で強化因
子活性は失われるので、本発明の酵素は粒状澱粉に対す
る作用において、他のグルコアミラーゼ製剤に類似して
いる。

熱安定性 澱粉が存在しない場合の酵素製剤の熱安定性を５０〜６
０℃において、酵素製剤サンプルを各温度において２０
分間ｐＨ６，７に維持し、１０Ｄ、Ｅ、マルトデキスト
リンを用いて分析することによって、測定した。室温に
保持したサンプルに比べて、５３℃では活性の９０％以
上及び５７℃では活性の５５％以上が保留された。

加水分解の形式 本発明の酵素製剤は、形成される可溶性糖類から判明す
る加水分解形式において、特に粒状澱粉に対する澱粉加
水分解に用いられる先行技術の酵素組成物と区別される
。本発明では、最初の数時間の加水分解中に溶液中に存
在する唯一の糖はデキストロースである、すなわち、乾
燥した糖固体ベースで溶液は実質的に１００％グルコー
スである。

澱粉溶解の初期段階後に、明らかにグルコースの再複合
または再重合によって形成される高級糖類が徐々に増加
するように思われる。２−４時間の最後に、１５％以上
の澱粉スラリーからのｌ張体のグルコース含量は乾燥物
質ベースで１００％から９７〜，９８％に減少し、４８
時間後には９６〜９７％及び７２時間後には９５〜９６
％にさらに漸減した。これに反して、α−アミラーゼと
グルコアミラーゼの組合わせによる粒状澱粉の典型的な
加水分解は２４時間後に９０％未満のデキストロース含
量を示すが、この含量は７２時間後に９２〜９３％まで
上昇し、９５％以下で横ばい状態になった。このことは
図１のグラフに示すが、詳しいことは後に実施例５で述
べる。

周知のように、グルコアミラーゼ存在下での澱粉の加水
分解を長時間続け７’（場合には、デキストロース濃度
のピークが生ずる。グルコアミラーゼ１０〜２０単位／
９を用いる営利的条件下では、通常約４８〜７２時間で
デキストロース含量は最大値に達し、その後再重合が生
じて、加水分解に耐性な短鎖無水グルコースポリマーが
形成されるため、デキストロース含量は徐々に減少する
。本発明の酵素製剤はこのようなピークを有ざず、その
代シに、澱粉加水分解物のデキストロース含量の初期測
定は本質的に１００％であシ、図１に示すように、濃度
が緩慢に低下するにすぎない。

澱粉ＩＩにつき本発明の酵素３０単位は、ｐＨ５，７，
５５℃において４８時間内に１６％固体分の粒状澱粉を
完全に溶解し７Ｉｉ：６溶液中の糖は９５％以上のデキ
ストロースであシ、澱粉が反応するヨウ素に対する反応
によって澱粉様物質は検出されない。すなわち、ヨウ素
錯塩を形成する無水グルコースポリマーは存在しない。

等電点 本発明の酵素のグルコアミラーゼ分画の等電点は他の大
部分のグルコアミラーゼ製剤に対して測定されたよシも
高い。単離したグルコアミラーゼ分画はｐＨ８，０以上
の等電点を有する。３種類の酵素製剤クロカビ、コウジ
カビ及びクモノスカビに関する測定値は、それぞれ３．
７，３．４及び７．７であった（文献では：それぞれ３
．４〜４．０　、３．４〜３．５及び８．７〜８．８）
。この測定等電点は、インゲル・アガロース・インエレ
クトリックフオーカソシング法（１’−Ａ　５ｔｅｐ　
ｂｙ　５ｔｅｐ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ＩｓｏｇｅｌＡｇ
ａｒａｓｅ　工５ｏｅｌｅｄｔｒｉｃ　Ｆｏｃｕｓｉｎ
ｇＪ　、　ＦＭＣＭａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　Ｄ
ｉｖｉｓｉｏｎ　５ｉｏｐｒｏａｕｃｔＳ。

１９８０年１月）によって求めたものである。

分子量 ＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動法（Ｎａｔｕｒｅ　２２７号（１９７０年）６８０頁
以降）によって、グルコアミラーゼと強化因子分画を分
析し、分子量を測定した。用いたゲルはそれぞれ２．７
％架橋している、７％及び１０％アクリルアミドであっ
た。グルコアミラーゼ酵素の分子量を６４，３００と測
定し、強化因子の３主要成分の分子量をそれぞれ、８７
，３００，７２，５００及び５２，２００と測定した。

金属イオンに対する感受性 テストした金属イオンはカルシウム、クロム。

第二鉄、亜鉛、マグネシウム、マンガン及ヒニッケルで
あった。粒状澱粉の加水分解に対する唯一の観察された
効果は、カルシウムイオンによって速度がやや促進され
ることであったが、これは加水分解の初期段階において
生じたにすぎなかった。

形態 上述したように、本発明の酵素の最初のサンプルは、文
献に述べられている有機体のフミコーラ・グリシ−変種
サーモイデアＡＴＣＣ１６４５３から単離された。ＡＴ
ＣＣ１６４５３はこの菌及びこの菌の誘導体である変種
ｔｌ−Ｎ−メチルーＮ′−二トローＮ−ニトロングアニ
ジンまたは殺菌紫外光線（２５３ｎｍ波長）に暴露させ
ることによって、徐々に突然変異した。ＡＴＣＣ１６４
５３及び発生した各突然変異体のサンプルを次の組成の
ＹｐＳｓ寒天上で増殖させた： 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）　　　　　　　　４．０ｇＫ
２ＨＰ○４１．０．９ ＭｐＳＯ４・７Ｈ２００，ｉ 可溶性澱粉　　　　　　　　　　１５．０．Ｆ蒸留水１
０００ｍｌ 寒天（Ｄｉｆｃｏ）　　　　　　　　　　１５　、！９
この有機体から誘導された突然変異体の形態は次の点で
ＡＴＣＣ１６４５３の形態とは異なる：表面　：　　Ａ
ＴＣＣ１６４５３は起伏のある表面及び寒天中に切シ込
まれた比較的明確なエラ：）を備えた幾らか不規則な溝
を有し、暗灰色であるが、突然変異体はＡＴＣＣ１６４
５３よりも全てが高度に着色しておシ（よシ強く黒色）
、次のような特徴を有する： ＮＲＲＬ　１５２１９−滑らかな表面と細い溝を有し、
褐色がかった灰色 ＮＲＲＬ　１５２２０−滑らかな表面とＡＴＣＣ１６４
５３よシも細い溝のある灰褐色 ＮＲＲＬ　１５２２１−やや起伏のある表面を有し、褐
色がかった灰色 ＮＲＲＬ　１５２２２−起伏ある表面になシがちな、比
較的幅の広い溝を有し、灰色 ＮＲＲＬ　１５２２３−褐色がかった灰色、若干しわの
ある滑らかな表面、ローンは完全には連接していない。

ＮＲＲＬ　１５２２４−不連続なコロニーを有し明るい
灰色、ローンは連接していない ＮＲＲＬ　ｌ　５２２５−暗灰色から黒色、ざらざらし
ている、表面増殖は連接していない、寒天中に色素あシ 裏　面：　ＡＴＣＣは３０℃において暗褐色から灰色及
びもも色であるが、突然変異体は全てＡＴＣＣ１６４５
３よりも濃く着色してお＃）（黒色）、次の持金を有す
る： ＮＲＲＬ１５２１９．−２２１及び−２２３暗灰色から
黒色。

ＮＲＲＬ　１５２２０及び−２２４灰色から黒色。

ＮＲＲＬ１５２２２灰色から黒色、殆んど黒色。

ＮＲＲＬ　１５２２５　　黒色。

のオリジナル菌株から区別することができず、Ｅｍｅｒ
ｓｏｎとＣｏｏｎｅｙの古典的な説明（Ｔｈｅｒｍｏｐ
−ｈｉｌｉｃ　Ｆｕｎｇｉ　、第８章）１に確証した。

同一条件下で増殖させ九、フミコーラ・インソレンスの
［株（ＡＴＣＣ１６４５４とＡＴＣＣ２２０８２）の比
較は、これらの菌株がＥｍｅｒｓｏｎとＣｏｏｎｅｙの
記述に適合することを示した。

温度限界：　　２５，３０，３７，４２，４５．５０及
び５５℃の温度において上述の組成の寒天上で５日間増
殖させたサンプルを観察した。この観察は以下の増殖と
胞子形成の表に示す。「見出し」の中で、「良好な増殖
」とは繁茂したローンを意味し、「中等度の増殖」は幾
らか少なく茂つ念ローンを意味し、「軽度」はプレート
が完全には覆われていない増殖を表すのに用いる。サン
プルのいずれも５５℃で増殖するのは観察されなかった
。

胞子形成量は温度と共に急速に増加し、コロニーと培地
の両方の色（着色）に明らかに影＊’ｉ与える。大量の
胞子形成は灰色から黒色を生ずる。

「肉眼で認められず」なる用語は、殆んどまたは全く着
色の認められない、すなわち殆んど白色の増殖を意味す
るが、「軽度」なる用語は殆んど着色のない、通常黄褐
色に見えるようなプレートを表すのに用いられる。

増殖に及ぼす温度（’Ｃ）の影響 （増殖温度：　２５，３０，３７，４２，４５，５０，
５５’）増殖度 １６４５３　２５　　３０．３７，４２，４５５ＯＲＲ
Ｌ １５２１９　２５．３０　３７４２，４５．５０１５２
２０　２５．３０　３７４２．４５　　５０１５２２１
２５３０　３７４２．４５　　　５０１５２２２　３０
　　３７．４２，４５．５０１５２２３２５３０　　３
７．４２，４５．５０１５２２４　２５　３ｃＰ、３７
　４２　　　　　　　　　４５，５０１５２２５２５３
０　３７４２．４５．５０※　このような条件下では、
５５℃において、いずれのサンプルの増殖も認められな
かった。

胞子形成に及ぼす温度（’Ｃ）の影響 （胞子形成温度：　２５，３０，３７，４２，４５．５
０）胞子形成度 １６４５３　２５　　３０　　３７　４２　　　　　　
４５．５ＯＲＲＬ １５２１９　　　　２５．３０　３７　４２　　４５．
５０１５２２０　　　　２５．３０　３７　４２　　　
　　　４５．５０１５２２２　　　　３０　　　　３７
．４２４５ｊ５０１５２２４　３０．３７　　　　４２
　　　　　　　　４５，５０１５２２５　３０　　　　
　３７　４２．４５，５０※「肉眼で認められず」なる
用語は増殖は存在するが、着色がないことを意味するの
に用いられる；温度が記載されていない場合には、増殖
も胞子も観察されなかった。

上記で言及したものを除いて、突然変異体は全て、ＡＴ
ＣＣ１６４５３のオリジナル菌株に類似していた。完全
に発生した胞子は球形もしくは球形に近かった。呵糸体
ローンの増殖度が増すＫつれて、単離した菌糸パッチを
区別することは困難になυ、成熟した個々の胞子の発生
は頻繁になった。同時に、胞子及び胞子連鎖が発生した
菌糸ストランド数は減少した。すなわち、増殖が増加す
るにつれて、部間胞子の検出は困難になった。

標準培養方法 種々の菌株のＲ８Ｈ酵素製剤を生成する能力を比較する
ために、標準培養方法は次のように定義される。標準培
養方法に従って培養した場合に、種々な菌変種のブイヨ
ンを分析し、直接比較することができる。次の組成を有
する無菌の液体基質上で培養する： 酵母エキス　　　　０．４％ に２ＨＰＯ４０，１％ Ｍｌ／Ｅ３０４・７Ｈ２００，０５％ 希釈澱粉　　　　　２０．０％ 水　　　　　　　　　バランス ※　希釈澱粉は、３％プロピオン酸カルシウムを含む２
Ｍ酢酸ナトリウムの約２容量％の存在下（Ｄ　ＰＨ６，
４〜６．６　Ｋオイテ、約１０　％　（Ｗ／Ｖ　）濃度
のコーン澱粉を糊化し、７０℃に冷却し、少量のＴｈｅ
　ｒｍａｍｙｌブランドα−アミラーゼを加え、７０℃
の温度を１時間維持することによって製造する。

５００ｍｌ　−バッフル付き振盪フラスコ中で無菌の胞
子形成培地（１００ｍ１．　ｐＨ７）に有機体を接種し
、フラスコを４２℃に５〜６日間維持して、胞子群を発
生させた。胞子フラスコは使用するまで凍結する。

５００ｍｊ　振盪フラスコ内で、同じ組成の無菌接種培
地ＩＱＱｍＡ！と、約３０００万胞子に対応する量の胞
子培地とを混合することによって、発屡器接種物を調製
する。接種した接種培地を４２℃において１６時間振盪
し、生成した接種物を、空気供給源と攪拌機付きの１４
１発酵器内の無菌増殖培地１０１１に、５容量％で加え
る。

液体発酵器培地は次の組成を有する： コーン浸せき液　　　　　　　２．０％に２ＨＰＯ４０
，１５％ Ｍ、９８０４・７Ｈ２００，０５％　　　　゛イースト
伏コーン粉末　　　０．１０％水　　　　　　　　　　
　　バランス 殺菌後、ペニシリンＧとオキシテトラサイクリンのそれ
ぞれＩｇを発酵器に加える。接種物を加えるときに、無
菌顆粒秋コーン粉末１００ｇをも培地に混入する。

最初は攪拌機を５０　Ｏｒｐｍで作動させ、増殖培地を
通して０．５量／量／分（ｖｖｍ）の流量で空気？流し
ながら、発酵器を４２℃に維持する。１８時間後に、無
菌コーン粉末２００Ｉと無菌のコーン浸せき液２００−
を発酵器に加える。空気流量と撹拌機速度をそれぞれ、
約１．８　ｖｖｍ　６０　ｒｐｍに高める。２６時間目
に、無菌コーン粉末１００ｇを発酵器に加える。

発酵は７３時間後に終了する。

発酵器からの酵素ブイヨンを濾過して、蕗糸体とその他
の固体物質を除去する。例えば′３７℃で発酵する菌の
ような、４２℃では増殖しない中等温度野性菌に対して
は、標準培養法を改良する。

酵素活性の測定 酵素活性の測定には２種類の方法が用いられている。

本発明の目的のために、最初のテストを標準分析法Ａ６
．１とする。この分析法は粒状澱粉に対する酵素製剤の
相対活性を測定するのに用いられる粗澱粉加水分解テス
トである。このテストはＤ〜、ＳＡテスト（ジニトロサ
リチル酸）による還元糖（グルコース）の測定に基づく
ものである。標準分析法／ｉ６１では、０．０２５ＭＩ
Ｊン酸塩緩衝液、カルシウムイオンとして０．ＯＩＭ　
（、ｐＨ６，５）中に懸濁させた１％コーン粒状澱粉１
ｒｎｌに培養ブイヨン（または酵素溶液）０．１罰を加
える。懸濁液を５０℃に１時間保持し、次にＩＴ）ＮＳ
ＡＪ溶液１ｍ７！を加える（ジニトロサリチルｅ１０．
Ｆ、２．６６Ｎ水酸化ナトリウム１５０ｍ１．酒石酸ナ
トリウムカリウム３００！１を水で１０００　ｍｌｌに
したもの）。この澱粉懸濁液を沸とう水中に５分間保持
し、水１０ｍ１を加える。５４０ｎｍにおける光学密度
を分光光度計（例えば、５ｐｅｃｔｒｏｎｉｃ　７０ブ
ランビ比色計）によって、相対活性の尺度として読み取
る。１粗澱粉加水分解（ＲＳＨ）単位を一定条件下で、
光学密度を０．１高めるのに必要な還元糖の量として定
義する。零時間におけるデキストロースを定量するため
にブランクをランする。還元糖含量は光学密度対還元糖
溶液（０〜０．３％溶液）の標準曲線から算出すること
ができる。このデータから、酵素活性の国際単位を決定
することができる。活性１単位は分析条件下で１分間に
デキストロース１μｍｏ’Ｊ、ｅ　ｆ生ずる酊素量であ
る。

粒状澱粉基質によって生ずる影響（濃度に関する速度の
変化、加水分解物の混合及び透明化に関する問題点等）
を避けるために、他の方法を用いることもできる。本発
明の目的のために、この方法を標準分析法／１６．２と
する。これは１０Ｄ、Ｅ、マルトデキストリンテストと
も呼ばれる。これは粒状澱粉よりもむしろ１ｏ　Ｄ、Ｅ
、マルトデキストリンを基質として用いるスクリーニン
グテストである。

０．０６〜１．１重位を含む酵素製剤１／１ｏｍｌを、
必要ならば希釈して、５０℃で５分間前加熱した基質溶
液０．ｇｒｎｌに加える。基質溶液は０．２５Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５，５）　４０容量部と４重：１
％１０Ｄ、Ｅ。

マルトデキストリン水溶液５０容量部から成るものであ
る。基質溶液を酵素溶液添加の前に、５０℃に５分間保
持する。１０分間後に、前加熱した１６ｉ＋ｍ試験管中
に注入し、１００℃水溶中で６分間加熱することによっ
て、反応を中断させる。例えばグルコース試薬キット１
５−ＵＶ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）またはＴｅ
ｃｈｎｉｃｏｎ　Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒのような機
器等の従来の方法によって、グルコースを定量する。

零時間におけるグ・ルコースを定量するために、ブラン
クをランする。結果をサンプルの希釈に関して補旧する
。との単位を１ｏＤ、Ｅ、または１０Ｄ、Ｅ。

マルトデキストリン単位と呼ぶ。

幾つかの改良突然変異体のＲ８Ｈ活性 上述の標準培養方法と標準培養方法屋１を用いて、特定
の突然変異体が以下の表に示すように、野生型ＡＴＣＣ
１６４５３よシも高力価ＦｔＳＥ（酵素活性を生ずるこ
とが発見された： 単位／ｍ１ ＡＴＣＣ８０ ＮＲＲＬ　　　　　　　　２８６ ＮＲＲＬ　　　　　　　　１７２ １但ＲＬ　　　　　　　　１５２ これらの突然変異体が野生型の約２倍から約３３Ａ倍の
Ｒ５ｆ（活性を生ずることがわかる。

次の実施例は本発明の方法と組成物を説明するために示
すのであって、実施例に述べる詳）洲に本発明を限定す
るものでないことは自明のことである。明細書及び特許
請求の範囲を通して、％、部及び比は重量に関するもの
であシ、温度は他に記載しないかぎり、℃である。

実施例　１ フミコーラ・グリシム変種サーモイデアの突然変異体閑
株、　ＮＲＲＬ　１５２１９を、次の組成の無菌液体基
質上で培養した： 酵母エキス　　　　０．４％ Ｋ　２　Ｅ（ＰＯ４０，１％ ＭｉＥ３０４−７Ｈ２００，０５％ ※ 希釈澱粉　　　　　２０．０％ 水　　　　　　　　バランス ８　希釈澱粉は、３％プロピオン酸カルンウムを含む２
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液約２容量％の存在下のｐＨ６，
４〜６．６において、約１０％（Ｗ、、Ｖ　）濃度の澱
粉を糊化させ、７０°Ｃに冷却し、少量のＴｈｅｒｍａ
ｍｙｌプラント９α−アミラーゼを加え、７０℃の温度
に１時間保持することによって製造されたものである。

５００ｍｌバッフル付き振盪フラスコ内で無菌胞子形成
培地（１００ｍＡ！、ＰＨ７）に有機伴を旋種し、フラ
スコを５〜６日間゛４２℃に維持して、胞子群を発生さ
せた。胞子フラスコは使用するまで凍結させた。

５００づ一振盪フラスコ内で同じ組成の無菌接種培地１
００ｍ１！に約３０００万胞子に相当するような量の胞
子培地を混合することによって、発酵器接種物を調製し
た。接種した接種培地を４２℃で１６時間振盪し、生成
した接種物を５容量％で、空気供給源と攪拌機付きの１
４／−発酵器内の無菌増殖培地１０１に加えた。この実
施例の酵素生成物を２つの発酵器内で製造した。

液体発酵器培地は次の組成を有するものであった： コーン浸せき液　　　　　　　　２．０％に２ＨＰＯ４
０，１５％ ＭｙＳＯ４・７Ｈ２００，０５％ ペースト状コーン粉末　　　　０．１０％水　　　　　
　　　　　　　　　ノ２ランス殺菌後、イニシリンＧと
オキシテトラサイクリンの各１．！９を各発酵器に加え
た。接種物を加えるときに、無菌の顆粒秋コーン粉末１
００ｇも培地に混入・した。

各発酵器を４２℃に維持して、最初は攪拌機を５０　Ｏ
ｒｐｍで作動させ、増殖培地に０．５量／量／分（ｖｖ
ｍ）の流量で空気を供給した。１８時間後に、無菌コー
ン粉末２００Ｉと無閑コーン浸せき液２００−を各発酵
器に加えた。空気流量と撹拌機速度をそれぞれ、約１．
２〜２．２ｖｖｍと６０　Ｏｒｐｍに高めた。

２６時時間区、無菌コーン粉末１００ｇを発酵器の１つ
に加えた。発酵は７３時間後に終了した。

各発酵器からの酵素ブイヨンを濾過して、ガ糸体及びそ
の他の固体物質を除去した。２つの発酵器からの濾過し
たブイヨンをプールし、凍結保存した。解凍した酵素溶
液を遠心分離して、形成された固体を除去した。濾過し
たブイヨンの活性は、１０　Ｄ、Ｅ。マルトデキストリ
ンを用いる上述の方法（標準分析法屑２）による測定に
よって、１８３単位／ｍｌであった。

この酵素全澱粉１ｇにつき１０　Ｄ、Ｅ、単位５０の割
合で用いて、乾燥物質２６％のスラリー状態のコーン粒
状澱粉ケ加水分解した。このスラリーは防腐剤として加
えた０、０２％プロピルパラベンと０．１％メチルパラ
ベンとともに、カルシウムイオン１００　ｐｐｍを含有
した（ｐｐｍはスラリー重量に基づく）。絶えず攪拌し
ながら、ＰＨと温度はそれぞれ、６．０と５５℃に９６
時間維持した。結果は表２に示す。

表　　２ ２４７６　　９４．１ ４８８６　　９３．７ ７２９０　　９２．３ ９６９４　　８８．８ 実施例　２ フミコーラ・グリシ−変種サーモイデア、ＡＴＣＣ１６
５４３を次の組成の寒天（ＰＨ７）上でストリークした
： 酵母エキス　　　　　　　０．２％ 牛肉エキス　　　　　　　０．２％ 麦芽エキス　　　　　　０．３％ Ｂａｃｔｏ寒天Ｄｉｆｃｏ　　　　１．５％Ｌｌｎｔｎ
ｅｒ　　＃粉　　　　１．０％水　　　　　　　　　　
バランス カバーしたプレートを逆にして、５〜６日間４２°Ｃに
維持した。これらは必要時まで凍結保存した。

培地１００罰を含有する５００ｍ／！フラスコに対して
約％プレートの割合で、接種培地に胞子を加え、ブレン
ダーで混合することによって、発酵器接種物を製造した
。この接種培地は次の組成を有した：コーン粉末　　　
　　　　　３．０％ ※Ｔｒａｄｅｒｓ　Ｏｉｌ　Ｍｉｌｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ
のＴｒａｄｅｒｓ蛋白質部門 ２組みのフラスコを用意し、１つはコーン粉末を加えた
後に殺画しくコーン粉末澱粉は糊化する）、他方は完全
な粒状澱粉を有する無菌コーン粉末を加える前に殺萌し
た。フラスコを４２℃において１６時間振盪し、接種物
は凍結保存した。

空気供給源と攪拌機付きの１４１−発酵器内の無菌増殖
培地１０／に、各接種物５重量％を加えた。

発酵器には水に加えた４％Ｐｒｏｆｉｏプランド綿実蛋
白質単離物のみを含めた。接種物の添加時に、無醒顆粒
状コーン粉末１００．９ｅも加え、この操作を１８時間
目と２４時間目の終シに〈シ返した。各発酵器を４２℃
に維持し、最初は攪拌機を５００ｒｐｍで作動させ、空
気を０．５ｖｖｍの流量で供給した。１８時間後に、空
気流量と攪拌速度をそれぞれ、約１．ｌｌｌ＋−２，２
ｗｍと６０　Ｏｒｐｍに高めた。発酵は７２時間後に終
了した。

発酵器からの酵素ブイヨンを実施例１と同様に処理した
。この活性は実施例１と同様な測定によって１−あた＃
）１０Ｄ、Ｅ、単位２９であった。

酵素をＩＮにつき１ｏＤ、Ｅ、単位１５の割合で用いて
、乾燥物質２９％のスラリー伏態のコーン粒鉄澱粉を加
水分解した。このスラリーは防腐剤として加えた０、０
２８％プロピルパラ（ンと０．１％メチルパラインを含
むものであった（％はスラリー重量に基づく）。絶えず
攪拌しながら、ｐＨと温度をそれぞれ、６．０と５５℃
に９６時間維持した。

結果を表３に示す。

表　　３ 澱粉 ２４　　　７０　　　　　９５．７ ４８　　　８６　　　　　９４．８ ７２　　　９１　　　　　９３．７ ９６　　　９５　　　　　９３．１ 実施例　に の実施例では、粒状澱粉と希釈澱粉（１０Ｄ、Ｅ、マル
トデキストリン）の加水分解における゛本発明のグルコ
アミラーゼの活性に及ぼす強化因子分画の効果を説明す
る。本発明の酵素製剤から上述のように分画化したグル
コアミラーゼの１０Ｄ、Ｅ、単位２によって、１％粒伏
澱粉懸濁液を５０”Ｃ、ＰＨ５，５において加水分解し
た。強化分画溶液を、表４に示すような量で、澱粉懸濁
液に加えた。

デキストロースを４時間にわたって測定した。この４時
間の結果（表４）は、粒状澱粉の可溶化及び澱粉のデキ
ストロースへの転化における゛グルコアミラーゼに対す
る強化酵素の効果を明白に実証している。

表　　４ 強化分画　　　グルコース 添加量ＣＩＰ１）ＣＴｎ９７ａｔ） 非分画化酵素　　　　　　　　　　　５，７グルコアミ
ラ一ゼ分画　　　　ｎ　ｉ　ｌ　　　　　　１．４混合
分画　　　　　　　　　２１　　　　２．８４２　　　
　４．０ ８４　　　　４．７ １６８　　　　４．９ ３３６　　　　６．３ １７　％　（Ｗ／Ｖ）　粒ａｅ　澱粉懸濁液中テｌＯＤ
、Ｅ、単位２．５〜２．８のグルコアミラーゼを用いて
、本質的に同じ反応条件下で同じテストを６時間実施し
た。

テストした３種類のサンプルは本発明の非分固化酵素、
単離したグルコアミラーゼ分画及び、強化因子（蛋白質
１３Ｉ！！ｉ）を加えた単離グルコアミラーゼ分画であ
った。この液体のデキストロース濃度はそれぞれ、７２
．１６及び７６ｍ９７ｍ１であった。

対照のために、公知の市販のグルコアミラーゼ製剤のサ
ンプルを最適ｐＨ４，４と、供給者が勧めているような
、各々に対する最適温度とを用いて比較した。これらは
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｂｅｉｍからのクロカ
ビとＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌからのコウジカビと
クモノロカビであった。最初の２種類は６０’Ｃ；最後
の種類は５０℃において、上述のような１％粒伏澱粉ス
ラＩＪ−に用いて４時間テストした。これら３種類の製
剤をそれぞれ２．４単位、１，７単位及び２，０単位に
おいて、本発明の精製されているが非分画化の酵素２．
４単位と比較した。組成物のグルコース含量はそれぞれ
、０．７　、１．７　、１．２及び５、ＯＩｎＱｉ旬で
あシ、本発明の酵素の粒状澱粉に対する効果を示してい
る。同じテストを可溶性１０Ｄ、Ｅ。

マルトデキストリンに対して実施した場合には、対照的
に、４種類の酵素製剤の全てが、１．５時間後に９５％
デキストロースに達した、すなわち同時に本質的に同じ
終点に達した。

実施例　４ この実施例では、Ｂ等級小麦澱粉の加水分解への本発明
のグルコアミラーゼ製剤の使用を説明する。この澱粉は
、グルテン除去後に小麦澱粉を遠心分離によって２つの
分画に分画化する結果として得られる。Ｂ等級澱粉はク
リーム色であシ、α−アミラーゼの作用に耐性であシ、
「ジェット」クツカー（蒸気噴射ヒーター）におけるよ
うな、高温澱粉処理と呼ばれるプロセスで処理するのが
困難である。

顆粒伏Ｂ−等級小麦澱粉の固体分２６％、　ｐＨ５，５
鴫る水性スラリーを、澱粉１．９につき酵素製剤１０Ｄ
、Ｅ、単位１５の存在下、５５℃において２４時間攪拌
した。残留固体から分離したシロップは９５．７％のデ
キストロースを含み、澱粉の６４％は溶解していた。９
６時間後に、デキストロース含量は９５．３％であシ、
澱粉の約７３．０％が溶解した。澱粉ＩＩにつき酵素製
剤ＩＱＤ、Ｅ、単位３０の存在における対応する結果は
、２４時間後にデキストロース含量９５．７％、澱粉の
７１％溶解及び４８時間後にデキストロース含量９４．
４％、澱粉７８％溶解であった。

澱粉固体分３４．４％における同じ条件では、澱粉１ｇ
につきＩＯＤ、Ｅ、単位１５によってノロツブ中に、２
４時間後にデキストロース９６％、溶解５４％及び４８
時間後には、転化が終了して、デキストロース９５．２
％、溶解５７％であった。澱粉につきｌ　Ｑ　Ｄ、Ｅ。

単位２０では、２４時間及び４８時間の最後にそれぞれ
、デキストロース含量９５．１と９４．２％に達し、溶
解は５５％と５８％であった。

実施例　５ この実施例では本発明の酵素と、グルコアミラーゼ製剤
をα−アミラーゼとともに用いて粒状澱粉をグルコース
に転化させる先行技術の方法との間の重要であるがまだ
明らかにされていない相違について説明する。この相違
は加水分解で形成される生成物の糖分布にあると思われ
る。データも本発明の酵素製剤を用いて大きな改良が得
られることを示している。

本発明の酵素製剤（ＡＴＣＣ１６４５３，ＮＲＲＬ１５
２１９から得られたもの）を澱粉ｌｌ！につきｌｏＤ、
Ｅ、単位１５の割合で、カルシウムイオン５０　ｐｐｍ
含有のコーン粒状澱粉の２６％固体物質水性スラＩＪ−
に加えた。サンプルｉ２４．４８及び９６時間後に採取
した。データは図１に示す（断読線）。液体の分析結果
（乾燥物質イース）を表５に示す。澱粉固体濃度は２６
％から約９％に減少した。同じ実験を澱粉ＩＩＩにつき
酵素１ｏ　Ｄ、Ｅ、単位２２．５を用いて〈シ返した場
合には、澱粉残渣が６％にまで減少した。

固体分１６％では、２４時間の最後にデキストロース含
量が９７％以上になシ、澱粉残渣は１％未満になった。

多くの試行で、澱粉残渣が検出できないことが発見され
ている。

対照実験を、乾燥物質２７．５％のコーン澱粉スラリー
中で、両方とも澱粉乾燥重量に基づいて、０．２７５％
のＮｏｖｏ　Ｔｈｅｒｍａｍｙｌ　６０Ｌブランドの細
菌性α−アミラーゼ及び０．２７５％のＭｉｌｅｓＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｄｉａｚｙｍｅ　Ｌ　−１００
プラント９のグルコアミラーゼ製剤を併用して実施した
。ＰＨ５，５及び温度６０℃’１１２０時間維持し、２
４時間毎にサンプルを採取した。これらの結果も図１（
実線）及び表５に示す。α−アミラーゼはバチルス・リ
チェニホルミス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ）から製造され、最適ｐＨは６０℃において
５．５である。

グルコアミラーゼはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ）属の文献ではクロカビの菌株と同定された菌株
から生成する（Ｓｍｉｔｈ等、５ｔａｅｒｋｅ　２８　
（１９７６年）。

２４３〜２４９頁）。このような条件下で、ｐＨ５，５
が澱粉の溶解に最適であるように思われた。ｐＨが低く
なるほど、液相中のグルコース含量が高くなるが、溶解
する澱粉は減少することが観察された。図１に示すよう
に、デキストロース含量が経時的に減少する本発明とは
対照的に、デキストロース含量（可溶性糖に基づく乾燥
物質）は徐々に増加する。α−アミラーゼ−グルコアミ
ラーゼの組合わせは７２時間の終シに１６％の澱粉を残
し、１２０時間後に１４％の澱粉を残した。

表　　５ 本発明　２４　９７．４　２．１５％　０１５％　０．
２５％の酵素　４８　９６．６　３．０６　　０．１６
　　０．１４７２９５．６３．８６０．２５０．１５α
−アミン２４　　８９．０　　３．１３　　　２．８４
　　　５．０７−ゼ／グ　４８　　９１．５　　２．５
１　　　２．５２　　　３．２１ルコアミ　７２　　９
２．７　　２．２５　　　２，３３　　　２．８３ラー
ゼ　　９６　　９４．０　　２．０５　　　１．９６　
　　１．８３１２０９４．５２．０７１．８３１．６２
図１と表５のデータは、本発明の酵素が粒秋澱粉を加水
分解させて溶解させる形式には、明らかに根本的な差異
があることを示している。すなわち、すくなくとも最初
の２４時間に形成される可溶性澱粉は９５％より多いデ
キストロースでアシ、Ｄ、Ｐ。３及びこれ以上のグルコ
ースホリマーは実質的に形成されない。Ｄ、Ｐ、２糖類
の増加は再重合の結果であると考えられる。これとは対
照的に、相互作用して粒状澱粉を可溶化させる酵素とし
てα−アミラーゼを含む、典型的なグルコアミラーゼ製
剤は２４時間内に９０％デキストロースに達せず、９６
時間後には９４〜９５％に徐々に減少する。

Ｄ、Ｐ、３及びこれ以上の重合度の糖を比較的多く生成
し、本発明におけるよシも実質的に高いレベルでこれら
の生成が横ばい状態になることも明らかである。

本発明の幾つかの利点をさらに完全に知ることができる
。特定の直によって生成される酵素を用いると、Ｒ−ス
ト秋澱粉よシもむしろ粗澱粉をグルコース形成の基質と
することができる。澱粉を（−スト化する必要がなくな
るため、実質的に非常なエネルギー節約が可能になる。

この酵素製剤は高い重量％の澱粉を含む粗澱粉スラリー
を加水分解して、希薄な溶液よシも水分を排除するエネ
ルギー必要量が少ない比較的濃厚なグルコース溶［−生
成するのに有効である。加水分解の出発点から、溶液中
の生成物は実質的に完全にグルコースである。この酵素
製剤が非常に低濃度の限界デキストリン及び三糖類を生
成するという事実は非常に重要である。これらの基質は
グルコースまたは、高フラクトースンロツプのような、
誘導生成物の甘味を高めることはなく、甘味を減するこ
とさえある。このように、この酵素製剤は澱粉からグル
コースを生成するための殆んど全ての見地から理想的で
ある。高力価の酵素混合物を生成するために開発された
突然変異体種は、グルコースを大規模に製造するために
酵素混合物？使用する可能性を高めるものである。

本発明を特定の好ましい実施態様に関して説明してきた
が、当業者にとって明らかな改良を本発明の範囲から逸
脱することなく、行うことも可能である。例えば、非常
に高力価の酵素を生成する改良された突然変異体が引続
いて開発されるであろう之期待される。また、とのＲ８
Ｈ酵素混合物を構成する酵素の性質についてさらに多く
知られるようになるにつれて、酵素を生成する遺伝子が
クローン化され、組換え体ＤＮＡテクノロジーによって
他の有機体中に適当に挿入されることも考えられる。本
発明の目的に関して、同じ酵素混合物を生成する改良さ
れた突然変異体また’／ｊ　？：Ｆｉ換え体の有機体は
、ここに述べた有機体の等個物であると考えられる。

本発明の種々な特徴については、特許請求の範囲の中で
述べる。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の酵素製剤とα−アミラーゼ／グルコアミ
ラーゼ組合わせとを用いた比較加水分解の過程でのデキ
ストロース含量と澱粉溶解量の変化を示すグラフである
。 （外５名〕 Ｊ２．た・吟マ　（時）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）実質的に直接グルコースを生成する粒状澱粉の加水
   分解を触媒する実質的に純粋な真菌類培養物によつて生
   成される酵素製剤であつて、 ａ）この酵素製剤は、約１５重量％の固体澱粉濃度で水
   中に懸濁した粒状澱粉の加水分解を触媒し、この加水分
   解をｐＨ約５．０〜約７．０及び温度約５５℃において
   、α−アミラーゼを添加せずにまたは、プルラナーゼ、
   イソアミラーゼもしくはβ−アミラーゼ型の分枝切断酵
   素を添加して行つた場合に、乾燥物質ベースで少なくと
   も約９７重量％のグルコースを含む可溶性グルコース・
   シロツプ固体にまで実質的に完全に加水分解し； ｂ）この酵素製剤はカルボキシメチルセルロースによつ
   て、第一非吸着性分画と第二吸着性蛋白質分画に分離可
   能であり、該第一非吸着性分画がグルコアミラーゼ強化
   活性を含み、該第二吸着性分画が約８．０またはそれ以
   上の等電点を有するグルコアミラーゼ酵素活性 （ＥＣ　３．２．１．３）を含む、 ことを特徴とする酵素製剤。 ２）フミコーラ属の菌株である真菌から誘導される特許
   請求の範囲第１項記載の酵素製剤。 ３）フミコーラ・グリセー変異体サーモイデアの菌株で
   ある真菌から誘導される特許請求の範囲第１項記載の酵
   素製剤。 ４）菌が、ＡＴＣＣ１６４５３、ＮＲＲＬ１５２１９、
   ＮＲＲＬ１５２２０、ＮＲＲＬ１５２２１、ＮＲＲＬ１
   ５２２２、ＮＲＲＬ１５２２３、ＮＲＲＬ１５２２４及
   びＮＲＲＬ１５２２５ならびにこれらから人工的に誘導
   された、遺伝学的に変化した菌株から成る群から選択し
   たフミコーラ・グリセー変異体サーモイデアの菌株であ
   る特許請求の範囲第１項記載の酵素製剤。 ５）真菌類から粒状澱粉加水分解酵素製剤を製造する方
   法において、 ａ）１）約１５重量％の固体澱粉濃度で水中に懸濁した
   澱粉粒の加水分解を触媒して、こ の加水分解をｐＨ約５．０〜約７．０及び温度約５５℃
   においてα−アミラーゼを添加せず または、プルラナーゼ、イソアミラーゼも しくはβ−アミラーゼ型の分枝切断酵素を 添加せずに行つた場合に、乾燥物質ベース で少なくとも約９７重量％のグルコースを 含む可溶性グルコースシロツプ固体にまで 実質的に完全に加水分解する、及び ２）カルボキシメチルセルロースによつて 第一非吸着性分画と第二吸着性蛋白質分画 に分離可能であり、該第一非吸着性分画が グルコアミラーゼ強化活性を含み、該第二 吸着性分画が約８．０またはそれ以上の等電点を有する
   グルコアミラーゼ酵素活性 （ＥＣ　３．２．１．３）を含む ことを特徴とする酵素製剤を分泌する真菌の胞子を発芽
   させ； ｂ）栄養培地中で該発芽した真菌によつて炭水化物基質
   を発酵させて、該分泌された酵素を含むブイヨンを製造
   する、及び ｃ）該発酵真菌から該酵素製剤を分離して澱粉粒加水分
   解酵素製剤を得ることから成る方法。 ６）該炭水化物基質が粗澱粉を含み、該真菌に高力価の
   酵素製剤を分泌させる特許請求の範囲第５項記載の方法
   。 ７）該培地がビタミンと蛋白質を供給する栄養源を含む
   特許請求の範囲第５項記載の方法。 ８）該栄養源がコーン浸せき液である特許請求の範囲第
   ７項記載の方法。 ９）該培地が該真菌の増殖を促進させる窒素源と無機塩
   を含む特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０）該真菌がフミコーラ属の菌株である特許請求の範
   囲第５項記載の方法。 １１）該菌がフミコーラ・グリシー変異体サーモイデア
   の菌株である特許請求の範囲第５項記載の方法。 １２）該真菌を、ＡＴＣＣ１６４５３、ＮＲＲＬ１５２
   １９、ＮＲＲＬ１５２２０、ＮＲＲＬ１５２２１、ＮＲ
   ＲＬ１５２２２、ＮＲＲＬ１５２２３、ＮＲＲＬ１５２
   ２４及びＮＲＲＬ１５２２５ならびにこれらから人工的
   に誘導された、遺伝学的に変化させた菌株から成る群か
   ら選択する特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３）ａ）１）約１５重量％の固体澱粉濃度で水中に懸
   濁した粒状澱粉の加水分解を触媒して、この加水分解を
   ｐＨ約５．０〜約７．０及び温度約５５℃においてα−
   アミラーゼを添加せずまたは、プルラナーゼ、イソアミ
   ラーゼもしくはβ−アミラーゼ型の分枝切断酵素を添加
   して行つた場合に、乾燥物質ベースで少なくとも約９７
   重量％のグルコースを含む可溶性グルコースシロツプ固
   体にまで実質的に完全に加水分解する、及び ２）カルボキシメチルセルロースによつ て第一非吸着性分画と第二吸着性蛋白質分画に分離可能
   であり、該第一非吸着性分画がグルコアミラーゼ強化活
   性を含み、該第二吸着性分画が約８．０またはそれ以上
   の等電点を有するグルコアミラーゼ酵素活性（ＥＣ　３
   ．２．１．３）を含む ことを特徴とする酵素製剤を得て、 ｂ）該酵素製剤を水中の粒状澱粉スラリーに加えて同ス
   ラリーをグルコースに加水分解することから成る、粒状
   澱粉からグルコースを製造する方法。 １４）該酵素製剤を水中の該粒状澱粉に対して、澱粉１
   ｇにつき約２５〜約３００の粗澱粉加水分解単位を供給
   するように加える特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５）該酵素製剤を水中の該粒状菌澱に対して、澱粉１
   ｇにつき約５０〜約１００の粗澱粉加水分解単位を供給
   するように加える特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １６）該スラリーが約１５〜約６０重量％の粒状澱粉を
   含む特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １７）標準培養方法によつて培養した場合に、本文に説
   明するような標準分析方法Ｎｏ．１によつて分析して１
   ２０単位／ｍｌ以上のＲＳＨ活性を有する酵素製剤を含
   むブイヨンを生成するように人工的に変化させた菌にお
   いて、該酵素製剤が ａ）約１５重量％の固体澱粉濃度で水中に懸濁した粒状
   澱粉粒の加水分解を触媒して、この加水分解をｐＨ約５
   ．０〜約７．０及び温度約５５℃において、α−アミラ
   ーゼを添加せずまたは、プルラナーゼ、イソアミラーゼ
   もしくはβ−アミラーゼ型の分枝切断酵素を添加して行
   つた場合に、乾燥物質ベースで少なくとも約９７重量％
   のグルコースを含む可溶性グルコースシロツプ固体にま
   で実質的に完全に加水分解し、及びｂ）カルボキシメチ
   ルセルロースによつて第一非吸着性分画と第二吸着性蛋
   白質分画とに分離可能であり、該第一非吸着性分画がグ
   ルコアミラーゼ活性を含み、該第二吸着性分画が約８．
   ０またはそれ以上の等電点を有するグルコアミラーゼ活
   性（ＥＣ３．２．１．３）を含む ことを特徴とする真菌。 １８）フミコーラ属の菌株である特許請求の範囲第１７
   項記載の真菌。 １９）フミコーラ・グリセー変異サーモイデアの菌株で
   ある特許請求の範囲第１７項記載の真菌。 ２０）ＭＲＲＬ１５２１９、ＮＲＲＬ１５２２０及びＮ
   ＲＲＬ１５２２２から成る群から選択する特許請求の範
   囲第１７項記載の真菌。 ２１）３７℃以上の温度において増殖する特許請求の範
   囲第１７項記載の真菌。 ２２）約８．０以上の等電点を有し、カルボキシメチル
   セルロースに吸着されることができ、約５．０〜約７．
   ０ｐＨにおいて最大活性を示すことを特徴とするグルコ
   アミラーゼ酵素分画。 ２３）ａ）約１５重量％の固体澱粉濃度で水中に懸濁し
   た粒状澱粉の加水分解を触媒して、この加水分解をｐＨ
   約５．０〜約７．０及び温度約５５℃においてα−アミ
   ラーゼを添加せずまたは、プルラナーゼ、イソアミラー
   ゼもしくはβ−アミラーゼ型の分枝切断酵素を添加して
   行つた場合に、乾燥物質ベースで少なくとも約９７重量
   ％のグルコースを含む可溶性グルコースシロツプ固体に
   まで実質的に完全に加水分解し、または ｂ）グルコアミラーゼ酵素分画の他に、カルボキシイチ
   ルセルロースに吸着せずに、グルコアミラーゼ相乗活性
   を有する分画を含む ことを特徴とする酵素製剤のカルボキシメチルセルロー
   ス吸着性分画である、特許請求の範囲第２２項記載のグ
   ルコアミラーゼ酵素分画。 ２４）真菌から誘導される特許請求の範囲第２２項記載
   のグルコアミラーゼ酵素分画。 ２５）フミコーラ属の菌株である真菌から誘導される特
   許請求の範囲第２４項記載のグルコアミラーゼ酵素分画
   。 ２６）フミコーラ・グリシー変種サーモイデアの菌株で
   ある真菌から誘導される特許請求の範囲第２４項記載の
   グルコアミラーゼ酵素分画。 ２７）真菌が、ＡＴＣＣ１６４５３、ＮＲＲＬ１５２１
   ９、ＮＲＲＬ１５２２０、ＮＲＲＬ１５２２１、ＮＲＲ
   Ｌ１５２２２、ＮＲＲＬ１５２２３、ＮＲＲＬ１５２２
   ４及びＮＲＲＬ１５２２５ならびにこれらから人工的に
   誘導される遺伝学的に変化した菌株から成る群から選択
   したフミコーラ・グリシー変種サーモイデアの菌株であ
   る、特許請求の範囲第２４項記載のグルコアミラーゼ酵
   素分画。 ２８）グルコアミラーゼ酵素（３．２．１．３）ととも
   に約１５重量％の固体澱粉濃度で水中に懸濁した粒状澱
   粉の加水分解を触媒して、この加水分解をｐＨ約５．０
   〜約７．０及び温度約５５℃においてα−アミラーゼを
   添加せず、または、プルラナーゼ、イソアミラーゼもし
   くはβ−アミラーゼ型の分枝切断酵素を添加して行つた
   場合に、乾燥物質ベースで少なくとも約９７重量％のグ
   ルコースを含む可溶性グルコースシロツプ固体にまで実
   質的に完全に加水分解する、強化酵素分画。 ２９）カルボキシメチルセルロースによつて吸着されな
   い酵素製剤分画であり、該酵素製剤がカルボキシメチル
   セルロースによつて吸着されるグルコアミラーゼ分画を
   も含む特許請求の範囲第２８項記載の強化酵素分画。 ３０）真菌から誘導される特許請求の範囲第２８項記載
   の強化酵素分画。 ３１）フミコーラ属の菌株である真菌から誘導される特
   許請求の範囲第３０項記載の強化酵素分画。 ３２）フミコーラ・グリシー変種サーモイデアの菌株で
   ある真菌から誘導される特許請求の範囲第３０項記載の
   強化酵素分画。 ３３）真菌が、ＡＴＣＣ１６４５３、ＮＲＲＬ１５２１
   ９、ＮＲＲＬ１５２２０、ＮＲＲＬ１５２２１、ＮＲＲ
   Ｌ１５２２２、ＮＲＲＬ１５２２３、ＮＲＲＬ１５２２
   ４及びＮＲＲＬ１５２２５ならびにこれらから人工的に
   誘導される、遺伝学的に変化した菌株から成る群から選
   択したフミコーラ・グリシー変種サーモイデアの菌株で
   ある、特許請求の範囲第３０項記載の強化酵素分画。 ３４）希薄な澱粉加水分解物からグルコースを製造する
   方法において ａ）粒状澱粉の実質的に完全なグルコースまでの加水分
   解を触媒する酵素製剤であつて、１）約１５重量％の固
   体澱粉濃度で水中に懸濁した粒状澱粉の加水分解を触媒
   して、この加水分解をｐＨ約５．０〜約７．０及び温度
   約５５℃において、α−アミラーゼを添加せずに、また
   は、プルラナーゼ、イソアミラーゼもしくはβ−アミラ
   ーゼ型の分枝切断酵素を添加して行つた場合に、乾燥物
   質ベースで少なくとも約９７重量％のグルコースを含む
   可溶性グルコースシロツプ固体にまで実質的に完全に加
   水分解すること及び２）酵素製剤分画がカルボキシメチ
   ルセルロースに吸着されず、また約８．０以上の等電点
   を有するグルコアミラーゼ酵素（ＥＣ３．２．１．３）
   を含むことを特徴とする酵素製剤の部分であることを特
   徴とする酵素製剤を得る； ｂ）該酵素製剤を希薄な澱粉加水分解液に加えて、同澱
   粉をグルコースに加水分解する ことから成る方法。 ３５）真菌から誘導される特許請求の範囲第３４項記載
   の酵素製剤分画。 ３６）フミコーラ属の菌株である真菌から誘導される特
   許請求の範囲第３５項記載の酵素製剤分画。 ３７）フミコーラ・グリシー変異サーモイデアの菌株で
   ある真菌から誘導される特許請求の範囲第３５項記載の
   酵素製剤分画。 ３８）真菌が、ＡＴＣＣ１６４５３、ＮＲＲＬ１５２１
   ９、ＮＲＲＬ１５２２０、ＮＲＲＬ１５２２１、ＮＲＲ
   Ｌ１５２２２、ＮＲＲＬ１５２２３、ＮＲＲＬ１５２２
   ４及びＮＲＲＬ１５２２５ならびにこれから人工的に誘
   導される遺伝学的に変化した菌株から成る群から選択し
   たフミコーラ・グリシー変異サーモイデアの菌株である
   特許請求の範囲第３５項記載の酵素製剤分画。 ３９）希薄な澱粉加水分解液が約１〜２５のＤ．Ｅ．、
   約５〜７のｐＨ、乾燥物質ベースで約１５〜６０％の固
   体澱粉含量を有し、澱粉加水分解物の加水分解が約５５
   ℃以上の温度で生ずる特許請求の範囲第３４項記載の方
   法。 ４０）希薄な澱粉加水分解液が約５〜１５のＤ．Ｅ．を
   有する特許請求の範囲第３９項記載の方法。