JPS6143986A - 酵母ウリカ−ゼの生産方法 - Google Patents
酵母ウリカ−ゼの生産方法Info
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- JPS6143986A JPS6143986A JP59166022A JP16602284A JPS6143986A JP S6143986 A JPS6143986 A JP S6143986A JP 59166022 A JP59166022 A JP 59166022A JP 16602284 A JP16602284 A JP 16602284A JP S6143986 A JPS6143986 A JP S6143986A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はカンジダ属酵母番ζよるウリカーゼの生産方法
に関し、更に詳細には該酵素を酵母菌体外に生産させる
方法に関する。
に関し、更に詳細には該酵素を酵母菌体外に生産させる
方法に関する。
従来の技術
ウリカーゼは、尿酸をアラントインと過酸化水素に酸化
する酵素で、種々の動物組織中や微生物組織中に広く存
在する。現在、ウリカーゼは人体内の尿酸蓄積に起因す
る種々の疾患の診断のため、血液または尿中番ζ存在す
る尿酸の測定用酵素として使用されている。種々の抽出
起源からのウリカーゼの中で、カンジダ・ウテイリス（
Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）の生産する酵素ウリカ
ーゼは尿酸に対するｈ値が最も小さく、水に対する溶解
性が大きい理由から実用性が最も高いものである。
する酵素で、種々の動物組織中や微生物組織中に広く存
在する。現在、ウリカーゼは人体内の尿酸蓄積に起因す
る種々の疾患の診断のため、血液または尿中番ζ存在す
る尿酸の測定用酵素として使用されている。種々の抽出
起源からのウリカーゼの中で、カンジダ・ウテイリス（
Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）の生産する酵素ウリカ
ーゼは尿酸に対するｈ値が最も小さく、水に対する溶解
性が大きい理由から実用性が最も高いものである。
従来、カンジダ属酵母のウリカーゼの生産には三段法が
使用されてきた。すなわち、酵素生産には菌体の培養集
菌、酵素の誘導的生成、そして菌体内酵素の分離抽出の
三工程を要し、非常に煩雑で時間を要し、労働集約的な
作業を必要とするものであった。
使用されてきた。すなわち、酵素生産には菌体の培養集
菌、酵素の誘導的生成、そして菌体内酵素の分離抽出の
三工程を要し、非常に煩雑で時間を要し、労働集約的な
作業を必要とするものであった。
この状況の解決を目指すものとしては、バクテリアを用
いて酵素を菌体外生産する方法〔特公昭４９−４３８５
号、特公昭４８−４０７５６号、アナリティカル・バイ
オケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｏａｌ Ｂｉｏｏｂｔ
＋ａｉｓｔｒｙ ）第３８巻、第６５頁（１９７０年）
」がある。しかしながら、前述した如く、カンジダ属酵
母のウリカーゼが最小のら値（５，９Ｘ１０−′輩）を
有するところからカンジダ・ウテイリスの酵素ウリカー
ゼが血中または尿中の尿酸の分析に最も多く使用されて
いる。
いて酵素を菌体外生産する方法〔特公昭４９−４３８５
号、特公昭４８−４０７５６号、アナリティカル・バイ
オケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｏａｌ Ｂｉｏｏｂｔ
＋ａｉｓｔｒｙ ）第３８巻、第６５頁（１９７０年）
」がある。しかしながら、前述した如く、カンジダ属酵
母のウリカーゼが最小のら値（５，９Ｘ１０−′輩）を
有するところからカンジダ・ウテイリスの酵素ウリカー
ゼが血中または尿中の尿酸の分析に最も多く使用されて
いる。
ウリカーゼのカンジダ・ウテイリスからの上述した分離
抽出操作は、海砂と共存させての磨砕、超音波、浸透圧
ショック（特公昭４３−２４４５１号）、凍結融解（特
公昭４２−５１９２号）、有機溶媒処理（特公昭５３−
１４６３６号）等の方法が知られている。しかしながら
、これらの方法による抽出液中にはウリカーゼ以外の夾
雑たんばくが多く、精製工程を煩雑にする原因となって
いる。
抽出操作は、海砂と共存させての磨砕、超音波、浸透圧
ショック（特公昭４３−２４４５１号）、凍結融解（特
公昭４２−５１９２号）、有機溶媒処理（特公昭５３−
１４６３６号）等の方法が知られている。しかしながら
、これらの方法による抽出液中にはウリカーゼ以外の夾
雑たんばくが多く、精製工程を煩雑にする原因となって
いる。
発明が解決しようとする問題点
本発明の目的は上記問題点にかんがみて、カンジダ属酵
母の生産するウリカーゼの工業的生産に適した迅速にし
て容易な生産方法の開発にある。
母の生産するウリカーゼの工業的生産に適した迅速にし
て容易な生産方法の開発にある。
問題点を解決するための手段
本発明を概説すれば、本発明は酵母によるウリカーゼの
生産方法に関し、ウリカーゼ生産能を有するカンジダ属
酵母によるウリカーゼの生産において、培養液中または
培養して得た菌体の懸濁液中に還元剤と非イオン系界面
活性剤またはカチオン系界面活性剤とを添加し、酵母菌
体外へ該酵素を蓄積させることを特徴とする。
生産方法に関し、ウリカーゼ生産能を有するカンジダ属
酵母によるウリカーゼの生産において、培養液中または
培養して得た菌体の懸濁液中に還元剤と非イオン系界面
活性剤またはカチオン系界面活性剤とを添加し、酵母菌
体外へ該酵素を蓄積させることを特徴とする。
本発明の上記方法によれば菌体外へ蓄積されたウリカー
ゼは菌体を遠心分離することで簡単に粗酵素液を得るこ
とが出来る。この粗酵素液は界面活性剤を透析で除いた
後、硫安塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー等の通常の精製手段を用いて精製することが出来る。
ゼは菌体を遠心分離することで簡単に粗酵素液を得るこ
とが出来る。この粗酵素液は界面活性剤を透析で除いた
後、硫安塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー等の通常の精製手段を用いて精製することが出来る。
本発明で用いるカンジダ属酵母はウリカーゼ生産能を有
する菌株であればよく、例えばカンジダ・ウテイリＸ
（ＩＦＯ−０３９８、ＩＦＯ−０６２６、ｘｙｏ −０
６３９）を使用できる。本発明方法を実施するに当って
は例えば、グルコース、コーン・ステイープ・リカー、
尿素、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硫酸マ
グネシウム、塩化カリウムを含む培地（ｐＨ６，２）で
上記菌株を用い２７℃、２２時間培養し、その培養液か
ら酵母菌体を遠心分離によって集め、よく水洗して培地
成分を除去する。
する菌株であればよく、例えばカンジダ・ウテイリＸ
（ＩＦＯ−０３９８、ＩＦＯ−０６２６、ｘｙｏ −０
６３９）を使用できる。本発明方法を実施するに当って
は例えば、グルコース、コーン・ステイープ・リカー、
尿素、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硫酸マ
グネシウム、塩化カリウムを含む培地（ｐＨ６，２）で
上記菌株を用い２７℃、２２時間培養し、その培養液か
ら酵母菌体を遠心分離によって集め、よく水洗して培地
成分を除去する。
次いで、尿酸を唯一の窒素源とする。例えば、尿酸、グ
ルコース、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグ
ネシウムを含む培地（ｐＨ７，２）にその菌体を懸濁し
て、２５℃で３時間好気的に振とう培養する。
ルコース、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグ
ネシウムを含む培地（ｐＨ７，２）にその菌体を懸濁し
て、２５℃で３時間好気的に振とう培養する。
この時点で、菌体内ウリカーゼの蓄積量は最大となる。
活性値は、培養液当たりに換算すると１ｄ当たり０．４
単位〔１単位は硼酸緩衝液（ｐＨ８，５）中で２５℃Ｃ
１分間に１声モルの尿酸をアラントインに変化さす酵素
量〕である。
単位〔１単位は硼酸緩衝液（ｐＨ８，５）中で２５℃Ｃ
１分間に１声モルの尿酸をアラントインに変化さす酵素
量〕である。
次いで培養液のｐＨを中性からアルカリ性に調整したの
ち、非イオン系またはカチオン系界面活性剤と還元剤を
添加して更に好気的振とうを続けることによりウリカー
ゼは培養液中に溶出されてくる。
ち、非イオン系またはカチオン系界面活性剤と還元剤を
添加して更に好気的振とうを続けることによりウリカー
ゼは培養液中に溶出されてくる。
本発明で用いる界面活性剤としては非イオン系界面剤お
よびカチオン系界面活性剤があり、たとえば非イオン系
界面活性剤としてはトライトンＮ−１０１、トライトン
Ｘ−１００（ローム・アンド・ハース社製）、カチオン
系界面活性剤としては塩化ラウリルピリジニウム、塩化
セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウ
ムおよび塩化ステアリルトリメチルアンモニウムがあげ
られる０添加量は酵母菌体濃度等処理条件により異なる
が、通常０．０１〜５％（トライトンの場合ｖ／ｖ 、
その他はＷ／マ）、好ましくは０．０２〜１％が使用さ
れる。また還元剤としては、たとえばβ−メルカプトエ
タノール、システィン、ハイドロサルファイド、亜硫酸
ナトリウムおよび硫酸鉄があげられる。添加量は酵母菌
体量等処理条件により異なるが、通常ｏ、ｏｏｓ〜５憾
（β−メルカプトエタノールの場合ｖ／ｖ 、その他は
＊／ｖ ） 、好ましくは０．０１〜１％が使用される
。
よびカチオン系界面活性剤があり、たとえば非イオン系
界面活性剤としてはトライトンＮ−１０１、トライトン
Ｘ−１００（ローム・アンド・ハース社製）、カチオン
系界面活性剤としては塩化ラウリルピリジニウム、塩化
セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウ
ムおよび塩化ステアリルトリメチルアンモニウムがあげ
られる０添加量は酵母菌体濃度等処理条件により異なる
が、通常０．０１〜５％（トライトンの場合ｖ／ｖ 、
その他はＷ／マ）、好ましくは０．０２〜１％が使用さ
れる。また還元剤としては、たとえばβ−メルカプトエ
タノール、システィン、ハイドロサルファイド、亜硫酸
ナトリウムおよび硫酸鉄があげられる。添加量は酵母菌
体量等処理条件により異なるが、通常ｏ、ｏｏｓ〜５憾
（β−メルカプトエタノールの場合ｖ／ｖ 、その他は
＊／ｖ ） 、好ましくは０．０１〜１％が使用される
。
例えば、詞導培養液に途中で非イオン系界面活性剤トラ
イトンＮ−１０１（ローム・アントΦハース社製）を０
．１ ％ （ｖ／マ）量と、それと共に種々の還元剤を
０．１襲量添加した場合の実験結果を表−１に示したＯ 表−１から明らかなごとくトライトンＮ−１０１とβ−
メルカプトエタノールを添加した場合が最も効果的で添
加後２．５時間で培養液１ｄ当たりの活性は０．４単位
に達した。
イトンＮ−１０１（ローム・アントΦハース社製）を０
．１ ％ （ｖ／マ）量と、それと共に種々の還元剤を
０．１襲量添加した場合の実験結果を表−１に示したＯ 表−１から明らかなごとくトライトンＮ−１０１とβ−
メルカプトエタノールを添加した場合が最も効果的で添
加後２．５時間で培養液１ｄ当たりの活性は０．４単位
に達した。
最も効果の強かったβ−メルカプトエタノールについて
、添加量を変えて実験を行なった（表−２）。表−２よ
り明らかな如く〜０．０５ ％（マ／ｖ ）以上の添加
が効果的である〇β−メルカプトエタノールを０，１％
（ｖ／ｖ ）添加するとともに種々の界面活性剤を０．
１％添加した場合の結果を表−３＃こ示した。
、添加量を変えて実験を行なった（表−２）。表−２よ
り明らかな如く〜０．０５ ％（マ／ｖ ）以上の添加
が効果的である〇β−メルカプトエタノールを０，１％
（ｖ／ｖ ）添加するとともに種々の界面活性剤を０．
１％添加した場合の結果を表−３＃こ示した。
非イオン系界面活性剤では、トライトンＮ−１０１、）
ライドンｘ−ｉｏｏが効果的である。
ライドンｘ−ｉｏｏが効果的である。
カチオン系界面活性剤では、塩化ラウリルピリジニウム
、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアン
モニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウムが有
効である。アニオン系界面活性剤は調べた範囲では効果
がみられなかった。
、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアン
モニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウムが有
効である。アニオン系界面活性剤は調べた範囲では効果
がみられなかった。
効果の高かったトライトンＮ−１０１について、添加濃
度の影響を調べたのが表−４である。
度の影響を調べたのが表−４である。
トライトンＮ−１０１は０．１ ％ （ｖ／ｖ ）以上
の添加で非常に効果を示した。ウリカーゼ生産に対する
培養液ｐＨの影響を調べた（表−５）。
の添加で非常に効果を示した。ウリカーゼ生産に対する
培養液ｐＨの影響を調べた（表−５）。
ｐＨ１１の場合にウリカーゼ生産量が低いのはウリカー
ゼの安定ｐＨＩ城ＣｐＨ７〜１０）からはずれることに
因ると推定される。
ゼの安定ｐＨＩ城ＣｐＨ７〜１０）からはずれることに
因ると推定される。
誘導培養して得た菌体を緩衝液中に懸濁させ、これに還
元剤および界面活性剤を添加した場合も同様の効果を奏
する。
元剤および界面活性剤を添加した場合も同様の効果を奏
する。
実施例
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。
明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例 １
酵母カンジダ・ウティリスＩＦＯ−０３９８をグルコー
ス５％、コーン・ステイープ・リカー３哄ｌＲ素０．３
３％、リン酸二アンモニウム０、０２５％、硫酸アンモ
ニウム０．０２５％、硫酸マグネシウム０．１％、塩化
カリウム０．１−からなる培地（ｐＨ６，２）で２７℃
にて２２時間培養した。培養は５００ｄ三角フラスコに
培地１００−を入れて、回転振とう＊ （２２０ｒｐｍ
）で、好気条件下で行なった。培養終了後、菌体を遠心
分離によって集め、冷却した蒸留水で２回洗浄し、湿菌
体８ｆを得た。
ス５％、コーン・ステイープ・リカー３哄ｌＲ素０．３
３％、リン酸二アンモニウム０、０２５％、硫酸アンモ
ニウム０．０２５％、硫酸マグネシウム０．１％、塩化
カリウム０．１−からなる培地（ｐＨ６，２）で２７℃
にて２２時間培養した。培養は５００ｄ三角フラスコに
培地１００−を入れて、回転振とう＊ （２２０ｒｐｍ
）で、好気条件下で行なった。培養終了後、菌体を遠心
分離によって集め、冷却した蒸留水で２回洗浄し、湿菌
体８ｆを得た。
この洗浄菌体をグルコース５％、リン酸二ナトリウム０
．３％、塩化カリウム０．１哄、硫酸マグネシウム０．
０５％、尿酸０．０３−からなる培地１００ｄ（ｐＨ７
，２）に再度懸濁し、好気条件下で誘導培養を行なった
。
．３％、塩化カリウム０．１哄、硫酸マグネシウム０．
０５％、尿酸０．０３−からなる培地１００ｄ（ｐＨ７
，２）に再度懸濁し、好気条件下で誘導培養を行なった
。
２５℃にて３時間回転振とう機（１００ｒＰｍ）で培養
し、ついで培養液ｐＨを水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９
に調整したのち、β−メルカプトエタノールとトライト
ンＮ−１０１を共ζこ０．１−添加した。
し、ついで培養液ｐＨを水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９
に調整したのち、β−メルカプトエタノールとトライト
ンＮ−１０１を共ζこ０．１−添加した。
更に４時間、回転数を下げて振とうを続けるとウリカー
ゼは培地中に生産された。培養液１ｄ当たりのウリカー
ゼ活性は０．４単位であり、比活性は２８ Ｑｎｍの吸
光度当たり０．０６６単位であった。
ゼは培地中に生産された。培養液１ｄ当たりのウリカー
ゼ活性は０．４単位であり、比活性は２８ Ｑｎｍの吸
光度当たり０．０６６単位であった。
透析で界面活性剤を除いたのち、通常の硫安塩析、限外
濾過、イオン交換クロマトグラフィーによって、ウリカ
ーゼを精製した。活性回収率は５５−であり、比活性は
２８０ｎｍの吸光度当たり６単位であった。
濾過、イオン交換クロマトグラフィーによって、ウリカ
ーゼを精製した。活性回収率は５５−であり、比活性は
２８０ｎｍの吸光度当たり６単位であった。
得られたウリカーゼの酵素化学的性質（ｐＨ・熱安定性
、最適ｐＨ，最適温度）は従来の自己消化法で得られた
ウリカーゼと同じであった。
、最適ｐＨ，最適温度）は従来の自己消化法で得られた
ウリカーゼと同じであった。
実施例 ２
酵母カンジダ・ウテイリスＩＦＯ−０６２６を実施例１
と同一の培地２０ｔで３０を容ジャーファーメンタ−を
用いて培養した。２８℃で１ｙｖＭ、 ３００ ｒｐＨ
で１２時間培養後、集菌、洗浄し、ついで実施例１と同
一の誘導培地２０１で誘導培養を行なった０培養条件は
２５℃、ＩＶＶＭ、 ３００ ｒｐｍとした。なお、ジ
ャー培養の場合には発泡を抑えるため消泡剤としてにド
ア０（信越化学社製）を０．０５１添加した。
と同一の培地２０ｔで３０を容ジャーファーメンタ−を
用いて培養した。２８℃で１ｙｖＭ、 ３００ ｒｐＨ
で１２時間培養後、集菌、洗浄し、ついで実施例１と同
一の誘導培地２０１で誘導培養を行なった０培養条件は
２５℃、ＩＶＶＭ、 ３００ ｒｐｍとした。なお、ジ
ャー培養の場合には発泡を抑えるため消泡剤としてにド
ア０（信越化学社製）を０．０５１添加した。
誘導培養３時間の時点で培養液のｐＨを９．０ ｌこ調
整し、更に、β−メルカプトエタノールとトライトンＮ
−１０１を共に０．１％添加した。
整し、更に、β−メルカプトエタノールとトライトンＮ
−１０１を共に０．１％添加した。
更に、通気を止め、２５℃、２０ Ｑ ｒｐｗｒで３時
間かくはんを続けるとウリカーゼが培地中に生産された
。
間かくはんを続けるとウリカーゼが培地中に生産された
。
培養液１ｄ当たりのウリカーゼ活性は０．５単位であっ
た。
た。
限外を遍機によって界面活性剤を除いたのちウリカーゼ
は通常の硫安塩析、イオン交換クロ・７トグラフイーｌ
ζよって精製した０活性回収率は５０％であり、比活性
は２８０ｎｍの吸光度当たり５単位であった。
は通常の硫安塩析、イオン交換クロ・７トグラフイーｌ
ζよって精製した０活性回収率は５０％であり、比活性
は２８０ｎｍの吸光度当たり５単位であった。
発明の効果
以上、詳細に説明したとおり、本発明によってカンジダ
拳つティリスのウリカーゼの迅速−容易な生産方法を確
立することができた０本発明は従来法と比較して工業的
に優れたウリカーゼの生産技術を開発した点で効果を有
する。
拳つティリスのウリカーゼの迅速−容易な生産方法を確
立することができた０本発明は従来法と比較して工業的
に優れたウリカーゼの生産技術を開発した点で効果を有
する。
Claims (1)
- １、ウリカーゼ生産能を有するカンジダ属酵母によるウ
リカーゼの生産において、培養液中または培養して得た
菌体の懸濁液中に還元剤と非イオン系界面活性剤または
カチオン系界面活性剤とを添加し、酵母菌体外へ該酵素
を蓄積させることを特徴とする酵母ウリカーゼの生産方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59166022A JPS6143986A (ja) | 1984-08-08 | 1984-08-08 | 酵母ウリカ−ゼの生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59166022A JPS6143986A (ja) | 1984-08-08 | 1984-08-08 | 酵母ウリカ−ゼの生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6143986A true JPS6143986A (ja) | 1986-03-03 |
| JPH0474999B2 JPH0474999B2 (ja) | 1992-11-27 |
Family
ID=15823470
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59166022A Granted JPS6143986A (ja) | 1984-08-08 | 1984-08-08 | 酵母ウリカ−ゼの生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6143986A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013132270A (ja) * | 2011-12-27 | 2013-07-08 | Meiji Co Ltd | 酵母及びカビの検出具 |
| WO2018159655A1 (ja) * | 2017-03-01 | 2018-09-07 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
| JP2018143236A (ja) * | 2017-03-01 | 2018-09-20 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
| JP2018143237A (ja) * | 2017-03-01 | 2018-09-20 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
| JP2019170202A (ja) * | 2018-03-27 | 2019-10-10 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
-
1984
- 1984-08-08 JP JP59166022A patent/JPS6143986A/ja active Granted
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013132270A (ja) * | 2011-12-27 | 2013-07-08 | Meiji Co Ltd | 酵母及びカビの検出具 |
| WO2018159655A1 (ja) * | 2017-03-01 | 2018-09-07 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
| JP2018143236A (ja) * | 2017-03-01 | 2018-09-20 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
| JP2018143237A (ja) * | 2017-03-01 | 2018-09-20 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
| CN110352248A (zh) * | 2017-03-01 | 2019-10-18 | 三洋化成工业株式会社 | 有用物质的生产方法 |
| JPWO2018159655A1 (ja) * | 2017-03-01 | 2019-12-19 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
| EP3591064A4 (en) * | 2017-03-01 | 2020-12-23 | Sanyo Chemical Industries, Ltd. | PROCESS FOR MANUFACTURING USEFUL MATERIAL |
| JP2019170202A (ja) * | 2018-03-27 | 2019-10-10 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0474999B2 (ja) | 1992-11-27 |
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