JPS61280269A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規微生物に関し、更に詳しくはエルビニア
属に属する新菌種に関する。

本発明に係る微生物は、鹿児島県鹿児島市において栽培
されているウツボカズラ属（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ）に属
する植物の有する捕虫袋中の水液から分離した微生物で
あり、以下に述べる通り、エルビニア属に属する新菌種
である。本発明者らは、この菌種をエルビニアＮｅｐ５
と命名した。

以下に本発明の新菌種の代表例であるエルビニアＮｅｐ
５ＫＳ−５の菌学的性質を示す。

Ａ、形態的性状 （１）細胞の形：桿菌 （２）細胞の大きさ　：　（０，５−１，０）ｘ（１，
０−５，、５）μ次 （３）細胞の多形成の有無：なし く４）運動性：あり （５）鞭毛の着生状態二層鞭毛 （６）胞子の有無：なし Ｂ、各種培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培地：コロニーの生育状態は適度、
形状は円形、***は半レンズ形、周縁は金縁、色状は淡
黄色 （２）肉汁寒天斜面培地：生育状態は適度、表面の状態
は円滑、色状は淡黄色、光沢は輝光、形状は平滑 （３）肉汁液体：湿間の程度は適度、液面の生育はなし
、沈査はあり。

（４）肉汁ゼラチン穿刺：生育する、液化する（５）リ
ドマスミルク　：ペプトン化、脱色Ｃ１生理的性質 （１）抗酸性：なし く２）ダラム染色性：陰性 （３）硝酸塩の還元二十（肉汁） （４）脱窒反応：→− （５）ＭＲテスト　ニー （６）Ｖ　Ｐテスト：＋ （７）インドールの生成：　モ （８）硫化水素の生成：＋ （９）デンプンの加水分解：＋ （１０）クエン酸の利用：　Ｋｏｓｅｒは一１Ｃｈｒｉ
ｓｔｅｎｓｅｎは＋ （１１）無機窒素源の利用：アンモニウム塩は＋、硝酸
塩は− （１２）色素の生成（拡散性）：あり（薄茶色、キング
Ｂ培地） （１３）カタラーゼ：＋ （１４）ウレアーゼエ　− （１５）オキシダーゼニー （１６）生育できるｐｌ（範囲：５〜９（至適ｐＨ７，
５）（１７）生育できる温度範囲、１０〜４０℃（至適
温度３２°Ｃ） （１８）酸素に対する態度二連性嫌気性（１９）ＯＦテ
スト　：発酵（グルコース）（２０）糖類からの酸及び
ガスの生成 培養温度　　　　　３０８Ｃ３７℃ 酸ガス　酸ガス １、Ｌ−アラビノース　　　　＋　＋＋−２Ｄ−キンロ
ース　　　　　−　−−−３、Ｄ−グルコース　　　　
　＋　＋＋−４Ｄ〜ラマンース　　　　　＋　＋＋−５
、Ｄ〜フラクトース　　　　＋　＋＋−６、Ｄ−ガラク
トース　　　　＋　千十−７、マルトース　　　　　　
　＋　＋　　モ　−８、サッカロース　　　　　　＋　
＋＋−９、ラクトース　　　　　　　−　−十　−１０
、トレハロース　　　　　　＋　＋＋−１１、Ｄ〜ソル
ビット　　　　　−−−−１２、　Ｄ−マンニット　　
　　　＋　＋＋−１３、イノジット　　　　　　　−　
−−−１４、グリセリン　　　　　　　＋　＋＋−１５
、デンプン　　　　　　　　＋　＋＋−１６゜Ｄ−リボ
ース　　　　　　　＋　＋＋−１７、Ｌ−ラムノース　
　　　　−−−−１８、サリシン　　　　　　　　千　
十−−１９、α−メチルグルコシド　　＋　＋＋−２０
、ラフィノース　　　　　　−　−一＝２１、ズルシッ
ト　　　　　　　−一一一２２、メレジトース　　　　
　　−−一−２３、メリビオース　　　　　　−−ｍ−
２４、アトニット　　　　　　　　　−一一一２５　　
セロビオース　　　　　　−−士　＝２６　　デキスト
リン　　　　　　＋　千　　十　±２７、エスクリン　
　　　　　　＋　十　　±　−２８、β−メチルゲルコ
ンド　　＋　＋十−（２１）カゼインの分解：＋ （２２）Ｄ　Ｎ　Ａの分解・＋ （２３）グルコン酸の酸化：＋ （２４）　Ｎ　ａ　ＣＣ（５％）の耐性：＋（２５）ア
ルギニンの分解二十 （２６）リジンの脱炭酸反応ニー （２７）オルニチンの脱炭酸反応ニー （２８）フェニルアラニンの脱アミノ反応ニー（２９）
シアン化カリウムの耐性ニー （３０）ペクチナーゼニー （３１）リパーゼニー （３２）栄養要求性：無 （３３）炭素化合物の利用 １、酢酸　　　　　　：＋ ２、フマル酸　　　　　°＋ ３、グルコン酸　　　　：＋ ４、リンゴ酸　　　　：＋ ５　コハク酸　　　　　二　十 ６、安息香酸　　　　ニー ７、シュウ酸　　　　　ニー ８、プロピオン酸　　　：　− ９、ギ酸　　　　　　　ニー １０、マロン酸　　　　　ニー １１、酒石酸　　　　　ニー ＋２．乳酸　　　　　　：＋ １３、ガラクチュロン酸ニー １４、澱粉　　　　　　：＋ １５、デキストリン　　　：＋ （３４）アスパラギンの利用（単一炭素および窒素源）
：＋ （３５）グルコン酸の酸化：＋ （３６）ショ糖より還元性物質の生成：＋以上の諸性質
をバージ−のマニュアル・オブ・デターミナティブ・バ
クテリオロジー第８版（１９７４年）により検索したと
ころ、本菌は、通性嫌気性、オキシダーゼ陰性の、周鞭
毛を有するグラム陰性桿菌で、３７℃ではグルコースか
らガスを生成しない事、およびフラクトース、グルコー
ス、ガラクトース、β−メチルグルコシド、サブ力ロー
スから酸を生成するが、アトニット、ズルシット、メレ
ジトースからは酸を生成しない事や、酢酸、フマル酸、
グルコン酸、リンゴ酸、コハク酸を炭素源として資化で
きるが、安息香酸、シュウ酸、プロピオン酸を炭素源と
して資化できない事から、エルビニア属に属するもので
ある。

また本菌は、デオキシリボ核酸を分解し、グルコン酸を
酸化し、硝酸塩を還元し、３６℃で成育できる事から、
エルビニア・ウレドボーラ（’Ｅｒｗｉｎｉａ　ｕｒｅ
ｄｏｖｏｒａ）に最も近いと考えられる。しかし、本菌
は、システィンから硫化水素を発生し、カゼインを加水
分解する点でエルビニア・ウレドボーラとは明確に異な
っているのが特徴である。更に本菌はアルギニンを分解
する点、ギ酸および酒石酸を資化しえない点、並びに生
育至適温度が３２℃である点においてもエルビニア・ウ
レドボーラと異なっている。

以上の事から、本発明者らは本菌をエルビニア属に属す
る新菌種と認め、エルビニアＮｅｐ５と命名、同定した
。

エルビニアＮｅｐ５の代表例の１っであるエルビニアＮ
ｅｐ５ＫＳ−５は、工業技術院微生物工業技術研究所に
受託番号微工研菌寄第８２６１号（ＦＥＲＭ−Ｐ８２６
１）として寄託されている。

エルビニア属に属する本発明の新規微生物は、これを培
養することによって培養液中に耐熱性プロテアーゼを産
生ずる。このプロテアーゼは高温でも活性を有する点に
特徴があり、食肉軟化剤、醸造用酵素剤、消炎酵素剤、
洗剤添加用酵素剤などに有用である。

本発明の微生物を培養するための培地としては、炭素源
、窒素源、無機物、その他の栄養物を適切に含有する培
地ならば１、合成培地および天然培地のいずれも使用す
ることができる。

炭素源としては、グルコース、可溶性澱粉、シュクロー
ス、デキストリン、コーンミールなどを使用することが
できる。窒素源としては、無機および有機アンモニウム
塩類あるいは他の窒素含有物質、たとえばペプトン、肉
汁エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、スキ
ムミルク、カゼイン、大豆粉、脱脂大豆粕などの蛋白性
有機物を使用することができる。

さらに、無機物として、燐酸二水素ナトリウム、燐酸−
水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫
酸第１鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウムおよび炭酸カ
ルシウムなどを使用することができる。ビタミンなどの
栄養源も適宜用いることができる。

培養は、常法に従って行えばよく、たとえば培地１）Ｈ
は５〜９とし、培地に菌を接種した後、１０〜４０℃で
好気的に培養すると、１〜５日間で著量の耐熱性プロテ
アーゼが生成、蓄積される。

培養終了後は、通常の分離精製手段による精製、硫酸ア
ンモニウムなどによる塩析、有機溶媒沈澱法、イオン交
換または吸着樹脂などを用いるクロマトグラフ法、蛋白
沈澱剤による沈澱法、等電点法、または電気透析などの
方法を適用して、精製することにより高純度のプロテア
ーゼを得ることができる。また、培養した菌体を培地か
ら単に分離して、菌体または培養液を粗酵素として用い
ることらできる。

プロテアーゼの定量は、ハンマースティン・カゼインを
基質として、カニフッ法「「酵素研究法」第２巻２３９
頁、朝倉書店（１９５６）参照］の変法で行い、１分間
に１μグチロジン相当量のトリクロル酢酸可溶性生成物
を与える酵素量をｌ単位と規定し、３０℃で３０分間反
応させた後、波長２７５ｎｍにおける吸光度から力価を
算出する。

次に本発明の微生物の純粋分離方法、該微生物の継代培
養による再現性について、実施例を挙げて詳述する。

実施例１ 鹿児島県鹿児島市において栽培を行ったウツボカズラの
一種（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ　ｓｐ、　）の捕虫袋中の水
液を１００倍に希釈し、その０　、１　ｍ１２を肉汁寒
天平板培地にコンラージ棒で均一に広げ、３７．５°Ｃ
で２４時間、次いで室温で２４時間培養した。

この培養によって発生したコロニーを白金耳で肉汁寒天
斜面培地に移し、３０℃で２日間培養した。

発生した菌の１白金耳を生理食塩水で１００００倍に希
釈し、その０　、１　ｍ（ｌを肉汁寒天平板培地にコン
ラージ棒で均一に広げ、３０℃で２日間培養し、発生し
た複数のコロニーが相互に相異しないことを肉眼および
顕微鏡的に確認した。

上記コロニーの内１０個のコロニーを各々肉汁寒天斜面
培地に接種し、２８℃で３日間培養し、１０本の斜面培
地上の菌が肉眼的および顕微鏡的に同じであることを確
認し、またこれら１０本の培養菌についての各培地上の
性状および生理学的性質が同一であること確認した。上
記各培地上の性状および生理学的性質は前記の通りであ
る。

上記試験の結果、１０本の培養菌はすべて自然界より純
粋に分離された単−菌であることが判る。

次いで上記のように純粋培養された肉汁寒天斜面培地上
の菌に、保護剤（スキムミルクｌＯ％およびグルタミン
酸ナトリウム１％の水溶液）を加え、肉汁寒天斜面培地
上で、細菌懸濁液を調製した。この細閑懸拘液を凍結乾
燥用アンプルに約１ｍｆｌずつ分注し、凍結乾燥を行っ
た。該凍結乾燥は、細菌懸濁液の入ったアンプルをドラ
イアイス／アセトン中で急速凍結し、これを凍結乾燥機
にセットし、真空度０　、０３　ｔｏｒｒ以下として行
った。次いで、ガスバーナーで真空溶封後、４°Ｃで保
存した。このようにして得られる凍結乾燥菌（標品）を
３箇月保存後、アンプルを開封し、滅菌ミニスパーチル
を用いて滅菌試験管に移し、これに復水液（グルコース
１％および酵母エキス１％の水溶液）を加え、１時間以
上放置した後、面記と同条件下に各培地上での性状およ
び生理学的性質を調べた結果、凍結前の菌（標品）と比
較して、変化は認められなかった。

また、上記凍結および再生を１箇月毎に５回繰り返した
菌について同様に、各培地上での性状および生理学的性
質を調べた結果、変化は認められなかった。これらの結
果から、本発明の微生物は、継代培養によって確実に同
一結果を再現できることが理解される。

参考例１ エルビニアＮｅｐ５ＫＳ−５をに２ＨＰ０．０．７％、
ＫＨ，Ｐｏ、０．２％、Ｍｇ５Ｏ，・７　Ｈｔ　ＯＯ。

０１％、クエン酸ナトリウム０．０５％、グルコース０
．２％、スキムミルク１％を含む液体培地（ｐＨ７，０
）　　１００Ｊ！１２の入ったフラスコに植え、３５℃
で７２時間培養した。このときのプロテアーゼ生成量は
１７．６単位／好であった。

参考例２ 参考例１と同様の方法で、４０本のフラスコを用いて４
Ｑの培養液を得た。この培徨液から遠心分離によって菌
体を除いた。得られた上澄の粗酵素液を、常法に従って
、５０％硫酸アンモニウム沈澱、ＤＥＡＥ−セルロース
によるイオン交換、セファデックスＧ７５によるゲル濾
過に付して、精製プロテアーゼを得た。この精製プロテ
アーゼの作用最適温度を調べたところ、５５℃であった
。

また、７５℃で１５分間処理してら、５５℃における活
性の９０％の活性を発現した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、エルビニア・ウレドボーラとは、少なくとも （１）システインから硫化水素を発生する、（２）カゼ
   インを加水分解する 点において菌学的性質が異なる新菌種エルビニアＮｅｐ
   ５。