JPS61258172A - 免疫分析用試薬およびそれを用いた免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は試料中の抗原又は抗体を定量分析するための免
疫分析試薬およびそれを用いた免疫分析方法に関する。

〔発明の背景〕

従来の免疫分析方法として、抗体あるいは抗原にラジオ
アイソトープを標識したものと試料中の抗体あるいは抗
原との抗原抗体反応を利用して試料中の抗体あるいは抗
原を定量分析するラジオイムノアッセイ法（例えば臨床
病理、２月・臨時増刊特集第５３号第１８頁〜３５頁）
や、酵素で標識した抗体または抗原と試料中の抗体ある
いは抗原との抗原抗体反応と、［識し九酵素による酵素
しかし、前記ラジオイムノアッセイ法は放射性物質を使
用するために特別な設備が必要であり、汎用性に問題が
ある。

また、ラジオイムノアッセイ法および特に酵素反応を用
いるエンザイムノアツセイ法のいずれにおいても、十分
な検出感度を得るため釦は長時間の測定を必要とすると
いう問題がある。

さらに、上記の従来分析法は高いバックグラウンドの信
号量による影響を大きく受けるという問題もある。すな
わち、被厳試料中に含まれる目的成分である抗体または
抗原の量が超微量である場合には、生ずる検出信号は微
小であるために、信号の微小変化量を増幅して測定感度
を高めることに対しては限界がある。

その他の免疫分析方法としては抗体に蛍光物質を結合さ
せ、被邸料中の抗原と抗原抗体反応を利用して蛍光の強
変さを測定することにより抗原の定量をおこなうＦＩＡ
法（前記臨床病理第４７頁〜第５７頁）も存在する。

しかし、このＦＩＡ法では、抗体に結合される蛍光物質
量が少ないために、生ずる信号量も少ないことになり試
料中に含まれる超微量目的成分を感度よく測定すること
に対して限界が生じていた。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、極めて短い分析時間でかつ試料中の微
量目的成分である抗原や抗体を高感度に定量することが
できる免疫分析用試薬およびそれを用いた免疫分析方法
を提供することＫある。

〔発明の概要〕

上記目的を達成するために、本願第１の発明は、補体活
性により溶解作用を受ける膜によって構成され、波膜の
外側表面に被徊試料中の目的成分と抗原−抗体反応を生
ずる抗原または抗体が結合されてなるマイクロカプセル
内に１時間分割された蛍光を指標とする化合物が含有さ
れたものからなることを特徴とする免疫分析用試薬であ
る。

また、本願第２の発明は補体活性により溶解作用を受け
る膜によって構成され、波膜の外側表面に抗原または抗
体が結合されたマイクロカプセル内に時間分割された蛍
光を試料とする化合物が含有されてなる免疫分析用試薬
と、被照試料を混合し、該被層試料中に含まれる抗Ｎま
たは抗体と前記膜外側表面に結合された抗原または抗体
との抗原−抗体反応により活性化された補体により前記
膜が溶解され、前記マイクロカプセルから放出された前
記指標化合物から放出された蛍光を計測することにより
前記積和試料中の抗原または抗体の定量をおこなうこと
を特徴とする免疫分析方法である。

上記本発明の構成において、抗原ま九は抗体を結合する
ことのできるマイクロカプセルとしては、動物膜例えば
羊の赤血球を好適に用いることができる。また、他の動
物の赤血球あるいは赤血球以外の動物細胞あるいは人工
膜であるリポソームであっても、膜に抗体あるいは抗原
を結合し、マイクロカプセルの内部に時間分割された蛍
光を指標とすることができる化合物を収容することがで
きれば、いかなるものもマイクロカプセルとして使用す
ることができる。

膜に抗原または抗体を結合する手法は、膜が動物膜であ
る場合は抗原または抗体を吸着によって結合することが
できる。また、膜が人工膜である場合は化学的結合例え
ば、カルボキシル基を膜に形成させ、このカルボキシル
基と抗原または抗体を結合させることＫより抗ｙＫまた
は抗体を膜に結合することができる。

膜に結合する抗体ま九は抗原は被験試料中の抗Ｗ、また
は抗体と特異的に抗原−抗体反応を生ずるものを使用す
る。例えば被験試料中の抗原（目的物質）がインシュリ
ンであるときＫは、膜に高インシュリン抗体を結合させ
る。

上記本願第２の発明において、被検試料中の抗原または
抗体の定量は時間分割蛍光法に基づいている。すなわち
、試料中の抗原または抗体と、膜に結合された抗原また
は抗体との抗原−抗体反応により補体が活性化され、こ
の補体の活性化によシマイクロカプセルが溶解作用を受
ける。その結果マイクロカプセル内から時間分割された
蛍光を指標とする化合物が、測定系に現われるようにな
る。この時間分割された蛍光を指標とする化合物は、継
続時間の短いパルス状の光によって励起され、励起パル
スから一定時間を経たのちに長寿命（重量オーダ）の蛍
光を発するものである。

従って励起から検出までの間に、干渉源からの蛍光（パ
ックグラウンド蛍光）は減衰するために、時間分割蛍光
測定時には、マイクロカプセル内に含有された長寿命用
蛍光物質由来の信号だけを検知することができる。この
ような化合物は、できるだけ強い蛍光と比較的長い蛍光
波長と犬きくストークスシフトを可能とする化学構造を
備えている必要がある。このような要件を満足させる蛍
光標識物質として、例えばスウェーデン国特許願第７９
０２０７９−８号に記載されているランタニドキレート
がある。これは、ランタニド（’［、ａｎｔｈａｎｉｄ
ｅ　）と芳香族β−ジケト７　（Ａｒｏｍａｔ　ｉｃβ
−ｄｉｋｅｔｏｎｅ）とからなるものである。

このランタニドキレートの蛍光持続時間は５０〜１００
０μ減であり、時間分割検出に適したものとなっている
。

ランタニドの中で特に好ましいのはユーロピウムおよび
テルビウムである。

上記本Ｉｌｉ第２の発明の構成【おいて、補体活性によ
り膜から長寿命蛍光物質が測定系に出てきたのち、円心
分離をおこない沈降物質を除いたのちに時間分割蛍光法
をおこなうことが好ましい。これは、補体によって溶解
しないマイクロカプセルも測定系に存在すると、外側か
ら当つ九励起光によりマイクロカプセル内の蛍光物質に
よって生じた蛍光が干渉し、測定系にこの干渉した物質
が影響してくるからである。従って、このような補体に
よって影響を受けないマイクロカプセルは円心分離によ
り沈降させ、測定系から除くことが好ましい。ただし、
この干渉した蛍光による影響はそれほど大きなものでは
々い。

試料中の抗体または抗原の定量は、溶解反応によってマ
イクロカプセル内部から生じた蛍光物質の蛍光強度ある
いは蛍光の半減期またはこれらの両者を継続することに
よって行うことができる。

上記本発明の構成において使用される補体は、動物の血
液中に含まれているものを使用することができる。例え
ば、モルモットの血清を補体含有液としてそのまま用い
ることができる。この補体は、試料中の目的成分とマイ
クロカプセルの表面に結合された抗原または抗体との抗
原−抗体反応によシ活性化され、マイクロカプセルを溶
解する本のである。

上記マイクロカプセル内に収容された蛍光化合物量は、
従来のＦＩＡ法に比べて大過剰であるため数１０時間も
要してい九分析をｌＯ程度でおこなうことができる。ま
た、前述したように、本発明の免疫分析方法で採用した
時間分割蛍光法では、蛍光寿命が長いために励起光から
蛍光を検知するまでの関に被継料中に含まれる共線物質
などの干渉源の蛍光は減衰する。従って、バラフグ２ウ
ンドの信号をキャンセルすることができるために１被検
試料中の抗原または抗体の量に依存する蛍光信号を十分
に増幅して測定することができる。

〔発明の実施例〕

（実施例１）ランタニドキレートを収容したマイクロカ
プセルの調整 まず、羊赤血球をサスペンドした等張渡（０，１５Ｍ塩
化ナトリウム含有緩衝液１）Ｈ７，４）と羊赤血球抗体
（市販品）とを混合すると、羊赤血球の細胞上に抗体が
抗原抗体反応によシ吸着し、抗体を細胞膜外側表面に結
合する赤血球を含む等張渡が得られる。次に、常法であ
る透析法によって赤血球内から細胞液等を排出して赤血
球内にランタニドキレートを収容する。収容するランタ
ニドキレートの濃度は、非常［ｌＩＪ感度の免疫分析を
要求するか否かＫよって適宜決定することができる。

（実施例２）免疫分析 次に、上記実施例１によって調整されたマイクロカプセ
ルと補体を含む例えばモルモット血清と試料を混合する
。試料としては生体より採取した抗体または抗原を含む
ものであシ、血液、血清。

尿、リンパ液などがあげられる。

すると、試料中の抗原または抗体（目的成分）とマイク
ロカプセルに結合された抗体または抗原とで抗原−抗体
反応が進行する。この抗原抗体反応により血清中の補体
が活性化され、この補体によりマイクロカプセルが損傷
を受は膜が溶解される。マイクロカプセルが溶解すると
、反応液中にマイクロカプセル内部に含有された長寿命
蛍光物質が放出される。

次に、放出した内容物（蛍光標識物）を時間分割蛍光法
により定量する。時間分割蛍光法による蛍光強度あるい
は半減期を測定することＫより、被検試料中に含まれる
抗原または抗体を定量することができる。被検試料中の
抗原ま九は抗体、マイクロカプセルに結合された抗体ま
たは抗原、および補体は化学量論的に反応する。従って
、あらかじめ既知！１度の抗原または抗体を用いて検量
線を作成しておくと、被検試料中の濃度未知の抗原ある
いは抗体を定量することができる。この定量の具体例で
ある実験例を以下に示す。

この実験例は、細胞とＬ５て羊赤血球を用いてマイクロ
カプセルを構成し１、このマイクロカプセル内に蛍光物
質としてユーロピウムキレ−トを含有させた。蛍光の測
定は反応液の励起波長３４０ｎｍ、蛍光検知波長６１３
ｎｍにておこなったものである。あらかじめ＋１［Ｌ、
たインシュリン含有量既知の試料１０β！、と、抗イン
シュリン抗体を含む免疫分析試薬１０　ｕ　ｔと補体含
有液１０μ！。

と０．０５　Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）９７
０μｔを混合し２て３７Ｃで１５分間反応させた。次い
で、各反応液の蛍光を励起後４００μ憂経過後１０μ（
６）量測定し７た。この結果を第１図に示す。

第１図からインシュリンがＯ〜１０ｒｘｇの範囲内で蛍
光強度が約１０００単位くらいとなるので非常に感度が
よい測定法であることが判る。これに対して従来のＦＩ
Ａ法に測定でけｎｇ単位の測定は非常に感度が低いもの
となっていた。

〔発明の効果〕

以上説明したように本発明によれば、マイクロカプセル
内に長寿命の蛍光物質をより多量に含有しているために
、信号量が大良くなるとともに蛍光時間が十分長い状態
で蛍光量を測定することができる。従って、バックグラ
ウンドの影響を消去して蛍光強度を測定することができ
るために、試料中に含まれる超微量目的成分を高感度に
測定することかで舞る。

また、被験試料中の目的成分である抗原または抗体の定
量する際に酵素反応やラジオアイソトープを起用するこ
とがないために、簡単な設備でかつ迅速に定量をおこな
うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る免疫分析方法により定量ｔ　ｆｔ
インシュリンの検量線を示す１７’　−＝Ｊ　７　／Ｃ
′あ々。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、補体活性により溶解作用を受ける膜によつて構成さ
   れ、該膜の外側表面に被検試料中の目的成分と抗原−抗
   体反応を生ずる抗原又は抗体が結合されて成るマイクロ
   カプセル内に、時間分割された蛍光を指標とする化合物
   が含有されたものからなることを特徴とする免疫分析用
   試薬。 ２、特許請求の範囲第１項において、前記指標化合物が
   ランタニドキレートであることを特徴とする免疫分析用
   試薬。 ３、補体活性により溶解作用を受ける膜によつて構成さ
   れ、該膜の外側表面に抗原又は抗体が結合されたマイク
   ロカプセル内に、時間分割された蛍光を指標とする化合
   物が含有されてなる免疫分析用試薬と、被検試料とを混
   合し、該被検試料中に含まれる目的成分と前記膜外側表
   面に結合された抗原又は抗体との抗原−抗体反応により
   活性化された補体により前記膜が溶解され、前記マイク
   ロカプセルから放出された前記指標化合物を計測するこ
   とにより前記被検試料中の抗原又は抗体の定量を行うこ
   とを特徴とする免疫分析方法。 ４、特許請求の範囲第３項において、前記抗原−抗体反
   応が生じたのち円心分離を行い、沈澱物を除去したのち
   前記指標化合物から放出された蛍光を計測することを特
   徴とする免疫分析方法。