JPS61251623A - 細胞付着阻害剤の製造法、このようにして得た抗アドヘツシン、およびこれを含有する薬物および食物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細胞付着阻害剤の製造法の改善、このように
して得た抗アドヘツシン （ａｎｔｉａｄｈｅｓｉｎ　）およびこれを含有する薬
物および食物に関する。

はとんどの微生物、特に病原微生物が周囲媒質（あらゆ
る種類の固形物質、ヒト、動物、植物細胞）の表面に結
合する性質を有することは、現在一般に認められている
。感染性微生物は、一般に付着因子（アドヘツシンａｄ
ｈｈｅｓｉｎ＞と証されるカプシド、外膜および／また
は線毛（ｐｉｌｉ）　、繊毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ）　、
鞭毛等の形に組織化された分子構造物によって標的細胞
に付着する。

多くの場合、感染機構の絶対条件は、微生物が予め周囲
媒質に、あるいは直接特異的な膜レセプターに付着する
ことであり、これはどの細菌コロニー化にとっても必須
条件である。これら微生物構造物あるいはアドヘツシン
の性質、及び％１着減少に関与するレセプターの性質は
いまだ完全には解明されていないが、多くの著者による
多数の研究は、この現象を把握するのにしだいに成功し
ている［とくに、■ジー、シャバノン：“ルヴユー　ド
　ランステイテユ　トリオン”１９８４．第１８巻、第
８５〜１０５頁（Ｇ、　Ｃｈａｂａｎｏｎ　：“ＲｅＶ
ｕｅ　ｄｅ　Ｌ’Ｉ　ｎｓｔ、　　Ｐａ５ｔｅｕｒ　　
ｄｅ　　Ｌ　ｙｏｎ　”、１９８４゜ｔ、１８．ｐ、８
５−１０５＞、■ジー、ダブリュー、ジョーンズ：“マ
イクロバイアル　インターアクションズ″シリーズＢ、
第３巻、第１４１頁〜１７６頁、１９７７　（Ｇ、Ｗ。

Ｊ　０ｎｅＳ　：“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　　Ｉｎｔｅｒ
ａＣｔｉｏｎ３″３ｅｒｉｅｓ　　Ｂ、Ｖｏｌ、３．ｐ
１４１−１７６（１９７７））、および■ニー、グンナ
ーソン他：“インフエクション　アンド　イミニテイー
″。

１９８４年７月、第４１〜４６頁（Ａ。

Ｑ　ｕｎｎａｒｓｓｏｎ等：“ｌ　ｎｆｅｃｔｉｏｎ　
ａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ　”　、　Ｊｕｌｙ　１９８４
．　Ｄ　４１−４６＞等を参照のこと）。これら研究の
結果は、アドヘツシンは時折それらの部位のあるものも
しくはそれらの構造単位のあるものと、標的細胞または
構造物の外膜の隣接周囲および／または実際の表面に存
在する化学的基との間の特異的相互作用を経て作用する
ということである。

感染因子の除去に現在用いられている種々の方法のうち
、次の２つが特に使用されている。ニーワクチン接種（
予防） 一抗体療法（治療） しかし１、場合によっては［■シャロン他：“アドヒー
ジョン　アンド　マイクロオーガニズム　バソジエニシ
ティー″、チバ　ファウンデーション　８０、第１１９
〜１３５頁（３ｈａｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ　　：“Ａｄｈ
ｅｓｉｏｎ　ａｎｄＭ　ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　　
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ”、Ｃ１ｂａ１”ｏｕｎｄ
ａｔｉｏｎ　３ｙｍｐｏｓｉｕｍ　（８０，ｐｌ　１９
〜１３５）、■ディー・シー・オールド二“ジャーナル
　オブ　ジェネテイカル　マイクロバイオロジー”、１
９７２，７ユ、第１４９〜１５７頁　　（Ｄ、Ｃ，ＯＬ
Ｄ、　　”Ｊ、ｇｅｎ　。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、”　、　　１９７２．　７１．　
　ｐ１４９−１５７＞、■ジー・ダブリュー・ジョーン
ズ。

前記出版物参照］、微生物の付着性を阻害することによ
る感染除去法が推奨される。この競合阻害には単糖類の
ような明確な構造の単純な糖が関係している。得られた
結果は、助長はしたものの問題に対し十分な解答を与え
るものではなかった。

細菌付着現象の、特に動物での徹底的な研究において、
本発明者は競合阻害方法を改善し、病原菌付着を防ぎ得
る新しい治療剤、抗アドヘツシンを開発するべく種々検
討を重ねてきた。

本発明はその作用が治療的および予防的である抗アドヘ
ツシンの製造方法を提供しようとするものである。ここ
で治療的作用は、感染因子がすでに標的構造または細胞
の近くに在るかまたは接触している場合にそれを脱離せ
しめる作用であり、予防的作用は、感染の危険性が高く
、抗アドヘツシンの投与により病原因子の標的への到達
を阻止する作用である。

本発明者は、細胞付着現象に関与する化学的相互作用が
多くのモデルに適合することを見出した。あるものは特
異的で、一般には蛋白（レシチン等）である巨大分子と
膜レセプターとの間の分子認識の現象に基づいている。

またあるものは非特異的で、疎水的、静電気あるいはイ
オン的な荷電、あるいは水素結合が一与する現象を伴う
。一般に、後者の現象は持続的付着を可能ならしめるに
は十分ではないが、しばしば特異的相互作用の安定化を
もたらす。後者の場合、レセプターにおいて活性な分子
ユニットは、一般に炭水化物特性を有する。

本発明の目的は、化学的観点から、認識現象に関与する
レセプターと似た構造物と見なし得る物質の製造方法を
提供することである。

本発明は、種々の液体もしくは固体有機基質に含まれる
かそれらに由来するＩＩ！白および／または糖ペプチド
、脂質構造物および／または糖脂質を酵素的および／ま
たは化学的に溶解し、部分的または全体的に糖特性を有
し、その分子量が、常に１０００以上である溶解（Ｉｙ
ｓｉｓ　）に耐性な構造物を集め無菌化することを特徴
とする、細胞付着阻害剤または抗アドヘツシンの製造方
法に関する。

このようにして得た、所望であれば種々の支持体にグラ
フトできる抗アドヘツシンは、多くの微生物の付着を妨
げ、感染除去や予防に適した薬物を構成する。

本発明方法の好ましい一実施態様においては、糖蛋白お
よび／または糖脂質は有機基質から抽出することなく処
理される。

本発明方法の他の好ましい実施例態様においては、糖蛋
白および／または糖ペプチドおよび／または糖脂質は、
それらが存在する生物学的媒質から抽出した後に加水分
解される。

この実ｒＭ態様を行なう一方法において、糖蛋白は ａ）有機媒質においてカプリル酸ナトリウムの存在下に
エタノールで抽出し、続いて ｂ）加熱処理（６０〜７０℃）及び沈澱した糖蛋白の分
離を行い、＠後に、 Ｃ）蛋白分解を行い、必要であれば、続いてヒドラジン
分解を行う。

この実施態様を行う別の方法において、糖脂質は混合媒
質を用いて抽出し、次いで加水分解する。

糖脂質を抽出するのに用いる溶媒はクロロホルム／メタ
ノールの二成分混合物あるいはクロロホルム／エタノー
ル／アセトンの三成分混合物がから成る。

本発明によれば、加水分解は １、　糖蛋白の場合、カルシウムイオンの存在下にｐＨ
５〜７、温度８０℃以下で、プロテアーゼを用い、また
、好ましくは、サーモリジン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ
　）を用いて行い、続いてヒドラジン分解または類似の
化学処理を行い構成抗アドヘツシンを遊離させる； ２、　糖脂質の場合、穏やかなアルカリ加水分解により
行い、続いて酸化分解または類似の処理を行いオリゴ糖
構造物を分離させる。

本発明方法の好ましい一部ｍ態様によれば、オリゴ糖類
を精製し、特に、酵素加水分解後酵素を不活性化しまた
は化学的溶解の場合には中和し、次に分子ｉ濾過を行い
分子量が１０００以上のものを集め、炉液を清澄化後、
ン濾過膜で無菌化する。

特に有利な実施態様においては、抗アドヘツシン溶液を
無菌化の前に濃縮する。この濃縮は限外ン濾過、沈澱、
分子排他クロマトグラフィ、イオン交換樹脂またはアフ
イニテイクロマトグラフイのような慣用の方法によって
行うことができる。

本発明はまた、本発明の方法により得られる抗アドヘツ
シンに係り、本発明抗アドヘツシンはその一部または全
部がオリゴ糖の特徴を示し、少なくとも３つの単純なも
しくは置換された糖を含み、その糖の１つが必ずガラク
トースかまたはグルコースでおり、分子量が１０００以
上でおることにより特徴付けられる。

これらの分子はすぐれた付着阻害因子を構成する：これ
らは広範な医薬製剤の形で投与することができ、また食
物と混合することもできる。

これら分子は種々の立体配置をとる。その構造において
、これらは核（ｎｕｃｌｅｉ）　、またはコア（ｃｏｒ
ｅ　）または骨格を有し、周辺ないし末端もしくはアン
テナ状配列をとる。これらは少なくとも、°単純な、も
しくは置換されたがラフ１〜−ス（ｇａｌ　＞またはグ
ルコース（ｑ！ｃ　）を有する。

第１〜３図にこれら構造のいくつかを示すが、例示に限
定されるものではない。

実際、すべての有機基質が本発明により抗アドヘツシン
を製造するのに適している。

即ち、本出願人は、 一生物学的液体として：血漿、胎児（仔）血漿、赤血球
、尿、リンパ１．脳を髄液、羊水、滑液；一種々のヒト
及び動物種の分泌物として：乳汁、初乳、胃ムチン、唾
液、粘液； 一植物分泌物； 一原核生物および真核生物、即ち、正常細胞または感染
により形質転換された細胞源として：ウイルス、ファー
ジ、細菌、真菌、酵母、藻、苔、地衣、シダ、高等動物
細胞、高等植物細胞；一種々の抽出物として：胚、腺お
よび組織、脳および神経組織、目、胸腺、甲状腺、膵臓
、肺臓、腎臓、肝臓、牌臓、腸、骨、筋肉、胎盤、を使
用した。

以下に実施例を挙げて本発明による産物の製造および本
発明による薬物の活性に関する薬理および臨床試験につ
き説明する。

下記の製造例および抗アドヘツシンの阻害活性を立証す
る試験は、何れも本発明を説明するためにのみ示すもの
であり、本発明は、これなどによっていかなる制限をう
けるものではない。

実施例　１ 血液を採取して抗凝固剤を加え、遠心分離して２相、即
ち、血漿および血餅（赤血球懸濁）、に分離する。血漿
は、サーモリジンのような、酢酸ナトリウムおよびカル
シウム緩衝塩２５％を含有する凍結乾燥物の形の熱安定
性プロプアーゼで加水分解する（フランス特許８３２１
０３３号参照）。

熱処理（７５℃以上）もしくは化学沈澱法により酵母を
不活性化した後、分子量１０００以上の抗アトへツーシ
ンを集め、清澄化し、ン濾過器を用いフィルタープレス
上に脂質を除き、０゜２２μ膜スクリーンで無菌化する
。抗アドヘツシンは、特定の化学処理、ヒドラジン゛分
解および／または特異的エンドグリコシターゼにより得
ることができる。抗アドヘツシンの収率は蛋′白原料の
約５％である。

実施例　２ 血漿をエタノール（８％）およびカプリル酸ナトリウム
（４・１０−”Ｍ）で処理する。６８℃で１５分間熱処
理した後、沈澱した糖蛋白をン濾過機を用いフィルター
プレス上にアルブミンとン戸別する。

糖蛋白の洗浄「ケーキ」は蛋白分解のための基質となる
。抗アドヘツシンの収率は約１０％である。

実施例　３ 実施例１および２の加水分解により得た抗アドヘツシン
を物理化学的方法、即ち、限外ン濾過、選択的沈澱、分
子押出クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ
、アフイニテイクロマトグラフイにより濃縮する。この
方法は特定の個々の種類を分離するのに用いる。

Ｂ１種々の赤血球膜に由来する抗アドヘツシン実施例　
４ 採取した血液に抗凝固剤を加えて遠心分離することによ
り得た赤血球を洗浄し、ニー・フォール等［Ａ、ＦＡｔ
ＪＲＥ、Ｊ、ＤＥＢＲＩＥＵＸおよびＭ、ＣＡＲＯＮ　
（Ｒｅｄ、Ｃｅ１ｌ　。

ＧｈＯ３ｔＳ　：レクチン精製手段、１９８３、Ｖｏｌ
。

３、　ｐｐ６ｅ　１−６６５．　Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅＧ
ｒｕｙｔｅｒ出版、ベルリン］記載の方法の変法により
細胞膜を調製する。凍結乾燥膜の収量は血液１０あたり
約４ｇである。

実施例　５ 実施例４により得た赤血球膜を実施例１記載のように蛋
白分解処理に付し、蛋白形構造物により担持される抗ア
ドヘツシンを得ることができる。

実施・例　６ 実施例４より得た赤血球を糖脂質画分の抽出のための方
法に付す。脂質画分を、クロロホルム−メタノール混液
（２：１）の作用および同溶媒混液（１：９）もしくは
クロロホルム−エタノール−アセトン三成分混液（２：
１：３０）による２回目の抽出により得る。このように
して得た抽出物を穏やかなアルカリ加水分解に付し、続
いてシリカゲルクロマトグラフィにより分別する。溶出
は、メタノール（容量Ｘ）−クロロホルム（容量ｙ）混
液を用い、Ｘ／Ｖをに９から２０＝１に増大しながら行
う。

化学的加水分解または酸化分解処理後、ニー・グンナー
ソン他（前出出版物）記載の変法によるクロマトグラフ
法を行うことにより、常に分子１１０００以上の個々の
オリゴ糖構造物を単離することができる。収率は約１％
である。

得られた仝両分は少なくとも単純もしくは置換ガラクト
ースおよびグルコースを含有する。

Ｃ０血液以　の生　　的°体に由　する　ア゛ヘツシン 実施例　７ 濃縮後、出発物質を実施例１の蛋白分解ｆｆｉ理もしく
は実施例６の糖脂質抽出過程に付す。収率は、約０．５
−１％でおる。

実施例　８ 初乳または乳汁を実施例１に従い蛋白分解および精製処
理、および／または実施例６に従い脂質構造物抽出処理
に付す。

Ｅ、　物の粘液から尋た　アドヘツシン：Ｗ！Ａ玖辺眉 実施例　９　− 十二指腸、空隔および回腸の粘液を削り取る。

懸濁した生物学的物質は遠心分離（２００００９）によ
り汚染物や細胞破片を除く。透析後、無菌条件下で濾過
した粘膜糖蛋白溶液は、実施例１における蛋白分解の基
質となる。

Ｆ、　　ペプチ゛および　　質に由来する抗アトへツシ
ンン 実施例　１０ 絨毛および上皮細胞を屠殺した動物の十二指腸、空隔お
よび回腸からこすり取り、遠心分離により洗浄する。ポ
ーターホモゲナイザーによる均質化もしくはトリプシン
での部分加水分解（３７℃、１５分間）後、脂質をクロ
ロホルム・メタノール・水混液（４：　８　：３Ｖ／Ｖ
）で抽出する。このようにして２画分、即ち、脂質と糖
脂質並びに脂質を含まない細胞、を得る。

糖脂質抽出物を実施例６の方法により処理する。脂質を
含まない上皮細胞は実施例１に記載の方法により加水分
解する。

Ｇ、　　　物に　来する打ア゛ヘツシン実施例　１１ 分泌物を、場合に応じて、水性または有ｉ緩衝液に懸濁
し、実施例１および３による蛋白分解および精製処理、
および／または実施例６による処理に付す。

Ｈ９イルス　来の　ア゛ヘツシン 実施例　１２ 感染液体もしくは細胞から得たウィルスを密度勾配超遠
心分離により精製する。

オリゴ糖構造物を担持する糖蛋白を、膜洗浄剤で処理し
た後、エル・ニー・ハント［Ｌ、Ａ。

１（ＵＮＴ、”ウィルスおよび細胞膜糖蛋白由来の大き
な酸型糖ペプチドのグリコシターゼ分析″、３ｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｊ、、１９８３，２０９，６５９−６６７］の方
法由来の方法によりブタノールで抽出する。

抗アドヘツシンを実施例１および３に従い酵素的消化に
より得、精製する。

■、ファージ由来の　アドヘツシン 実施例　１３ ファージを種々の液体肥料、農場肥料等から、スミス他
（Ｓｍｉｔｈ　　ａｎｄ　Ｉ−ｉｕｇｌ−１ｕ、　　（
１９８２）、“マウスにおける実験的大腸菌感染のファ
ージによる治療：構成物質に対する優位性”　、Ｊ　＊
ｏｆ　　Ｇｅｕｅｒａｌ　　５ａｃｔｅｒｉ０１０ａｙ
　、　１２８．３０７−３１８１の方法により分離する
。オリゴ糖は実施例１に従い蛋白分解により得る。

Ｊ、細°から　た　ア゛ヘツシン 実施例　１４ 細菌は一般に、発育に適した培地（例えば、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　　Ｋ２Ｓ、　トリブチカーゼ−ソイ培地：Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ　　Ｋ９９．ミンカ培地；乳酸桿菌、口コサ培地
等）において３７℃で２４時間培養する。

細菌抽出物を超音波分解により得、濃縮し、実施例１点
よび３に従い加水分解に、あるいは実施例６に従い脂質
構造物の抽出に付す。

Ｋ、東Ａ１肚匹良米立莢ヱ旦Δス之之 実施例　］５ 微生物は増殖に用いた工業用抽出物または培養培地から
遠心分離により分離する。抽出物を実施例１，２．３ま
たは６に従い蛋白分解に付す。

Ｌ、９％、　　　　、シ　　来の抗アドヘツシン実施例
　１６ 植物を摩砕し、糖蛋白を緩衝液に溶解し、実施例１に従
い加水分解に付す。抗アドヘツシンを実施例３または６
に従い精製する。

Ｍ、　　植物から抽出した抗アドヘツシン実施例　１７ 乾燥または湿潤した、完全に摩砕した状態で使用でき、
２成分、即ち、蛋白と脂質成分に分別され得る植物を、
必要であれば溶解もしくは懸濁後、実施例１，３または
６に記載の過程に・付す。

Ｎ１組　または臓器から　離した　ア゛ヘツシン 実施例　１８ 糖脂質および糖ペプチドを、脳、腎臓、肝臓、肺臓等の
全臓器を摩砕することにより得る。糖脂質は実施例６に
従い抽出する。糖ペプチドは実施例１または２に従い加
水分解により得る。

これらはグリコサミノグリカンから、後者を塩化セチル
ピリジニウムで沈澱させることにより分離することがで
き、次に実施例３に従って処理する。

０、タマゴから　　した　ア゛ヘツシン実施例　１９ リゾチームの選択沈澱およびクロマトグラフ分離後に集
めた卵糖蛋白（例えば、オボムコイド、アビジン、オボ
アルブミン）を実施例１に従い蛋白分解に付し、抗アド
ヘツシンを実施例３に従い濃縮、精製する。

菌付着に・する　害活性 本発明の抗アドヘツシンの活性を明らかにするため以下
の実験を行ったニ ー調べた微生物が耐着する標的に関するインごトロ実験 一病原微生物による感染動物に関するインビボ実験 一臨床試験 下記方法をインビトロ実験に採用した：付着試験は、培
養により微生物を、遊離または固定標的に接触させるこ
とにより行う。それぞれの濃度、ｐＨ，イオン強度、イ
オン特性、温度および試験期間のパラメーターを用い、
付着阻害試験を、本発明の抗アドヘツシンを微生物と前
培養することにより、もしくは抗アドヘツシンを微生物
および標的構造物含有培地に、遊離または支持体に固定
して、導入することにより行う。

付着および抗付着はニ ー当該実験系により可能であれば肉眼的に一光学顕微鏡
により、染色後（もしくは染色せず）直接読み取るかま
たは位相差により、−分光光度法により、 一標的に付着した微生物の放射活性または蛍光を測定す
ることにより、観察もしくは定量化する。

最後の方法は現象をより定置化することかできる。

２、標的細胞に付着した微生物の放射活　のに基づく−
的ト　および抗付着０験の説明対象徴生物を培養し、前
駆体をその構成物質中に取り込ませることにより放射活
性をラベルする。

微生物の最終濃度は、試験条件に応じて調整する。標的
構造物、即ち、細胞および／またはその粘液は、細胞を
得るための化学文献に記載の種々の方法により調製する
。性質の判断基準は、対象徴生物の付着性である。

臥−一員 細胞および／またはその粘液を、抗アドヘツシンの存在
または非存在下に、放射活性微生物をそれらと接触させ
得る適当な支持体に固定する。続いて数回洗浄後、生物
学的成分（標的並びに付着放射活性細菌）を適当な処理
により支持体から脱離させ、培地中の放射活性を液体シ
ンチレーションにより計測する。

各実験において、対照値は１００％付着を示す・本試験
は・抗アドヘツシンの単位質量に久（するその生物学的
活性を定最化することができる。

一旦、並旦に９９を、微生物の構成成分中に取り込まれ
得る前駆体である放射活性化学物質（アミノ酸、プリン
またはピリミジンヌクレオシド、酢酸ナトリウム等）を
添加したグルコースおよびビタミン類を含有する適当な
培地例えばミンカ培地（Ｇｕｉｎ６ｅ　Ｆ）、　Ａ、　
Ｍ、　。

Ｊ　ａｎｓｅｎ　　Ｗ　、　　ト１．　　、　７！ｉ、
ｇｔｅｒｂｅｒｇ　　　Ｃ，Ｍ、　　、　　１９７６）
で培養する。

Ｋ９９線毛の合成が起こるならば３７℃で、そうでなけ
れば１８℃で、１８時間培養後、細菌を集め、洗い、Ｄ
Ｈ７，２の慣用の緩衝液（ＨＥＰＥＳ−ハンクス、塩類
リン酸緩衝液等）に懸濁する。

細菌数は、４２０−−６６２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を
測定することにより明らかにしくＯＤは、コロニー数の
一次関数である、０Ｄ＝ｆ（Ｃ）＞、濃度を１０８−１
０ｇ個／ｌｌ１１２に調整する。チェックは、Ｋ９９線
毛の存在については抗に９９抗体による血清凝集により
、また細菌細胞の生存力については、培養物の一部を適
当な培地に希釈することにより行う。

−標的細胞および／または粘液のＩｌ！ｓ４および固定
法（Ｃ，Ｄ、ＬＡＵＸ等、１９８４による）粘液を屠殺
動物（マウス、幼若ウサギ、子ブタ、子ヒツジ、子ウシ
等）の小腸からこすり取り、緩衝液（ｐＨ７，２）に集
める。２８０００ｇで１５分間遠心分離すると細胞破片
や成分が完全に除去される。各調製物の蛋白１度を調べ
、少なくとも３．５１１９７ｍＱに調製する。

細胞を動物（５−８退会マウス、１退会つザギ、子ブタ
、子ヒツジ、５日未満の子ウシ）の小腸からこすり取り
、細胞を保存するのに用いる緩衝液に集める。１０００
９で遠心分離して組織破片を除去し、濾過および遠心分
離（２０００ｇ＞して夾雑物を除去する。腸管絨毛細胞
をトリプシン処理（０，１％トリプシン）または切裂（
ポーターＮα１８ホモグナイザー）により分離し、濃度
を１０６−１０８個／ｍｉ２に調整する。

ｍ胞または粘液標本（０，２５戚）を組織培養プレート
のウェルに入れ、４℃で一晩培養し、緩衝液（１１７，
２＞で２回洗い非結合蛋白または細胞を除去する。

動物細胞（定着細胞系または一次培養物）を１０％ウシ
胎仔血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンの存在
下に細胞培養培地で培養する。細胞は制御気圧において
３７℃で２４−４８時間培養し、培養プレートのウェル
に融合単細胞層を得る。使用前、細胞は洗い、培養培地
を完全に除去する。

一付着および付着の阻害 細菌（０，２５綬、即ち、最小取込み５０００ｄｐｍ）
ｃｌよび緩衝液５０μｍｌをウェルに入れ、固定細胞お
よび／または粘液と共に３７℃で培養する。

洗浄後、０．５％５Ｄ３０．５謂、または他の洗浄剤も
しくはキレート化剤を、３７℃で２時間作用させること
により、付着細菌を脱離させる。

採取したサンプル（０，２５１１１１２＞は続いて、液
体シンチレーションにより放射活性を計測することによ
り分析する。′ 付着阻害の試験においては、本発明の薬物を細菌を有す
る緩衝液５０μＱ中の上記培地中に導入する。

一漿限匁五里 結果は、上記条件下にウェルから回収した、１００％付
着とした対照値に対する放射活性量として表わす。

通常得られる結果の標準曲線は、第８ａおよび８ｂ図に
示す（これは例示でおり、これに制限されるものではな
い）。阻害は、薬物濃度の対数の一次関数である。分子
量約２００のオーダーの単純糖または分子量約４００の
オーダー、即ち分子＠１０００以下のオリゴ糖は、あっ
たとしても、非常にわずかな阻害作用しか示さない。

４、マンノース耐性血球凝集阻害の　験これは、微生物
の標的細胞への付着を調べる別のモデルである。

ａ）原理 血球凝集１０単位（１単位は、マンノースにの存在下に
選ばれた種の赤血球細胞を凝集し得る細菌懸濁液の最大
希釈に相当する）と等しいＨａ（Ｄ細１ｍ　（１０７−
１０９個／ｍ１２）　ヲ緩衝等張液（ｐＨ６，８−７，
２＞２５μＱに懸濁し、本発明の薬物５０μＱの存在も
しくは非存在下に、４℃または室温で１０分間培養する
。次に３％（Ｖ／Ｖ）濃度の赤血球を２５μｅ１培養培
地に加える。結果は、３０分間接触させた後（肉眼的に
、または顕微鏡、比濁計または分光光度計により）読み
取る。

ｂ）人員蓋Δ辺長月 用いた実験系を第１表に示す。

第　　　■　　　表 薬物の附害能、即ち、旦、ｃｏｌｉ　　Ｋ９９によリヒ
ツジ赤血球の凝集を阻害することのできる最小濃度の逆
数は、本発明の物質の最に比例する（第９図参照）。

麹 上記方法により得た絨毛または細胞を直ちにあるいはハ
ンクス培地もしくは細胞の保存に適した培地に一２０℃
で凍結後、使用する。凍結標本を使用する場合、添加物
を連続洗浄により除去する。

細菌（１０７−１０”個／戚）を、本発明の薬物の存在
もし′くは非存在下に、ｐＨ範囲５゜５−８．５で、実
験系に応じて、２０℃または３７℃で４０分間、細胞標
本（１０７個／或）と接触させる。

細菌１５個以上が細胞表面に固着する場合、付着は陽性
である。

阻害は次式により表わす： 細菌を有しない細胞数 細菌を有しない細胞数 ２Ｘ１０５細胞（２００μ９）　を２ｘ１０７細菌＜２
００ｉ）　と、本発明の産物０］２５■の存在下に３７
℃で４０分間接触させた場合、観察された阻害率は対照
値に対し６０−６５％である。

インビボ実験の場合には下記の方法を採用した： １）幼　マ　スへのｌ：、　ｃｏｌｉ　　Ｋ９９の実験
子種 生後４８時間以内の同種（ＳＷＩＳＳ、ＯＦＬ　ＣＤ等
）のマウスの各群を旦、並月−Ｋ９９（５Ｘ１０’また
は１０５）で経口感染させる。感染後３０分以内に本発
明の薬物を一回経口投与した後、または投与せず、３日
間（Ｄ）固体数の変化を調べる。

接種（５ｘ１０’−１０５旦、並旦　Ｋ９９／固体）後
３日以内にＬＤ＋ｏｏ感染の場合、各群の防衛を下記の
第■表に示す。

２）新生仔　シへのＥ、ｃｏｌｉ　　Ｋ９９の実験的ｌ 下痢は、Ｈ，Ｗ、５ＭｌＴｌ−１およびＳ、Ｓ。

ＨＡＬＬ　（１９７６）記載の方法に由来する手法によ
り生じさせる。生後８時間以内の初乳を受けていない仔
ウシを致死用１１０′。Ｅ、　ｃｏｌｉＫ９９で経口感
染させる。未処置対照群は、脱水後４８時間以内に死亡
する。被験仔ウシに本発明の抗アドヘツシンを経口投与
する。

数種の処置法が有効であった：接種後２時間以内または
下痢開始後すぐの投与、処置動物はすべて回復した。

臨床的改善はすみやかで、回復は４８時間以内に認めら
れた。本発明の製品の有効性は、血清または***物イオ
ノグラム、糞のｐＨ１水分喪失停止のような生化学的パ
ラメーターが正常化することにより示される。処置を受
けた仔ウシは、９０日間の観察期間中に胃腸の異常を全
く示さず、正常に成長し続けた。

抗アドヘツシン活性は、腸壁に付着する細菌叢を調べる
ことにより明らかにされる。

十二指腸、空隔および回腸の細菌数は、対照動物および
処置動物の腸壁を削り取ることにより計測した。そのた
め、および病原細菌叢を存在するかも知れないあらゆる
付着大腸菌性腸管゛細菌叢から区別し得るようにするた
め、接種物は、抗生物質耐性特性を有する。即ち、ナリ
ジクス酸耐性（Ｎａｌｒ　＞を旦、並旦　Ｋ９９株のマ
ーカーとする。

処置した仔ウシでは、付着旦、ｃｏｌｉ　　Ｋ９９Ｎ　
ａｌｔ病原細菌叢は、未処置対照群ウシにおける叢より
少なくとも２対数単位だけ減少する。

得られた結果を第■表に示す。

３）皇床試眉 本発明において、野外試験により、治療前に採取した糞
について行った系統的チェックにより、大腸菌、ウィル
スまたは寄生性の感染性の病原診断を確立することが可
能でめった。

薬物の効力を診断と比較する。下痢をしており、Ｋ９９
大腸菌の攻撃を受けやすい５日令以下の仔ウシおよび５
日令以上の仔ウシは、２種類の試験の２１９頭について
得られた第１Ｖおよび第Ｖ表の結果に示すように、抗ア
ドヘツシンにより高い割合で治癒する。

効力は、早期に、胃腸炎の最初の症状が出現するとすぐ
に抗アドヘツシンを投与すれば、より著しい。母ウシに
よる授乳は停止しなかったことは留意すべきである。

抗アドヘツシンは、通常の使用条件下の治癒力において
有効である。薬物の１〜２日間投与（１〜１０ｘ６０Ｉ
ｉｙ）が大腸菌、ウィルスまたは寄生性の下痢の有効な
治療に必要な期間であった。

４）薬物の無毒性 実験室において、本発明の薬物摂取により、’１２０１
ｒｌｓＦ／日で９０日間投与した幼若マウスあるいは仔
ウシにおいても、死亡は記録されなかった。動物の発育
にも影響はなかった。実験中、副作用は観察されなかっ
た。抗アドヘツシンのカテゴリーに属する生物学的起源
のこの薬物は、経口投与でも腹腔内投与でも全く無毒で
ある。

実験は、下痢している仔ウシ２１９頭で行った。治癒と
記録された動物のみが、獣外科医または飼育者により必
要と考えられたその他の処置や補助処置を除いて、本発
明に記載の抗アドヘツシンを投与されていた。

投与量：抗アドヘツシンは、飼育者が、ある動物の場合
長期投与を説明する著しい下痢を発見した後しばしば彼
の依頼により投与した。

前述の本文説明から明らかなように、本発明はここによ
り明示的に記載した実施方法、実施態様および適用方法
に限定されるものではない。

逆に、本発明の構成または範囲から逸脱することなく、
当業者に考えられるでおろうあらゆるるめ変形をも包含
するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は動物起源のオリゴマンノシド型のグリカン構造
を示す： 第２図は、植物起源のオリゴマンノシド型のグリカン構
造を示す； 第３，４図は反復または非反復、置換または非置換Ｎ−
アセチルラクトサミン単位を含有するｎグリカンの典型
的構造を示す； 第５〜７図は支持体にグラフトした核の内部配列の２，
３の例を示すもので、第５図は蛋白もしくはペプチド支
持体上の動物起源の糖ペプチド、第６図は蛋白もしくは
ペプチド支持体上の植物起源の糖ペプチド、第７図は脂
質支持体にグラフトした抗アドヘツシンをそれぞれ示す
；第８ａ図および第８ｂ図は、抗アドヘツシン濃度に対
する付着および付着減少の標準曲線をそれぞれ示す； 第９図は、旦、ｃｏｌｉ　　Ｋ９９に本発明アドヘツシ
ンを適用した場合のその阻害能を示すグラフである。 各図では下記の略号を用いる。 Ｍａｎ＝マンノース ｇ　Ｉ　ｃ＝ニブルコー スａｌ＝ガラクトース Ｘ＝炭水化物残基 Ｓｅ　ｒ＝＝セリン ＡＳｎ＝アスパラギン ＱＩＣ−Ｎａｃ＝Ｎ−アセチル−グルコサミンに７ａ　
Ｉ　−Ｎａｃ＝Ｎ−アセチル−ガラクトサミン Ｆｕｃ＝フコース ＳＡ＝シアリン酸 Ｔｈｒ＝スレオニン Ｆ、ａ、＝脂肪酸 ｘｙｌ＝キシロース （以　上） ＦｔＧ、３ ＡＳ　（０’ａ　ｎ）　−□　ｇａ目Ｏａ　ｎ）　□　
ｇ　Ｌｃ　Ｎａｃ　（Ｏら（Ｌ２−３　ｏｕ　６　　　
　　　　β１−４ｕ −ｕｃ Ａｓ（０占ｎ） ｇａ目１ｏｕＯ） ＩＯ２，４ ↑ ９８０１　ｏｕ　Ｏ） ＡＳ　（Ｏらｎ） Ｆ（Ｇ、／。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）種々の液体または固体有機基質に含まれるかある
   いはそれらに由来する糖蛋白および／または糖ペプチド
   、脂質構造物および／または糖脂質を酵素的および／ま
   たは化学的に溶解し、一部もしくは全体が糖の特性を示
   しその分子量が常に１０００以上である溶解に耐性な構
   造物を集め無菌化することを特徴とする細胞付着阻害剤
   、または抗アドヘツシンの製造方法。
2. （２）糖蛋白および／または糖脂質を有機基質から抽出
   することなく処理することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
3. （３）糖蛋白および／または糖脂質を、これが存在する
   生物学的媒質から抽出した後溶解することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）血漿糖蛋白を ａ）有機媒質中においてカプリル酸ナトリ ウムの存在下にエタノールで処理することにより抽出し
   、続いて ｂ）熱処理（６０〜７０℃）および沈澱し た糖蛋白の分離、および ｃ）蛋白分解およびさらに化学処理に付し、分子量１０
   ００以上の抗アドヘツシン構造物を得ることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項または第３項に記載の方法。
5. （５）糖蛋白を有機溶媒混合物の作用により抽出し、次
   に化学的溶解に付して抗アドヘツシンを得ることを特徴
   とする特許請求の範囲は第１項または第３項に記載の方
   法。
6. （６）溶解を、 １）糖蛋白の場合、カルシウムイオンの存 在下にｐＨ５〜７、温度８０℃以下で、プロテアーゼを
   用い、また、好ましくはサーモリジンを用いて行い、続
   いてヒドラジン分解もしくは類似の化学処理を行つて構
   成抗アドヘツシンを遊離させ、 ２）糖蛋白の場合、穏やかなアルカリ加水 分解により行い、続いて酸化分解もしくは類似の化学処
   理を行つて構成抗アドヘツシンを遊離させる、 ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
7. （７）抗アドヘツシンを任意の分離方法により精製し、
   濃縮および無菌化することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項〜第６項のいずれかに記載の方法。
8. （８）分子量１０００以上のオリゴ糖タイプであり、少
   なくとも３種の単純もしくは置換糖を含有し、その糖の
   １つが必ずラクトースかもしくはグルコースである、特
   許請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載のように
   して得た抗アドヘツシン。
9. （９）蛋白または脂質支持体にグラフトされた、特許請
   求の範囲第８項記載の抗アドヘツシン。
10. （１０）特許請求の範囲第８項および／または第９項に
    記載の抗アドヘツシンからなるもしくはそれを含有する
    薬物。
11. （１１）特許請求の範囲第８項および／または第９項に
    記載の抗アドヘツシンを含有する食品および食品添加物
    。