JPS61239898A - Production of hyaluronic acid - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To stably, extremely raise productivity stably and to produce inexpen sively hyaluronic acid, by cultivating a bacterium capable of producing hyaluronic acid in a specific culture solution. CONSTITUTION:100-2,500 units/l lytic enzyme (e.g., lysozyme), 0.5-10g/l surface active agent (e.g., cetyltrimethylammonium bromide), glucose, KH2PO2, anti- foaming agent, etc. are added to a culture solution which is sterilized under heating and cooled to <=45 deg.C. A bacterium (e.g., Streptococcus pyogenes) capable of producing hyaluronic acid is inoculated into the culture solution, cultivated at 25-40 deg.C at 6.5-8.5pH for 1-2 days aerobically and hyaluronic acid formed and accumulated in the culture solution is separated and purified.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒアルロン酸生成能を有する微生物（以下、ヒ
アルロン酸生産菌という。）によるヒアルロン酸の製造
法Ｃ二関する。さらＣ二詳しくは溶菌酵素および／また
は界面活性剤を添加した培養液でヒアルロン酸生産菌を
培養し、ヒアルロン酸を該培養液中に生成、蓄積せしめ
、これを採取することＣ：よるヒアルロン酸の製造法に
関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to method C2 for producing hyaluronic acid using microorganisms capable of producing hyaluronic acid (hereinafter referred to as hyaluronic acid-producing bacteria). Furthermore, C2: Specifically, hyaluronic acid-producing bacteria are cultured in a culture solution containing a lytic enzyme and/or a surfactant, and hyaluronic acid is produced and accumulated in the culture solution, and then collected. Concerning the manufacturing method.

ヒアルロン酸は関節、硝子体、屓帯、軟骨、皮膚、鳥類
のとさかなどの結合組織中Ｃ：その構成成分として存在
し、組織の柔軟性、構造維持、細胞の代謝調節などに重
要な機能を果たしている。また、該ヒアルロン酸は非常
に大きな高分子物質であり、その溶液は強い粘弾性を持
ち、保水作用を有するところから、化粧品、創傷治療剤
、眼薬、関節炎治療薬として広い用途がある。Hyaluronic acid exists as a component in connective tissues such as joints, vitreous body, ligaments, cartilage, skin, and bird crests, and plays important functions in maintaining tissue flexibility, maintaining structure, and regulating cell metabolism. Fulfilling. In addition, hyaluronic acid is a very large polymeric substance, and its solution has strong viscoelasticity and water-retaining properties, so it has a wide range of uses as cosmetics, wound treatment agents, eye medicines, and arthritis treatment agents.

従来、該ヒアルロン酸は工業的Ｃ二はＣ二わとりのとさ
か、牛の目の硝子体、または屓帯もしくは鯨の軟骨など
から抽出法（二より得られている。Conventionally, the hyaluronic acid has been obtained industrially from the comb of a chicken, the vitreous body of a cow's eye, or the ligament or cartilage of a whale.

しかし、これら生体から抽出法（二より得たヒアルロン
酸は蛋白質やコンドロイチン等のムコ多糖と複合体を形
成しているので、分離精製Ｃ二複雑な工程を必要とし、
またヒアルロニダーゼが混在することが多いので、抽出
、精製工程中で該ヒアルロン酸が分解されて分子量が低
下し、粘度および保水性が低くなるといった欠点がある
。このため培養法ｇ二よりヒアルロン酸を生産する試み
が特開昭５８−５６６９２号公報に開示されている。However, since the hyaluronic acid obtained from these living organisms forms a complex with proteins and mucopolysaccharides such as chondroitin, a complicated process of separation and purification is required.
Furthermore, since hyaluronidase is often present in the mixture, the hyaluronic acid is decomposed during the extraction and purification steps, resulting in a decrease in molecular weight, resulting in a disadvantage of low viscosity and water retention. For this reason, an attempt to produce hyaluronic acid using culture method g2 has been disclosed in JP-A-58-56692.

本発明者はヒアルロン酸の製造にかかわる上述の問題点
を解決するべく鋭意研究し、ヒアルロン酸生産菌を培養
するにあたり、該培養液Ｃ：血清を添加した培養液を用
いること（二より、該ヒアルロン酸の生産性が大巾（：
高まることを見い出し、特願昭５９−１８５１５０号と
して提案した。しかしながら、この方法は血清がロット
間ｇ二より品質Ｉ：ばらつきがあり、かつ他の培地材料
Ｉ：くらべて高価なため、ヒアルロン酸の製造コストが
高くなることが否めない。The present inventor has conducted intensive research to solve the above-mentioned problems related to the production of hyaluronic acid, and in culturing hyaluronic acid-producing bacteria, culture solution C: using a culture solution to which serum has been added (from the second point, The productivity of hyaluronic acid is huge (:
We found that this would improve the performance of the technology and proposed it as patent application No. 185150/1983. However, this method undeniably increases the production cost of hyaluronic acid because the serum quality varies between lots and is more expensive than other medium materials.

本発明者は安価Ｃ：かりヒアルロン酸の生産性を大巾（
二高めることのできる製造方法について鋭意研究をつづ
けた。その結果・ヒアルロン酸生産菌な培養するＣ二際
し、該培養液に溶菌酵素１　　　および／または界面活
性剤を添加した培養液を用いてヒアルロン酸生産菌な培
養することにより・製造コストを低下させ、かつヒアル
ロン酸の生産性を大巾に高めることができることを見い
出し、この知見にもとづいて本発明を完成した。The present inventor has greatly improved the productivity of inexpensive C:kari hyaluronic acid (
We continued to conduct intensive research on manufacturing methods that could improve the quality of our products. As a result, by culturing hyaluronic acid-producing bacteria using a culture solution with lytic enzyme 1 and/or surfactant added to the culture solution, production costs are reduced. The inventors have found that the productivity of hyaluronic acid can be significantly increased, and the present invention has been completed based on this knowledge.

本発明で用いる溶菌酵素および界面活性剤はロット間の
ばらつきがほとんどないので、常！−一定の品質および
生産量が確保できる。The lytic enzyme and surfactant used in the present invention have almost no variation between lots, so it is always easy to use! -A constant quality and production volume can be ensured.

以上の記述から明らかなようＩ：、本発明の目的は、ヒ
アルロン酸の生産性を安定かつ大巾に高め、しかも安価
にヒアルロン酸を製造する方法を提供することである。As is clear from the above description, an object of the present invention is to provide a method for stably and significantly increasing the productivity of hyaluronic acid and producing hyaluronic acid at low cost.

本発明は以下の構成を有する。The present invention has the following configuration.

溶菌酵素および／または界面活性剤を添加してなる培養
液にて、ヒアルロン酸生成能を有する微生物を培養して
、該培養液中にヒアルロン酸を生成蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とするヒアルロン酸の製造法。It is characterized by culturing microorganisms capable of producing hyaluronic acid in a culture solution containing a lytic enzyme and/or a surfactant, producing and accumulating hyaluronic acid in the culture solution, and collecting the hyaluronic acid. A method for producing hyaluronic acid.

本発明Ｃ：用いるヒアルロン酸生産菌としては、ストレ
プトコッカス中ピオゲネス （８ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕａ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　）
　。Present invention C: The hyaluronic acid-producing bacteria used are Streptococcus pyogenes (8treptococcua pyogenes).
.

ストレプトコッカス・エクイ （８ｔｒａｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕＩ　）　。Streptococcus equi (8traptococcus equi).

ストレプトコッカス・エクイシミリス （８ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕａ　ｅｑｕｌｓｉｍｌｌｌ
ｇ　）　。Streptococcus equisimilis
g).

ストレプトコッカス・ディスガラクチイエ（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇａｌａｃｔｌａｅ　）　。Streptococcus dysgalactiae (Strep
tococcus dysgalactlae).

ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（８ｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ　ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ　）　。Streptococcus zooepidemicus (8trept
ococcus zooepidemicus).

パスツレラ・マルトンダ （Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｆｄａ　）な
どがあげられる。Examples include Pasteurella multocfda.

本発明に用いる溶菌酵素は溶菌活性をもつすべての酵素
が利用できるが、リゾチームが最も好ましい。培養液に
添加する該溶菌酵素の量は特に制限されないが、好まし
くは培養液１ノ当り１００〜２５００単位、より好まし
くは３００〜２０００単位、最も好ましくは５００〜１
０００単位である。溶菌酵素の添加量が少なすぎるとヒ
アルロン酸の生成・蓄積が少なくなり、また該添加量が
多すぎると溶菌作用が大きくなり、ヒアルロン酸生産菌
の生育が阻害されるので好ましくない。As the lytic enzyme used in the present invention, any enzyme having bacteriolytic activity can be used, but lysozyme is the most preferred. The amount of the lytic enzyme added to the culture solution is not particularly limited, but is preferably 100 to 2,500 units, more preferably 300 to 2,000 units, and most preferably 500 to 1 unit per culture solution.
000 units. If the amount of the lytic enzyme added is too small, the production and accumulation of hyaluronic acid will be reduced, and if the amount added is too large, the bacteriolytic effect will increase and the growth of hyaluronic acid-producing bacteria will be inhibited, which is not preferable.

さら１：該溶菌酵素の添加時期は、添加しようとする培
養液を加圧蒸気滅菌法などで滅菌したのち、冷却し・温
度が４５℃以下Ｃ二なった時点で無菌的（：培養液Ｃ二
添加するのが好ましい。Further 1: The timing of adding the lytic enzyme is to sterilize the culture solution to be added by autoclaving, etc., then cool it and aseptically prepare the culture solution when the temperature reaches 45°C or below. It is preferable to add two.

本発明に用いる界面活性剤としては、臭化セチルトリメ
チルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム１ツイーン
８０（商品名、花王化学■製）−ツイーン９０（商品名
、花王化学■製）、ラウリル硫酸ナトリウム、トライト
ンＸ−１００（商品名、ロームアンドハース■製）、ス
パン８０（商品名、花王化学■製）、スパン９０（商品
名、花王化学■製）、ノニオン（商品名）、スルホコハ
ク酸ジエチルヘキンルなどをあげることができる。培養
液Ｃ：加える該界面活性剤の添加量は好ましくは培養７
ｘｔ当り０．５〜ｌｏｔで、より好ましくは０．５〜３
Ｆ、最も好ましくは１．０〜２．Ｏｆである。該界面活
性剤は培養液を加圧蒸気で滅菌する前に培養液Ｃ：添加
する。The surfactants used in the present invention include cetyltrimethylammonium bromide, cetylpyridinium chloride 1 Tween 80 (trade name, manufactured by Kao Chemical ■) - Tween 90 (trade name, manufactured by Kao Chemical ■), sodium lauryl sulfate, Triton X -100 (trade name, manufactured by Rohm and Haas ■), Span 80 (trade name, manufactured by Kao Chemical ■), Span 90 (trade name, manufactured by Kao Chemical ■), Nonion (trade name), diethylhexyl sulfosuccinate, etc. I can do it. Culture solution C: The amount of the surfactant added is preferably culture 7.
0.5-lot per xt, more preferably 0.5-3
F, most preferably 1.0-2. Of. The surfactant is added to culture solution C before the culture solution is sterilized with pressurized steam.

本発明シーあっては、溶菌酵素および／または界面活性
剤を添加する前の培養液の成分としては、ヒアルロン酸
生産菌を培養するのＣ：通常用し・られる培養液を用い
ればよく、例えばブドウ糖２．０〜３．０％、リン酸ｌ
カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫
酸ナトリウム０．０１％％硫酸マグネンウー〉原塩０．
０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト
０．００１％、塩化マンガン０．００１％、消泡剤Ｏ，
Ｓ％を含む成分でｐＨ６，ｏ〜８．５の培養液を用いる
ことができる。（ただし％はいずれも重量をｔ。In the present invention, as a component of the culture solution before adding the lytic enzyme and/or surfactant, a culture solution commonly used for culturing hyaluronic acid-producing bacteria may be used, for example. Glucose 2.0-3.0%, phosphoric acid l
Potassium 0.3%, dipotassium phosphate 0.2%, sodium thiosulfate 0.01%% Magnene sulfate raw salt 0.
01%, sodium sulfite 0.002%, cobalt chloride 0.001%, manganese chloride 0.001%, antifoaming agent O,
A culture solution containing S% and having a pH of 6.0 to 8.5 can be used. (However, all percentages refer to weight in t.

容量をｌとした重量／容ｔ％を表わし、以下特にことわ
らない限り％は上述の重量／容量％を表わす６　） 本発明のヒアルロン酸の製造は、まず溶菌酵素および界
面活性剤を含まない培養液または界面活性剤を含み、溶
菌酵素を含まない培養液を加圧蒸気滅菌法などで滅菌し
たのち・冷却し・１　　　該培養液の温度が４５℃以下
になった時点で溶菌酵素を無菌的Ｃ二該培養液Ｃ：添加
し、ついでヒアルロン酸生産菌な無菌的に該培養液ｌ：
接種する。溶菌酵素を添加しない場合には、界面活性剤
を添加した培養液を上述の加圧蒸気滅菌法などで滅菌し
たのち、冷却し、該培養液の温度が４５℃以下になった
時点でヒアルロン酸生産菌を無菌的に該培養液（二接種
する。ついでヒアルロン酸生産菌を接種した培養液を通
気攪拌もしくは静置して温度２５℃〜４０℃、好ましく
は３０’Ｃ〜３５℃の温度で、ｐＨ６，５〜Ｂ、０　、
好ましくは７．０に制御してヒアルロン酸生産菌を１〜
２日間培養したのち、該培養液（＝さらに糖成分を３％
追加してさらにｌ〜２日間培養してヒアルロン酸を生成
、蓄積させる。その後、該培養液を遠心分離もしくは濾
過によって除菌したのち、該Ｐ液を限外濾過もしくは透
析することによって低分子量物質を除去する。ついで低
分子量物質を除去したＰ液にメタノール、エタノールな
どのアルコールを添加して、ヒアルロン酸の粗生成物を
沈澱させ、該沈澱ヒアルロン酸を再び水Ｃ二溶解させた
のち、臭化セチル）９メチルアンモニウムを添加して該
臭化セチルトリメチルアンモニウムによる分画沈澱、つ
いでイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィーなど公知の精製手段によって１生成したヒア
ルロン酸を精製する方法（二より行なわれる。The weight/volume t% is expressed based on the volume in liters, and unless otherwise specified, % refers to the weight/volume % described above. After sterilizing a culture solution or a culture solution containing a surfactant but not containing a lytic enzyme using an autoclave sterilization method, etc., cool it. Add C2 to the culture solution C, and then add hyaluronic acid-producing bacteria aseptically to the culture solution L:
Inoculate. When a lytic enzyme is not added, the culture solution to which a surfactant has been added is sterilized by the above-mentioned autoclaved steam sterilization method, cooled, and when the temperature of the culture solution falls below 45°C, hyaluronic acid is added. The producing bacteria are aseptically inoculated into the culture solution.Then, the culture solution inoculated with the hyaluronic acid producing bacteria is stirred with aeration or allowed to stand still at a temperature of 25°C to 40°C, preferably 30'C to 35°C. , pH6.5-B.0,
Preferably, the hyaluronic acid-producing bacteria are controlled at 7.0 to 1 to 7.0.
After culturing for 2 days, the culture solution (=additionally 3% sugar component)
In addition, the cells are cultured for another 1 to 2 days to produce and accumulate hyaluronic acid. Thereafter, the culture solution is sterilized by centrifugation or filtration, and then the P solution is subjected to ultrafiltration or dialysis to remove low molecular weight substances. Next, alcohol such as methanol or ethanol is added to the P solution from which low molecular weight substances have been removed to precipitate the crude product of hyaluronic acid, and the precipitated hyaluronic acid is again dissolved in water (C2), followed by cetyl bromide)9. A method of purifying the produced hyaluronic acid (1) by adding methylammonium and fractional precipitation with the cetyltrimethylammonium bromide, followed by known purification methods such as ion exchange chromatography and gel filtration chromatography (2).

本発明の溶菌酵素および／または界面活性剤を添加して
なる培養液を用いた培養法を用いることにより・該溶菌
酵素および／または界面活性剤を添加しない通常の培養
液を用いた培養法（比較例）にくらベヒアルロン酸の生
産性を培養液ＩＩ！当り４〜５倍と大巾に向上させるこ
とができ、かつ血清を用いる培養法（＝くらべて、ヒア
ルロン酸の製造原価を１／２０以下に下げることが可能
となった。また、用いる溶菌酵素および界面活性剤は、
ロット間の品質のばらつきがほとんどないので、常に一
定の品質、生産量でヒアルロン酸の製造が可能となり画
期的なヒアルロン酸の製造法である。また本発明により
得られるヒアルロン酸は不純物の含有量がきわめて少な
く、高純度のヒアルロン酸であり・医薬品、化粧品の用
途に好適に使用することができる。By using a culture method using a culture solution to which the lytic enzyme and/or surfactant of the present invention is added; - By using a culture method using a normal culture solution without adding the lytic enzyme and/or surfactant ( Comparative example) Nikurabe hyaluronic acid productivity in culture solution II! In addition, the production cost of hyaluronic acid can be reduced to less than 1/20 compared to the culture method using serum.In addition, the lytic enzyme used and surfactants are
Since there is almost no variation in quality between lots, it is possible to produce hyaluronic acid with constant quality and production at all times, making it an innovative method for producing hyaluronic acid. Furthermore, the hyaluronic acid obtained by the present invention has an extremely low content of impurities and is a highly purified hyaluronic acid, which can be suitably used for pharmaceutical and cosmetic applications.

以上記述したように本発明に係るヒアルロン酸の製造法
は安定的に純度の高いヒアルロン酸をきわめて高い生産
性で製造できる方法であることが確認された。As described above, it has been confirmed that the method for producing hyaluronic acid according to the present invention can stably produce highly pure hyaluronic acid with extremely high productivity.

以下実施例および比較例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれにより限定されるものではない。EXAMPLES The present invention will be specifically explained below with reference to Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited thereto.

実施例１ ブドク＠　２．０％、酵母エキス０．５％、ペプトン１
．５％、リン酸１カリウム０．３％％！Ｊ７酸２カリウ
ム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１１％、硫酸マ
グネンウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．０
０２％、塩化コパル）　０．００１％、塩化マンガン０
０ＯＯ１％、大豆油０．５％からなるｐＨ７，０の培養
液１．５１を内容ｙｔ３．ｏｚのミニジャーファーメン
タ−に注入し、１２０℃で１５分間加熱滅菌し、室温ま
で冷却したのち、卵白リゾチーム０．７５　”Ｐ　（６
７５単位）を無菌的に該培養液に添加し、ついでストレ
プトコッカス・ズーエピデミカスの前培養液０．１７を
接種し、毎分３００回転、通気量０．７　ｖｖｍ　ｓ温
度３５℃でｐＨ７，０：：なるように自動制御して２４
時間培養した。その後、ブドウ糖の５０％水溶液１００
−をさらに該培養液に無菌的墨；加えて・上述の培養条
件下（−さらに２６時間培養したのち、該培養液（ニイ
オン交換水３．２１！を加えて攪拌し、ついで遠心分離
して菌体を除去した。得られた上澄液を中空糸限外ｆ過
機で１．６〕（：濃縮し、さらＣ：イオン交換水（二対
して透析した。Example 1 [email protected]%, yeast extract 0.5%, peptone 1
．． 5%, monopotassium phosphate 0.3%%! J7 dipotassium 0.2%, sodium thiosulfate 0.011%, magnesium sulfate heptahydrate 0.01%, sodium sulfite 0.0
02%, copal chloride) 0.001%, manganese chloride 0
1.51 of a pH 7.0 culture solution consisting of 1% 0OO and 0.5% soybean oil was added to the contents yt3. of egg white lysozyme 0.75"P (6
75 units) was aseptically added to the culture, and then 0.17 of a preculture of Streptococcus zooepidemicus was inoculated, and the mixture was incubated at 300 revolutions per minute, aeration volume of 0.7 vvm, and a pH of 7.0 at a temperature of 35°C. Automatically control so that 24
Cultured for hours. Then, 100% aqueous solution of glucose
- was further added to the culture solution in a sterile manner under the above-mentioned culture conditions (- After further culturing for 26 hours, the culture solution (3.21 liters of ion-exchanged water was added, stirred, and then centrifuged. The bacterial cells were removed. The resulting supernatant was concentrated using a hollow fiber ultraf filter and further dialyzed against ion-exchanged water.

この液Ｃ二酢酸ナトリウム０．５％を加え・さら（；エ
チルアルコール５ｊを加えてヒアルロン酸を含む多糖類
を沈澱させたのち遠心分離（二より分取した。分取した
ヒアルロン酸を含む多糖類をイオン交換水０，５／ｌ二
溶解させ、４％の臭化セチルトリメチルアンモニウム水
溶液０，２３　ｌ！を添加して生成した沈澱を分取した
。ついで該沈ζ 澱を０．３モル／ｌ！濃度の塩化ナトリウム水溶液４０
−（二分散し・遠心分離したのち・上澄液Ｃ二１２０ｆ
Ｒ１のエチルアルコールを添加し、生成した沈澱を分取
した。この分取した沈澱をイオン交換水（二溶解したの
ち、イオン交換クロマトグラフィー法で精製し１フ、９
　ｆの精製ヒアルロン酸す）リウムの白色粉末を得た。Add 0.5% of sodium diacetate to this solution C and further add 5j of ethyl alcohol to precipitate the polysaccharide containing hyaluronic acid. Sugars were dissolved in 0.5/l of ion-exchanged water, and 0.23 liters of a 4% aqueous solution of cetyltrimethylammonium bromide was added to collect the resulting precipitate.Then, the precipitate was dissolved in 0.3 mol of ion-exchanged water. /l! concentration of sodium chloride aqueous solution 40
- (After bidispersion and centrifugation, supernatant C2 120f
Ethyl alcohol of R1 was added, and the resulting precipitate was collected. This separated precipitate was dissolved in ion-exchanged water (2 times, then purified by ion-exchange chromatography method, 1st time, 9th time).
A white powder of purified hyaluronate (f) was obtained.

培養液ＩＩ！当り５．２ｔの生産量であった。この精製
ヒアルロン酸ナトリウムの蛋白質含有量は０．０５重量
％であった。また、ウベローデ粘度計Ｃ二よる極限粘度
ハ（？）　＝　１７，３　ｄｉ／ｆ　テ分子量１，００
５，０００ダルトンであることが確認された。Culture solution II! The production amount was 5.2 tons per unit. The protein content of this purified sodium hyaluronate was 0.05% by weight. In addition, the intrinsic viscosity according to Ubbelohde viscometer C2 = 17,3 di/f te molecular weight 1,00
It was confirmed to be 5,000 Daltons.

実施例２ ブドウ糖２．０％、酵母エキス０．５％・ペプトン１．
５％、リン酸ｌカリウム０．３％、リン酸２カリウム０
．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１１％・硫酸マグネ
シウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２
％、塩化コパル）　０．００１鴨、塩化マンガン０．０
０１％、大豆油０．５％および界面活性剤としてツイー
ン８０（商品名）１．５２を加えたｐＨ７，０の培養液
１．５１！ヲ内容積３、ｏＩ！のミニジャーファーメン
タ−（＝注入し１１２０℃、１５分間加熱滅菌し、室温
まで冷却したのち、ストレプトコッカス・エクイの前培
養液０．Ｉ　Ｉ！を無菌的（二接種し、実施例１（：準
拠した培養条件、培養方法で培養した。その後該培養液
を実施例１（：準拠した方法で精製処理し、６．１２の
ヒアルロン酸ナトリウムの白色粉末を得た。培養液１１
！当り４．１ｔの生産量であった。Example 2 Glucose 2.0%, yeast extract 0.5%, peptone 1.
5%, l potassium phosphate 0.3%, dipotassium phosphate 0
．． 2%, sodium thiosulfate 0.011%, magnesium sulfate heptahydrate 0.01%, sodium sulfite 0.002
%, copal chloride) 0.001 duck, manganese chloride 0.0
01%, soybean oil 0.5%, and a pH 7.0 culture solution 1.51 containing Tween 80 (trade name) 1.52 as a surfactant! Wo inner volume 3, oI! After injecting and heat sterilizing at 1120°C for 15 minutes and cooling to room temperature, the preculture solution of Streptococcus equi was aseptically inoculated (2 times) in a mini jar fermenter (Example 1 The culture was carried out under the same culture conditions and culture method as in Example 1.The culture solution was then purified using the same method as in Example 1 to obtain a white powder of sodium hyaluronate (6.12).Culture solution 11
! The production amount was 4.1 tons per unit.

この精製ヒアルロン酸の蛋白質含有量は０．０３重１１
％であった。またウベローデ粘度計（二よる極限粘度は
（η）　＝　１２．０　ａｔ／ｌ−ｃ分子ｉ１６２８，
０００ダルトンであることが確認された。The protein content of this purified hyaluronic acid is 0.03 times 11
%Met. In addition, the Ubbelohde viscometer (the intrinsic viscosity based on two is (η) = 12.0 at/l-c molecule i1628,
It was confirmed that it was 000 Daltons.

実施例３ ブドウ糖２．０％、酵母エキス０．５％、ペプトン１．
５％、リン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０
．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１１％、硫酸マグネ
シウム７水塩０，０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２
％、塩化コパル）　０．００１％、塩化マンガンｏ、０
０１％、大豆油０．５％からなるｐＨ７，０の培養液１
．５１！（二界面活性剤としてツイーンＳＯ（商品名）
　０．７　ｆを加えたのち・該培養液を内容積３．○ｌ
のミニジャーファーメンタ−Ｃ：注入し、１２０℃、１
５分間加熱滅菌し、室温まで、冷却したのち、卵白リゾ
チーム０．４岬（３６０単位）を無菌的Ｃ：添加し、つ
いでストレプトコッカス・ズーエピデミカスの前培養液
０．ＩＩ！を接種し、実施例ＩＣ二準拠した培養条件、
培養方法で培養した。その後、該培養液を実施例１（＝
準拠した方法で精製処理し、Ｂ　、　０’ｒ’（ｒ）精
製ヒアルロン酸ナトリウムの白色粉末を得た。培養液１
１！当り５．３２の生産量であった。この精製ヒアルロ
ン酸ナトリウムの蛋白質含有量は０．０４重量％であっ
た。また、ウベローデ粘度計（二よる極限粘度は〔η）
　＝　１５．Ｏｄｉ／ｆで分子量８３　’７．　ＯＯＯ
ダルトンであることが確認された。Example 3 Glucose 2.0%, yeast extract 0.5%, peptone 1.
5%, monopotassium phosphate 0.3%, dipotassium phosphate 0
．． 2%, sodium thiosulfate 0.011%, magnesium sulfate heptahydrate 0.01%, sodium sulfite 0.002
%, copal chloride) 0.001%, manganese chloride o, 0
Culture solution 1 with pH 7.0 consisting of 0.01% and soybean oil 0.5%
．． 51! (Tween SO (product name) as a dual surfactant
After adding 0.7 f, the culture solution was reduced to an internal volume of 3. ○l
Mini jar Fermenter C: Inject, 120°C, 1
After heat sterilization for 5 minutes and cooling to room temperature, 0.4 cape (360 units) of egg white lysozyme was added aseptically, followed by 0.4 cape (360 units) of egg white lysozyme, followed by 0.4 cape (360 units) of a preculture of Streptococcus zooepidemicus. II! inoculated with culture conditions according to Example IC 2,
It was cultured using the culture method. Thereafter, the culture solution was mixed with Example 1 (=
Purification treatment was carried out in accordance with a method according to the present invention to obtain a white powder of B, 0'r' (r) purified sodium hyaluronate. Culture solution 1
1! The production amount was 5.32 per unit. The protein content of this purified sodium hyaluronate was 0.04% by weight. In addition, the intrinsic viscosity based on the Ubbelohde viscometer is [η]
= 15. Molecular weight at Odi/f: 83'7. OOO
It was confirmed that it was Dalton.

比較例１ ブドウ糖２．０％、酵母エキス０．５％、ペプトン１．
５％、リン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０
．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１１％、硫酸マグネ
シウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウムＱ、ＯＯ２
％、塩化コバルト０．００１鴨、塩化マンガン０８ｏｏ
１％、大豆油０．５％からなるｐＨ７，０の培養液１．
５１を内容積３．０／＋７）ミニジャーファーメンタ−
Ｃ：注入したのち・１２０℃・１５分間加熱滅菌し・室
温まで冷却したのち、ストレプトコッカス・ズーエピデ
ミカスの前培養液０．１１を接種し、実施例１（＝準拠
した培養条件、培養方法で培養した。その後、該培養液
を実施例１（：準拠した方法で精製処理し％　１．５　
ｆの精製ヒアルロン酸ナトリウムの白色粉末を得た。培
養液１１！当り１．Ｏｆの生産量であった。この精製ヒ
アルロン酸ナトリウムの蛋白質含有衛は０．０３重量％
であった。またウベローデ粘度計（：よる極限粘度は〔
η）　＝　１２．Ｏｄｚ／ｌで分子量６ｔ２８，０００
ダルトンであることが確認された。Comparative Example 1 Glucose 2.0%, yeast extract 0.5%, peptone 1.
5%, monopotassium phosphate 0.3%, dipotassium phosphate 0
．． 2%, sodium thiosulfate 0.011%, magnesium sulfate heptahydrate 0.01%, sodium sulfite Q, OO2
%, cobalt chloride 0.001 duck, manganese chloride 08oo
1. pH 7.0 culture solution consisting of 1% soybean oil and 0.5% soybean oil.
51 to internal volume 3.0/+7) mini jar fermenter
C: After injection, heat sterilization at 120°C for 15 minutes, and cooling to room temperature, 0.11 of a preculture solution of Streptococcus zooepidemicus was inoculated and cultured under the culture conditions and culture method according to Example 1 (= Thereafter, the culture solution was purified by a method according to Example 1 (% 1.5
A white powder of purified sodium hyaluronate of f was obtained. Culture solution 11! Win 1. The production volume was of. The protein content of this purified sodium hyaluronate is 0.03% by weight.
Met. In addition, the intrinsic viscosity according to the Ubbelohde viscometer (:
η) = 12. Molecular weight 6t28,000 in Odz/l
It was confirmed that it was Dalton.

以上 、１　　　　　　　　特許出願人　　チ　ッ　ソ　株　
代金　社代理人　弁理士　佐々井　彌太部 同　上　野中克彦 手続補正書 昭和６０年７月η日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 屯 １、事件の表示 昭和６０年特許願第８０９４９号 λ　発明の名称 ヒアルロン酸の製造法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 大阪府大阪市北区中之島三丁目６番３２号（〒５３０）
（２０７）チッソ株式会社 側者野木貞雄 ４、代理人 東京都新宿区新宿２丁目８番１号（〒１６０）５゜補正
命令の日付 ６、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ７、補正の内容 （１）明細書簡２頁１１行目〜１２行目「または贋帯も
しくは」を「もしくは屓帯または」に補正する。Above, 1. Patent applicant: Chisso Co., Ltd.
Katsuhiko Nonaka, Attorney-at-Law, Patent Attorney, Yata Sasai, Patent Attorney, Katsuhiko Nonaka, July 1985, Commissioner of the Japan Patent Office, Michibu Uga, Todonun 1, Indication of Case, 1985 Patent Application No. 80949λ Title of Invention Production method of hyaluronic acid 3, relationship with the amended case Patent applicant 3-6-32 Nakanoshima, Kita-ku, Osaka-shi, Osaka (530)
(207) Chisso Corporation Parter Sadao Nogi 4, Agent 2-8-1 Shinjuku, Shinjuku-ku, Tokyo (160) 5゜ Date of amendment order 6, "Detailed description of the invention" of the specification to be amended Column 7, Contents of amendment (1) In the 11th and 12th lines of page 2 of the specification letter, "or a counterfeit belt or" is amended to "or a counterfeit belt or".

（２）　　明細書第６頁１２行目「ノニオン（商品名）
」を「ノニオン（商品名、日本油脂■製）」に補正する
。(2) Page 6, line 12 of the specification “Nonion (product name)
" is corrected to "Nonion (product name, manufactured by NOF ■)".

（３）明細書第１０頁８行目と９行目の間に次の文章を
挿入する。(3) Insert the following sentence between lines 8 and 9 on page 10 of the specification.

「なお、本発明で用いたストレプトコッカス・ズーエピ
デミカスは農林水産省家畜衛生試験場より入手し、スト
レプトコッカス・エクイは東京大学医学部附属医科学研
究所よシ入手した。」 （４）明細書簡１３頁７行目「この精製ヒアルロン酸の
」を「この精製ヒアルロン酸ナトリウムの」に補正する
。"The Streptococcus zooepidemicus used in the present invention was obtained from the Livestock Hygiene Laboratory of the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, and the Streptococcus equi was obtained from the Institute of Medical Science, Faculty of Medicine, University of Tokyo." (4) Specification Letter, page 13, line 7. Correct "this purified hyaluronic acid" to "this purified sodium hyaluronate".

以上that's all

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）溶菌酵素および／または界面活性剤を添加してな
る培養液にて、ヒアルロン酸生成能を有する微生物を培
養して、該培養液中にヒアルロン酸を生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とするヒアルロン酸の製造法
。(1) Cultivating microorganisms capable of producing hyaluronic acid in a culture solution containing a lytic enzyme and/or a surfactant, producing and accumulating hyaluronic acid in the culture solution,
A method for producing hyaluronic acid, which comprises collecting the hyaluronic acid. （２）溶菌酵素としてリゾチームを用いる特許請求の範
囲第（１）項に記載のヒアルロン酸の製造法。(2) The method for producing hyaluronic acid according to claim (1), which uses lysozyme as the lytic enzyme.