JPS61227789A - ピルビン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はピルビン酸の製造法に関する。

ピルビン酸は解糖系で生じる中間代謝産物であり、生体
細胞の中では糖代謝、アミノ酸代謝においてｆｆｉ要な
役割を果しておシ、細胞に対して代謝促進物質として作
用することが知られている。まｔ工業的にはアラニン、
チロシン、トリプトファン等の各種のアミノ酸の製造原
料として、更に種々の医薬製造の中間原料として広い用
途を有している。従って安価に製造し得れば種々の合成
原料として、ｔた代謝促進物質として極めて有用である
。

（従来の技術） 従来、微生物によるピルビン酸の生産に関しては、特開
昭５１−７９８５号公報におけるキャンディダリポリチ
カ（Ｃａｎｄｉｄａ　Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）　　のメ
チオニン要２．変異株を用いた発酵法による生産、特開
昭５７−１５９４９２号公報における担子菌アガリクス
０カンプストリス（Ａｇａｒｉｃｕｓ　Ｃａｎｐｅｓｔ
ｒｉｓ）を用い次発酵法による生産が報告されている。

ま九本発明者等は既にペディオコッカス（Ｐｅｄ−ｉｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属またはアエロコツカス（Ａｅｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属に属するピルビン酸生産能を有する細菌に
よる発酵法を提案し友。

（発明の解決しようとする問題点） しかしながら、これらの報告においては対象徴生物を栄
養培地中に培養し、該＠漬物よ゛シビルビン酸を抽出分
離しようとすることを特徴とするものであり、複雑な培
地成分および微生物の発酵代謝産物の混合物より抽出分
離しなければならないために１分離精製がむづかしいと
いう問題があシ。

またピルビン酸の生成は微生物増殖と共に行なわれるも
ので、微生物増殖に時間がかかるためにピルビン酸生成
に時間がかかるという問題、更には一旦生成したピルビ
ン酸が培養中に微生物自身によって代謝分解されて、生
成収量が低下する等々の問題があり、工業的にピルビン
酸を製造する方法としては必ずしも有利な方法とは言え
ない。

（問題点を解決するための手段） そこで本発明者等は工業的に効率のよいピルビン酸のｌ
ｌ！造を行なう方法を開発すべく鋭意研究を行なった結
果、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属又
はアエロコツカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）　　＠に属
する微生物を栄養培地に培養し、該培養物よシ培養液を
除いて得られる菌体または菌体処理物に、培養に使用さ
れ得る炭素源としての糖類のｌｉｔまたは２種以上を水
性溶媒中、好気条件下に添加作用せしめ、微生物の増殖
がなくとも、ｔＡ作用溶液中に多量のピルビン酸が短時
間で生成蓄積することを見出し、本発明を完成するに至
った。

すなわち、本発明はペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏ−（
ｏｃｃｕｓ）　Ｗ４’ｔたはアエロコツカス（Ａｅｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属に属するピルビン酸生産菌を栄養培地
に培養し。

該培養物から培養液を分離除去し、得られた菌体または
該菌体処理物に、１種または２種類以上の糖類を添加牢
番し、生成したピルビン酸を採取することを特徴とする
ピルビン酸の製造法である。

本発明において用いられる菌株としては、ペディオコッ
カス属に属するピルビン酸生産能を有するものならば、
どのような菌株でも使用可能である。例、ｔ　ハ、ペデ
イオコツカスホマリ（Ｐｅｄｉｏｃｏ−ｃｃｕ＠ｈｏｍ
ａｒｉ）、ペダイオコツカス囃アシデイラクテイＶイ（
Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）
、ベデイオコツカスセリヴイジイｘ　（Ｐｅｄｉｏｃｏ
ｃｃｕｓ　５ｅｒｅｖｉｓ　−１ｕｅ）、ベデイオコツ
カスバルヴアラス（Ｐｅｄｉｏｃｏ−ｃｃｕａ　ｐｓ＊
ｒｖａｌｕｓ）、ペディオコッカスφウリナエーエクイ
（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｗｒｉｎａｅ−ｅｑｕｉ）
等のペディオコッカス属に属するピルビン酸生産性細菌
が挙げられる。またアエロコツカス・ビリダンス（Ａｅ
ｒ−ｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｉｒｉｄａｎｃｅ）　　などの
アエロコツカス属に！ 属するピルビン酸呑菌性細菌も使用される。

本発明では上記ピルビン酸生産菌のほかにこれらの菌株
に種々の突然変異処理を行なって得られる高ピルビン酸
生産性変異株等が使用可能である。

本発明方法は、前記細菌を適当な炭素源、窒素源、有機
促進物質等を含む栄養培地に培養して得た培養物から培
養液を除去して得られる菌体または該菌体処理物に、Ｎ
類のｆｌｉｔたは２種以上を好ましくは水性溶媒中好気
条件下に添加作用せしめ、ピルビン酸を生成せしめるも
のである。本発明において、ｔず前記細菌を培養するた
めの栄養培地に使用され得る炭素源としては、グリセロ
−／ｖ、グルコース、フックドース、ツクドース、Ｖニ
ークロースあるいは廃糖蜜などが使用できる。

窒素源としてはペプトン、酵母エキス、肉エキス。

コーンステイープリカーなどの窒素源が良い。無機塩類
としてはカリウム、ナトリウム、マンガン。

マグネシウム、亜鉛、鉄などの金属塩類や硫°註、リン
酸、塩酸、硝酸などの塩類が使用できる。有機促進物質
としては、特に酵母エキス、アスコルビン酸、α−ケト
グルグル酸等が有効であるが。

またピルビン酸自体もむの目的に使用し得る。

培地のｐＨは中性付近とし、培養は通気攪拌。

振とうなどの好気培養を２５〜３２℃で１０〜１００時
間、好ましくは２０〜２５時間行なう。

この場合、培養中はピルビン酸の生成に伴って培地のｐ
Ｈ低下が起こるので炭酸カルシウム、炭酸ナトリクム、
苛性ソーダ、苛性カリを九はリン酸ｌ水素ナトリウム（
ｔたはカリウム）等のアルカリ水溶液でｐＨ６〜８に調
整することがピルビン酸生産能を高率で維持する九峠に
好ましい。

次に培養終了後、培養物から培養液を分離除去して菌体
を得る方法としては、前記培養物を遠心分離する方法、
自然濾過、高圧濾過（例えばフィルタープレス法）する
方法等１通常の微生物集菌法が用いられる。また前記の
如くして得られた菌体から得る菌体処理物としては、そ
の乾燥菌体。

あるいは生菌体を磨砕、自己消化、音波処理等により得
た処理物、更にはこれら菌体よシの抽出物並びに該抽出
物よシ得られるピルビン酸生成に関与する酵素画分等が
あげられる。

続いて前記の如くして得られた菌体または該菌体処理物
に１種または２種類以上の糖類を好ましくは好気条件下
に水注溶謀中で作用せしめる方法としては、前記菌体ま
たは菌体処理物に、１種または２種類以上の糖類を水ま
たは緩衝液に溶解して得られる水溶液を、菌体または菌
体処理物当シ１０〜１０００重量部添加した後、好気条
件下に振とうまたは通気攪拌することによって行なうこ
とができる。また別の方法としては、菌体または菌体処
理物を通常の公知の固定化法によって固定化した後、カ
ラムに充填し、該カラムに前記のようにして調製した糖
類含有水溶液を流す方法によっても行なうことができる
。なお、後者の固定化した菌体または菌体処理物をカラ
ムに充填して行なう方法が、目的とするピルビン酸生成
を連続化できるので、工業的には有利である。

本発明において使用する糖類としては１本発明の微生物
の培養に用いられる栄！Ｉ培地に炭素源として使用され
る糖類ならば、どれでも使用可能である。他の糖類の中
でもピルビン酸を生成し得るものならばどのような糖類
でも使用可能である。

すなわちグリセロール、グルコース、フラクトース、Ｖ
ニークロース、ラクトース、ガラクトース傅から選ばれ
る糖類の１種または２＠ｉ以上を混合して水または緩衝
液に溶解して使用され得るものである。またこの時使用
される糖の濃度は１〜３０チ、好ましくは２〜１０％で
使用される。なお、使用される糖類を溶解する緩衝液と
しては、リン酸緩衝液、）リス・塩酸緩衝液等、有機、
無機いずれの緩衝液でも用いることができる。更にこれ
ら糖類を作用せしめる方法においては、ピルビン酸の生
成蓄積を便通する目的で１作用温度を１０〜４０℃、好
ましくは２５〜３５℃に保ち。

また菌体または菌体処理物と糖液の混合物を振とう１通
気攪拌等によシ好気条件に保つととが好ましい・ 次に、前記の如くしてピルビン酸を生成せしめた後、ピ
ルビン酸を採取する方法としては、菌体または菌体処理
物を単に糖液に懸濁することによシ作用せしめた場合に
は、該懸濁液に、ｔたは該懸濁液からＦＭ、遠心分離等
により菌体を除去して得られた上清液に、あるいは菌体
または菌体処理物を固定化してカラムに充填して糖液と
作用せしめた場合にはカラムよシ流出する流出液にそれ
ぞれ塩酸ｔ−添加してｐＨ２以下の塩酸酸性液とした後
、疎水性の有機溶媒で抽出する方法で行なうことができ
る。ここで用いられる疎水性有機溶媒としては、エチル
エーテル、メチルエチルケトン。

クロロホルム、石油エーテル、酢酸エチル等力有効であ
る。

本発明では有機溶媒抽出液を５０℃以下で減圧濃縮し、
該濃縮物を冷水に溶解した後、苛性ソーダ水溶液を添加
してｐＨ６前後に調整した後、エチルアルコールを添加
するとピルビン酸はピルビン酸ナトリウムとして結晶化
し沈殿を形成するので、該エタノール沈殿物をＰ：ａま
たは遠心分離によって集め、減圧乾燥してビルビン酸ナ
トリ°つ、ムの粉末として採取する。

（発明の効果）″ 本発明では医薬品、化学工業品の製造中ｆｉｆｌ料とし
て、また代謝促進物質として工業的に極めて有用なピル
ビン酸を分離菌体法（これを菌体酵素法と呼称する）に
より安価に効率良く製造することができる。

（実施例） 次に本発明を実施例により更に詳しく説明する。

実施例１゜ ポリペプトン０．８　％　、粉末肉エキス０．４　％　
、グリセロール６Ｌ酵母エキス０．６チ＊　Ｋ！　ＨＰ
Ｏ４２，２５Ｔｏ　、　　ＫＨ２ＰＯ４０，４Ｔｏ　、
　ＭｆＳ０４４Ｈｇ００．０５Ｔｏ　、　Ｆｅ５Ｏａ　
４ＨｚＱ０．００５％、　ＭｎＣｊ＊　・４ｆｌｚ８０
．００３９ｋ　、　ＮａＣＪ　Ｏ，００２％、　Ｃ１Ｃ
Ｊｔ　・２ＨｔＯＱ、０００２％。

Ｚｎ５Ｏ＜　・７Ｈ＊　ＯＯ，０００１’１に、　ビ＊
ビｙａ０．２％を水道水に溶解し、　ｐＨ７，２に調整
し、１０１容ジャーファーメンタ−に分注して、１２０
℃で２０分間オートクレーブ滅菌した培地を得た。次い
で同じ組成の培地で予め３０℃１５時間振盪培養したベ
グイ、ｔ：Ｉ？／カス−＊ｆｆす（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ｈｏｍａｒｉ）ｘｐｏ１２２１７株、ペディオコ
ッカス命ホマリ（Ｐｅｄｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｍａｒ
ｉ）　Ｉ　ＦＯ１２２１７株及びペディオコッカス・セ
リヴイジイエ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｓｅｒｅｖｉｓ
Ｉａｅ）　Ｉ　ＦＯｌ　２２３０株の培養菌体液（培地
当Ｄ２％相当）を接取し１通気攪拌条件下、３０℃で２
４時間培賞した。

＠養中はｐＨ７±０．１になるように苛性ソーダ水溶液
でｐＨＩＩＮ整した。通気攪拌中は６時間毎に２４時間
まで２０ｄづつ懸濁液を抜取り、＃ｉ体濃度は０Ｄａｏ
０の吸光度測定によ゛り、またピルビン酸含有量は乳酸
脱水素酵素を用いたＮＡＤＨｓの吸光度測定法による常
法で測定した。

一方、培養２４時間目には培！ｉＩを止め、培養物を全
て抜き取シ、冷却下に遠心分離し、Ｖｉ４体を集メｆｔ
−後ｓ　Ｏ−８９ｋ　Ｏ！ｊ　ｙ酸＊　！Ｊ緩［ｒ　＋
’［（ＫＩ　ＨＰＯ４−ＫＨ＊ＰＯ４，ｐＨ７，０）　
ｌ　ｊに該菌体を懸濁し、前記同様にして遠心分離して
沈殿菌体を得、湿重量を測定した。これらの測定結果は
第１表に示した。

第　　　Ｉｆｆ 次に上記において得た菌体の全盆を５％のグリセロール
含有Ｏ，Ｓ　Ｓリン酸緩衝液（ＫＩ　ＨＰＯ４−ＫＨｚ
ＰＯ４，ｐＨ７，０）　６　Ｊに均一に分散懸濁した後
、１０Ｊジヤーフアーメンタに入れて前記と同様の方法
によシ３０℃で２４時間通気攪拌した。

通気攪拌中は苛性ソーダ水溶液を添加しながら懸濁液の
ｐＨが７±０．１に保たれるようにした。通気攪拌中は
、６時間毎に２４時間まで２０ｍｔづつ懸濁液を抜き取
プ、菌体濃度及びピルビン酸含有量を前記と同様の方法
で測定した。その結果は第２表に示す通りであった。

第２表 一方１通気攪拌２４時間目には通気攪拌を止め。

懸濁液を採取し、遠心分離を行なった後、上滑液と菌体
を得た。ここで得た上滑液をｌｊ採取し。

塩酸を加えてｐＨ２以下とし、ＩＪのエチルエーテルで
３回抽出し、抽出液（エーテμ層）を合わせて５０℃以
下で減圧乾燥した。析出したピルビン酸を１００腸ｔの
冷水に溶解後、苛性ソーダ液を少しづつ加えてｐＨ６，
０とした後、エチルアルコールを滴下したところピルビ
ン酸ソーダの結晶を析出した。

析出したピルビン酸ソーダをグラスフィルター上に集め
エタノールで洗浄後、Ｍ圧下に乾燥・して粉末を得て重
量測定した。更にこの粉末ｌｆを正確に秤取し、冷水に
溶解後、乳酸脱水素酵素を用いて常法に従ってピルビン
酸含有率を測定した。

前記遠心分離後の菌体の湿重量、上清液１ｊから得られ
た粉末の重量及び粉末１ｆ中のピルビン酸含有率の測定
結果は第３表に示す通りでらった。

第　　　３　　　表 （発明の効果） 本発明は、＆生物によるピルビン酸の製造を目的とする
ものであシ、実施例に示される如く、短時間でのピルビ
ン酸の生成が可＃ｒ、　（発酵法で２４時間培養時の生
成蓄積量（第１表）を本発明方法での生成蓄積量（第２
表）の比較において生成蓄積速度は本発明方法が著しく
早く、生成量も多い）であシ、また第３表に示される如
く、得られたピルビン酸ソーダの粉末の純度も高いこと
が明らかとなシ、効率的なピルビン酸の製造法となるこ
とが明らかとなった◎

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ペデイオコツカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属または
   アエロコツカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属するピ
   ルビン酸生産菌を栄養培地に培養し、該培養物から培養
   液を分離除去し、得られた菌体または菌体処理物に１種
   または２種以上の糖類を添加し、生成したピルビン酸を
   採取することを特徴とするピルビン酸の製造法。