JPS61197528A - 免疫毒素製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） この発明は免疫毒素製剤に関する。

（従来技術の説明） 先行技術であるフランス特許７８／２７８３８およびそ
の追加特許７９／２４６６５およびフランス特許出願８
１１０７５９６および８１／２１８３６において出願人
は破壊される細胞に保持されている抗原に対する抗体め
るいは抗体の部分とりシンのＡ鎖を共有結合によりて結
合させることによって得られる抱合体と呼ばれる制癌物
質の製造方法を記載している。この種の製品は本出願の
中では免疫毒素という一般名によって表現されている。

フランス特許出願８１／２１８３６．８２１０２０９１
゜８２１０４１１９、８２１０４０４７．８２１０４５
４７において出願人はある種の物質が（アンモニウム塩
、１価のカル〆キシリクイオノフォア、メチルアミン、
クロロキン、アンモニアを放出することの可能な酵素抱
合体）免疫毒素の細胞毒作用を増強する能力があること
を示した。

しかしながら活性化されたあるいは活性化されてない免
疫毒素の治療効果はその免疫毒素がその抗体の部分と共
に活性型の形でｉｎ　ｖｉｖｏの状態で破壊される標的
細胞上に局在化（免疫毒素の活性のすべての表現に不可
欠な条件）させる能力があるならば、その時にのみ完全
に表われるのである。標的上に局在化される免疫毒素の
能力はまっ先に活性型の形で血流中およ、び細胞外液の
中で、標的細胞に到達するのに十分な時間とどまり、更
に対応する抗原の部位を高度に占有するのに十分な高濃
度にとどまる免疫毒素の能力に依存している。

出願企業は多くの動物種の静脈内の注射の後に免疫毒素
の血漿内除去機作を証明することを可能にし九人規模な
試験を遂行した。注射後に生化学的に活性な免疫毒素の
血漿内濃度が急激に、しかも徹底的に減少することが見
出された。

かくして、兎を含む典型的事例において、すなわちリシ
ンのＡ鎖をジスルフィドの橋かけを含む結合によって人
間の’ｌ’　ＩＪンパ細胞のＴ６５抗体に対するモノク
ロナル抗体と連結させることによって作られ几免疫毒素
を使用したモデルにおいて、注射後０時に血流中に存在
している免疫毒素の９７％が３０分間に消滅し、９９．
９％が１７時間中に消滅することが見出された。リシン
のＡ鎖に抗体を連結させる結合がジスルフィド結合の代
りにチオエーテル結合を含んでいる場合でも得られた結
果は同様であり九。免疫毒素のこの急激な消滅は全く明
らかに完全な細胞毒能力の表現を減少させ、細胞毒素は
破壊される細胞が保持している標的抗原を高駆で持続的
に飽和させることを妨げている。更に免疫毒素の血漿内
除去機作と対応する非抱合型抗体の血漿内除去機作との
比較は、公知のように抗体は血漿中にかなシの長時間高
濃度に保たれているという顕著な差異を示している。さ
て、最高純度の免疫毒素の製造においてもなお常に非抱
合型抗体の一定の残余濃度が存在するのである。

免疫毒素および抗体の除去の異った北本の効果によって
、当初少数成分中に極めて多数あった非抱合型抗体が徐
々に数分後に多数成分になり、その結果これら抗体は徐
々に免疫毒素をその標的に固定するための強力な拮抗物
質になろうとする。

本研究は活性型の形で血漿中にある免疫毒素の持続性を
増強する価値を明らかに示しており、経過時間と標的抗
原の占有度の両者を増大し、その結果免疫毒素の治療効
果を改善することを示している。

（発明の詳細な説明） 本発明は免疫毒素の特徴的な固有の性質に不利に作用す
ることなく注射後に血漿から免疫毒素の急速な除去を阻
害することを可能にする薬効のある会合体に関係するも
のである。

驚くべきことには、本発明によればマンナンが免疫毒素
の血漿濃度を増大させるための特に価値あるタイプの物
質を構成していることが見出された。マンナンという用
語はここではマンノース残基を高率で含有し、更に特異
的にはマンノース残基を２０チ〜１００％含有し、これ
らマンノース残基をお互いにあるいは他の糖類に結合し
ていているグリコサイド結合とは関係なく、１０００以
上の平均分子量を有するポリオサイド（ｐｏｌｙａｍｉ
ｄｅ　）あるいは多糖類炭水化物高分子を示すことに使
用されている。特に、更に非制限的実施例において、イ
ースト（例えば、サッカロミセスセレビシアエＳａｃｅ
ｈａｒｏｍｙｃｅａｃｅｒｓｖｉｓｉａａ）から単離さ
れた天然のマンナンをすなわち、これらイーストの細胞
壁に属しているペグチドグリカンの炭水化物部分を使用
することが本発明の用語の範囲内で可能である。蛋白質
−マンナン錯体は多糖類の成分が錯体の５０チ〜９０％
を示すような高分子の混合物でおる。マンナン部分はＤ
−マンノースの高分子そのものである。この高分子はα
１→６位で結合しているマンノース残基の骨格よりなり
、αｌ→３とα１→２結合と含有する異なった長さの余
分の側鎖を有している。

驚くべきことには、それ自身であるいは免疫毒素との会
合体でもマンナンが動物に毒性と示さない投与量で使用
して、マンナンは免疫毒素の血漿白濃度を極めて高率に
（１００の桁で）しかも持続的方法で、増大することを
可能にし、これによって前述のように標的上でその局在
化を顕著に改良し、生成物中の遊離の抗体の存在による
固定化阻害現象を顕著に回避することになった。

マンナンに顕著な毒性がない事が免疫毒素との会合体の
医薬品としての使用の迄めに有利な物質になったのであ
る。マンナンと免疫毒素との会合体は、免疫毒素の個有
の毒性を顕著に増加せず、上述の増強剤が存在している
場合あるいは存在していない場合において、免疫毒素特
有の特異的な細胞毒特性をこの会合体は妨げるものでは
ない。

更に特異な標的を持たない動物に注射され九放射性標識
つきの免疫毒素のｉｎ　ｖｔｖｏ局在化に関与する実験
は、抱合体は注射後最初の数分間優先的に肝臓に局在化
することを示した。同様の事はＡ鎖にも妥当し、非結合
の形で注射された時にＡ＠は同様のパターンを示す。こ
の事は、免疫毒素は免疫毒素の中に含まれているリシン
のＡ鎖を通じて肝臓中に固定されるということを強く示
唆するものである。リシンのＡ鎖は、グリコプロティン
であり、そのポリオサイディク（ｐｏｌｙｏｓｉｃＨｃ
　）基はマンノース残基とＮ−アセチルグルコサミン残
基よりなっていて、マンノース残基は末端に存在してい
ることはよく知られている。

Ａｇｒ、　　Ｂｔｏｌ、　Ｃｈｉｎ、　１９７８年　４
２巻　５０１頁。

また、これら末端のマンノーズ残基を含有しているグリ
コプロティンを認識する能力のあるレセプターは肝臓中
に存在していることが見出されている。

これらレセプターによって認識されたグリコプロティン
−レセプターは大部分クラブエル細胞上に存在している
、これら細胞に固定することによって血流中からすみや
かに除去され、これら細胞がこれらを代謝することが示
されているのである。特にβ−グルクロニダーゼとり？
ヌクレアーゼＢの場合にこの事はよく証明されている０
Ａｒｃｈ、　Ｂｔｏｅｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、１９
７８年１８８巻　４１８頁：　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　編集者Ａ、　Ｍｅｊｍｔａ
ｒ　　二、−ヨーク（１９７４年）。

Ｐｅｄｔａｔ、　Ｒ１！１１．１９７７年１１巻８１６
負う全体として観察するならば、この情報は免疫毒性の
急速な除去は肝臓細胞、特にクラブエル細胞によるりシ
ンのＡ鎖のマンノーズ残基の認識によって説明されうろ
ことを示している。リシンの人鎖を含有する免疫毒素の
血漿内の急速な除去を阻害するマンナンの特性は投与さ
れたマンナンがグリコプロティンのレセプター細胞を占
拠し、し几がってリシンのＡ鎖が保有しては、あるいは
りシンのＡ鎖を含んでいる抱合体が保有している、ポリ
オサイデイク部分のこれらレセプターによる認識を阻害
しているという事実によって容易に説明される。

リシンのＡ鎖を含む免疫毒素の急速な血漿内除去を阻害
しているマンナンの特性は、上記の理由のためにリシン
の結合されてないＡ鎖−あるいはりシンのＡ鎖を含有す
るあらゆる天然産の、半合成による、あるいは合成によ
るノ・イブリッド分子に適用され、リシンのＡ鎖に抗体
を結合させるのに選択される結合の様式には関係せず、
符にリシンのＡ鎖を含有しているどんな免疫毒素にも適
用されるのである。

この毒素があるいは毒性のあるサブユニットがマンノー
ス残基金特に末端の位置で含有する多糖類から成りたっ
ているならば、構成する抗体のいかんを問わず、毒素あ
るいは毒性のあるサブユニットに抗体を結合させるのに
選ばれている結合様式にかかわらず免疫毒素を産生ずる
九めに如何なる毒素が使われていても同様の理由の友め
にマンナンのこの特性は、もつと一般的にすべての免疫
毒素に適用出来るのである。

以下の実施例は発明のよりよい理解のために供するもの
であって、その視野を制限するものではない。

実施例１ この実施例の目標は、マンナンの存在下であるいはマン
ナンの存在しない状態で免疫毒素（およびその構成要素
）の除去機作の変化を示すことにある。

Ａ−以下の操作が使用され友。

−免疫毒素ＩＴ−ＴＩＯＩの除去機作の測定ＩＴ−ＴＩ
ＯＩと呼ばれている抱合体は活性化されたジスルフィド
基によって置換された人間のＴ細胞（抗体Ｔ６５に対す
る抗体Ｔｌ０Ｉ）に対する抗体をリシンのＡ鎖と反応さ
せることによって得られる。この抱合体の合成と細胞毒
特性は出願人の名義のフランス特許出願８１／２１８３
６に記載されている。抱合体ＩＴ−ＴＩＯＩは耳の静脈
を通じて単回注射によって兎に投与され友。投与され友
量は免疫毒素１．２５ｍｔｐ／ｋｅ体重に相当している
。すなわちＡ鎖として表現するならば０４１５ｍｙ　／
　ｋ！？抗体として表現するならば０．８３５ｉψ／ゆ
である。血液試料はへ・９リンを使って間隔をおいて採
血した。血漿はこれ以下ＲＩＭ　−１と略記する放射性
免疫測定法によって分析された。

この技術は免疫毒素を変化することなく決定するという
有利さを持っている。この決定法はミクロ滴定板（例え
ばＮＵＮＣ−ＴＳＰ　　スフＩＪ　−＝ング系、ポリラ
？ブロック（Ｐｏｌｙ　Ｌａｂｏ　Ｂｌｏｃｋ）フラン
ス（Ｆｒａｎｃｅ　）　）を使って行なわれ、そのカバ
ーには底面のウェルに浸漬し７’Ｃ高吸収性の先端が付
けられている。この先端は固相を形成している。リシン
のＡ鎖に対する羊の抗体（以下略号Ａｃｌと記すことと
する）はアフィニティクロマトグラフィによって精製さ
れ固相に吸収される。このことを行なうには燐酸塩に関
して２０　ｍＭ　、　ｐＨ７、食塩に関しては１５０ｍ
Ｍである緩衝液中に１０μＥ／−を含有するＡｃ　１の
溶液２００μｌがウェルに分注される。先端は４℃で２
４時間Ａｃｌの溶液とまず接触し、その後すべての固定
部位を飽和するｔめに２０℃で３時間ウシ胎児血清と接
触する。飽和した免疫吸収体はその後３時間２０℃で種
々異なった稀釈で血漿試料と接触し、あるいは校正曲線
を作成するために既知の濃度の免疫毒素ＩＴ−ＴＩＯＩ
のａ’ｇｉ、と接触させる：燐酸塩に関して２０　ｒｆ
ＩＭ、　ｐＨ７、食塩に関して１５０ｍＭである緩衝液
で洗滌が行なわれ九。更に免疫吸収体は２０℃で２時間
マウスＩｇＧに対する山羊の抗体と接触させる。マウス
ＩｇＧはアフィニティクロマトグラフィーによって精製
されておシ、放射性標識を付けられている（以下Ａｃ２
と略記する）。Ａｃ２はグリーンウッド（Ｇｒｅｅｎ−
ｗｏｏｄ　）とハンター（Ｈｕｎｔｅｒ　）法によって
クロラミンＴの存在下で沃素１２５によって放射性標識
される。

（ＩＨｏｃｈｅｍ、　Ｊ−＊　１９６３年８９号１１４
頁）放射性標識されｆｃ　Ａｃ　２の比活性は５〜１０
μＣ１／〜である。放射性標識されｆｃ　Ａｃ　２１０
　ｃｐｍ　＊体積２００−が緩衝液中に導入される。こ
の緩衝液は燐酸塩に関して２０ｍＭ　、　ｐＨ７食塩に
関して１５０ｍＭであって、牛血清アルブミン０．１１
含有している。燐酸塩に関して２０　ｍＭ、　ｐＨ７、
食塩に関して１５０ｍＭである緩衝液中で洗滌したのち
、先端は引きあげられ、結合し几Ａｃ　２の社が放射能
を計測することによって測定される。

決定される試料中の免疫毒素の濃度は洩々の既知濃度で
行なわれたＩＴ−ＴＩＯＩを使って行なわれた校正曲線
を参照して測定される。

認識の原理の助力をえて、この試験は未変化体の免疫毒
素分子を測定することを可能にした。

更にこの測定法で得られた濃度と標的細胞に関するｉｎ
　ｖｉｔｒｏの細胞毒性の活性のための試験によって測
定された濃度と比較すると同一の価を示し、この事はＲ
ＩＭ−１試験によって決定された免役毒素は細胞毒性の
特性を保有してい次分子に対応していることを保証して
いる。

ｂ）ヒトのＴ細胞（あるいは抗体Ｔｌ０Ｉ　）に対する
抗体の除去機作の測定 この抗体はフランス特許出願８１／２１８３６の中で指
示された方法で合成され、精製された。

抗体Ｔ１０１は、静注方法で０．８３５　ｍ９／ｋｇの
投与量で兎に注射され友。血漿試料は前と同じように採
取され友。試料中の抗体濃度は放射性免疫測定（ＲＩＭ
−２）によって測定された。この測定は、ここでマウス
ＩｇＧに対する山羊の抗体１０■／ｄを含む溶液がＡｃ
　１溶液であり、アフイニテイクロマトグラフィによっ
て精製された以外はＲＩＭ−１と同じ条件下で行なわれ
た。抗体Ａｃ　２は、ＲＩＭ−１試験の抗体と同一であ
る。決定される試料中の抗体Ｔ１０１の濃度は、異っ友
既知の濃度で導入された抗体Ｔ１０１で作成された校正
曲線を参照することによって測定された。

ｅ）　　ＩＪシンのＡ鎖の除去機作の測定リシンのＡ鎖
は先行技術のフランス特許７８／２７８３８およびその
追加特許７９／２４６５５に示されている方法で合成さ
れ、精製され九。Ａ鎖は０．４１５　ｍｇ／に９の投与
量で兎に静注によって注射された。血漿試料は以前と同
じように採取され友。

試料中のＡ鎖の濃度は放射性免疫測定ｉ　ＲＩ　Ｍ−３
）によって測定された。この測定法はＲＩＭ−１試験と
同じ条件下で行なわれた。

抗体Ａｃｌは固相に吸収され、リシンのＡ鎖に対する羊
の抗体であり、アフィニテイクロマトグラフイーによっ
て精製され、抗体Ａｃ　２　ハＲＩＭ−１に記載し友と
同じような放射性標識をつけた抗体である。決定される
試料中のりシンのＡ鎖の濃度は異なった既知の濃度で導
入され九ＩＪシンのＡ鎖で作成され九校正曲線を参照す
ることによって測定された。

これら３測定によって測定され几免疫毒素、抗体、血漿
中のりシンのＡ鎖の濃度の価は再現性があり、信頼性が
ちシ、定態的である。これら３種の生成物の検知閾値は
ｌｎｊ’／−である。

１つの測定法内の、更に測定法間の再現性の研究は１　
ｎｌ／ｌｄ〜２００　ｎｌ／−の範囲内では濃度につい
ては１０チ以下の変動係数を示したＯＢ〜結果 遂行され几実験の結果は、横軸上に時間で表現した時間
を示し、縦軸上には対数目盛で時間Ｏにおける理論的な
血漿中の濃度の百分率の形で表現し、測定された生成物
の濃度を示すカーブの形で表現されている。“相対的血
漿濃度”（ＲＰＣ）とよばれているこの価は下記の式を
使りて計算される。

血漿体積は３６ｄ／ｋｇ動物の体重に等しいと考えられ
ている。

ａ）マンナンの存在しない場合：免疫毒素ＩＴ−ＴＩＯ
Ｉの血漿内除去 図１はＩＴ−ＴＩＯＩの血漿内除去曲線を示している。

この曲線は２つの相を持っている。最初の相では生成物
は速やかに消滅している（３０分間に約９７９６）：第
２の相では減少はよりゆっくりである。ＩＴ−ＴＩＯＩ
で観測され次第１の除去の相は、抗体Ｔ１０１の除去機
作の中にはあられれない。ここには唯一のゆっくりした
除去相が記録されているにすぎない（曲線２）。他方結
合してないＡ鎖の血漿内除去機作はＩＴ−ＴＩＯＩの除
去機作と極めて類似している。注射１時間後に投与量の
わずか０，７チのみが血漿中になお残存している。（曲
線３） ｂ）マンナンの存在中：免疫毒素ＩＴ−ＴＩＯＩの血漿
内除去機作とりシンのＡ鎖 マンナンは下記、の方法に即して投与された。

この多糖類の最終投与量の２０％がＩＴ−ＴＩＯＩある
いはＡ鎖の注射１０分前に静脈投与によって注射される
。時間０においてその多糖類の最終投与量の４０係がＩ
Ｔ−ＴＩＯＩあるいはＡ鎖（Ｑ、４１５■／Ａ鎖／ユ）
と会合の形で静脈投与によって注射された。その後その
多糖類の最終投与量の２０％がそれぞれ１．５時間およ
び５時間の後に静脈投与によって注射された。

図２は時間の関数として０．４１６Ｑ／−の全投与にで
マンナンとの会合体の形で静脈投与によって注射された
ＩＴ−ＴＩＯＩの血漿内除去曲線を示している。マンナ
ンの存在中に最初の除去相−生成物の大部分の消滅の原
因となっているーは事実上抑制され、そこで血漿中の活
性のある免疫毒素の濃度の大きな増大を導くことになる
。

注射１５時間後にＩＴ−ＴＩＯＩの濃度は免疫毒素がマ
ンナンと会合されている時には、マンナンがない時よシ
も１００倍高い（曲線１）。

血漿から免疫毒素を除去することを阻害する効果は、マ
ンナンの投与量に依存している。マンナンの低投与ｔ（
１６６■／に９および１６．６ｑ／ｋｇ）は、よシ弱い
効果を生じている（曲線３と４）。

マンナンの特性が図３に示されているように結合シてい
ないＡ鎖によって観測されている。

この点は免疫毒素の急速な消滅は事実上構成成分Ａ鎖に
、特にその末端のマンノーズ残基のために起因している
。

しかしながらＡ鎖の最初の除去相は免疫毒素についてお
こっていることと対照的に完全には抑制されていない。

これがマンナンと免疫毒素が同時に投与され九時に観測
された全く驚異的な効果を確証している。

実施例２ マンナンの作用の可能な特異性を示すために免疫毒素Ｉ
Ｔ−ＴＩＯＩの血漿内除去機作は末端の位置にマンノー
ス残基を有さない他の多糖類の存在中でも測定され、こ
の多糖類はデキストランＴ１０．あるいはＴ２Ｏあるい
はＴ５Ｏ０（それぞれの分子瀘約１０，０００　、４０
，０００　、５００．０００を有する葡萄穂高分子）４
１６ｍ９／ｋｆ？の全投与緻で投与されており、ガラク
タン（ガラクトース高分子）１６６■／時の全投与腋で
投与されており、アシアロフェトイン（末端のガラクト
ースを持つ高度にグリコジル化されたグリコプロティン
）が１６６　■／ｋｇの全投与鷺で投与されている。

図４に示されている曲線がこれら多糖類は免疫毒素ＩＴ
−ＴＩＯＩの血漿内除去機作に事実上効果を持ってない
ことを示している。

実施例３ この例は静脈注射ののちにリシンのＡ鎖の肝臓内捕捉を
示しており、更にマンナンによってこの捕捉の阻害を示
している。

沃素１２５によりて放射性標識付けされたＡ鎖は１１７
に９の投与量でマンナンの存在しない、あるいは存在し
ている場合にチャールスリパーフランス（Ｃｈａｒｌｅ
ｓ　Ｒｌｖｅｒ　Ｆｒａｎｃｅ　）　ＣＤに千日ねずみ
に静脈投与によって注射された。実験中の異なった時に
、２匹の動物が麻酔がかけられた。腹腔が開かれ、大静
脈が切断され、門脈の中への注射によって肝臓が１０−
の生理食塩水によって洗滌される。肝臓は完全に切除さ
れ、放射能が決定される。結果は肝臓に固定されている
ｅｐｍの１００分駆として表現されている。

（図５） マンナンのない場合には、リシンのＡ鎖はすみやかに捕
捉されしかも放射能のピークに示されているように肝臓
によって効果的に捕捉されている。逆にマンナンの存在
している場合にはこの放射能ピークは事実上抑制されて
いる。この結果はりシンのＡ鎖は肝臓に捕捉され、Ａ鎖
と同じようにマンナンの存在中に免疫毒素を血漿中で高
濃度に維持しておくことは事実上肝臓のこの捕捉の阻害
によることを確証している。

実施例４ 免疫毒素ＩＴ−ＴＩＯＩのｉＨｖｉｔｒｏでの選択的細
胞毒性に対するマンナンの拮抗作用効果のないことをこ
の実施例は示している。

これらの実験においては、試験されている免疫毒素ある
いは細胞毒性のある対照物質の既知濃度の存在中に３７
℃で２４時間の培養後に、標的細胞（ＯＥＭ細胞）によ
って１０ｍ９／−の濃度でマンナンのないあるいは存在
する場合に１４（−ロイシンのとりこみを測定すること
によって細胞毒は評価される。使用された技術はすでに
報告されている技術である（　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、１９８４，２５９　　（１５）９５３９）。

マンナンが使用された濃度では、細胞に細胞毒を有して
ないことを示すために事前に検査が行なわれた。これら
の実験の結果は表１に示されている。細胞毒の効果はＡ
鎖として表現され次モル濃度（工Ｃ３ｏ）の価によって
測定された。

このことは放射性同位元素のとりこみの５０チ阻害を原
因としている。

免疫毒素はそれ自身によっであるいは塩化アンモニウム
によって活性化された形でその活性を完全に保持してい
る。同じようにＡ鎖の固有の毒性は変化をうけていない
。かくしてマンナンの存在中には免疫毒素の特徴的な細
胞毒特性は影響をうけていない。

表　　　１ 試験物質　■Ｃ３ｏＡ鎖のモル 濃度で示されている マンナ４ｈず　　マンナン含有 １０■／ｄ ＩＴ−ＴＩＯＩ　　　　　　　　１．０・１０　　Ｍ　
　１．２・１０　　ＭＡ　　鎖　　　　　　　　７．０
・１０　　　Ｍ　　　７．０・１０　　Ｍ実施例５ マンナンと会合して二十日鼠に注射された免疫毒素ＩＴ
−ＴＩＯＩの毒性 すべての動物についてマンナングラス免疫毒素の会合体
の全体の毒性学的効果を検討することは重要である。こ
のととはチャールスリパーフランス（Ｃｈａｒｌｅｓ　
Ｒｉｖｅｒ　Ｆｒａｎｃｅ）　ＣＤに二十日鼠にマンナ
ンのない場合に、あるいはマンナン１０Ｔｒｕｉを併用
して静脈内に投与され几抗黒色腫免疫毒素Ｉ　Ｔ−ＨＭ
の５０係致死投与屋を決定することによって行なわれた
。この抗黒色腫抱合体ＩＴ−ＨＭの細胞毒性的性質と合
成はフランス特許出願８１１０７５９６に記載されてい
る。

観測された価は、表■に示されている。

表　　■ 試験生成品　　　　　　　　ＬＤ５゜ ＩＴ−胆　自身　　　　　　４６０μＩ／マウスこれら
の結果は免疫毒素がマンナンと同時に投与された時には
免疫毒素の毒性のわずかの増大を示している。わずか４
倍という毒性のこの増加は上記の通り、ｉｎ　ｖｌｖｏ
での免疫毒素の血漿白濃度を維持することに関して極め
て有意な効果を考慮してマンナンのｉｎ　ｖｉｖｏでの
使用を制限するものでない。

実施例に の実施例の目的は１ｎｖｔｖｏ　（生体内）実験におい
て免疫毒素の作用についてマンナンの効果を示すことに
ある。

ＢＬｌ、１・・ツカネズミについて（ネガティブ’ｒｈ
ｙ　ｔ、　２細胞）について、この実験はおこなわれた
（　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊ、　ｏｆ　Ｃａｎ
ｃｅｒ　２４　、１９７９゜１６８−１７７頁）。使用
された免疫毒素は抱合体であって、その中で’ｒｈｙ　
１．２　（抗体ＡＴ１５Ｅ　）に対する抗体はりシンの
Ａ鎖とジスルフィド結合によって結合され、先行技術の
我々の出願の中において記載された方法によって合成さ
れている。

以下のプロトコルが使用された。

０日に１０ＢＬ１．に二十日鼠のグループが静脈注射に
よって５Ｘ１０Ｔ２細胞（ムリンリンパ腫のポジティブ
’ｒｈｙ　ｉ、　２細胞）を摂取し、処理の前にランダ
マイズされる。

処理は１日に静脈処理によって行なわれている。

一方のグループは抱合体抗体ＡＴ１５Ｅ／リシンのＡ鎖
自身とｌＯμｇ／二十日鼠摂取する。

他のグループはマンナン１０ｗ１を混和した同じ抱合体
の同量を摂取する。

更に４つのコントロールグループがそれぞれ以下の通り
摂取する。

一培地ＲＰＭＩ　（Ｔ２細胞の培養のために使われた培
地） 一マンナン自身（１０■／二十日鼠） −リシンのＡ鎖（１０μＩＩ）とマンナｙ（１０１ｎ９
）−リシンのＡ鎖（１０μｊ）、抗体ＡＴ１５Ｋ　（３
０μｇ）およびマンナン（１０■） 動物は５０日間観察され、その死亡率が記録される。

図６は処理後に経過した時間の関数として生存している
動物の百分率を示している。

曲線１は免疫毒素自身を摂取し九動物に関係しており、
曲線２は免疫毒素プラスマンナンの会合体を摂取した動
物に関係している。

観察されるように免疫毒素／マンナン会合体は処理５０
日後に９０チという生存率を示している。一方免疫毒素
自身の投与は５０日後に３０俤の動物生存率を示してい
るにすぎない。

更に以下の観察がコントロールグループについて５０日
に行なわれ九（図６には示されていない） −ＲＰＭＩ処理動物およびＡ鎖プラスマンナン処理の動
物についてはＯｅｓ生存率 一マンナン自身を摂取した動物については１０俤の生存
率 一リシンのＡ鎖＋抗体＋マンナン処理動物については２
（ｌ生存率 これらの結果は使用された免疫毒素自身およびコントロ
ール物質と比較した場合に免疫毒Ｖマンナン会合体の有
効性を示している。

免疫毒素とマンナンからなシ立つこの会合体はし九がっ
て人間の治療において医薬として使用される。この会合
体は標的細胞が免疫毒素を生成していることを使用され
た抗体によって認識されるような癌性のあるいは非癌性
の訴えの処理のために使用される。

すべての標的細胞を除去することを自損して、免疫毒素
のすべての投与あたり１０ｒｒＵｉ〜Ｌｉ／ｋｇに変動
する。マンナンの量と結合されている免疫毒素の十分な
投与社によって処理は遂行されなければならない。会合
体の成分の投与についての最適処方および更に処理の継
続時間は患者および処理される訴えの性質によって各々
の場合において決定されねばならない。

この発明による新しい医薬は注射による、好ましくは静
脈注射による投与のために包装される。会合体の成分は
好１しくは別々に保存され、必要に応じて注射器の中で
あるいは潅流浴媒の中で、その直後に使用するために混
合される。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第６図は本発明に係わる免疫毒素製剤の特
性を説明するための線図である。 図面の浄書で内容に兎 Ｆｉｇｕｒｅ　１ ｉ更なし） Ｆ＋ｇｕｒｅ　２ ＰＣ １５１０１５２０２５、）Ｔ町が１．叫聞Ｆｉｇｕｒｅ
　３ ＭＣ ）　５　＋０１５２°２５　、を沖１っｑ間Ｆｉｇｕｒ
・４ 〜℃ Ｆｉｇｕｒｅ　５ Ｆ＋ｇｕｒ＠６ １ｅｊノ １、事件の表示 特噸昭６０−２６９１９２号 ２、発明の名称 免疫毒素製剤 ３、補正をする者 事件との関係　！？許１ｆＵＱ人 サ　　ノ　　フ　　イ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも１種の免疫毒素と少なくとも１個のマ
   ンノースを有する高分子との組合せからなる免疫毒素製
   剤。
2. （２）免疫毒素は天然産、半合成、合成毒素、毒素サブ
   ユニット、特に末端部位にマンノース残基を含有する多
   糖基を有するものから得られ；マンノースを有する高分
   子は平均分子量１０００以上で、マンノース残基を２０
   ないし１００％の割合で含む特許請求の範囲第１項記載
   の免疫毒素製剤。
3. （３）免疫毒素が免疫毒素抗−Ｔ６５であり、マンノー
   ス含有高分子がマンナンである特許請求の範囲第１項ま
   たは第２項記載の免疫毒素製剤。
4. （４）注射用として包装されている特許請求の範囲第１
   ないし第３項のうちのいずれか１項に記載の免疫毒素製
   剤。
5. （５）免疫毒素とマンノース含有高分子が別々に包装さ
   れている特許請求の範囲第１項ないし第４項のうちのい
   ずれか１項に記載の免疫毒素製剤。