JPS61181398A - 形質転換酵母におけるグルカゴンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵母においてグルカゴンまたはその断片もし
くは誘導体を産生ずる方法、グルカゴンまたはその断片
もしくは誘導体をコードする合成遺伝子、相当する発現
ビヒクルおよび形質転換酵母株に関する。

〔従来技術〕

グルカゴンは、ランゲルハンス膵島のα−細胞から分泌
されるポリペプチドホルモンである。これは、次の配列
の２９個のアミノ酸からなる単鎖ポリ−！グチドである
。

以下余白 Ｈｌｓ−８ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｓ−Ｔ
ｈｒ−８ａｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙ
ｒ−Ｌａｕ−Ａａｐ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ
−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−
Ｌ＠ｕ−Ｍ＠ｔ−Ａａ　ｎ　−Ｔｈ　ｒ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　（１）グルカゴンはそ
の代謝効果のために低血糖の治療に用いられる。グルカ
ゴンはまた平滑筋ニオケる鎮痙作用と胃酸分泌抑制作用
をも示す。

グルカゴンは膵臓抽出物から単離される。屠殺動物の膵
臓からのグルカゴン抽出は複雑な方法であシ、多くの膵
臓が必要である。さらにグルカゴンはタンパク質加水分
解による分解を受けやすいので膵臓抽出物からの生成物
は不均質であシ、膵臓のグルカゴン含有物の約７が得ら
れるだけである。

ヨーロッノ臂特許第８１３０２９７８号からは、グルカ
ゴンの断片または誘導体は次の一般式で知られている： Ｒ’　−Ｒ２（ＩＩ） （式中、ＲＦｉＨｌｓ−８＠ｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
ｒ−Ｐｈｓ　−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−８ｅ
ｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ　ｆ表わし、ＲはＯ
Ｈ，ペプチド鎖−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｖｐ−Ｌ
ｅｕもしくは−Ｍａｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒｉたは最後に言
及した２つのペプチド鎖と同一であるがただしこれらの
２つのペプチド鎖のアミノ酸１個以上が省略された相当
するペプチド鎖を表わす・） 式■で表わされる化合物はグルカゴンと同じ鎮痙作用と
同じ胃酸分泌抑制作用を有するが、しかしわずかの代謝
作用を示すかまたは全く示さない。

それゆえ、式■で表わされる化合物は鎮痙作用または胃
酸分泌抑制が所望される場合のみグルカゴンよシ優れて
いると思われる。

弐■で表わされる化合物は、天然グルカゴンからまたは
ベグチド合成で一般に知られているより困難な方法によ
って調製されうる。式■で表わされる好ましい化合物は
グルカフ９ン（１−２１）である。

本明細書においてグルカゴンの後の括弧内の数はアミノ
酸の数を示す。天然グルカゴンは２９個のアミノ酸を有
し、これはグルカゴン（１−２９）（ｔたは単にグルカ
ゴン）とする。グルカゴン（’１７２１）は天然産生グ
ルカゴンの最初の２１個のアミノ酸残基金倉む等である
。

本発明の目的は、組換えＤＮＡの技術を用いてグルカゴ
ンまたはその断片もしくは誘導体を調製するためのよシ
有利女工業的方法を提供するものである。

〔発明の概要〕

本発明は、グルカゴンおよびその誘導体（グルカゴン、
（１−２１））が、このような産物をコードするＤＮＡ
配列で形質転換された酵母株培養液の上清中に均質物質
として高収率で表われるという驚くべき発見に基づく。

本発明の第一の観点によれば、グルカゴンまたはその断
片もしくは誘導体音コードする遺伝子からなる複製可能
な発現ビヒクルを有する酵母株を適当な栄養培地中で培
養し続いて培養培地から発現産物を回収することからな
るグルカフ９ンまたはその断片もしくけ誘導体の高収率
産生法を提供するものである。

グルカゴン（１−２９）をコードする遺伝子は合成遺伝
子であるかまたはグルカゴンのＣＤＮＡ　クローンもＬ
＜Ｈグルカゴンのゲノムクローンから誘導されてもよい
。

好ましいグルカゴンまたはその断片もしくは誘導体は、
適当な酵母ＤＮＡ発現ビヒクルに所望産物をコードする
合成遺伝子を挿入し、適当な酵母宿主株全発現ビヒクル
で形質転換し、形質転換微生物を培養した後発現した産
物を培養ブイヨンから回収することにより調製される。

本発明の第二の観点によれば、酵母においてグルカコ゛
ンまたはその断片もしくは誘導体の発現をコードする合
成遺伝子からなるＤＮＡ配列を提供するものである。

本発明の第三の観点によれば、酵母において安定な維持
をもたらす複製システムおよびグルカゴンまたはその断
片もしくは誘導体をコードするＤＮＡ配列からなる複製
可能な発現ビヒクルを提供するものである。

本発明の第四の観点によれば、酵母においてグルカゴン
またはその断片もしくは誘導体奮発現しうる複製可能な
発現ビヒクルを含む形質転換酵母株を提供するものであ
る。

適当な酵母宿主を上記の発現ビヒクルで形質転換するこ
とによシ所望産物が高収率で産生される。

驚くべきことに形成されたグルカゴンまたはグルカゴン
断片は非常に均質であシ、培養の間に酵母によシ産生し
た酵素によるグルカゴンの１７番目と１８番目の二塩基
性アミノ酸列Ａｒｇ−Ａｒｇの開裂は全く見られない。

酵母がこのような対になった塩基性アミノ酸部位を特異
的に開裂するトリグシン様エンドペプチダーゼを産生す
ることは知られているので、このようなことは非常に驚
くべきことである。

次に本発明を図面を用いて説明する。第１図はプラスミ
ドｐＭＴ　２９０の構築を示す図式、第２図はグラスミ
ドｐＭＴ　５４４　、　ｐＫＦＮ　６およびｐＭＴ６１
２の構築を示す図式、第３図はグラスミドｐＫＦＮ　２
３の構築を示す図式、菌４図および第５図はグラスミド
ｐＭＴ　５４４からの一定配列のインビトロ変異誘導を
示す図式、第６図は純粋な本物のグルカゴン添加前ま次
は添加後の酵母上清のＨＰＬＣ分析曲線を示し、第７図
は濃縮ＤＥＡＥ漏出ｆｆ７．（ｂ　ｒ　ｅ　ａ　ｋ　ｔ
ｈｒｏｕｇｈ　）の調製用分別グラフを示す。

〔好ましい実施態様の記載〕

上記アミノ酸配列（１）からグルカゴン（１−２９）を
コードする合成遺伝子は、アミノ酸コドン好ましくは酵
母におけるタンパク質の高発現に用いられるアミノ酸コ
ドンの使用によ）幾っかのオリゴヌクレオチドから構築
された〔ベネッツェンジエイ６エルら（Ｂ＠ｎｎｅｔｚ
＊ｎ　Ｊ、Ｌ、ｅｔａｌ　）　。

（１９８２）、デ　ジャーナル　オプ　バイオロジカル
　ケミストリ４　（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈ＠ｍ１ｓｔｒｙ　）　、　　２
５７．３０２６−３０３１　）。

さらに制限酵素識別部位を分子の適当な部分に入れて遺
伝子を特異的に切シ出し特性決定と変異誘発を助けるこ
とができる。連結反応および反応の埋め合わせ（ｆｉｌ
ｌｉｎｇ　１ｎ　ｒ＋５ａｅｔｌｏｎａ）を妨害する可
能性のある二次構造を避ける試みがなされた。

グルカゴンの断片または誘導体についてコードする合成
遺伝子をグルカゴン（１−２９）遺伝子から構築するこ
とができる。グルカゴン（１−２１）をコードする合成
遺伝子は、グルカゴン（１−２９）遺伝子においてグル
カゴン（１６−２９）Ｋ相当する制限断片をグルカゴン
（１６−２１）に相当する合成りＮＡ断片で置換するこ
とにょシ構築される。合成グルカゴン（１−２９）遺伝
子から他のグルカゴン断片または誘導体をコードする合
成遺伝子を調製することまたはこのような産物に対する
全遺伝子のオリゴヌクレオチド合成によシどのようにし
てこのような断片または誘導体に対する合成遺伝子を調
製するかは画業者にとって明らかであろう。

グルカゴン（１−２９）の遺伝子はｃ　ＤＮＡグルカゴ
ンクローンから誘導することもできる。ウシ膵臓プレグ
ログルカゴンｃＤＮＡ　ｆ単離し配列する〔エル・シイ
、ｏＪズら（Ｌ、Ｃ，Ｌｏｐ＠ｚ　＠ｔ、ａｌ）。

（１９８３）、　　ゾロシーディング　オグ　ナチュラ
ル　アカデミイ　オプ　サイエンス　オプ　ニーニスニ
ー　（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
）　　ｅ８０．５４８５−５４８９〕。このグレグログ
ルカゴンｃＤＮＡは、シグナル・もしくはプレーペプチ
ド、ＮＨ２末端ベグチド、グルカゴンおよび２つのカル
ゲキシ末端グルカプン様被グチド（ＧＬＰ−１およびＧ
ＬＰ−２）　？コードする。本発明の目的の丸めにグル
カゴン配列は合成ｃ　ＤＮＡから切シ出され、特異的変
異誘導を位置させることによ１Ｔｈｒ（２９）のコドン
の後に停止コドンを有するようにしてもよい。

発現されたタン・母り質をたとえば内在酵素によるイン
ビメ分解に対して保護する機能または発現され友タンノ
々り質を原形質膜空間へ輸送し最後には細胞壁を通過し
て培養培地へ輸送するために必要な情報をもたらす機能
を有する別のメン・々り質をコードするＤＮＡ列に、所
望産物の遺伝子を融合させてもよい。

遺伝子が融合生成物として発現される場合には、このよ
うな融合産物からグルカゴン部分を分割する手段が提供
されるべきである。このような目的のために、選択的分
割部位を有するアミノ酸配列をコードするコドンを、別
のタンノ臂り質ｔ−コードするＤＮＡ列と所望産物の遺
伝子との間に挿入する。

別のタン・臂り質は、形質転換微生物自体によシ所望産
物の分泌の間に分離される。たとえば２個の塩基性アミ
ノ酸（たとえばＬｙｓ−Ｌｙｓ、　Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌ
ｙｓ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｌｙｓ　）　ｆコードする
コドンをグルカゴンのＮ−末端に隣接して挿入する場合
には、これら塩基性アミノ酸とグルカゴン間のベグチド
結合は分泌の間に酵母によ多分割されうる。

別のタンパク質が後に酵素的または化学的手段によシ余
分なアミノ酸配列を分離するために所望タンパク質のＮ
−末端に隣接して選択的分割部位を有するならば、所望
メン・臂り質をこの所望タン・９り質のＮ−末端と連結
し九別のタンパク質配列とともに分泌することもできる
。

分泌のために別のＤＮＡ配列はシグナルペプチドをコー
ドしうる。別のＤＮＡ配列はさらにリーダーイグチド配
列金コードしうる。シグナルおよびリーダーベグチドは
細胞から形質発現タンパク質産物が分泌される間に形質
転換微生物によ多分割除去され、よシ簡単な所望産物の
単離方法が確保される。酵母に対する非常に好適なり−
メーイプチド系は酵母ＭＦａ１　リーダー列またはその
一部である〔クリジャンージエイ、　（Ｋｕｒｊａｎ　
、　Ｊ、　）およびヘルスコウィツ、アイ、　（Ｈａｒ
ｓｋｏｗｌｔｚ　、　［、）　ｓセル（Ｃｅｌｌ）３０
（１９８２）９３３−９４３）。

しかしながら酵母において分泌をもたらすいかなるシグ
ナル−またはリーダー配列も使用することができ、本発
明は特定の分泌系に限定されるものではない。

発現の目的で、ブロモ−ター配列が所望タン／ぐり質産
物に対するＤＮＡ配列の上流に位置する。酵母宿主微生
物固有の遺伝子からのプロモーター、すなわちＴＰＴ−
（）リオースホスフェート異性化酵素）遺伝子プロモー
ターが用いられる。所望産物のＤＮＡ配列の後には、転
写ターミネータ−配列、好ましくは宿主酵母微生物固有
の遺伝子からのり１ネーター配列すなわちＴＰＴ−遺伝
子または旺α１−遺伝子のターミネータ−が続くであろ
う。

Ｊ当なプロモーター、リーダーおよびターミネータ−配
列と融合する所望タンノｆり質産物をコードするＤＮＡ
配列は、酵母において所望タンパク質産物の形質発現の
ための発現ビヒクルに挿入される。

発現ビヒクルは酵母において複製しうるプラスミドまた
は酵母の染色体へ組込まれうるプラスミドである。この
プラスミドは、宿主細胞の生存率または正常増殖に必須
の遺伝子、すなわち細胞分割、細胞壁生合成、タンｉ４
り質合成等をコードする遺伝子を入れることによシ宿主
微生物のグラスミド損失に対し安定化されるのが好まし
い。

〔詳細な記載〕

グルカゴン（１−２９）合成遺伝子は、連結反応とこれ
に続く部分的二重鎖構造の酵素による閉鎖によシ、幾つ
かのオリプヌクレオチドから構築される。

オリゴヌクレオチドはシリカ支持体においてホスホアミ
ダイト化学（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　ｃｈｅ
ｍｌ−ｓｔｒｙ）を用いて自動ＤＮＡ合成機において合
成される〔ニス、エル、ビュウケー・ゾ（Ｓ、Ｌ、　Ｂ
＠ａｕｅａｇｅ）とエム、エイテ、カルサーズ（Ｍ、Ｌ
　Ｃａｒｕｔｈｅｒａ）（１９８１）テトラヒドロン　
レターズ（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎｌｔｔｔｅｒｓ　）
　２２　、１８５９−１８６９　）かまたはジーおよび
トリヌクレオチド　ブロックに接近するホスホトリエス
テルおよび？リスチレン支持体を用いる半自動的カラム
合成によシ合成される〔エイチ、イトウ（）（、Ｉｔｏ
　Ｌレイ、イタ（Ｙ。

Ｉｋｅ）、ニス、イカク（Ｓ、　Ｉｋａｔａ　）および
ケイ。

イタクラ（Ｋ、　Ｉｔａｋｕｒａ　）　（１９８２）　
＋　　ヌクレイツク　７シド　レス（Ｎｕｃｌａｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）１０．１７５５−１７６９　
）。連続的カップリング反応によシより小さい単位から
オリゴヌクレオチド。

を合成することは当業界では公知である。グルカプン（
１−２９）をコードする合成遺伝子は次のように合成さ
れる： ３３　ｍａｒ（１）： ＧＡＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＧＧＴＡＣＣＴＴＣＡＣＴＴ
ＣＴＧＡＣＴＡ　（１）を、１３ｍｅｙ個）： ＡＴＴＴＡＧＡＧＴＡＧＴＣＧ［［） の存在下に　３３　ｍａｒ（ＩＩ）　：ＴＣＴＡＡＡＴ
ＡＣＴＴＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡ
Ｃ（ＩＩ）と連結すると　６６−ｍａｒ（１−１１）　
：■ が得られる。

さらに、７３−ｍａｒが、３３−ｍａｒ（ｎ）の存在下
に１３−可働、１６−ｒｎ＊ｒ（ｖ）： ＣＴＴＣＴＡＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴ　　　（Ｖ）と４４
−　ｍ＠ｒα）： ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡ
ＴＴＧＧＡＣＧＡＡＧＴＣＴＴＧＧＧＣＴ■と全連結す
ることによシ合成され、７３−ｍａｒ（ＩＩＩ−Ｖ−Ｉ
Ｖ）　　： が得られる。

３′末端が３９塩基にわたって相補性である６６−ｒｎ
＠ｒ　（１−１）と７３−ｍａｒ（ＩＩ−Ｖ−■）　　
をアニールし、３′−末端を酵素により延長し、その結
果得られる１　００　ｂｐの二重鎖ＤＮＡ分子を編入し
た制限部位とともに次に示す（大文字：化学合成。

小文字：酵素による延長）： 以下余白 合成遺伝子のＫｐｎｌ　−Ｈｌｎｄ　３断片ｉＴ４りが
−ゼを用いてプラスミド（Ｋｐｎ　１とＨｌｎｄ　３で
切断されたｐＬａＣ４８）に挿入する。連結反応全周い
てコンピテント大腸菌細胞を形質転換する。再度形質転
換後、グルカゴン（４−２９）に対する正しい配列を有
する形質転換細胞（ｐＫＦＮ４）が同定される。

合成グルカゴン（１−３）配列金有する酵母グラスミド
中にグルカゴン（４−２９）遺伝子を挿入することによ
りグルカゴン（１−２９）全コードする合成遺伝子全構
築する。連結はＫｐｎ　ｌ一部位で生じる。

グルカゴン（＋−２ｘ）ｋコードする合成遺伝子（１−
２１）は、グルカゴン（１６−２９）に相当するＸｂａ
　１−　Ｈｌｎｄ　３断片をグルカゴン（１６−２１）
に相当する合成Ｘｂａ　ｌ　−Ｈｌｎｄ　３断片に置換
することによシグルカコ°ン（１−２９）２を転子から
構築される： 以下；５２　ＩＮ （Ｓ）ｅｒ　　ＡｒｇＡｒｇ　　Ａｌ＠　Ｇｉｎ　　Ａ
ｓｐ　ＥｎｄＸｂａ　１　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　）（ｉｎｄ　３５’　　ＣＴＡＧＡＡＧＡ
ＧＣＣＣＡＡＧＡＣＴＡ３′　　　　　ＴＴＣＴＣＧＧ
ＧＴＴＣＴＧＡＴＴＣＧＡグラスミド構築 グルカゴンの最初の４つのアミノ酸をコードしＫｐｎ　
１位置で終わる合成オリゴヌクレオチドを、ＭＦｆｆｌ
ｌＪ−グー配列の後で酵母ベクターに入れる〔ジェイ、
クリジャン（Ｊ、　Ｋｕｒｌｊａｎ　）とアイ。

ヘルスコウィッツ（Ｔ、　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　）、
ストラクチュア　オプ　ア　イースト　フェロモン　ジ
ーンＭＦα（５ｔｒｕｃｔｕｒ＠ｏｆ　＊　Ｙｅａｓｔ
　ＰｈｅｒｏｍｏｎｅＧｓｎｅ　ＭＦα）ニア　ビュー
タテイブ　アルファーファクター　プレカーソル　コン
ピテント　フォアタンデム　コピーズ　オプ　マチュア
　アルファーファクター（Ａ　Ｐｕｔａｔｌｖｅα−Ｆ
ａｃｔｏｒ　Ｐｒｅ　−ｃｕｓｏｒ　Ｄｏｎｔａｉｎｓ
　ｆｏｕｒ　Ｔａｎｄｅｍ　Ｃｏｐｉｅ＋ｓ　ｏｆＭａ
ｔｕｒｌ！α−Ｆａｃｔｏｒ　）　、　＋ＬＡ／（Ｃｅ
ｌｌ）　３０（１９８２）９３３−９４３１゜ α−ファクターリーダーの最後のもとからのＨｌｎｄ　
３位置全カップリングによシ破壊する。

カップリングは次のように示される： Ｇｌｕ　　ＡｌａＨｌｓ　　８ｓｒ　Ｇｉｎ　　Ｇｌｙ
　　ＴｈｒＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＴＡＣＧＴ
ＧＡＧＡＧＴＴＣ 得られるグラスミドｐＭＴ２９０は、ＭＦａｌリーダー
のＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａの
後に直ちに置かれたグルカゴン挿入部のプロモーター近
接部を有し、ＴＰＩグロモーター（ＴＰ　ｒ　ｐ）で制
御される。

このプラスミドはグラスミドｐＫＦＮ　４　からのグル
カゴン（４−２９）に対する配列の挿入に適する。

しかしながらこのプラスミドは転写終結のいかなる酵母
シグナルをも含まない。このような終結部位はクローン
タンパク質の収率を１０倍はど増加すると報告されてい
る〔ジエイ、メロ−ら（Ｊ。

Ｍａｌｌｏｒ　ｓｔ、Ｌｌ　）、ジーン（Ｇｅｎｅ　）
　２４　（１９８３）１−１４：）。それゆえ酵母発現
ベクターｐＭＴ５４４においては、ｐＭＴ　４０９から
のα−ファクター転写ターミネータ−（ＭＦａｌや）配
列をグルカゴン挿入部の後に入れる。

ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー・グルカゴン（１−２９）
−ＭＦａｌ、に対する挿入コード金有するプラスミドｐ
ＭＴ　５４４はいまだにＮ−末端ＧＩｕ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａ延長をコードする配列全会み、これは我々の
構築においては酵母により分子の約１が除去されるだけ
である。ＭＦ、７１リーダーのＣ−末端Ｇｌｕ−Ａｌａ
　−Ｇｌｕ−Ａｌａ　ｆコードするＤＮＡ配列は、イン
ビトロの欠失矢然変異誘発によりｐＭＴ　５４４から除
かれる。

得られる酵母発現プラスミドｐＫＦＮ　６はＴＰ　Ｉ　
ｐ−ＭＦａ１リーダー（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ　ｆ引＜）〜グルカゴン（１−２９）−ＭＦαＩＴに
対する挿入コードを含む。

好ましい構築において、この発現単位は安定で高いコピ
ー数の酵母プラスミドＣＰＯＴ　（ＡＴＣＣＡ３９６８
５）−＼移され、これは増殖培地においてグルコースの
存在により単に選択されるだけである。得られるグルカ
ゴン（１−２９）に対する酵母発現プラスミドはｐＭＴ
６１２の番号が付けられる。

ＴＰ　ｒ　ｐ　−ＶＩＦａ　１リーダー（Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｕ−Ａｌａｆを引く）−グルカブ０ン（１−２
１）　−ＭＦαｌＴに対する挿入コードを含むプラスミ
ドは、ｐＫＦＮ６から、グルカゴン（１６−２１）’ｉ
ｉコードスルＸｂａ　１−　Ｈｌｎｄ　３断片をグルカ
ゴン（１６−２１）全コードする合成Ｘｂａ　１−　Ｈ
ｉｄ　３断片に置き換えることによシ構築される。

好ましい構築において、上記発現単位は酵母プラスミド
ＣＰＯＴ　（ＡＴＣＣ扁３９６８５）へ移される。

得られるグルカゴン（１−２１）に対する酵母発現プラ
スミドはｐＫＦＮ２３の番号が付けられる。

形質転換 グラスミドｐＭＴ６１２を、グルコースにおける増殖に
対し選択することによシトリオースホスフェートイソメ
ラーゼ（ＴＰＴ）遺伝子に欠失全有する酵母（Ｓ、　ｅ
ｅｒｅｖｌｓｉａｅ）株へ形質転換する。このような株
は、一般に、単独炭素源としてのグルコースでの増殖が
不安定であり、ガラクトースラクテート培地で非常にゆ
っ〈シ増殖する。この欠陥は、ＴＰｔ遺伝子における突
然変異のためであり、これは欠失によシま念はこの遺伝
子の大部分を酵母（Ｓ、　ｃｅｒｓｖｉｓｌａｅ　）　
ＬＥＵ　２遺伝子で置き換えることＫより得られる。増
殖欠失のために、ＴＰＩをコードする遺伝子を含むプラ
スミドに対し強い選択性がある。ｐＭＴ６１２はスキゾ
サッカロマイセスポンベ（５ｃｈｌｚｏ　、　ｐｏｍｂ
ｅ　）　ＴＰＴ遺伝子を有する。

グラスミドｐＭＴ　５４４　ｆ　、ロイシンプロトロシ
イに対する選択性により酵母（Ｓ、　ａｅｖｅｖｌｓｌ
ａ＠）　　　　　　ＬＥＵ　２突然変異株へ形質転換す
る〔ニー・ヒンネン（Ａ、　Ｈ１ｎｎ＠ｎ　）、ジェイ
、ビイ、ヒックス（Ｊ、Ｂ。

）１１ｅｈｓ　）およびシイ、アール、フィンク（Ｇ、
Ｒ。

Ｆｌｎｋ　）、　′トランスフォーメーシ、ン　オプイ
ースト（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｙｅａ
ｓｔ　）　”　。

プロシーディング　オプ　ナチュラル　アヵデミイオプ
　サイエンス、７　ｓ　、（１９７８）、１９２９）。

プラスミドｐＫＦＮ　２３を、グルコース増殖に対する
選択性によ、９ＴＰＴ遺伝子に欠失を有するニス。

セレヴイシアエ（Ｓ、　ｅｅｒｅｖｉｓｌａｅ　）株へ
形質転換する。移された株ＫＦＮ３１は別な用途の九め
に選択される。

プラスミドｐＭＴ６１２ｔ”有する形質転換株ＭＴ６１
５は、出願人により、　Ｄ　−３４００）ｊ′ッチ７）
ｆ７、グリースバッハストラーセ８のトイチェ　サムラ
ング　７オン　ミクロオルガニスメニン（Ｄｅｕｔｓｃ
ｈｅＳａｍｍｌｕｖｇ　ｖｏｎ　Ｍｊｋｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｒｎｓｎ　）　（ＤＳＭ　）に１９８５年１月１０
日に寄託され、寄託番号ＤＳＭ　３１８４が付された。

株ＫＦＮ３１は、出願人により１９８５年１２月１３日
にＤＳＭに寄託され、寄託番号ＤＳＭ　３６０８が付さ
れた。ＤＳＭは１９７７年のプダイスト条約により権限
を与えられた国際寄託機関であシ、上記条約のそれぞれ
９条と１１条にしたがって上記寄託物の永続性と公衆に
よるこれの取得を保証するものである。

実験 例１、 オリゴデオキシリゾヌクレオチド合成 保護されたデオキシリゾヌクレオシド　３′−ｐ−クロ
ロフェニルホスフェートなラヒに保護すしたジーおよび
トリヌクレオチド　３’−ｐ−クロロフェニルホスフェ
ートを記載されているように調製する〔シイ、アール、
ゴッフ（Ｇ、Ｒ，Ｇｏｕｇｈ　）、ケイ、ジェイ、コリ
ー（Ｋ、Ｊ、　Ｃｏ１１ｉｅｒ　）、エイチ、エル、ワ
イス（Ｈ，Ｌ、　Ｗｅｌｔｈ　）およびピー、ティ、ギ
ルハム（Ｐ、Ｔ、　Ｇｉｌｈａｍ　）　（１９７９）ヌ
クレイツク　アシド　リサーチ（、ＮｕｅｌｅｌｅＡｃ
ｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　７　、１９５５−１９
６４）。

ピリジンを還流し次いで水素化カルシウムから留出する
ことによシ無水物にする。

ホスホトルエステルの接近によシオリゴヌクレオチド合
成に対する支持体は、３′−０−スクシニル基を介して
アミノメチル化１チ架橋ポリスチレンビーズ（パッケム
　Ｂａｅｈａｍ　）　　と結合する完全に保護されたジ
オキシリＩヌクレオシドである。

３３−ｒｎ・ｒ（１）の合成を、カラム（オムニフィツ
ト０ｍｎ１ｆＩｔ　＋　６．５ｍ内径）に充てんしたＤ
ＭＴｒ　−ｄＡ”　−／リマー３μモルで開始する。Ｈ
ＰＬＣポング（コントロンＫｏａｔｒｏｎ　　ＬＣポン
プ４１０）および６個の出口を有する空気作動性回転弁
（レオダイア　Ｒｈｅｏｄｙｎ＊　　５０１１型）を介
した制御装置（コントロン　グログラマー　Ｋｏｎｔｒ
ｏｎＰｒｏｇｒａｍｍｅｒ　　２００型）を用いてカラ
ムへ溶媒と反応物を流す。最初のサイクルは、トリクロ
ロ酢酸の１０係クロロホルム溶液でジメトキシトリチル
基を除去し続いてクロロホルムとピリジンテ洗浄するこ
とからなる。カップリング反応は、無水ピリジン中に０
．１Ｍジメトキシトリチル　チミジン　３’−０−ｐ”
クロロフェニルホスフェート、０．３Ｍ　　ｌ−メシチ
レンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−）リアゾー
ルおよびＩＭ　　Ｎ−メチルイミダゾールを手動により
注入することで行ナワれる〔ビー、ニス、スプロート（
Ｂ、　Ｓ。

５ｐｒｏｕｔ　）およびダプリュ、パンワース（Ｗ。

Ｂａｎｗａｒｔｈ　）　　（１９８３）テトラヘドロン
　レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ　）２４ａ　　５７７１−５７７４：ｌ。室温で３０
分間カップリング後、ポリマーをぎりジンとクロロホル
ムで洗う。サイクル時間は８５分であった。同様な方法
で、保護されたジーおよびトリヌクレオチド　３’−０
−ｐ−クロロフェニルホスフェートを、支持体上で成長
するオリゴヌクレオチドに連結する。完全に保護された
３３−ｍａｒ’ｉ部分的に脱保護化し、３７℃で２４時
間ピリジン−水（４：１）中の０．５Ｍテトラメチルグ
アニジニウム　ピリジン−２−アルドキシメートで処理
することによシ支持体から分割する〔シイ、ビイ、リー
セ（Ｃ，Ｂ、　Ｒｅｅｓｅ　）、アール、シイ、チトマ
ス（Ｒ，Ｃ，Ｔｉｔｍａａ　）およびエル、ヤウ（Ｌ、
　Ｙａｕ　）　（１９７８）　　テトラヘドロン　レタ
ーズ、２７２７−２７３０　）。　２４時間５５℃にて
濃アンモニアで処理することによシ塩基性保護基を除去
する。最後に、室温で３０分間８０％酢酸水溶液で処理
することによシジメトキシトリチル基を除く。記載され
ているようにＣＩ８カラム中でＨＰ　ＬＣに２す３３−
　ｍｅ　ｒ（Ｉ）　ｋ精製する〔エイチ、ジェイ、フリ
ッツ（Ｈ，Ｊ、　Ｆｒ１ｔｚ　）、アール　ベ２７１／
ジ、　（Ｒ，Ｂｓｌａｇａｊｓ　）、イー。

ブラウン（Ｅ、　Ｂｒｏｗｎ　）、アール、エイチ。

フリック（Ｒ，Ｈ，Ｆｒ１ｔｚ　）、アール、ニー、ジ
。

ンズ（Ｒ，Ａ、　Ｊｏｎｓｓ　）　、７−ｋ　、　’）
４　、　Ｉ）　−Ｘ”（Ｒ−Ｊ、　Ｌ＠ｅｓ）およびエ
イチ、シイ、コーラナ（Ｈ，Ｊ、Ｋｈｏｒａｎａ　）（
１９７８）バイオヶミストリイ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　）、１７．１２５７−１２６７］。

同様な方法で１３−ｍａｒ（ｍ）、１６−　ｒｎｓ　ｒ
（Ｖ）、４４−　ｍａ　ｒ儀が合成され、α−ファクタ
ーリーダー配列とグルカゴン（１−２９）遺伝子の融合
に対する合成グルカゴン（１−４）リンカ−として２つ
のオリがヌクレオチド（１０−ｍｅｒと１８−ｍｅｒ）
が使用される。３３−ｍ＠ｒｌ、グルカゴン（１−２１
）の遺伝子構築に用いられる２個の１９−ｍｅｒおよび
２６−　ｒａｍ　ｒ突然変異誘発性欠失プライマーは、
自動ＤＮＡ合成機（アプライド　バイオシステムズＡｐ
ｐｌ饅ａｄ　Ｂｆｏｍｙｇｔｅｍｓ　３８０　Ａ型）中
で　ホスホラミシト　ケミストリイおよび市販されてい
る反応物を用いて合成される。

例２゜ グルカゴン（４−２９）　？コードする遺伝子の合成オ
リがヌクレオチドを記載されているようにイー末端でラ
ベルする〔ケイ、ノリス（Ｋ、Ｎｏｒｒｉｍ）、エフ、
ノリス（Ｆ、Ｎｏｒｒｉｍ　）、エル、クリスｆ−？ン
セン（Ｆ、ＣｈｒｉｓＮａｎａｓｎ　）および！Ｘ、　
７４　　／ｌ／（Ｎ、ｒｔ■）（１９８３）ヌクレイツ
ク　アシドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｆｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
＠５ｅａｒｃｈ　）　　１１　＊５１０３−５１１２：
ｌ。

水１０μ！中のＩおよび５′−Ｐ−標識化■のそれぞれ
１０ピコモルと１１１２０ピコモルの混合物を５分間６
０℃で加熱し水中で急冷する。１３２ｍＭトリス−ＨＣ
Ｌ　（ＰＨ７，４）　１０１’ｌ　−２０ｍＭ　　Ｍｇ
Ｃｌ２．２ｍＭ　ＡＴＰ　、２０ｔｎＭ　ＤＴＴ、　　
１００　Ａｌｌ／ＩｒＬｌ　　ゼラチンおよび０．５μ
ｌＴ４リガーゼ（２００単位）を加える。１６℃で２．
５時間連結反応を行ない、ここ　　　　。

で約２／３が連結する。得られる６６−ｍａｒ　（１−
１）をＰＡＧＥ変性および緩衝液溶出によシ精製する。

同様に５′−３２ｐ−標識化Ｖ２０ぎコモルを、１６℃
にて２．５時間［２５ピコモルの存在下に５’　−５２
Ｐ−４Ｕｆ＆化ＧＩＤ２０　ヒｚモルＪ−■２０　ヒ＊
モルと連結する。得られる７３−ｍａｒ　（ＩＩＩ−Ｖ
−ｆＶ）をＰＡＧＥ変性および緩衝液溶出によシ精製す
る。

９μｌの５０　ｍＭ　）リス−ＨＣｔ（ｐｉ（７，８）
、５ｍＭＭｇＣ２２，１０ｍＶ　ＤＴＴおよび５０　ｐ
ｇ／ａｔゼラチン中の（１−１１）および（１−Ｖ−Ｉ
Ｖ）　　そレソれ２ピコモルｔ−８０℃にて３分間加熱
し、次いで３０分間かけて４５℃まで冷却する。４５℃
で１５分間アニーリングした後、反応混合物を１６℃ま
で冷却し１　ｐｉ　ｄＮＴＰ−ｍｉｘ　（ｄＡＴＰ　、
　ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰ　。

ｄＴＴＰそれぞれ５　ｍＭ　）と１　μｉ　ＤＮＡポリ
メラ−虻！、フレノウフラグメント（３，５単位）を加
える。

反応における充てんが１６℃で６０分間進められ、次い
でフェノール抽出によシ単離され、エタノールで析出さ
れる。ＤＮＡはＫｐｎ　１とＨＩｎｄ３ｔ−消化し、プ
ラスミドｐＬａ　０４８　（独自のＫｐｎ　１とＨ１ｎ
４３部位を有するｐＢＲ３２２の誘導体）からの大きな
Ｋｐｎ　１−　Ｈｌｎｄ　３断片と連結する。

連結混合物音アンピリジン耐性を選択するコンピテント
大腸菌細胞へ形質転換させる。制限酵素分析（Ｘｂａｌ
、Ｋｐｎ　１およびＨｌｎｄ３）およびＤＮＡ配列〔ニ
ー・マキサム（Ａ−Ｍａｘａｍ　）およびダプリュ・ギ
ルバート（Ｗ、　Ｇ１１ｂ＠ｒｔ　）　（１９８０）　
　メソード　エンザイモール（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ−）６５．４９９−５６０〕によシ、合成グル
カゴン（４−２９）遺伝子を含むグラスミドｐＫＦＮＪ
　を有するコロニーが同定され友。

実施例３ グルカゴン（１−２９）の発現に対する酵母グラスミド
の構築 グラスミドｐ２８５を制限酵素Ｘｂａｌで切断し、次イ
でフレノウポリメラーゼとデオキシリゾヌクレオチドト
リホスフェートで処理することによりプラントエンドす
る。フェノールで抽出しエタノールで析出させ再懸濁後
、ＤＮＡ　ｆ：　Ｈｌ　ｎｄ　３　で切断し１０．５ｋ
ｂ断片を単離する。この断片は、ＴＰＩプロそ一ター〔
ティ、アルパー（Ｔ、　Ａｌｂ＠ｒ　）とシイ・カワサ
キ（Ｑ、　Ｋａｗａｓａｋｉ　）、ジャーナルオツ　モ
レキュラー　７プライド　ジェネト（Ｊ、　Ｍｏ１．　
ＡｐｐｌＩｅｄ、　Ｇ＠ｎｅｔ、　）、１　（１９８２
）。

４１９−４３４］とＭＦα１リーダー配イー有する。

ｐ２８５の構築は米国特許出願Ｓ、Ｎ、　５４７．７４
８（１９ｇ３年１１月１日）に記載されている。

ｐ２８５は挿入ＴＰＴｐ−ＭＦα１リーダーＢ−Ｃ−Ａ
−ＴＰＴ？ｌ有し、酵母株Ｚ　３３　（ＡＴＣＣ４２０
６８１）で寄託される。プラスミドｐＢｏ＠１５　（Ｋ
ｐｎ　１　部位を含む合成Ｈ１ｎｃ　２　、　Ｈｌｎｄ
　３挿入部を備えたｐｔｙｃ　８の誘導体）ｔ−制限酵
素Ｎｄ＋１で切断し、上述のようにフレノウポリメラー
ゼを用いてプラント一二ノドし、Ｋｐｎ　ｌで切断し、
最後に０．３ｋｂの断片を単離する。上述したように調
製された合成グルカゴン（１−４）リンカ−を用いて、
ｐＵｃ８挿入部のＫｐｎ　１部位をＭ　Ｆａ　ｌリーダ
ー配列の２６３位のＨ１ｎｄ３部位と接続することによ
り、これら２つの断片を連結する。多重コピーの挿入を
避けるために、リンカ−を連結前にホスホリル化しない
。ＭＦ、　１リーダーの最後の固有Ｈ１ｔ＋ｄ３部位は
リンカ−によりて改質されない。連結混合物を７ミピシ
リン耐性要求性大腸菌へ形質転換する。

所望の制限パターンを含むプラスミド、９ＭＴ２９０（
第１図）が得られる。

グルカゴン（１−２９）’ｔ”コードする完全な遺伝子
；よび遺伝子に続く転写終結配列上も含む発現プラスミ
ドを得るために、９ＭＴ２９０からの６．５ｋｂ　Ｘｈ
ｏ　１−　Ｋｐｍ　１断片ｆ　ｐＭＴ　４０９　（０，
７ｋｂ）（ｂａ　１−　ＢａｍＨ１欠失を有する９ＭＴ
１８３）からの５、　ｌ　ｌｃｂ　Ｈｌｎｄ　３−　Ｘ
ｈｏ　１断片およびｐＫＦＮ　４からのグルカゴン（４
−２９）？コードする合成Ｋｐｎ　１−　Ｈｌｎｄ　３
断片と連結する。プラスミドｐＭＴ　１８３は２．１　
ｋｂ　Ｓｐｈ　ｌ　−ＢａｍＨ３挿入部を含むＹＥＰ１
３の誘導体である。挿入部はスキゾサツカｏ−ｒイセス
　？ンベ（Ｓａｈｉｚｘｏｓｍａｅｈａｒｏｍｙｅｓｓ
ｐｏｒｌｂｓ　）からのアルコールデヒドロｒナーゼプ
ロモーターの制御下にニス・セレグイシアエ（Ｓ。

ｃａｒ＠マ１１１）のＭＦα１遺伝子の発現をコードす
る。そのＢａｍＨ３隣接部における挿入部はまた転写終
結を特定するＭＦａ１遺伝子からの配列をも含む、連結
混合物をアンピシリン耐性を選択する大腸菌へ形質転換
する。得られるグラスミドの１つ、９ＭＴ５４４（第２
図）はグルカゴン（１−２９）の発現をコードする予想
された制限パターンを示すが、まだＮ−末端Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ伸展部をコードする配列上も有す
る。Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｉｍ　ｆコードする配
列全インビトロ変異誘発によｆｉ　ｐＭＴ５４４から除
くとｐＫＦＮ６が得られる。ｐＭＴ　５４４をグルカゴ
ン遺ダ子における固有のＸｂａ１部位で切断することに
よシ直線化する。Ｅｘｏ■ヌクレアーゼ処理によシ得ら
れた二重鎖ＤＮＡの３′−末端から５′−モノヌクレオ
チド全除去する。Ｅｘｏｌ［ｌヌクレアーゼ処理を２３
℃で行ないこの条件下で線状グラスミドの各３′−末端
から約２５０個のヌクレオチドが除かれる〔エル・グオ
（Ｌ、Ｇｕｏ）およびアール・ダブリユニー・（Ｒ，Ｗ
Ｕ、）（１９８３）、メソード　イン　エンザイモロジ
イ（Ｍ＠ｔｈｏｄｓ　ＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）　
１００　、６０−９６　）。キナーゼ化２６−ｒｏａｒ
変異誘発性欠失グライマーｄ（ＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡ
ＡＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＴ）全突然変異位置まで
アニールする（第４図）。クレノウボリメラーゼを用い
た充てんとＴ４すが一ゼを用いた連結により二重鎖環状
ＤＮＡが作られる。グルカゴン遺伝子における最初のＸ
ｂａ１部位はフレノウ充てんとそれに続く連結によシ破
壊される。大腸菌（ＭＴ　１７２　）の形質転換後、５
′−Ｐ−標識化２６ｒｎｅｒ欠失変異誘発性グライマー
を用いてコロニーハイブリッド法によシ突然変異体が同
定される。

８個の突然変異体からのプラスミドｆ　Ｋｐｎ　１＋Ｐ
ａｔ　ｌ消化により分析し、これにより１２個の塩基の
予想された欠失が確認される。８個の突然変異体のうち
３個は“純粋な１突然変異体であるがこれらからのプラ
スミドはそれにもかかわらず再度大腸菌（ＭＴ１７２）
へ形質転換される。

ｐＭＴ　５４４からの４．４　ｋｂ　ＢａｍＨ１−Ｘｈ
ｏ　１およびＱ、９　ｋｂ　ＢａｍＨ１−Ｋｐｎ　１断
片（グルカゴン（４−２９）遺伝子を含む）を１２　ｂ
ｐ欠失を有する２つのグラスミドからの６．５　ｋｂ　
Ｘｈｏ’ｌ　　−Ｋｐｎｌ断片と連結することによシ、
グルカゴン遺伝子における破壊されたＸｂａ１部位を再
構築する（第５図参照）。

２つの連結混合物を形質転換に使用する〔大腸菌（ＭＴ
１７２）と形質転換細胞から単離されたグラスミドｋＸ
ｂａ１部位（Ｘｂａ　１　十ＥｅｏＲ１消化）の存在に
ついてスクリーニングする〕。４個のグラスミドからの
Ｘｂａ　１−　ＳａＬ　１断片のＤＮＡ配列決定によシ
欠失を確認する〔エイ・マクサム（Ａ。

Ｍａｘａｍ　）とダブリ−・ギルバート（Ｗ、Ｇ１１ｂ
ｅｒｔ）（１９８０）メソード　イン　エンザイモロジ
イ（Ｍｓｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ）ｒｍｏｌｏｇｙ　
）　６５　＋　４９９−５６０〕。別の用途のために１
つのグラスミド、ｐＫＦＮ６　が選択される。

ＴＰｒｐ−ＭＦαｌ　リーダー（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌｍを引く）−グルカゴン（１−２９）−ＭＦα
ＩＴを含むｐＫＦＮ６からの２．１　ｋｂＢａｍＨｌ　
−Ｓｐｈ　１（部分）断片を、ニス・ポンベ（Ｓ、　ｐ
ｏｍｂｅ　）を含むプラスミドＣＰＯＴの約１１　ｋｂ
　ＢａｍＨｌ　−５ｐｈ　１断片に連結する。連結混合
物をアンピシリン耐性選択性大腸菌へ形質転換する。得
られたプラスミドはｐＭＴ６１２であった（第２図参照
）。

例４゜ グルカゴン（１−２１）の発現に対する酵母グラスミド
の構築両方ともｐＫＦＮ６からの０．９ｋｂＢａｍＨ１
−Ｈｌｎｄ　３断片と１１　ｋｂ　Ｘｂａ　ｌ　−Ｂａ
ｍＨ１断片をグルカゴン（１６−２１）　２コードする
合成の１９　ｂｐ　Ｈｌｎｄ３−Ｘｂａｌ断片に連結す
る（上記参照）。連結混合物をアンピシリン耐性選択性
大腸菌（ＭＴ　１７２　）へ形質転換する。１２個の形
質転換体からのプラスミドｆ　Ｂａｍ　Ｈ１＋Ｘｂａｔ
１消化によシ分析する。プラスミドの１つからの２．ｌ
ｋｂＢａｍＨ１−Ｓｐｈ　１　（部分）断片をニス・ボ
ンベＴＰＴ遺転子全含むプラスミドＣＰＯＴからのほぼ
ｌｌｋｂＢａｍＨｌ　−Ｓｐｈ　１断片と連結する。連
結混合物全アンピシリン耐性選択性大腸菌（ＭＴ　１７
２　）へ形質転換する。

制限酵素分析（ＢａｍＨ１＋Ｘｂａ　１およびＨ１ｎｄ
３十’　Ｐｓｔ　１　）および０．７　ｋｂ　３２Ｐ−
標識化５ａｔ１−８ｐｈ　１断片のＤＮＡ配列決定によ
り、合成グルカゴン（１−２１）含有グラスミドｐＫＦ
Ｎ２３を有するコロニーが同定される。

例５゜ 酵母株ＭＴ　５５６におけるグルカゴン（１−２９）の
発現 ニス・セルヴイシアエ株３６２（ｔａｕ　２　）　ｆＯ
，Ｄ、　６００が２．１になるまでＹＰＤ培地〔ジャー
マンら（Ｓｈａｒｍａｎ　ｅｔ、ａ、１．　）　、メソ
ートインイースト　ジェネティックス（Ｍｓｔｈｏｄｓ
　ＩｎＹｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）、：ｒ−ル）
ｘプリンクハーバ−ラデラトリイ（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　）　ｙ　１
９８１　）で増殖する。培養液１０Ｑ＋＋ｔｌｔ−遠心
分離によシ採取し、水ｌＱｍｌで洗い、再度遠心分離し
、（１，２Ｍソルビトール、２５　ｍＭ　Ｎａ　２　Ｅ
ＤＴＡ　ｐ’　＝　８−０−６−７　’９Ａ”ジチオト
レイトール）１０ゴに再懸濁する。懸濁液を３０℃で１
５分間インキュベートし、遠心分離し、細胞を（１，２
Ｍソルビトール、１０　ｍＶ　Ｎａ２ＥＤＴＡ。

０．１Ｍクエン酸ナトリウム−＝５，８．２ｍ９ノゲザ
イムＮＯマｏｚｙｍ■２３４）のｌＱａ／に再懸濁する
。

懸濁液上３０℃で３０分間インキ−ベートし、細胞全遠
心分離によシ集め、１．２Ｍソルビトール１０ｄとＣＡ
Ｓ　（１，２Ｍソルビトール、１０　ｍＭＣａ　ＣＬ　
２．１０　ｍＭ　）リス（トリス−トリス（ヒドロキシ
メチル）−アミノメタン）ＩＪ（＝７．５）１０ｄ中で
洗い、ＣＡＳ　２　ｒｒｌｌに再懸濁する。形質転換の
ためにＣＡＳ−再懸濁細胞０．　ｌ　ｌｎｉ！をほぼｌ
μＩのプラスミドｐＭＴ　５４４と混合し、室温で１５
分間放置する。（２０％、ｊ？リエチレングリコール４
０００．１０　ｍＭ　ＣａＣｌ２．１０　ｍＭ　）リス
ー−７，５）　　の１４を加え、混合物をさらに３０分
間室温で放置する。混合物を遠心分離し、被レノ）　ｉ
　ＳＯ８（１，２Ｍソルビトール、３３　％　ｖ／ｖ　
ＹＰＤ　１６．７　ｍＭＣａＣｔ２．１４ｐｌｊ／ｒｎ
ｌｏイシン）の０．　ｌ　ｄ中に再懸濁させ、３０℃で
２時間インキ−ベートする。

次いで懸濁液を遠心分離し、被レットを１．２Ｍソルビ
トール０．５７中に再懸濁させる。寒天上層〔ジャーマ
ンらのＳＣ培地（グレート　イン　イースト　ジェネテ
ィックス、コールド　スプリング７”ｉ　　、ｐ４−　
　ラＮラトリイ、１９８１）、ロイシンを排除し、１．
２Ｍソルビトール＋２．５％寒天ヲ淀むもの１５ｉＡ！
を５２℃で加え、この懸濁液を同種の寒天固化ソルビト
ール含有培地を含むグレートの上面に注入する。３０℃
にて３８後形質転換コロニー１−選び、再単離し、液状
培養を開始するのに使用する。このような形質転換体の
１つＭＴ５５６（＝　ＭＴ　３６２／　ｐＭＴ　５４４
　）をさらに特性決定のために選択する。

株Ｍ７５６６’！ｉｌ”、ロイシンを含まない合成の完
全培地ＳＣ（ジャーマンら、グレート　インイーストジ
ェネティックス、コールド　スゲリング　ハーバ−ラ？
ラトリイ、１９８１）で増殖する。２１の流れ防止フラ
スコ中の１１培養液を３０℃で攪拌してＯ−０，６００
ｒ＋ｍ　７〜１０までとなるようにする。次いで培養物
を遠心分離し、さらに別の分析のために上清を除く。

抗グルカゴン血清に一６２４８ｉ用いたラジオイムノア
ッセイによ！＋ＭＴ５５６からの上清中でグルカゴン様
免疫活性（ＧＬＩ　）　ｉ測定する〔ヘディング　エル
、ジ４　、　（Ｈｅｄｉｎｇ　Ｌ、Ｇ、　）、（１９８
３）ハンドブック　オプ　エクス硬リメンタル　ファル
マコロジ４　（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉ
ｒｎｅｎｔａｌＰｈａｒｍａｅｏｌｏｇｙ　）、グルカ
フ９ンＩ；ビイ、ジェイ。

レフェプレ（Ｐ、Ｊ、　Ｌｓｆｓ＋ｂｖｒｓ　）編、ス
グリンガーフエアラーク（Ｓｐｒｌｎｇｓｒ　Ｖｅｒｌ
ａｇ　）　ｐｐ　１ｇ９−２０２〕。この抗体はグルカ
ゴン分子の中心にある配列を識別する。

形質転換酵母細胞における免疫活性グルカゴン（１−２
９）の発現レベルは１７７ナノモル／ｌ上清である。

ａＬｒ−−ｅプチドをＭＴ５５６上清から回収する。

上ｉｓｏｏｍｚへ　　■−グルカゴントレーサーと９６
％エタノールをアルコール濃度５　％　（ｖ／ｖ）が得
られるまで添加する。上清全セダーパック（Ｓｅｐ　−
Ｐａｋ　）■カラム（ウォーターズＷａｔｅｒｓ　）で
濃縮し、上清５３３ｄに相当する濃縮液の２／′３’に
抗グルカゴンイムノンルベントカラムで精製する。

抗グルカゴンカラムからの溶出液ｆｆｉ、１０μクオー
ターズ　ミクロデンドノやツク（μＢｏｎｄｏｐａｋ　
）Ｃ−１８カラＡ（３，９Ｘ３００ｍ）中ＨＰＬＣで分
別する。Ａ緩衝液およびＢ緩衝液は、それぞれ０．１　
％　ＴＦＡ（Ｈ２Ｏ）と０．０７％ＴＦＡ　（ＭｅＣＮ
　）である。カラムを２５％Ｂ（流速：１．５ｄ／分）
で平衡化し、被プチドをＭｅＣＮの直線状勾配（１チ／
分）で溶出し、２７６ｎｍで検出する。

ＧＬＩに相当するピークが膵臓グルカゴン１−２９標準
物と同じ領域で溶出する。この分画を濃縮し、再度溶解
し、アミノ酸配列分析を施す。単離された４グチドの配
列分析をガスフェーズセフエン・ト（Ｇａｓ　Ｐｈａｓ
ｓ　Ｓ＠ｑｕ＠ｎｃｓｒ　）で行なう〔モーディ。

エイ・ジェイ・（Ｍｏｏｄｙ　、　Ａ、　Ｊ、　）　、
チム、エル・（Ｔｈｉｍ、Ｌ）、ヴアルベルデ、アイ、
（Ｖａｌｖａｒｄｅ　。

ｒ、）フェデレーシ、ン　オプ　ヨーロピアンバイオケ
ミカル　ソサイアティーズ　レター（ＦＥＢＳＬ＠ｔｔ
、）、１７２（１９８４）、　　１４２−１４８〕。

次の結果が得られた： 以下、〉白 ＭＴ　５５６からのＧＬＩ−ペプチドの精製工程　　　
　容量　ＧＬＩ（抗体Ｋ　−６２４８）収率ｄ　　　　
　ナノモル　　　　係 上清　　　　　８００　　　　１４２　　　１００セグ
−パック 濃縮液　　　　　２　　　　　１１１　　　　７８抗グ
ルカゴン カラム　　　　０．２　　　　　２９　　　　２０）Ｉ
ＰＬＣ２，０１１８ 配列決定結果から発現産物は３つのペプチドからなるこ
とがわかる： Ｇｌｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌｍ−グルカフ９ン（１−
２９）　　　３３％Ｇｌｕ−Ａｉｍ−ダルカプン（１−
２９）　　および　　　３３％グルカゴン（１−２９）
　　　　　　　　　　　３３％３つのペプチドは示唆し
た相対量で存在する。

さらにＡｒｇ−Ａｒｇ配列はすべての３つのペプチドで
損なわれていないこともわかる。

例６゜ 醇母株ＭＴ６１５におけるグルカゴン（１−２９）の発
現 ニス・セレヴイシアエ（Ｓ、　ｃ＠ｒ・マ１ｓｉａ・）
株ＭＴ　　５０１　　（Ｅ２−７Ｂ　　Ｘ　　Ｅｌｌ　
−３Ｃ（＊／ａ　　、Δｔｉ／ΔｔｐＩ。

ＰＩ３）　４−３／１）＠Ｐ４−３　）　）　　を、次
の修正を伴壜りて例４で記載したように９７Ｍ６１２で
形質転換する＝１）形質転換前に株ＭＴ　５０１　ｋ　
ＹＰ　ＧａＬ　（１９６パクト酵母抽出物、２％バクト
ペプトン、２係ガラクトース、１％ラクテート）でＯ，
Ｄ、　６００が０．６になるまで増殖する。２）　　Ｓ
Ｏ８溶液はＹＰＤの代わシにＹＰＧ凰Ｌｔ−含む。１つ
の形質転換体ＭＴ６１５（−ＭＴ　５０１　／　ｐＭＴ
　６１２　）　ｔ−さらに特性決定の九めに選択する。

株ＭＴ６１５をＭＴ５５６について記載し九ようにただ
しＹＰＤ培地（ジャーマンら、メソード　インイースト
　ジェネティックス、コールド　スプリング　ハーバ−
ラがラトリイ、　１９８１）で、Ｏ，Ｄ、　６００が１
５になるまで増殖する。

グルカゴンｐＭＴ６１５上清から単離する。２回単陥を
行なう。最初に、上清からのペプチドをメルク（Ｍｅｒ
ｃｋ）Ｃ１８のカラムに結合し、６０チエタノールで溶
出し、次いでウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ　）　ＨＰＬ
ＣＳＰイオン交換体中で分別する。

この方法では、ＳＰ上での分離のために０１８溶出液の
調製の間トレーサーとして用いる　　■−グルカプンが
定量的に析出するために、部分的に成功するだけである
。第二の方法は、ＭＴ６１５上清液中のベグチド？ＳＰ
セファデックスに結合し、逆相ＨＰＬＣによシ溶出し分
別することである。抗グルカゴン血清Ｋ　６２４８およ
びに５５６３（これはグルカフ９ンのＣ末端部分を識別
する）を用いて〔ヘディング　ｚ　Ａ／−ジ（・（Ｈ＠
ｄｉｎｇ　Ｌ、Ｇ、）、（１９８３）ハンドズック　オ
プ　エクスイリメンタル　ファ／Ｌ／　−２：２０ジ４
　（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐ＠ｒｉｒｎｅｎｔ
ａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　）、グルカブ０ン■　
：　ビイ、ジェイ。

レフェグレ編、スプリンガー　フェアラーク。

ｐｐ１８９−２０２）、ＲＴＡ（ヘディング、エル。

シイ、（１９７１）、ラジオロジカル　ディターミネー
ション　オプ　・々ンクレアティック　アンドガツト　
グルカゴン　イン　プラズマ （Ｒｍｄｌｏｌｏｇｌｅａｌ　ｄ＠ｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｏｎ　ｏｆｐａｎｃｒｅａｔｌｃ　　ａｎｄ　ｇｕｔ　
ｇｕｌｃｍｇｏｎ　　ｉｎ　ｐｌａｓｍｍ）、ダイアヘ
トロギア（Ｄｉａｂｓｔｏｌｏｇｉｍ　）　７　、１０
−１．９］によシ測定される。

単離１ １２５■−豚グルカゴン全９００ａ／のＭＴ６１５（パ
ッチ１）へ加え、８００１１１ｔ−次のようにじて分別
する。試料を５憾エタノール溶液に調整し、メルク　リ
クロプレッ７’　（Ｍｅｒｃｋ　Ｌｉｅｈｒｏｐｒｓｐ
　）Ｃ１８（２５−４０μ）の４．８Ｘ１．５αカラム
へ約２００ｍ１／ｈｒで加える。２５ミリモル／ｌ・ギ
酸アンモニウム、ｐＨ３，５中の５チエタノールおよび
同じ緩衝液中の１５％エタノール５Ｑｄでカラムラ洗浄
した後、保持されたペプチドをエタノールの６０チギ酸
アンモニウム溶液で溶出する。

粗イプチドを水で希釈する（イオン強度および有機溶媒
チの両方ともを減じるため）と、１′■−グルカゴンの
塊を含む多久の析出物が形成される。これはｐＨ３−５
でのＳＰイオン交換剤の計画的使用を予め排除する。析
出物’１ｐ）１９．０で溶解し、ｐＨ４，０で再度沈で
んさせる。ウォーターズＤＥＡＥイオン交換体中で分別
するために、試料’１２０１ア七トニトリル中の２．５
ミリモル／ｌ・ギ酸アンモニウム−７，５に溶かす。試
料を施こすと　　■−グルカゴンが結合しない。それゆ
え、ＤＥＡＥカラムからの漏出液を減圧下に濃縮し、ヌ
クレオシル（Ｎｕｃｌｓｏｓｉｌ　）　５　μＣ１Ｂの
２５０Ｘ４．６ｍカラム上で逆相ＨＰＬＣによシベグチ
ドを分別する。

単＃＆２゜ ＳＰセファデックスＣ２５（適当な特性含有する他のイ
オン交換体を使用してもよい）２Ｎｆｅ２００ｄのＭＴ
　６１５　（パッチ２）（ｐＨを４．３に調整）へ加え
、懸濁液を室温で２０分間攪拌する。ＳＰセファデック
スを直径２．５　ｃｍのガラス製クロマトグラフィカラ
ム中で戸去し、２５ミリモル／ｌ・ギ酸アンモニウム、
ｐＨ３，５の５０ＰＩＬｌで洗い、結合した。Ｊ４ｆチ
ドを５００ミリモル／ｌ・ギ酸アンモニウムｐＨ８，４
で溶出する。ヌクレオシルＣ１８の２５０Ｘ４．６ｍカ
ラム中で逆相ＨＰＬＣによシこの溶出液からグルカブ９
ンを単離する。

分別の間のグルカゴン様免疫活性（ＧＬＩ　）　（７）
分布ヲ、グルカゴン１１−１５およびグルカゴンのＣ−
末端部を識別する抗体（それぞれに６２４８およびに５
５６３　）　ｆ用いてＲＩＡによシ測定する。

分別におけるＨＰＬＣ−グルカゴン１の量ハＨＰＬＣＫ
より評価される。使用される方法は、グルカゴンを加え
ることなく試料を分析し、次いで内１部標準グルカゴン
を加えて“グルカゴン”全同定スることである。次いで
、“グルカゴン”の聞ピークを、試料中のＨＰＬＣ”グ
ルカゴン”のｆｔｅ算定するのに用いる。ピーク高さの
算定に対する基線は１グルカゴン１ピークと隣接する［
Ｊ、Ｖ、　）レースである。グルカゴン１■（２９０ナ
ノモル）／ｄが２７０　ｎｒａで２．０ｍ　　の吸収率
を有すると仮定され九。

結果 ＭＴ　６１５　、パッチ１およびパッチ２におけるＨＰ
ＬＣ″グルカゴン１とＧＬ、Ｔの含有量ｔ−第１表に示
す・ 未処理ＭＴ６１５上清（パッチ１）単独のＨＰＬＣ分析
曲線（上側図）および３μＩグルカゴン添加後のＨＰＬ
Ｃ分析曲線（下側図）′！！−第６図に示す。カラムは
、２５チアセトニトリル中の１００ミリモに／ｌ・ギ酸
７７　モニ＋７　ム、ｐＨ３，５テ１．０＃！／／分に
て平衡化されたマーチェレイーナｒル　ヌクレオシル（
Ｍａｃｈｅｒ＠ｙ−Ｎａｇ＠ｌ　Ｎｕｅｌｅｏｓｉｌ　
）　　５　ｉクロンＣ１８，２５０Ｘ４．６晴である。

２分後、試料をギ酸アンモニウム中のアセトニリル勾配
液で溶出する（３分間２５チから３０％、次いで３５分
間３０幅から４０１）。流出液の昔吸収率をフルスケー
ル０．０８Ａ単位で２８０ｎｍにて測定する。ＨＰＬＣ
”グルカゴン”は上側図にハツチされる。ペプチドピー
ク（ａｔ　２０．３８　）がグルカゴンの添加によシ増
加することがわかシ、この物質が）ＩＰＬＣ″″グルカ
ゴン”ではないかと思われる。

濃縮されたＤＥＡＥ漏出液の調製用分別を第７図に示す
。ＨＰＬＣ分１４’ｌ第６図のように行なうが、ただし
Ｕ、Ｖ、吸収率は２８０ｎｍ、フルスケール１、２８　
Ａ単位で測定する。上側図は濃縮ＤＥＡＥ漏出液の調製
用ＨＰＬＣ分離を示し、下側図は画分におけるＧＬＩの
分布を示す。カラムからの流出ａｔ−減圧下に減少させ
、凍結乾燥し、ＧＬｒ分析のために６０％エタノール中
の０．１％酢酸に溶かす。

“グルカゴン”　Ｒｔ　２０．５１が完全に配列し、グ
ルカゴンであることがわかる。

分別の間にＭＴ６１５、パッチ１からの　　■−グルカ
デン、ＨＰＬＣ′″グルカゴンａおよびＧＬｌ、の回収
を第２表に示し、パッチ２からのＨＰＬＣ”グルカゴン
“の回収を第３表に示す。

酵母構築物ＰｗＩＴ６１５が２５０−１０００ナノモル
／ｌ（１（ＰＬＣで判定されるように）の範囲でグルカ
ゴンを産生ずることがわかる。

１１゛１・−２；ミ白 第３表 ＭＴ６１５．パッチ２からの“グルカフ０ン′の回収出
発物質（２０Ｑｉｚ）　　　　１９２ＳＰＰｉ（２１５
ｄ）　　　　　４０　（２１％）”ｓｐ溶出液（ｌｓａ
／）　　　　１１７（６１チ）ａｐｔ、ｃ−ｃｌｓ（１
ｄ）　　　　１１８（６１％）ａ）“グルカゴン１は非
常に低いピークで、定量するのが難しい。

例７゜ 酵母株ＫＦＮ３１におけるグルカゴン（１−２１）の発
現 ニス、セレヴイシアエ（Ｓ＠　ｃｅｒｅｖｉａｉａｅ　
）株ＭＴ　６６３　（２／α、Δｔ、１／ΔｔｐＳ、　
ＰＩ３）４−３　／ｐｅｐ４−３　）を、例６で記載の
ようにｐＫＦＮ　２３　　で形質転換する。１つの形質
転換体ＫＦＮ３１（＝　ＭＴ　６６３／　ｐＫＦＮ　２
３　）　　をさらに特性決定のために選択する。株ＫＦ
Ｎ　３１　’ｌｉ−ＭＴ　６１３　　についテ記載した
ように（例６参照）増殖し０．０．６００＝１５とする
。

発現レベル 酵母上清中のグルカゴン（１−２１）の＠ヲ次の方法に
よ、ｊ７　Ｉ（ＰＬＣ分析で測定する：溶媒Ａ　：　Ｈ
２Ｏ中のトリフロロ酢酸（ＴＦＡ　）　０．１％ｖ／ｖ
溶媒Ｂニアセトニトリル（ＭｓＣＮ）中のＴＦＡ　０．
０７％　ｖ／ｖカラム：　ＲＰ−Ｃ１８ノテー・リフ（
Ｎｏｖｏ　−ｐａｋ）■。

５μ、４．６Ｘ１５０調（ウォーターズ）流速：ｌ、５
ｒｎ／／分 倹　出：　２８０　ｎｍにおける四−吸収率溶出方法：
０−２分：１０％Ｂ／９０％Ａで平均的溶出２−２２分
：１０％Ｂ７９０％Ａから ３０％Ｂ／７０％Ａへ１％ＭｓｃＶ分 に相当しながら勾配溶出 標準品二合成グルカゴン（１−２１） （ノボ　インダストリイ　Ａ／Ｓ　） 上記）（ＰＬＣ法において、グルカゴン（１−２１）は
保持時間１７．３６分で溶出する。異なった量の酵母株
ＫＦＮ３１上清を注入することによυ、グルカゴン（１
−２１）の発現レベルを測定する：０．８８　μｍｏｌ
／　ｌ　（”ＨＰＬＣ”−グルカゴン（１−２１））。

グルカフ９ン（１−２１）の精製 リクロプレｆ　Ｌｌ　ｅｈｒｏｐｒｅｐ■ＲＰ−１８（
メルク。

商品、９３０３　）のカラム（１×９の）を、６０チ（
ｖ／ｖ）エタノール含有　５０　ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３
３０’で洗う。次いでカラムを５％（、／ｖ）エタノー
ル含有５０　ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３で平衡化する。９６
係エタノール２３．５ｄを上清４５０１ｎｌへ加え、混
合物を一晩カラムへ一ンプ注入する（流速２５　ｒｎｌ
／ｈ　）。

カラムｔ−０，１Ｍ　ＮａＣ４１５１ｍで次いでＨ２０
１５ｒｕｇで洗い、ペプチド物質金６０％（Ｖ／、）エ
タノール含有ＮＨａＨＣＯｓ　５０　ｍＭで溶出する。

　３ｒＩＬｌの分画を集める。−！！プチド物質が分画
Ａ６と７に溶出し、これら分画をプールし、減圧遠心分
離〔サパント　バキューム　セントリフニーＪ　（Ｓａ
ｖａｎｔｖａｃｕｕｍ　ｃｅｎｔｒｌｆｕｇｅ　）　：
］により　１　＃！ｔまで濃縮してエタノールを除去す
る。２５　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＨ＝７．４）１
ｍをこの濃縮液へ加え、これを予め２５　ｍＭ　ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液（、、Ｆ（−７，４）　Ｉ　Ｑ７で平鳶化シ
た抗−グルカゴンセファロースカラム（１，５Ｘ　２．
５１Ｍ）へ捲こす。捲用後、カラム全室温で３０分間放
置し、その後２５　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝夜（ＰＩ”Ｉ
＝７．４）１０ｄで洗う。４デチド物質を２０　ｓ　（
ｖ／ｖ）酢酸で溶出し、溶出液のｐＨ１ＮＩ（４０Ｈで
７．０に調節する。

先きの工程からの溶出液を減圧回転により５００μｌま
でＫｍし、グルカゴン（１−２１＞全上述の方法を用い
て逆相ＨＰＬＣによりさらに精製する。試１斗をそれぞ
れ１００μ！容俗の５つのアリコートに分ける。保持時
間１７．３６分に相当するピークとして溶出するペプチ
ド物質を集める。ペプチド物質を減圧遠心分離により乾
燥し、０．１％（ｖ／ｖ）酢酸１００μｌに再溶解する
。グルカゴン（１−２１）の全収率は８５％である。

特性決定 精製されたグルカゴン（１−２１）は、アミノ酸分析〔
テム、エル・（Ｔｈ１ｍ　、　Ｌ、　）およびモーディ
、エイ、ジェイ、　（Ｍｏｏｄｙ　ｒ　Ａ−Ｊ−）＋パ
イオキミカエ　バイオフィジカ　アクタ（Ｂｌｏｃｈｉ
ｍ。

Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）　７０３（１９８２）１
３４−１４１）およびアミノ酸配列分析〔モーディ、エ
イ、ジェイ、。

チム、エル、およびヴアルベルデ、アイ、。

フェデレーシ、ン　オプ　ヨーロピアン　バイオケミカ
ル　ソサイアティーズ　レターズ（ＦＥＢＳＬ＠ｔｔ−
）ｐ　　１り２　（１９８４）、　１４２−１４８　　
ｍｌにより特性決定を行なう。結果全それぞれ第４表お
よび第５表に示す。

以下企白 第５表：酵母株ＫＦＮ　−３１から精製されるグルカゴ
ン（１−２１）のアミノ酸配列分析 Ｇ　１　ｎ　ｓおよびＧ　１　ｎ　２０から計算される
平均反応収率は９０チである。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＭＴ　２９０　　の構築を示す図
式、 第２図はプラスミドｐＭＴ　５４４　＊　ｐＫＦ’Ｎ　
６およびｐＭＴ６１２の構築を示す画成１ 第３図はプラスミドｐＫＦＮ　２３の構築を示す図式、
第４図および第５図はプラスミドｐＭＴ５４４からの一
定の配列のインビトロ突然変異誘発を示す図式、 第６図は純粋な真生グルカゴン添加前および後の酵母上
清のＨＰＬＣ分析曲線金示し、第７図は濃縮ＤＥＡＥ漏
出液の調製用分別グラフを示す。 以下会白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グルカゴンまたはその断片もしくは誘導体の発現を
   コードする遺伝子からなる複製可能な発現ビヒクルを含
   む形質転換酵母株を適当な栄養培地で培養し、続いて発
   現産物を回収することからなる酵母におけるグルカゴン
   またはその断片もしくは誘導体を産生する方法。 ２、グルカゴンまたはその断片もしくは誘導体の発現を
   コードする遺伝子が合成遺伝子である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３、遺伝子がグルカゴン（１−２９）の発現をコードす
   る特許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 ４、合成遺伝子がグルカゴン（１−２１）の発現をコー
   ドする特許請求の範囲第２項記載の方法。 ５、酵母においてグルカゴンまたはその断片もしくは誘
   導体の発現をコードする合成遺伝子からなるＤＮＡ配列
   。 ６、好ましくは酵母において高度発現に用いられるアミ
   ノ酸コドンからなる特許請求の範囲第５項記載のＤＮＡ
   配列。 ７、合成遺伝子がグルカゴン（１−２９）の発現をコー
   ドする特許請求の範囲第５項または第６項記載のＤＮＡ
   配列。 ８、合成遺伝子がグルカゴン（１−２１）の発現をコー
   ドする特許請求の範囲第５項または第６項記載のＤＮＡ
   配列。 ９、酵母において分泌をもたらす配列をコードするリー
   ダーを合成遺伝子の上流に隣接して挿入された特許請求
   の範囲第５項〜第８項のいずれか１に記載のＤＮＡ配列
   。 １０、酵母において安定な保持をもたらす複製システム
   およびグルカゴンまたはその断片もしくは誘導体をコー
   ドするＤＮＡ配列からなる複製可能な発現ビヒクル。 １１、さらに発現産物のプロセッシングおよび分泌をも
   たらす配列からなる特許請求の範囲第１０項記載の複製
   可能な発現ビヒクル。 １２、特許請求の範囲第１０項または第１１項記載の複
   製可能な発現ビヒクルを含む形質転換酵母株。