JPS61173774A - 生薬成分を含む生物組織の培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 実施例　１　全草および茎葉部分に生薬成分を含む植物
体の頂芽を用いる組織培養法（適用例　センブリ、ドク
ダミ、ヒキオコシ。

イカリソウ、クサノオウ、ミッガシワ、ヘンルーダ、パ
イカイカリツウ、キランソウ、カキオドシ、ワサビ、セ
ラコク、ゲンノショウコ、ユキノシタ、ニチニチソウ、
センニチソウ、シュンサイ、イチヤクソウ、ヨツバヒヨ
ドリバナ、ミゾ力りシ、シロネ、フジバカマ。

リュウノウギク、ナギナタコウジュ、カヮミドリ、イラ
クサ、イシミカワ、ナンバンギャル、ヤマジソ、ミッデ
ウラボシ、オタネニンジン等） 上記に示した生薬成分を含む茎葉の頂部分を無菌的に解
剖顕微鏡下ではがし、生長点細胞をとりだす、取り出し
た生長点細胞を、下記組成の滅菌培養液で手早く洗い、
培養液を含んだ固体培地で恒温条件下で培養する。

代表的な培養液組成ＣＧ／Ｌ）　　　　　　　　（Ｇ／
Ｌ）ア）塩化カリウム（ＫＣＬ　　）　　　　　　　０
．０８イ）硫酸マグネシウム（ＭＧＳＯ４）　　　　０
．３６つ）硫酸ナトリウム（ＮＡ２ＳＯ４）　　　　０
．２０工）硫酸第二鉄　　　　　　　　　　　　　０．
０２５オ）第１リン酸ナトリウム　　　　　　　　０．
０１６５力）硝酸力ルシュウム　　　　　　　　　　０
．２０キ）硫酸マンガン　　　　　　　　　　　　０．
００４５り）硫酸亜鉛　　　　　　　　　　　　　　０
．００１５ケ）ホウ酸　　　　　　　　　　　　　　　
　ｏ、ｏｏｉｓコ）ヨウ化カリウム　　　　　　　　　
　　　０．０００７５す）グリシン　　　　　　　　　
　　　　　０．００３シ）ビタミンＢ１、Ｂ６．ニコチ
ン酸　　　０．００５ス）ショ糖　　　　　　　　　　
　　　２０，０００セ）インドール酢酸　　　　　　　
　　　　０．０５生長点組繊細胞を栄養そとホルモン剤
を含んだ培養液で無菌的に洗浄することにより、組織片
の周囲を培養液が包み、必要な水分と栄養そが補給され
るとともに、培養液中のホルモン剤の作用により、培養
しようとする組織や細胞が刺激され、成長を１段と促す
ようになるのである。

２）　組織片の植込み、培養 前処理を施した組織片は、無菌箱中で小型の三角フラス
コ中のカンテン培地に植込む、カンテン培地の培養液の
組成は前述の代表的な培養液組成で培養液ＩＬにカンテ
ン１０グラムを加え、Ｏ，ＩＮのＮａＯＨでＰＨを補正
し、分注後、加圧、滅菌する。

組織片を植込む際にはフラスコの口を炎にかざして火炎
滅菌するとともに、口は常時横に向けて、上から落てく
る雑菌などが入らないようにする。植込みの終了したフ
ラスコの口は炎で滅菌後ふたをして、外部からの雑菌の
侵入を防ぐ。

組織片を植込んだ容器は無菌箱から取出し、２０−３０
度、好ましくは２５度位に調整した恒温室内に入れる。

茎や葉を分化、成長させるためには照明を用いる。照明
には、植物の光合成に効率良く吸収される波長の光を出
す照明を用いれば、光合成も活発になり、成長が速い、
照明時間は連続的なものでもよいし、昼夜を交互にした
ものでも、どちらでも成長速度は似通っている。なお、
恒温室に入れて２−３日すると、組織片移植時に滅菌が
不充分であったり、雑菌の混入したものは、雑菌のコロ
ニーが形成されるので、それらが発生した容器は直ちに
取除く。

３）　カルスの形成、***、株わけ 恒温器中で培養開始後１０数日を経過すると、植込んだ
組織片は細胞***を始め１組織片の表面の色が変ってく
る。約４週間後には生長点は大きく成長し、以後日数が
たつにつれて大きく増殖してゆく、シかし、そのまま放
置しておくと、培養地中の養分の欠乏などによりカルス
は変色し、硬くなったりして増殖が止る。このようにな
らない前に、カルスを分割し、新しいカンテン培地へ移
して、さらに栄養増殖を起す、まず上記４−５週間たっ
た生長点組織を、垂直に分割し、分割切片を今度は前回
よりもやや内容積の大きいフラスコ中のカンテン培地へ
移植する。培地は前回とほぼ同様の組成のものを用いる
が、この培地中へのホルモン剤は前回のインドール酢酸
からカイネチンへ変更する。あるいは、インドール酢酸
を若干含んだままでカイネチンを加えてもよい、カイネ
チンは培養組織の茎葉の分化を促進する０日数の経過と
ともに、フラスコ中には茎や葉が伸び、やがてフラスコ
いっばいになる。このようにフラスコ内に茎や葉がいっ
ばいになる前に、何回か分割、移植してゆくことにより
、１つの生長点から同じ植物体を無数に増殖させること
ができるのである。さらに、内容積の大きいフラスコを
使用する場合には。

その内部で大きな植物体として育てることができる。ま
た、前述の大型のフラスコを用いて培養、増殖、成長さ
せた後の植物体を通常の土壌へ移し、栽培しても充分に
満足のゆく結果が得られるのである。このように、ある
程度大きくなるまでフラスコ内で成長させた後、土壌へ
移す栽培法も本発明は含むものである。その結果、通常
露地で育てた場合と比べて、その成長速度は著しく速く
、かつ同一植物体を多数に分割できることから、培養中
の成長速度の速いものや、病原菌に対して抵抗の強い株
などを選びぬくことも可能である。

本発明はさらに、フラスコ内で***、増殖、成長させた
植物体を移植する場合に、土壌ではなく水栽培や水気耕
栽培と言われる方法への応用までも含めているのである
。フラスコ内で伸長し１発根した植物は自然光条件下へ
移すことにより、人工光条件下よりも強い光合成を行な
い、生薬成分の含有量も増し、乾燥品にした際に乾燥、
減量が少なく、歩留りも向上する。また、本発明により
伸長、成長した幼苗を水気耕栽培法を用いて、温室下で
栽培する場合には、茎や葉の繁茂は著しく、土壌栽培の
２−３倍の収穫量を得ることもまれではない９本発明を
用いて水気耕栽培をするもう一つの利点は、根や茎の土
を落す作業が省略されることである。根や茎は培養液中
で生長するために、少しの水洗いのみで根や茎が洗浄さ
れるのである。

実施例−２根、根茎、塊茎、塊根、鱗茎、根皮、球根１
球茎、貯蔵根、茎皮、幹皮、樹皮、木部などの部分に生
薬成分を含む植物体の形成層、板端、燐片、出芽部など
を用いる組織培養法（適用例ボタン、ンヤクヤク、オウ
レン、アミガサユリ、ウスバサイシン。

カノコソウ、アマドコロ、ナルコユリ、クララ、チガヤ
、エゾエンゴサク、シャツヒゲ、セキシ、つ、ナキナグ
サ、シンシュウダイオウ、ショウブ、アマナ、カントウ
マムシグサ、フジコブ、ニガキ。

テンダイウヤク、７オダモ、セラコク、ムラサキ、コガ
ネバナ、ケガイソウ、オタネニンジン、キキョウ、ハマ
ゴボウ、ハマスゲ、キハダ、ツリガネニンジン、センキ
ュウ、トウキ、カラスビシャク、アカヤジオウ、ウキャ
ガラ、アカネ、イブキトラノオ、ヒナタイノコズチ、オ
ニツヤガラ、オオツズラフジ、コウホネ、ニラケイ、シ
シウド、マタタビ、ムクゲ、トチバニンジン、ミャマト
ベラ、トリアシショウマ、シュンサイ、イケブ、ジュズ
ダマ、ヒロハセネガ、カガミグサ、ノブドウ、オニドコ
ロ、オニユリ、ハナスゲ、ヒオウギ、オオグルマ、ツル
ニンジン、ヤブラン、シャク、ジュロソウ、ビャノブ、
ヤマドリカブト、ナツズイセイ、ヤプコウジ、オケラ。

シ、ウガ、サラシナショウマ、ミシマサイコ、ヤマノイ
モ、クサスギカズラ、クズ、オミナエシ、リンドウ、ワ
レモコウ、ノダケ、ヒガンバナ、キカラスウリ、サジオ
モダカ、ツルドクダミ、サルトリイバラ、トロロアオイ
、スイセン、カナオイ、ラッキョウ、タマサキッズラフ
ジ、コフキサルノコシ力ヶなど）実施例−１で示した前
処理法を用いる。よく水洗した根、根茎、塊茎、鱗茎を
無菌箱中で７０％エタノール中に数秒間浸し、滅菌培養
液で洗浄後、輪切りにする０輪切りにした根茎などを、
形成層の部分が含まれるように数個に分割し、培養用の
組織片とする。ここで用いる培養液は植物ホルモンの濃
度を低くするかジベレリンを用いるかあるいは含まない
ものを用いる。

２）　組織片の植込み、培養 実施例−１の２）で示した方法でカンテン培養液を準備
し、分注、滅菌する０組織片を植込む方法は実施例−１
とほぼ同様で、無菌箱中で火炎滅菌的に行い、植込みが
終了したら雑菌の混入を防いで、恒温培養する。恒温培
養中には照明はほとんど不要である。

３）カルスの形成、***、増殖、株わけ恒温器中で培養
中の根茎などの形成層組織は、３−４週間後にはカルス
を形成する。このカルスは日数の経過とともに***、増
殖して大きくなる。ある程度の大きさになったカルスは
、実施例−１の３）で示した方法で株わけをする。無菌
的に分割したカルスを、新しいカンテン培地へ移し、恒
温下で栄養成長させる。

培養容器はやや内容積の大きいフラスコを用い、培養液
は実施例−１とほぼ同様の組成のものを用いるが、含ま
れるホルモン剤の濃度は実施例−１よりもやや希くして
用いるか、ジベレリンを用いるか、あるいはほとんど植
物ホルモンを含まないものを用いる。インドール酢酸は
高濃度では根や茎にたいしては抑制的に作用するので注
意を要する０日数の経過とともにフラスコ中には根や茎
が伸び。

一部緑色になり葉緑体の出現するものや色素の出現する
ものも見らｈ　＾礒ζイ曾＾坦獣ツ士づ一Δルを上広１
←二けｈ！このようにフラスコ内に根や茎が全体的に広
がるまえに、？−３回分割、移植をくりかえしてゆくこ
とにより、１つの形成層から多数の同一植物体を増殖さ
せることができるのである。カルスの移植、株わけ＃ｅ
数週間すると、移植したカルスは肥大成長し１本発明の
目的とする生薬成分を含んだ根茎の組織培養品ができあ
がる。このように、カルスの移植、株わけ、肥大成長を
くり返してゆくことにより、目的とする生薬成分を含ん
だ植物体組織が得られる。根や茎の肥大成長後、さらに
栄養分を補給することにより、根茎からは芽や根が伸長
し、ついには通常の植物体になり、光照射により伸長し
た葉には葉緑体が出現し、光合成機能を営むようになる
。このように成長した植物体は、実施例−１の３）での
べた水栽培や水気耕栽培を用いて温室下で育てることも
可能である。

しかし、実施例−２の方法は根や茎などに生薬成分が多
量に含まれるものを、この根茎部分のみを多量に、短時
間に培養するものであるので、植物体全体まで伸長、成
長させなくともよい。

実施例−３植物体の雌しべ、雄しべ、花弁、かく、花柱
、はいのう細胞、子葉、幼芽、出芽、植物こぶ、植物粒
、はい芽などに生薬成分を含む植物体の当該部の組繊細
胞を培養する方法（適用例　サフラン、フジこぶなど） ｌ）　前処理 生薬成分を含む雌しべ、雄しべ、花弁、がく、花柱、は
いのう細胞、子葉、幼芽、出芽、植物こぶ、植物粒、は
い芽などの目的とする組織や器官の形成前にその植物体
の幼穂、幼花、幼雌しべ、幼雄しべ、はいのう、幼芽、
こぶ、植物粒を無菌的に解剖顕微鏡下で取出し、実施例
−１または実施例−２の方法で前処理し、洗浄する。

洗浄後の組織を、大きければ四分割、小さければ二分割
して培養用の組織片とする。

２）　組織片の植込み、培養 前処理を施した培養用の組織片は無菌的に小型の三角フ
ラスコ中のカンテン培地に積込む、カンテン培地の培養
液の組成は実施例−１の代表的な培養液組成のものにＡ
ＴＰ　（アデノシン三リン酸）を０．００１−５．０ｇ
／Ｌ、好ましくは０．０２ｇ／Ｌ加え、培養液ＬＬにカ
ンテン１０ｇを加え、Ｏ，ＩＮＨｃＩまたは０．ＩＮの
ＮａＯＨでＰＨを補正し、分注後、滅菌する。ＡＴＰは
細胞***に必要とされ、細胞***を盛んにする０組織片
を植込むときには火炎滅菌的に行い、雑菌の混入を防ぐ
、植込みの終了したフラスコの口にふたをし、２０−４
０’Ｃ１好ましくは３０″′Ｃ前後に調整した恒温室内
に入れる。培養初期には茎や葉の分化は起らないため照
明はなくともよい、雑菌混入のフラスコは２−３日後に
は判明するので、取除く。

３）　カルスの形成、***、増殖、株わけ恒温器中で培
養開始後１０数日を経過すると、移植した植物片は細胞
***、増殖【始め１組織片の表面の色が変り、だんだん
大きく成長し、カルスを形成する。ここで、さらに同一
植物体の増殖をはかるためにカルスの分割を無菌的に行
い、分割したカルスを新しいカンテン培地へ移して栄養
増殖を行う、増殖をしだカルスを次に。

やや内容積の大きいフラスコに移すが、フラスコには上
記２）のカンテン培養液を分注後、滅菌しておく、この
カンテンの上に、成長したカルスを分割後、その一つを
火炎滅菌的に移植する。培養液は上記２）とはＣノ同じ
でよいが、ホルモン剤をインドール酢酸からカイネチン
へ変更した方が成長の速いものがあるので、その場合に
はカイネチンを用いる０日数の経過とともにフラスコ内
にはカルスが成長し、雌しべ、雄しべ、かく、花弁、柱
頭、はいのう、子葉、植物こぶなどが分化してくる。カ
ルスがフラスコ内にいっばいになる前に、何回か分割、
移植してゆくことにより、一つの組織から多数の植物体
組織を無数に増殖させることができ、これら組織中に含
まれる生薬成分を多方面へ利用することが可能になるの
である。このように、必要な生薬成分を含む組織を必要
に応じて増殖できることは、生薬成分を多量に、かつ安
価に供給できるものとなるのである。

実施例−４動物体のたんのう、***腺、すいぞう、会陰
膣、甲状腺、消化腺などの細胞あるいは組織を培養する
方法（適用例　ジャコウジカ、ジャコラネコ、ヒキガエ
ル、マウス、ラット、ウサギ。

イヌ、ネコ、トリなど） この方法はジャコラなどの分び腺の細胞あるいは組織を
培養することにより、その細胞内にジャコラを多量に含
む細胞を、多量に得ようとするものである。また、ヒキ
ガエルなどの消化腺細胞を培養することにより、その細
胞中に含まれるステロイドホルモンなどを。

その細胞中より得ようとするものである。

ｌ）　前処理 芳香や生薬成分を含む組織や細胞を無菌的に取出し、滅
菌空気を通気中の滅菌生理食塩水に浸し、３７Ｃを保つ
、この生理食塩水でよく洗浄後、つざの培養液で培養す
る。

２）　動物組織の培養液 動物の組織や細胞を培養するときには１次の培養液組成
のものを７）　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　
　９．０００イ）　硫酸マグネシウム　　　　　　　　
　　　０．３６０つ）　第一リン酸ナトリウム　　　　
　　　゛　　０．０２０工）　グルタミン酸ナトリウム
　　　　　　　　　ｏ、ｏｉ。

オ）　メチオニン　　　　　　　　　　　　　　　０．
０１０力）　アラニン　　　　　　　　　　　　　　　
０．０１０キ）　　トリプトファン　　　　　　　　　
　　　　０．００５り）　　リジン　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０．００５ケ）　ビタミンＢ、Ｂ、
ニコチン酸　　　　　　０．００５コ）　　　ＡＴＰ（
アデノシン三リン酸）　　　　　　　０．００５す）　
グルコース　　　　　　　　　　　　　　　０，０１０
シ）　鶏卵圧さく汁　　　　　　　　　　　　　　０，
０１０ス）　血しょうにワトリ）　　　　　　　　　　
　０．０１０前処理を短時間で終了した移植片を、無菌
的に上記組成の培養液中で１通気をしながら液体培養す
る。培養に必要な温度は３５−４５°Ｃ１好ましくは３
７’Ｃで、常に滅菌した空気を培養液中に通気し。

酸素の補給と培養液の攪拌を行う、液体培養のみでなく
、カンテンを用いた固体培養でも、上記組成の培養液に
カンテンをｌ　Ｏｇ／Ｌ加え、分注、滅菌後に組織片を
移植する。

３）　カルスの形成、***、増殖、株わけ恒温器中で培
養開始後、１０数日を経過すると、植込んだ組織片は盛
んに***を始め、組織片の表面の色が変ってくる。約４
週間後には、移植片は大きな塊となり、以後日数の経過
とともに大きく増殖してゆく。

しかし、このままで培養を続けてゆくと、培養液中の栄
養分の欠乏などにより、カルスは変色したり、硬くなっ
たりして成長が止る。

このようにならない前に、カルスを分割し、新しい培養
液に移して。

さらに栄養増殖をおこす、４−５週間経ったカルスを、
２−４分割し、分割切片を新しい培養液へ移し、通気培
養する。新しい培養液に移された分′Ｍ切片は、再び栄
養分を吸収して、増殖する。ただ。

この時点で、液体培養に不向きなカルスはカンテン培地
へ移す、カルスの移植は火炎滅菌的に行う。

フラスコの中で大きく成長した動物組織片あるいは動物
細胞は。

芳香を放つようになったり、ステロイドホルモンを含む
ようになる。

このようになったフラスコ中の細胞や組織を粉砕、破壊
して、芳香成分や生薬成分を分離、ちゅう出、精製して
もちいる。

植物の茎や根を滅菌した温湯あるいは熱湯に入れた後、
滅菌水で冷却して用いるのは、生長点細胞や形成層に刺
激を与え、それにより細胞***が高まったり、生長点付
近についている雑菌が殺されたりするために、有効な一
つの手段となるのである。また、前処理過程でｆｆｉ織
片に赤外線、紫外線、Ｘ線、可視光線などを組織片に当
てることにより、光線のエネルギーが細胞を刺激し、や
はり増殖を促すことになるのもある。前処理として、組
織片を電場あるいは磁場におくことにより、磁気エネル
ギーが細胞***を刺激し、また細胞***を盛んにする。

さらに、組織片を有機酸液に浸すことは、組織片細胞の
細胞壁や細胞膜を刺激し、ひいては細胞***が活発にな
るのである。

また、培地に金属イオンの含まれている培地を使うのは
、生元素としてＦｅやＭｇなどがクロロフィルの形成や
へ千グロビンの生成に大変重要なものであるため、これ
を補給するのが目的である。

ビタミンおよびＡＴＰなどの核酸類も細胞***に対して
エネルギーの補給や補酵素として重要な役割を果たすの
である。

また、ホルモン剤の投与は細胞***の促進と細胞の伸長
を増す働きをもつ。

細胞が***の準備をする間に必要な元素があり、これら
の必要な元素は培養液のなかにふくまれているが、この
培養液には無機塩類等培地、有機質類、ビタミン類、核
酸類、ホルモン等が含まれている。

細胞***を早め、側々の細胞の成長を促すために植物ホ
ルモンやＡＴＰなどが加えられる。

本発明の目的とするところは、いかに早く、大きく、か
つまた生薬成分を多量に含む細胞および組織を培養する
かということであり。

その方法が本発明である。したがって、本発明の方法で
早く、多量に生薬成分を含む細胞や組織が培養できるこ
とは、人類に多大な恩恵を与えるものとなるのである。

特許出願人　株式会社　日証金設 須田幹生 手　　　　続　　　　補　　　　正　　　　書昭和６０
年　６月１２日 １、事件の表示　　　　昭和６０年　特許願第１３２７
１号２、発明の名称　　　　生薬成分を含む生物組織の
培養法３、補正をする者 本件との関係　　特許出願人 ５、補正の対象　　　　明細書の始めに　３、発明の詳
細な説明の項目を記載すること。

６、補正の内容　　　　別紙の通り 方式■　　　５．１ゝ＼ ｉ　　　　　＼も　・（ ダーク　　−− ３、発明の詳細な説明 本発明は、薬理学的に重要な生薬成分を含む植物体ある
いは動物体の臓器、組織、細胞を多量に、かつ安定的に
培養することを目的とした生物組織の培養方法に関する
ものである。

従来、生薬成分を含む植物体は薬草として山野より集め
られたり。

Ｌ部は栽培などによりつくられていた。また、生薬成分
を含む動物の臓器等は野生動物などから集められていた
。このように野生動物や植物に頼る収集の仕方では数量
も不安定で、少なく、不定期的であり、必要な時に必要
なものが入手しにくかった。

本発明は、このような不安定な供給に頼ることなく、生
薬成分を含んだ生物の組織および細胞を安定に供給し、
かつ安価で、早く入手できるようにするために開発され
た生物組織の培養方法である。

本発明の特徴は、培養しようとする組織片あるいは細胞
などを。

栄養そとホルモン剤を含んだ無菌の等ちょう液で洗浄後
、カンテン培地などの固形培地へ移し、無菌的に増殖さ
せようとするものである。生物種の組織片あるいは細胞
によっては、カンテン培地のような固形培地よりも液体
培地の方が生育、増殖のよいものがあるので、その場合
には液体培地を用いる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　生薬成分を含む生物体の生長点、ちょう芽、出芽、
   よう芽、はいのう細胞、おしべ、めしべ、花柱、花弁、
   がく、形成層、茎葉部、根端、肝臓、腎臓、骨髄、繊維
   芽、腫瘍、癌、軟骨、心臓筋、平滑筋、横紋筋、神経芽
   、りんぱ球、精細胞、卵細胞、たんのう細胞、ひぞう細
   胞等の細胞や組織を単離し、前処理を加えた後、下記の
   栄養分を含んだ液体培地あるいは固体培地で無菌的に分
   裂、増殖、成長させることを特長とした生物組織の培養
   法。 ２　前処理として滅菌した温湯あるいは熱湯に組織片を
   浸し、その後滅菌した水で冷やすことを特長とする特許
   請求の範囲第１項記載の生物組織の培養法。 ３　前処理としで紫外線、赤外線、Ｘ線、可視光線など
   を組織片に照射することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の生物組織の培養法。 ４　前処理として、電場に組織片をおくこを特徴とする
   特許請求範囲第１項記載の生物組織の培養法。 ５　前処理として、磁場に組織片をおくことを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の生物組織の培養法。 ６　前処理として、有機酸液に組織片を浸すことを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の生物組織の培養法。 ７　培地として　金属イオンを含む無機塩類培地（以下
   無機塩類等培地と称する）を用いることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の生物組織の培養法。 ８　培地として無機塩類等培地に有機質類（炭素源とし
   て糖類、ちつそ源としてアミノ酸、蛋白質、酵母ちゅう
   出液、細胞ちゅう出液、天然物エキス、ペプトン等）を
   添加して用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の生物組織の培養法。 ９　無機塩類等培地に、有機質類およびビタミン類を添
   加して用ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の生物組織の培養法。 １０　無機塩類等培地に、有機質類、ビタミン類、ホル
   モン剤および核酸類（ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＮＡＤ
   、ＤＰＮ、ＴＰＮ、ＦＡＤ、ＣｏＡ、ヌクレオチド、核
   酸誘導体）を加えることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の生物組織の培養法。 １１　無機塩類等培地に、有機質類、ビタミン類および
   ホルモン剤を加えることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の生物組織の培養法。 １２　無機塩類等培地に、有機質類およびホルモン剤を
   加えることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の生
   物組織の培養法。 １３　無機塩類等培地に、有機質類、核酸類およびホル
   モン剤を加えることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の生物組織の培養法。 １４　前処理として、前記７−１３の培養液に組織片を
   浸すことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の生物
   組織の培養法。