JPS61172897A - ウイリス‐特異的プロテアーゼ活性検出用ペプチド基質 - Google Patents
ウイリス‐特異的プロテアーゼ活性検出用ペプチド基質Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は一般的に感染症の診断分野、および特に、特異
的プロテアーゼをコードするウィルスによる感染を検出
するための化合物および方法に関する。
的プロテアーゼをコードするウィルスによる感染を検出
するための化合物および方法に関する。
プロテアーゼはタンパクを特異的なイプチド結合で分解
する酵素である。生体系においては、特異性の高いプロ
テアーゼおよび相補的プロテアーゼ阻害剤が広範囲の生
物学的機能を仲介しまたはそれを制御している。例えば
、プロテアーゼは前駆体を分解してポリペプチドの翻訳
後のプロセシングにおいて活性タンパクを形成し、酵素
原活性化カスケード反応例えば細波凝固、線維素溶解、
免疫系の補体反応などのメカニズムを与え、そして選択
されたタンパクの生物学的な膜を通しての輸送を仲介す
る。
する酵素である。生体系においては、特異性の高いプロ
テアーゼおよび相補的プロテアーゼ阻害剤が広範囲の生
物学的機能を仲介しまたはそれを制御している。例えば
、プロテアーゼは前駆体を分解してポリペプチドの翻訳
後のプロセシングにおいて活性タンパクを形成し、酵素
原活性化カスケード反応例えば細波凝固、線維素溶解、
免疫系の補体反応などのメカニズムを与え、そして選択
されたタンパクの生物学的な膜を通しての輸送を仲介す
る。
ウィルスゲノムによりコード化されたプロテアーゼは多
くのウィルスの複製に重要な役割を果している。ウィル
スプロテアーゼは感染細胞により産生される大きな前駆
体ポリペプチドをよシ小さなタンパク成分またはサブユ
ニットに分解するか、それらはその後機能性ウィルス複
製を形成するように組立てられる。LoZitakii
ら(Usp、Sovrem、Biol、 93: 35
2〜362 (1982) )は鳥類および曙乳類ウィ
ルスの複製におけるタンパク分解の役割を論じ、またウ
ィルスプロテアーゼ阻害物質に関する文献の一部を調査
している。
くのウィルスの複製に重要な役割を果している。ウィル
スプロテアーゼは感染細胞により産生される大きな前駆
体ポリペプチドをよシ小さなタンパク成分またはサブユ
ニットに分解するか、それらはその後機能性ウィルス複
製を形成するように組立てられる。LoZitakii
ら(Usp、Sovrem、Biol、 93: 35
2〜362 (1982) )は鳥類および曙乳類ウィ
ルスの複製におけるタンパク分解の役割を論じ、またウ
ィルスプロテアーゼ阻害物質に関する文献の一部を調査
している。
ウイルス−特異的プロテアーゼ(Virus−spec
ifi社proteasθ)によるウィルスポリRゾチ
ドの翻訳後のプロセシングは、以下のものを言むいくつ
かの重要な科の動物ウィルスの複製の際に生起する。
ifi社proteasθ)によるウィルスポリRゾチ
ドの翻訳後のプロセシングは、以下のものを言むいくつ
かの重要な科の動物ウィルスの複製の際に生起する。
AM肝炎ウィルス(hepatitis A viru
s)カルデイオウイルス(cardiovirus)デ
ング熱ウィルス(dengue virus)(Men
ovirusesノ ウ(/L/スー特異的プロテアーゼの役割はその他のウ
ィルス科、特に、ミキソウイルス(myxovirus
es)、バラミキンウイルス(戸1q−virusea
λパクシニアウイルス(vaccinia virus
es)、コモウィルス(comoviruses)およ
びレオウィルス(rsovirusθB)の複製におい
ても報告されている。
s)カルデイオウイルス(cardiovirus)デ
ング熱ウィルス(dengue virus)(Men
ovirusesノ ウ(/L/スー特異的プロテアーゼの役割はその他のウ
ィルス科、特に、ミキソウイルス(myxovirus
es)、バラミキンウイルス(戸1q−virusea
λパクシニアウイルス(vaccinia virus
es)、コモウィルス(comoviruses)およ
びレオウィルス(rsovirusθB)の複製におい
ても報告されている。
Korant[”■nhibition of Vir
al Protein C1ea−vage” 、An
tiviral Chemotherapy、Gaur
i版り(Academic Pr5ss、New Yo
rk、1981))およびKOrantじRegula
tion of Animal Virus Repl
i −cation by Protoin Clea
vage”、Proteases andBiolog
ical Control、(cold Spring
HarborLaborator7s 1975) )
はウィルス特異的プロテアーゼに関する文献のレビュー
である。
al Protein C1ea−vage” 、An
tiviral Chemotherapy、Gaur
i版り(Academic Pr5ss、New Yo
rk、1981))およびKOrantじRegula
tion of Animal Virus Repl
i −cation by Protoin Clea
vage”、Proteases andBiolog
ical Control、(cold Spring
HarborLaborator7s 1975) )
はウィルス特異的プロテアーゼに関する文献のレビュー
である。
人間および動物における重要な病原体であるピコルナウ
ィルスはウィルス複製に包含される特異的なプロテアー
ゼをコードするウィルスの例である。
ィルスはウィルス複製に包含される特異的なプロテアー
ゼをコードするウィルスの例である。
ピコルナウィルスは人間および動物における重要な病原
体である小さくて、エンベロープ無しのRNA含有ウィ
ルスである。ピコルナウィルス科のプロトタイプのもの
は、中枢Wb系のよく知られた恐しい病気であるポリオ
を髄炎(poli。
体である小さくて、エンベロープ無しのRNA含有ウィ
ルスである。ピコルナウィルス科のプロトタイプのもの
は、中枢Wb系のよく知られた恐しい病気であるポリオ
を髄炎(poli。
myelitlg)の原固体であるポリオウィルスであ
る。これまでの数十年間に、ポリオウィルス流行病は何
千という子供中背少年に麻痺性の疾病を起こしその結果
研究が刺激され、西側工業国においては効果的免役が確
豆されその病気はほとんど根絶するに到っている。今日
、衛生状態が原始的な人口密度の高い地域ではポリオウ
ィルスは依然として慢延している。一部の小児は影響を
受けるがこのような地域の人口の多くは主なポリオウィ
ルス型に対する抗体を有している。しかしながら西gI
U諸国では、そのウイルスの流行式ははるかにはい。時
として臨床的に亘要な症例か免疫されていない個人に生
じる。
る。これまでの数十年間に、ポリオウィルス流行病は何
千という子供中背少年に麻痺性の疾病を起こしその結果
研究が刺激され、西側工業国においては効果的免役が確
豆されその病気はほとんど根絶するに到っている。今日
、衛生状態が原始的な人口密度の高い地域ではポリオウ
ィルスは依然として慢延している。一部の小児は影響を
受けるがこのような地域の人口の多くは主なポリオウィ
ルス型に対する抗体を有している。しかしながら西gI
U諸国では、そのウイルスの流行式ははるかにはい。時
として臨床的に亘要な症例か免疫されていない個人に生
じる。
人間に影譬を及ぼすその池のピコルナウィルスとしては
、緩やかな腸感染と関連するコックスサラキーウィルス
;風邪やマイナーな呼吸感染と関連するライノウイルス
:A屋肝炎ウィルス;および脳心筋炎において示唆され
ているカルジオウィルスなどが挙げられる。
、緩やかな腸感染と関連するコックスサラキーウィルス
;風邪やマイナーな呼吸感染と関連するライノウイルス
:A屋肝炎ウィルス;および脳心筋炎において示唆され
ているカルジオウィルスなどが挙げられる。
***ウィルス(FMDV)は畜牛および他の分肚蹄動
物を悩ますピコルナウィルスの一属である。
物を悩ますピコルナウィルスの一属である。
***は極めて伝染性か高く、この病気のぼっ発かm認
された時には感染動吻を含む家畜群全体がだめになって
しまう。したがって***流行の経術的影響は極めてひ
どいものとなシうる。
された時には感染動吻を含む家畜群全体がだめになって
しまう。したがって***流行の経術的影響は極めてひ
どいものとなシうる。
FMDV icよる感染に対しある程度の保護を与える
ワクチンが生産されてはいるがこの病気は多くの地域に
依然として残っている。
ワクチンが生産されてはいるがこの病気は多くの地域に
依然として残っている。
ピコルナウィルスは一般的に類似した複製、Jターンを
伴う。まず感染性ウィルス粒子は標的細胞表面の特異受
容体に非共有結合的に結合する。次にウィルス粒子は細
胞膜を透過しそして一本鎖ウイルスRNA分子の外被を
除く。このプラス鎖RNAは最初、ウィルスRNAポリ
メラーゼを含むウィルスタンパク合成のmRNA鋳型と
して役立つ。そのウィルスRNAポリメラーゼは以後の
付加的プラス鎖産生の鋳型として役立つマイナス鎖(ま
たは相補) RNAの合成を触媒する。
伴う。まず感染性ウィルス粒子は標的細胞表面の特異受
容体に非共有結合的に結合する。次にウィルス粒子は細
胞膜を透過しそして一本鎖ウイルスRNA分子の外被を
除く。このプラス鎖RNAは最初、ウィルスRNAポリ
メラーゼを含むウィルスタンパク合成のmRNA鋳型と
して役立つ。そのウィルスRNAポリメラーゼは以後の
付加的プラス鎖産生の鋳型として役立つマイナス鎖(ま
たは相補) RNAの合成を触媒する。
感染過程の進行に伴い比例的により多くの新たに合成さ
れたプラス鎖が成熟ピリオン内に取込まれる。
れたプラス鎖が成熟ピリオン内に取込まれる。
ウィルスRNAポリメラーゼのほかに、ウィルスゲノム
はまたvpl 、vp2 、vp5およびVF6と称さ
れる4櫨頑の主なカプシド構逝タンパク;vp。
はまたvpl 、vp2 、vp5およびVF6と称さ
れる4櫨頑の主なカプシド構逝タンパク;vp。
と称されるRNAキャッピングタンパク;およびウィル
ス特異的プロテアーゼを含むいくつかの非構造タンパク
を特定する。ウイルス−特異的プロテアーゼはピコルナ
ウィルスの複製上独特な役割を果し、また本発明の診断
基買および方法の標的を提供する。
ス特異的プロテアーゼを含むいくつかの非構造タンパク
を特定する。ウイルス−特異的プロテアーゼはピコルナ
ウィルスの複製上独特な役割を果し、また本発明の診断
基買および方法の標的を提供する。
宿主細胞タンパク合成のウィルス誘発性遮断の後、ウィ
ルスmRNAはウィルスmRNA鋳型に沿った宿主リポ
ソームの連続通過においてウィルスタンパクに翻訳され
る。得られる翻訳生成物は各々異なる機能を有するいく
つかの領域(ドメイン)ヲ甘ひポリプロティンである。
ルスmRNAはウィルスmRNA鋳型に沿った宿主リポ
ソームの連続通過においてウィルスタンパクに翻訳され
る。得られる翻訳生成物は各々異なる機能を有するいく
つかの領域(ドメイン)ヲ甘ひポリプロティンである。
このポリプロティンはリポソーム/タン/ぞり複合体の
解[C先立ち、宿主細胞およびウィルス特異的プロテア
ーゼにより分解される。本質的に即時的に生起する発生
期分解反応は明らかに、宿生細胞翻訳装置に関連した細
胞プロテアーゼによ)仲介さnている。次に、最終的に
はカプシドアセンブリとなって実を結ぶ三次構造におけ
るコンフォメーション変化およびその他の変化を誘起す
る一連の中間分解反応は、高度に特異的でウィルスによ
りコードされたプロテアーゼによプ触媒される。タンノ
ぞり分解はまたウィルスRNAポリメラーゼを活性化お
よび不動化することによ、9 RNA合成を調節する。
解[C先立ち、宿主細胞およびウィルス特異的プロテア
ーゼにより分解される。本質的に即時的に生起する発生
期分解反応は明らかに、宿生細胞翻訳装置に関連した細
胞プロテアーゼによ)仲介さnている。次に、最終的に
はカプシドアセンブリとなって実を結ぶ三次構造におけ
るコンフォメーション変化およびその他の変化を誘起す
る一連の中間分解反応は、高度に特異的でウィルスによ
りコードされたプロテアーゼによプ触媒される。タンノ
ぞり分解はまたウィルスRNAポリメラーゼを活性化お
よび不動化することによ、9 RNA合成を調節する。
ピコルナウィルスにより感染された細胞中に独特なウイ
ルス−特異的プロテアーゼが存在することは、幾系統か
の研究により実証されている。第1に後で詳述されるよ
うくいウイルス−特異的プロテアーゼ活性は極めて部位
−特異的であ)、また正常な細胞内分解経路に関連した
タンパク分解活性に類似していない。第2にこの部位−
特異的酵素活性は未感染細胞の抽出液中VC検出されな
いが、感染過程の進行に伴い、また感染ウィルス証が増
えるに伴い増加する童として感染細胞の溶解液中に認め
られる。第3に、ウィルスmRNAでプログラム化され
た細胞不含タン・ξり合成系はカプシドポリペプチドを
もプロセシングする%微的なプロテアーゼ活性を生L6
゜第4に、ウィルスプロテアーゼは異型ウィルス゛また
は細胞タンパクの分解には効率的でないことが感染細胞
および細胞不含系において実証されている。
ルス−特異的プロテアーゼが存在することは、幾系統か
の研究により実証されている。第1に後で詳述されるよ
うくいウイルス−特異的プロテアーゼ活性は極めて部位
−特異的であ)、また正常な細胞内分解経路に関連した
タンパク分解活性に類似していない。第2にこの部位−
特異的酵素活性は未感染細胞の抽出液中VC検出されな
いが、感染過程の進行に伴い、また感染ウィルス証が増
えるに伴い増加する童として感染細胞の溶解液中に認め
られる。第3に、ウィルスmRNAでプログラム化され
た細胞不含タン・ξり合成系はカプシドポリペプチドを
もプロセシングする%微的なプロテアーゼ活性を生L6
゜第4に、ウィルスプロテアーゼは異型ウィルス゛また
は細胞タンパクの分解には効率的でないことが感染細胞
および細胞不含系において実証されている。
前述のとおり、ウイルス−特異的プロテアーゼは極めて
部位−特異的である。過去数年の間に、ウイルス−特異
的プロテアーゼにより認識される開裂部位のアミノ酸配
列がいくつかのピコルナウィルスについて決定されてい
る。このデータは一部、ウィルスタン11りの末端基分
析によ)与えられるがウィルスゲノムRNA 、あるい
はウィルスRNAに相捕的なDNAの配列決定により付
加的情報が得られている。ピコルナウィルスの開裂部位
の比較によりいくつかのクラス開裂認識部位が判明して
いる。翻訳の際本質的に即時的にプロセシングを受ける
発生期開裂部位はキモトリプシン開裂部位に類似してお
シ、また新しいカルボキシル末端は典型的には芳香族ま
たは疎水性残基により供与されている。ウイルス−特異
的プロテアーゼによりgmされる中間のあるいは以後に
プロセシングを受ける開裂部位は極めて明瞭である。ピ
コルナウィルスの場合、これらの部位はしばしば疎水性
(ロイシン、インロイシンまたはバリン)配列によ)囲
まれたグルタミン−グリシンまたはグルタミン酸−X連
鎖により%徴付けられる。ウイルス−特異的プロテアー
ゼにより認識される開裂部位配列1間の高い保存度は、
保存配列のW造に類似させるべく設計された人工基質を
、特異的プロテアーゼ活性の存在、および従ってピコル
ナウィルスによる細胞の感染の有無の検出に用いうろこ
とを示唆している。
部位−特異的である。過去数年の間に、ウイルス−特異
的プロテアーゼにより認識される開裂部位のアミノ酸配
列がいくつかのピコルナウィルスについて決定されてい
る。このデータは一部、ウィルスタン11りの末端基分
析によ)与えられるがウィルスゲノムRNA 、あるい
はウィルスRNAに相捕的なDNAの配列決定により付
加的情報が得られている。ピコルナウィルスの開裂部位
の比較によりいくつかのクラス開裂認識部位が判明して
いる。翻訳の際本質的に即時的にプロセシングを受ける
発生期開裂部位はキモトリプシン開裂部位に類似してお
シ、また新しいカルボキシル末端は典型的には芳香族ま
たは疎水性残基により供与されている。ウイルス−特異
的プロテアーゼによりgmされる中間のあるいは以後に
プロセシングを受ける開裂部位は極めて明瞭である。ピ
コルナウィルスの場合、これらの部位はしばしば疎水性
(ロイシン、インロイシンまたはバリン)配列によ)囲
まれたグルタミン−グリシンまたはグルタミン酸−X連
鎖により%徴付けられる。ウイルス−特異的プロテアー
ゼにより認識される開裂部位配列1間の高い保存度は、
保存配列のW造に類似させるべく設計された人工基質を
、特異的プロテアーゼ活性の存在、および従ってピコル
ナウィルスによる細胞の感染の有無の検出に用いうろこ
とを示唆している。
トガウィルスは典型的には節足動物担持RNA含有ウィ
ルスの1科であシ、黄熱病、風疹(麻疹)、デング熱、
脳炎およびある種の準臨床的状態の病原体を含む。ピコ
ルナウィルスのように、)ガウイルスはすべてのウィル
スポリペプチドの形成にタンパク開裂を用い、また特異
的プロテアーゼがそのトガウィルスゲノムによりコード
されているという証拠が存在している。
ルスの1科であシ、黄熱病、風疹(麻疹)、デング熱、
脳炎およびある種の準臨床的状態の病原体を含む。ピコ
ルナウィルスのように、)ガウイルスはすべてのウィル
スポリペプチドの形成にタンパク開裂を用い、また特異
的プロテアーゼがそのトガウィルスゲノムによりコード
されているという証拠が存在している。
ピコルナウィルスの場合と同様に、ウィルス前躯体ポリ
ハプチドの開裂部位に高度に保存されたペプチド領域が
みられるがこのことはウイルス−特異的プロテアーゼに
対する役割を示唆している。
ハプチドの開裂部位に高度に保存されたペプチド領域が
みられるがこのことはウイルス−特異的プロテアーゼに
対する役割を示唆している。
レトロウィルスは鳥窺および哺乳動物の生物種における
各種の肉腫、白血病、リンパ腫およびその他の癌腫に関
連した多くの属を含んでいる。アデノウィルスは時とし
て呼吸器および眼の感染の急性症状の発現に発展する、
リン/ξ様組織における潜伏感染を誘起するDNA 含
有ウィルスである。ピコルナウィルスおよびトガウィル
スと同様に、レトロウィルスおよびアデノウィルスは特
異的ウィルスプロテアーゼをコードしているものと思わ
れる。
各種の肉腫、白血病、リンパ腫およびその他の癌腫に関
連した多くの属を含んでいる。アデノウィルスは時とし
て呼吸器および眼の感染の急性症状の発現に発展する、
リン/ξ様組織における潜伏感染を誘起するDNA 含
有ウィルスである。ピコルナウィルスおよびトガウィル
スと同様に、レトロウィルスおよびアデノウィルスは特
異的ウィルスプロテアーゼをコードしているものと思わ
れる。
少くとも2つの論文が感染細胞の溶解物中のピコルナウ
ィルスプロテアーゼ活性の有無の検出に標識基質を用い
ることを開示している。
ィルスプロテアーゼ活性の有無の検出に標識基質を用い
ることを開示している。
Korantら(Proc、Natl、Acad、Sc
i、U8A 76:2992(1979) )はポリオ
ウィルス感染HeLa細胞をプロテアーゼ阻害物質であ
るヨードアセトアミドで処理することにより (35B
)メチオニン−標識ウィルス前駆体タンパクを得た実験
を記載している。標識タンパクは様々なウィルス感染段
階で得られたHeLaNJU胞の抽出液に添加された。
i、U8A 76:2992(1979) )はポリオ
ウィルス感染HeLa細胞をプロテアーゼ阻害物質であ
るヨードアセトアミドで処理することにより (35B
)メチオニン−標識ウィルス前駆体タンパクを得た実験
を記載している。標識タンパクは様々なウィルス感染段
階で得られたHeLaNJU胞の抽出液に添加された。
放射活性分解生成物はドデシル硫酸ナトリウム(Sn2
)ゲル遡気泳動によ)分析された。ウィルスにより感染
された細胞に由来する抽出液は特徴的な低分子量標識断
片群を含有した。
)ゲル遡気泳動によ)分析された。ウィルスにより感染
された細胞に由来する抽出液は特徴的な低分子量標識断
片群を含有した。
xorant ら(Ann、N、Y、Acad、Sci
、343:304(1980))はピコルナウィルスプ
ロテアーゼ活性の有無の検出に、アセチル−L−フェニ
ルアラニル−L−グリシルーL−アラニル−L−ロイシ
ルチオベンジルエステル(Ac −Phe −Gay−
Ala−Ledチオベンジルエステル)を用いることを
記載している。
、343:304(1980))はピコルナウィルスプ
ロテアーゼ活性の有無の検出に、アセチル−L−フェニ
ルアラニル−L−グリシルーL−アラニル−L−ロイシ
ルチオベンジルエステル(Ac −Phe −Gay−
Ala−Ledチオベンジルエステル)を用いることを
記載している。
感染細胞は機械的に破砕され、基質は得られた細胞質画
分に添加され、そしてプロテアーゼ活性は分光光度計を
用いて監視された。
分に添加され、そしてプロテアーゼ活性は分光光度計を
用いて監視された。
今般、特徴的なアミノ酸配列と、プロテアーゼにより触
媒される開裂を行った後に検出できるインジケータ基を
含むある櫨の合成イブチドを、ウイルス−特異的プロテ
アーゼ活性を迅速に測定するのに用いうろことを見出し
た。これらの化合物およびかかる化合物を用いた1断方
法は特異的プロテアーゼをコードするウィルス、例えば
ピコルナウィルスが原因する感染症の診断にM用である
。
媒される開裂を行った後に検出できるインジケータ基を
含むある櫨の合成イブチドを、ウイルス−特異的プロテ
アーゼ活性を迅速に測定するのに用いうろことを見出し
た。これらの化合物およびかかる化合物を用いた1断方
法は特異的プロテアーゼをコードするウィルス、例えば
ピコルナウィルスが原因する感染症の診断にM用である
。
発明の概要
本発明はウイルス−特異的ポリペプチド前駆体を開裂し
てウィルスに関連付けられたタンパクを形成するプロテ
アーゼを検出するための特異的ペプチド基質をgJ造す
る方法であって、ここで検出すべきプロテアーゼはピコ
ルナウィルス、トガウィルス、レトロ1ィルス、アデノ
ウィルス、コモウィルスおよびその他のウィルスプロテ
アーゼをコードするウィルスよ)なる群から選択される
ウィルスにより特定され、そして (a) ウィルスタンパク、 RNA 、 DNA、
mRNA1たはウィルスRNAに相補的なDNAを単離
し;(b) そのタン/ぐり、RNA 、 DNA
1mRNAまたはa DNAを分析してウイルス−特異
的タンノ(りのポリペプチド前駆体のアミノ酸配列を決
定し;(c) そのアミノ酸配列内の、ウイルス−特
異的プロテアーゼの開裂認識部位の位置を定め;そして は) ウイルス−特異的プロテアーゼを検出するための
特異的ペプチド基質を製造する(ここで、その基質はポ
リペプチド前駆体の開裂認識部位に直接隣接して、かつ
その部位の上流に位置するアミノ酸配列に実質的に相当
する3〜5個のアミノ酸またはアミノ酸類似体のイプチ
ド配列にエステルまたはアミド結合により連結された〇
−末端インジケータ部分を含む) ことよ)なる前記方法を提供する。
てウィルスに関連付けられたタンパクを形成するプロテ
アーゼを検出するための特異的ペプチド基質をgJ造す
る方法であって、ここで検出すべきプロテアーゼはピコ
ルナウィルス、トガウィルス、レトロ1ィルス、アデノ
ウィルス、コモウィルスおよびその他のウィルスプロテ
アーゼをコードするウィルスよ)なる群から選択される
ウィルスにより特定され、そして (a) ウィルスタンパク、 RNA 、 DNA、
mRNA1たはウィルスRNAに相補的なDNAを単離
し;(b) そのタン/ぐり、RNA 、 DNA
1mRNAまたはa DNAを分析してウイルス−特異
的タンノ(りのポリペプチド前駆体のアミノ酸配列を決
定し;(c) そのアミノ酸配列内の、ウイルス−特
異的プロテアーゼの開裂認識部位の位置を定め;そして は) ウイルス−特異的プロテアーゼを検出するための
特異的ペプチド基質を製造する(ここで、その基質はポ
リペプチド前駆体の開裂認識部位に直接隣接して、かつ
その部位の上流に位置するアミノ酸配列に実質的に相当
する3〜5個のアミノ酸またはアミノ酸類似体のイプチ
ド配列にエステルまたはアミド結合により連結された〇
−末端インジケータ部分を含む) ことよ)なる前記方法を提供する。
本発明はまた前述の方法の生成物をも提供する。生成物
の例は、式 %式%[) 〔式中、 A1はGln 、 GluまたはGluのエステルおよ
びAgnよ多なる群から選択されるアミノ酸残基であ)
; A2はAla % Leu %工1eおよびVanより
なる群から選択されるアミノ酸残基であり; ム3i?よびA4はそれぞれ独立してAha 1Aii
n NArg s Asp % ays 1GIn %
GIn % G17 % Hls 、工1e1Leu
% L7B 、Me t % Phe % pro
、sir % Thr % ’r7r %Mal 、
Trpおよびそれらの類似体よりなる群から選択される
D−またはL−配置のアミノ酸残基であシ: R1は水素またはN−末端保護基であシ;そしR2は−
OHまたは−X(ここでXはアミノ酸残基A1のC−末
端力ルボニルとアミドまたはエステル結合を形成でき、
そして更にそのアミドまたはエステル結合の加水分解的
開裂の後に遊離のXとして砂型して検出されうる部分で
ある)である〕で示される化合物およびその生理学的に
許容しうる塩である。
の例は、式 %式%[) 〔式中、 A1はGln 、 GluまたはGluのエステルおよ
びAgnよ多なる群から選択されるアミノ酸残基であ)
; A2はAla % Leu %工1eおよびVanより
なる群から選択されるアミノ酸残基であり; ム3i?よびA4はそれぞれ独立してAha 1Aii
n NArg s Asp % ays 1GIn %
GIn % G17 % Hls 、工1e1Leu
% L7B 、Me t % Phe % pro
、sir % Thr % ’r7r %Mal 、
Trpおよびそれらの類似体よりなる群から選択される
D−またはL−配置のアミノ酸残基であシ: R1は水素またはN−末端保護基であシ;そしR2は−
OHまたは−X(ここでXはアミノ酸残基A1のC−末
端力ルボニルとアミドまたはエステル結合を形成でき、
そして更にそのアミドまたはエステル結合の加水分解的
開裂の後に遊離のXとして砂型して検出されうる部分で
ある)である〕で示される化合物およびその生理学的に
許容しうる塩である。
本発明はまた、前記式■の範囲内の1種またはそれ以上
の化合物を用いることよりなる試料中のピコルナウイル
ス−特異的プロテアーゼ活性の検出方法をも提供する。
の化合物を用いることよりなる試料中のピコルナウイル
ス−特異的プロテアーゼ活性の検出方法をも提供する。
本発明の方法はC−末端インジケータ部分をMする選択
されたトリー、テトラ−およびはンタペプチド基買を提
供する。ウイルス−特異的プロテアーゼにより開裂され
うるこれらの化合物は試a中のウィルスプロテアーゼ活
性の有無の検出に用いることができる。
されたトリー、テトラ−およびはンタペプチド基買を提
供する。ウイルス−特異的プロテアーゼにより開裂され
うるこれらの化合物は試a中のウィルスプロテアーゼ活
性の有無の検出に用いることができる。
好ましくは、ペプチド基質の配列はポリペプチド前駆体
の開裂認識部位に直接1iiI接しかつその部位の上流
にあるアミノ酸配列に極めて類似したものとする。本明
細書において「上流」とは翻訳方向とは逆の方向の意で
ある。
の開裂認識部位に直接1iiI接しかつその部位の上流
にあるアミノ酸配列に極めて類似したものとする。本明
細書において「上流」とは翻訳方向とは逆の方向の意で
ある。
個々のペプチド配列に関連して本明細書全体にわたって
用いられる「実質的に相当する」という用語は、当該ペ
プチド配列が基準配列と同様の数のアミノ酸残基を包含
し、その同一性および配列が基準配列に関連して極めて
相同しているかまたは保存的に置換されていることを示
す。本明細書に用いられる「保存的に置換される」の用
語は、所定の残基が生物学的に類似した残基により置き
換えられていることを示している。保存的置換の例には
、1個の脂肪族残基を別のもので、例えば工1e X
val、LeuまたはAlaを相互に置き換える例、あ
るいは、1個の極性残基を別のもので、例えばLysと
Arg ; GluとAsp ;またはGlnとAsn
の間で置き換える例が含まれる。上で用いた「残基」は
アミノ酸またはアミノ酸類似体を意味する。
用いられる「実質的に相当する」という用語は、当該ペ
プチド配列が基準配列と同様の数のアミノ酸残基を包含
し、その同一性および配列が基準配列に関連して極めて
相同しているかまたは保存的に置換されていることを示
す。本明細書に用いられる「保存的に置換される」の用
語は、所定の残基が生物学的に類似した残基により置き
換えられていることを示している。保存的置換の例には
、1個の脂肪族残基を別のもので、例えば工1e X
val、LeuまたはAlaを相互に置き換える例、あ
るいは、1個の極性残基を別のもので、例えばLysと
Arg ; GluとAsp ;またはGlnとAsn
の間で置き換える例が含まれる。上で用いた「残基」は
アミノ酸またはアミノ酸類似体を意味する。
前述の如く、本発明方法により製造されるペプチド基質
のアミノ酸配列はウイルス−特異的プロテアーゼによ勺
認識される開裂部位のアミノ酸配列を基準に確豆される
。これらのデータは2つの一般的方法を用いて得ること
ができる。
のアミノ酸配列はウイルス−特異的プロテアーゼによ勺
認識される開裂部位のアミノ酸配列を基準に確豆される
。これらのデータは2つの一般的方法を用いて得ること
ができる。
第1に、ウィルスタンパクを精製ウィルス粒子または感
染細胞から単離しそして成分ポリペプチドに解離し、そ
れらを次にN−およびC−末端の両方から慣用のタン/
Jり配列分析方法〔例えばエドマン(ffidman)
分解〕によ)配列決定する。この方法は既知の開裂部位
に直接隣接した配列データを与える。第2に、ある種の
ウィルスのRNAゲノム(またはそのcDNA転写物)
の配列を決定してヌクレオチドの一次配列を与えること
ができそれよ)翻訳の読取解読枠を用いてウィルスタン
/Jり配列が導かれる。次いでその導かれたアミノ酸配
列を相同のまたは関連のウィルスの既知タンノ々りのも
のと比較することにより開裂部位を決定する。
染細胞から単離しそして成分ポリペプチドに解離し、そ
れらを次にN−およびC−末端の両方から慣用のタン/
Jり配列分析方法〔例えばエドマン(ffidman)
分解〕によ)配列決定する。この方法は既知の開裂部位
に直接隣接した配列データを与える。第2に、ある種の
ウィルスのRNAゲノム(またはそのcDNA転写物)
の配列を決定してヌクレオチドの一次配列を与えること
ができそれよ)翻訳の読取解読枠を用いてウィルスタン
/Jり配列が導かれる。次いでその導かれたアミノ酸配
列を相同のまたは関連のウィルスの既知タンノ々りのも
のと比較することにより開裂部位を決定する。
ウィルスタン/4りまたは核酸を取得および精製し、そ
してウィルス核酸の配列を決定する方法は周知であシ、
ここでは#述しない。次のものは適切な方法に関する有
用な一般文献であシ、参考として本明細書に包含される
。
してウィルス核酸の配列を決定する方法は周知であシ、
ここでは#述しない。次のものは適切な方法に関する有
用な一般文献であシ、参考として本明細書に包含される
。
M!L!am、A、M@ 、およびG11bert、W
、 、Proc、Natl、aAcad、8ci l1
rSム74:560〜564(1977)。
、 、Proc、Natl、aAcad、8ci l1
rSム74:560〜564(1977)。
8anger、?、 、N1ckler 、8. 、お
よびCarison、A、R。
よびCarison、A、R。
Proc、Natl、Acad、8ci、tTSA 7
4:5463〜5467(1977)。
4:5463〜5467(1977)。
Peattie、D、A、、Proc、Natl、Ac
ad、8ci、USA 76二1760〜1764(
j979)。
ad、8ci、USA 76二1760〜1764(
j979)。
Simoncsits、A、、Erownlee、G、
G、、Brown、R,S、。
G、、Brown、R,S、。
Rubin、J、R,、およびGuilly、H,、N
ature 269:833〜836(1977)。
ature 269:833〜836(1977)。
以下に述べる文献は個々のウィルスのゲノムまたはタン
パクの関与する配列決定実験を記載している。
パクの関与する配列決定実験を記載している。
1、 0arroll、A、B、、Rowlands、
D、、T、および0harke。
D、、T、および0harke。
B、E、、Nucleic Ac15 Res、1
2:2461(1984);(***ウィルス)。
2:2461(1984);(***ウィルス)。
2、 Herbart、に、、およびMuhler、
M、、l:!e1m 30:1(1982); (アル
ファウィルス(alphavirus))。
M、、l:!e1m 30:1(1982); (アル
ファウィルス(alphavirus))。
l Klenk、H,D、、Garten、H,D、
、Keil、W、、Niemann。
、Keil、W、、Niemann。
H,、Scwartz、R,T、 #およびRott、
R,、”Procesaingof the工nflu
enza Virus Hemagglutinin、
”G。
R,、”Procesaingof the工nflu
enza Virus Hemagglutinin、
”G。
Koohおよびり、Rlcter il 、Bioay
nthesig。
nthesig。
Modification、and Process
ing of Cs1lularand Vira
l Polyproteins(Academic P
ress。
ing of Cs1lularand Vira
l Polyproteins(Academic P
ress。
New York、1980)。
4、 Korant、B、、Ohow、N、、Liv
e17+M、+およびPowers、J、、Proc、
Natl、Acad、Sci、USA 76:299
2(1979); (ポリオウィルス)。
e17+M、+およびPowers、J、、Proc、
Natl、Acad、Sci、USA 76:299
2(1979); (ポリオウィルス)。
5、 Korant、E、、J、Viro110ニア
51(1972); (ポリオウィルス)。
51(1972); (ポリオウィルス)。
6、 Lee、T、H,、Ooligan、J、に、
、Homma、T、、McLane。
、Homma、T、、McLane。
M、F、 、Tachibana、N、 、およびEs
5ex、M、 、Proc。
5ex、M、 、Proc。
NatlAcad、Sci、USA 8C3856(
1984)、’(ヒ ト T−細胞白血病ウィルス)。
1984)、’(ヒ ト T−細胞白血病ウィルス)。
7.0roszlan、S、、Henderson、L
、に、、0opeland、T。
、に、、0opeland、T。
D、 、8chultz、A、M、 #およびRa b
i n 、 E 、 M、 、”Proceeysi
ngancl 5tructure of Murin
e Leukemia Virusgag and e
nv Gene Encoded Po1yprotj
ins、”G、Kochおよびり、R1chter編、
Biosynthesis 。
i n 、 E 、 M、 、”Proceeysi
ngancl 5tructure of Murin
e Leukemia Virusgag and e
nv Gene Encoded Po1yprotj
ins、”G、Kochおよびり、R1chter編、
Biosynthesis 。
Modification、and Processi
ng of 0sllularand V’1ra
IPolyproteins (Academic
Pres+s。
ng of 0sllularand V’1ra
IPolyproteins (Academic
Pres+s。
工nc、、New York、1980)。
a Palmsnberg慶AmC,、Kirby+
に*M、、、Tanda、M、R,。
に*M、、、Tanda、M、R,。
Darks、N、L、 、Duke、G、M、 、Po
tratz、に、F、 、および0o11ett、M、
S、、Nucleic Aai4s Ree、12:
2969(1984L儂心筋炎ウイルス)。
tratz、に、F、 、および0o11ett、M、
S、、Nucleic Aai4s Ree、12:
2969(1984L儂心筋炎ウイルス)。
9.5eiki+M、、5eiauks、H,、Hlr
ayama、Y、、およびYoshla*M−、Pro
c、Natl、Acad、Sci、USSaO2368
(1983); (ヒト’I’−細胞白血病ウイルス)
。
ayama、Y、、およびYoshla*M−、Pro
c、Natl、Acad、Sci、USSaO2368
(1983); (ヒト’I’−細胞白血病ウイルス)
。
jO,Stanway、G、、at al、、Nucl
eic Ac15 Res。
eic Ac15 Res。
11:3629(1983);(ポリオウィルス)。
11、 5trause、Fi、G、、Rlce、C!
、M、、および5trauss 。
、M、、および5trauss 。
J、H,、Virology 133:92(1984
); Cシンドビスウイルス(Sindbis vir
us))。
); Cシンドビスウイルス(Sindbis vir
us))。
本発明の特定化合物例はC−末端レポータ(rθpor
ter)tたはインジケータ部分を含む、ピコルナウイ
ルスポロテアーゼ開裂部位にみられる配列忙相当する選
択されたテトラペプチドである。このインジケータまた
は標識はペプチド分子の残部から開裂後独立して検出す
ることができる。かかる標識イプテドはピコルナウイル
ス−特異的プロテアーゼによ)認識される開裂部位と相
同となるように設計され、それKよってピ;ルナウィル
スプロテアーゼ比活性を測定するための人工基質を提供
する。かかる活性の有無はピコルナウィルス感染の診断
となる。
ter)tたはインジケータ部分を含む、ピコルナウイ
ルスポロテアーゼ開裂部位にみられる配列忙相当する選
択されたテトラペプチドである。このインジケータまた
は標識はペプチド分子の残部から開裂後独立して検出す
ることができる。かかる標識イプテドはピコルナウイル
ス−特異的プロテアーゼによ)認識される開裂部位と相
同となるように設計され、それKよってピ;ルナウィル
スプロテアーゼ比活性を測定するための人工基質を提供
する。かかる活性の有無はピコルナウィルス感染の診断
となる。
本FiA細書全体にわたって、アミノ酸残基またはアミ
ノ酸に対し次の省略形が用いられる。
ノ酸に対し次の省略形が用いられる。
アミノ酸 −文字省略形 三文字省略形し
−アラニン A AlaL−アルギ
ニン RArg L−アスパラギン N AsnL−アス
パラギン酸 D AspL−システィン
OCys L−グルタミン Q GinL−グル
タミン酸 K Gluグリシン
G G17L−ヒスチジン HH
ls L−インロイシン エ エ1eL−ロイシ
ン L LeuL−リジン
K LyeL−メチオニン M
MetL−フェニルアラニン F P
heL−プロリン P Pr。
−アラニン A AlaL−アルギ
ニン RArg L−アスパラギン N AsnL−アス
パラギン酸 D AspL−システィン
OCys L−グルタミン Q GinL−グル
タミン酸 K Gluグリシン
G G17L−ヒスチジン HH
ls L−インロイシン エ エ1eL−ロイシ
ン L LeuL−リジン
K LyeL−メチオニン M
MetL−フェニルアラニン F P
heL−プロリン P Pr。
L−セリン B 58rL−)レオエ
ン T ThrL−)リプトファン
W TrpL−チロシン Y
TyrLo−バリン V V
al”D−”が前に付しである前述の省略形はD−配置
のアミノ酸を示す。
ン T ThrL−)リプトファン
W TrpL−チロシン Y
TyrLo−バリン V V
al”D−”が前に付しである前述の省略形はD−配置
のアミノ酸を示す。
本明細書全体にわたシ用いられる″N−末端保護基”と
はアリールカルボニル、アルキルカルボニル、アルコキ
シカルボニル、アリールオキシカルボニル、アルアルコ
キシカルボニル、アリールスルホニル、アルキルスルホ
ニル、マタハアリールスルホニルペプチド保護基、また
はその他のペプチド合成技術分野における当業者に知ら
れた等個物を意味する。GrosθおよびMeianh
ofer iJ!I、The Peptidee、VO
l 3(AcademicPress、New Yor
k、1981) pp 3−81(その開示を引用によ
)本明細書の記載の一部とする)は多くの適当なアミン
保護基を記載している。本明細書において、個別的に、
あるいはよシ大きな基の一部として用いられる”アルキ
ル”は、1〜10個の炭素原子を有する直線状、環状ま
たは分枝鎖状脂肪族部分を意味し;″置換アルキIはN
、OまたはSなどのへテロ原子(1個または複数個)を
含む置換分を有するアルキル基を意味し;”アリール”
は未置換のまたは1個またはそれ以上のアルキル置換ア
ルキル、ニトロ、アルコキシ、またはハロ基で置換され
た、6〜18個の炭素原子を有する芳香族部分、例えば
フェニルを意味し:そして1アルカリール”は脂肪族置
換分、そして所望により他の置換分例えば1個またはそ
れ以上のアルキル、置換アルキル、アルコキシまたはア
ミノ基などを有する7〜19個の炭素原子をMするアリ
ール部分を意味する。”アラルキル″はアリール基(1
個または複数個)を含む6〜18個の炭素原子を有する
直線状または分枝鎖状脂肪族部分を意味する。
はアリールカルボニル、アルキルカルボニル、アルコキ
シカルボニル、アリールオキシカルボニル、アルアルコ
キシカルボニル、アリールスルホニル、アルキルスルホ
ニル、マタハアリールスルホニルペプチド保護基、また
はその他のペプチド合成技術分野における当業者に知ら
れた等個物を意味する。GrosθおよびMeianh
ofer iJ!I、The Peptidee、VO
l 3(AcademicPress、New Yor
k、1981) pp 3−81(その開示を引用によ
)本明細書の記載の一部とする)は多くの適当なアミン
保護基を記載している。本明細書において、個別的に、
あるいはよシ大きな基の一部として用いられる”アルキ
ル”は、1〜10個の炭素原子を有する直線状、環状ま
たは分枝鎖状脂肪族部分を意味し;″置換アルキIはN
、OまたはSなどのへテロ原子(1個または複数個)を
含む置換分を有するアルキル基を意味し;”アリール”
は未置換のまたは1個またはそれ以上のアルキル置換ア
ルキル、ニトロ、アルコキシ、またはハロ基で置換され
た、6〜18個の炭素原子を有する芳香族部分、例えば
フェニルを意味し:そして1アルカリール”は脂肪族置
換分、そして所望により他の置換分例えば1個またはそ
れ以上のアルキル、置換アルキル、アルコキシまたはア
ミノ基などを有する7〜19個の炭素原子をMするアリ
ール部分を意味する。”アラルキル″はアリール基(1
個または複数個)を含む6〜18個の炭素原子を有する
直線状または分枝鎖状脂肪族部分を意味する。
N−末端保護基R1の適例には、ホルミル、アセチル、
トリフルオロアセチル、ベンジルオキシカルボニル(カ
ルボベンゾキシ)、置換ベンジルオキシカルボニル、t
art−ブチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシ
カルボニル、アリルオキシカルボニル、フタロイル、ベ
ンゾイル、アセトアセチル、クロロアセチル、フェノキ
シカルボニル、メトキシスクシニル、スクシニル、2,
4−ジニトロフェニル、タンシル、p−メトキシベンゼ
ンスルホニル、p−トルエンスルホニル、メタンスルホ
ニルおよびフェニルチオが含まれる。
トリフルオロアセチル、ベンジルオキシカルボニル(カ
ルボベンゾキシ)、置換ベンジルオキシカルボニル、t
art−ブチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシ
カルボニル、アリルオキシカルボニル、フタロイル、ベ
ンゾイル、アセトアセチル、クロロアセチル、フェノキ
シカルボニル、メトキシスクシニル、スクシニル、2,
4−ジニトロフェニル、タンシル、p−メトキシベンゼ
ンスルホニル、p−トルエンスルホニル、メタンスルホ
ニルおよびフェニルチオが含まれる。
N−末端保護基R1のあるものは本明細書全体忙わた)
次のよ5に省略される。
次のよ5に省略される。
2 :カルボベンゾキシ
Boa :t −7’チルオキシカルポニルムCニア
セチル Bt:エチル Suc ニスクシニル MeO8uc:メトキシスクシニル DNS :ダンシル DNP : 2,4−ジニトロフェニル側鎖アミノ基
を有する、例えばA3およびA4がLys またはAr
gである本発明化合物は、所望によりその側鎖に結合し
た適当なN−末端保護基を含んでいてもよい。同様に、
酸またはヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸残基、例えば
A1、A5またはA4はメチル、ベンジルまたはその他
の適当なエステルまたはエーテルの形で保護することが
できる。
セチル Bt:エチル Suc ニスクシニル MeO8uc:メトキシスクシニル DNS :ダンシル DNP : 2,4−ジニトロフェニル側鎖アミノ基
を有する、例えばA3およびA4がLys またはAr
gである本発明化合物は、所望によりその側鎖に結合し
た適当なN−末端保護基を含んでいてもよい。同様に、
酸またはヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸残基、例えば
A1、A5またはA4はメチル、ベンジルまたはその他
の適当なエステルまたはエーテルの形で保護することが
できる。
前述のとおシ、A5およびA4はD−配置のアミノ酸ま
たはアミノ酸の類似体であってもよい。
たはアミノ酸の類似体であってもよい。
本明細書全体にわたって用いられる「類似体」で示され
る天然アミノ酸ではない残基を意味する。前記式■のR
3はアルキル、置換アルキル、アリール、アラルキルま
たはアルカリール基であってもよく、そしてそれらは場
合により末端がヒドロキシ、アミン、ホスフェートまた
はチオ基となっていてもよい。かかる類似体の例にはヒ
ドロキシプロリン、を−カルボキシグルタメート、0−
ホスホセリン、カルニチン、シスfイアrR、フェニル
グリシン、α−アミノイソ酪酸およびα−アミノカプロ
ン酸などが含まれる。
る天然アミノ酸ではない残基を意味する。前記式■のR
3はアルキル、置換アルキル、アリール、アラルキルま
たはアルカリール基であってもよく、そしてそれらは場
合により末端がヒドロキシ、アミン、ホスフェートまた
はチオ基となっていてもよい。かかる類似体の例にはヒ
ドロキシプロリン、を−カルボキシグルタメート、0−
ホスホセリン、カルニチン、シスfイアrR、フェニル
グリシン、α−アミノイソ酪酸およびα−アミノカプロ
ン酸などが含まれる。
式Iの化合物の許容しうる塩には、遊離塩基が存在する
場合にはその酸付加塩が含lれ、その場合その酸は有機
または無機であってもよく、例えば塩酸、燐酸、マレイ
ン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸などであってもよい。
場合にはその酸付加塩が含lれ、その場合その酸は有機
または無機であってもよく、例えば塩酸、燐酸、マレイ
ン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸などであってもよい。
あるいはまた、ナトリウム、カリウム、およびアンモニ
ウム塩を含む遊HOプチド酸(peptidic ac
id)の塩も本発明の範囲に包含される。
ウム塩を含む遊HOプチド酸(peptidic ac
id)の塩も本発明の範囲に包含される。
前記式■の置換分R2は前述のとお、り、−OHまたは
XであってもよくここでXはアミノ酸残基A1のC−末
端カルボニルと共にアミドまたはエステル結合を形成し
てXとペプチドとの接合体を与えることのできる部分で
ある。部分Xはまた、ウイルス−特異的プロテアーゼに
よるアミドまたはエステル結合の開裂の後、遊離の、ま
たは接合していないXとして独立して検出されうる。す
なわち、例えば部分Xは、次式■R1−A4A3A2−
NHOHO−−−NH(X) (ill)によって
示されるように、アミノ酸残基A11C対するペプチド
結合を形成するのに都合のよい位置にアミノ基またはヒ
ドロキシル基を包含する。
XであってもよくここでXはアミノ酸残基A1のC−末
端カルボニルと共にアミドまたはエステル結合を形成し
てXとペプチドとの接合体を与えることのできる部分で
ある。部分Xはまた、ウイルス−特異的プロテアーゼに
よるアミドまたはエステル結合の開裂の後、遊離の、ま
たは接合していないXとして独立して検出されうる。す
なわち、例えば部分Xは、次式■R1−A4A3A2−
NHOHO−−−NH(X) (ill)によって
示されるように、アミノ酸残基A11C対するペプチド
結合を形成するのに都合のよい位置にアミノ基またはヒ
ドロキシル基を包含する。
ピコルナウィルスプロテアーゼ活性を検出するだめのテ
トラペプチド基質の場合には、残基A1はGln %
Glu %またはGluのエステルおよびAsnよりな
る群から選択される。それ故に前記式中om換分R4バ
ーCH2(H2000H、−0H2CONH2オヨび−
oa2cH2ooNa2 、および前述の如き適当な保
護基を富む前述の基の変形よりなる群から選択される。
トラペプチド基質の場合には、残基A1はGln %
Glu %またはGluのエステルおよびAsnよりな
る群から選択される。それ故に前記式中om換分R4バ
ーCH2(H2000H、−0H2CONH2オヨび−
oa2cH2ooNa2 、および前述の如き適当な保
護基を富む前述の基の変形よりなる群から選択される。
前述の条件が満たされる限夛、インジケータ部分Xの正
確な本体および性質は本発明にとって臨界的ではない。
確な本体および性質は本発明にとって臨界的ではない。
Xは溶液千の特定の被分析@ (analyte)また
はりガントな検出する技術分野において知られる数多く
の方法の一つにより検出しうる色原、螢光系、化学光、
放射性、抗原またはハプテン基であってもよいと現在で
は考えられる。適切なXについての更なる井細は以下に
記載する。
はりガントな検出する技術分野において知られる数多く
の方法の一つにより検出しうる色原、螢光系、化学光、
放射性、抗原またはハプテン基であってもよいと現在で
は考えられる。適切なXについての更なる井細は以下に
記載する。
Xが色原基である場合、浴液中の遊離Xは、そのペプチ
ドの残部から開裂後に分光光度測定により検出可能であ
る。適当な色原基例には、ニトロアニリノ、ニトロフェ
ニルオキシ、2.4−ジニトロフェニルオキシ、ニトロ
フェニルアミノ、ナフチルアミノ、ニトロナフチルアミ
ノ、メトキシナフチルアミノ、キノリルアミノ、ニトロ
キノリルアミノおよび4−トリフルオロメチルクマリル
−7−アばノが含まれる。好ましい色素原基はナフチル
アミノ、特にβ−ナフチルアミノ(以下″’NA”と略
す)である。
ドの残部から開裂後に分光光度測定により検出可能であ
る。適当な色原基例には、ニトロアニリノ、ニトロフェ
ニルオキシ、2.4−ジニトロフェニルオキシ、ニトロ
フェニルアミノ、ナフチルアミノ、ニトロナフチルアミ
ノ、メトキシナフチルアミノ、キノリルアミノ、ニトロ
キノリルアミノおよび4−トリフルオロメチルクマリル
−7−アばノが含まれる。好ましい色素原基はナフチル
アミノ、特にβ−ナフチルアミノ(以下″’NA”と略
す)である。
Xが螢光原基である場曾、遊−Xはそのペプチドの残部
からインジケータ基を開裂後、ある波長で励起しそして
別の波長で検出することによ)溶液中で検出できる。適
当な螢光原基には4−メチルクマリル−7−7ミノ(以
下′″AMO”と略す)、4−トリフルオロメチルクマ
リル−7−アばノ、ナフチルアミノ、7−オキシ−クマ
リル、4−メチルウンベリフェロンおよび5−アミノー
イソフタール酸ジエチルエステルが含まれる。前述の中
でもムMeが好ましい。
からインジケータ基を開裂後、ある波長で励起しそして
別の波長で検出することによ)溶液中で検出できる。適
当な螢光原基には4−メチルクマリル−7−7ミノ(以
下′″AMO”と略す)、4−トリフルオロメチルクマ
リル−7−アばノ、ナフチルアミノ、7−オキシ−クマ
リル、4−メチルウンベリフェロンおよび5−アミノー
イソフタール酸ジエチルエステルが含まれる。前述の中
でもムMeが好ましい。
Xは化学光インジケータ基、例えばアミノイソルミノー
ルなどであってもよい。
ルなどであってもよい。
Xが放射性原子(1個またはり数)、例えば〔14の、
C55B)または〔3H〕などを含む基である場合には
、遊離のXを接合された(conjugated)Xか
ら分割するための系または手順が提供される。
C55B)または〔3H〕などを含む基である場合には
、遊離のXを接合された(conjugated)Xか
ら分割するための系または手順が提供される。
例えば、このような分割は有機溶液と水性溶液の分離の
M来として行うことができる。有機相中に分配されうる
インジケータ基の例には、1個またはそれ以上の(14
0)または〔5H〕基を含有するアニリノ、ベンジルア
ミノまたは低級アルコキシ基が含まれる。放射性標識基
質を特異的プロテアーゼ活性を含有していると思われる
試料とインキュベーションした後、有機溶媒例えばトル
エンを検定混合物に添加することができる。有機溶媒へ
の遊離のXの溶解度が比較的高いことから比較的高割合
の遊離のXがその有機溶媒中に抽出されることになシ、
それを取り出して液体シンチレーションカクテルを含む
シンチレーションバイアルに添加しそして既知方法によ
り計数することができる。
M来として行うことができる。有機相中に分配されうる
インジケータ基の例には、1個またはそれ以上の(14
0)または〔5H〕基を含有するアニリノ、ベンジルア
ミノまたは低級アルコキシ基が含まれる。放射性標識基
質を特異的プロテアーゼ活性を含有していると思われる
試料とインキュベーションした後、有機溶媒例えばトル
エンを検定混合物に添加することができる。有機溶媒へ
の遊離のXの溶解度が比較的高いことから比較的高割合
の遊離のXがその有機溶媒中に抽出されることになシ、
それを取り出して液体シンチレーションカクテルを含む
シンチレーションバイアルに添加しそして既知方法によ
り計数することができる。
あるいはまた、遊離の放射性インジケータ基は固体基質
上の遊離放射性インジケータ基を固定するリガンド結合
系により接合した基から分割することができ、あるいは
固定された基質を用いそして41mされたインジケータ
をモニターすることができる。
上の遊離放射性インジケータ基を固定するリガンド結合
系により接合した基から分割することができ、あるいは
固定された基質を用いそして41mされたインジケータ
をモニターすることができる。
Xが特異抗体により独立して検出しうる抗原またはハプ
テン基である場合には、遊離のXは認識するが、gj会
されたXは認識しないかまたは接合されたXに対する結
合親和性の低下した抗体試薬、特にモノクローナル抗体
が必要である。適当なハプテンインジケータ基の例は0
−二トロフェノールである。その場合、いくつか知られ
ている免疫学的方法の任意のものを用いてプロテアーゼ
活性を検出することができる。
テン基である場合には、遊離のXは認識するが、gj会
されたXは認識しないかまたは接合されたXに対する結
合親和性の低下した抗体試薬、特にモノクローナル抗体
が必要である。適当なハプテンインジケータ基の例は0
−二トロフェノールである。その場合、いくつか知られ
ている免疫学的方法の任意のものを用いてプロテアーゼ
活性を検出することができる。
かかる方法として鉱例えば放射免疫検定またはW#素免
疫検定、粒子増感濁度測定免疫検定およびアフイニテイ
力ラム介在免疫検定などが挙げられる。
疫検定、粒子増感濁度測定免疫検定およびアフイニテイ
力ラム介在免疫検定などが挙げられる。
慣用の放射免疫検定または酵素免疫検定においては、標
識基質のプロテアーゼ触媒加水分解によ)生成したハプ
テン(遊離x)のほかに、添加された酵素−またはラジ
オアイソトープ−標識ハプテンがハプテン特異抗体上の
限られた数の結合部位を求めて拮抗する。既知の方法に
より定を化しうる抗体により結合された活性の量は特異
的プロテアーゼ活性により生じたハプテンまたは遊離の
Xの量に反比例する。
識基質のプロテアーゼ触媒加水分解によ)生成したハプ
テン(遊離x)のほかに、添加された酵素−またはラジ
オアイソトープ−標識ハプテンがハプテン特異抗体上の
限られた数の結合部位を求めて拮抗する。既知の方法に
より定を化しうる抗体により結合された活性の量は特異
的プロテアーゼ活性により生じたハプテンまたは遊離の
Xの量に反比例する。
粒子増感濁度測定免疫検定においては、粒子lこ、イン
ジケータ基Xとして基質にも結合されるハプテンまたは
その他の分子種でコーティングする。得られたX−被覆
粒子は次に、X−標識ヘプチド基質と予めインキュベー
トしである試料のほか、xK対し特異的な抗体とインキ
ュベートする。特異的プロテアーゼ活性により遊離する
遊離のXの存在により、ほかに被覆粒子に対するX−特
異的抗体の作用から生じるであろう濁夛形成を阻害する
。
ジケータ基Xとして基質にも結合されるハプテンまたは
その他の分子種でコーティングする。得られたX−被覆
粒子は次に、X−標識ヘプチド基質と予めインキュベー
トしである試料のほか、xK対し特異的な抗体とインキ
ュベートする。特異的プロテアーゼ活性により遊離する
遊離のXの存在により、ほかに被覆粒子に対するX−特
異的抗体の作用から生じるであろう濁夛形成を阻害する
。
アフイニテイ力ラム介在免疫検定においては、インジケ
ータ基Xに対し特異的な酵素標識抗体を、特異的プロテ
アーゼ活性を含有する、または含有すると思われる試料
、そしてX−標識ペプチド基質とインキュベートする。
ータ基Xに対し特異的な酵素標識抗体を、特異的プロテ
アーゼ活性を含有する、または含有すると思われる試料
、そしてX−標識ペプチド基質とインキュベートする。
インキュベーションの後、得られた混合物を、ハプテン
または抗原基XKも結合した固体基質を含むカラムKか
ける。試料とのインキュベーション中にXを結合した酵
素−標識抗体はカラムを通過しそしてカラム流出液中に
果められることになる。
または抗原基XKも結合した固体基質を含むカラムKか
ける。試料とのインキュベーション中にXを結合した酵
素−標識抗体はカラムを通過しそしてカラム流出液中に
果められることになる。
遊離抗体はカラムに結合されることになる。次いで、カ
ラム流出液中の酵素活性tを測定することができる。得
られた量は試料とのインキュベーション中に遊離した遊
離のXの量に関係する。
ラム流出液中の酵素活性tを測定することができる。得
られた量は試料とのインキュベーション中に遊離した遊
離のXの量に関係する。
本発明の範囲の化合物例を同定する特徴的ペプチド配列
は、ウイルス−特異的プロテアーゼにより認識される開
裂部位の既知アミノ酸配列を基準に確立された。このデ
ータは2つの一般的方法を用いて導かれた。第1K1ウ
イルスタンパクを精製ウィルス粒子または感染細胞から
単威し、そして成分ポリペプチドに解離した後、慣用の
タンパク配列分析法(例えばエドマン分解)によj5N
−末端およびC−末端の両方から配列決定した。この方
法により既知の開裂部位に直接Iil接した配列データ
が得られた。次に、ある種のウィルスのRNAゲノム(
tたは−tのaDNA転写物)の配列を決定して得られ
るヌクレオチドの一次配列から翻訳の転写解読枠を用い
てウィルスタンパク配列を導いた。次いでその導かれた
アミノ酸配列を、相似または関連のウィルスの既知タン
パクのものと比較することにより開裂部位を決定した。
は、ウイルス−特異的プロテアーゼにより認識される開
裂部位の既知アミノ酸配列を基準に確立された。このデ
ータは2つの一般的方法を用いて導かれた。第1K1ウ
イルスタンパクを精製ウィルス粒子または感染細胞から
単威し、そして成分ポリペプチドに解離した後、慣用の
タンパク配列分析法(例えばエドマン分解)によj5N
−末端およびC−末端の両方から配列決定した。この方
法により既知の開裂部位に直接Iil接した配列データ
が得られた。次に、ある種のウィルスのRNAゲノム(
tたは−tのaDNA転写物)の配列を決定して得られ
るヌクレオチドの一次配列から翻訳の転写解読枠を用い
てウィルスタンパク配列を導いた。次いでその導かれた
アミノ酸配列を、相似または関連のウィルスの既知タン
パクのものと比較することにより開裂部位を決定した。
ある復のウィルスタンパクの開裂部位間の相同性を第2
図に示す。第2図にはポリオウィルス・タイプ1、口蹄
疫ウィルス、セムリキ森林熱ウィルス(semliki
forest virus)およびシンドビスウイル
スのタンパクについての配列情報のほかに22個の開裂
部位が列挙されている。ウイルス−特異的プロテアーゼ
により認識される開裂部位は斜線により示され、また完
全な相同性は黒丸で示されている。第2図に記載の情報
に示唆されるように、ピコルナウィルスについての開裂
部位の場合にはしばしば、グルタミン−グリシンまたは
グルタミン酸−グリシン配列(しばしば疎水性残基例え
ばアラニン、バリン、インロイシンまたはロイシンなど
Kよシ囲まれている)が目立つ。これまでVC!徴付け
られているその他の開裂部位はアス、2ラギン残基を含
んでいる。残基A2よ)も開裂部位から遠位にある残基
、すなわちA3およびA4は現在のところ、生成する合
成基質の特異性に著しく影響するとは考えられていない
。
図に示す。第2図にはポリオウィルス・タイプ1、口蹄
疫ウィルス、セムリキ森林熱ウィルス(semliki
forest virus)およびシンドビスウイル
スのタンパクについての配列情報のほかに22個の開裂
部位が列挙されている。ウイルス−特異的プロテアーゼ
により認識される開裂部位は斜線により示され、また完
全な相同性は黒丸で示されている。第2図に記載の情報
に示唆されるように、ピコルナウィルスについての開裂
部位の場合にはしばしば、グルタミン−グリシンまたは
グルタミン酸−グリシン配列(しばしば疎水性残基例え
ばアラニン、バリン、インロイシンまたはロイシンなど
Kよシ囲まれている)が目立つ。これまでVC!徴付け
られているその他の開裂部位はアス、2ラギン残基を含
んでいる。残基A2よ)も開裂部位から遠位にある残基
、すなわちA3およびA4は現在のところ、生成する合
成基質の特異性に著しく影響するとは考えられていない
。
トガウィルス構造タンノぞりの開裂部位における多様性
は更に大きい。アルファウィルス(トガウィルス科の部
分集合)の場合には、アラニン残基が存在する傾向にあ
る。セムリキ森林熱ウィルスとシンドウイルスを比較す
ると中等度ないし高度の個別部位の保存がみられるが、
異なる部位は実質的な化学的相異を示し、いくつかのプ
ロテアーゼが参画していることを示唆している。エンベ
ロープタンパク2と6の間で開裂する二塩基性arg−
arg/serまたはlys −arg /ser部位
を除いて、すべての開裂はキモトリプシン様であると考
えられる。
は更に大きい。アルファウィルス(トガウィルス科の部
分集合)の場合には、アラニン残基が存在する傾向にあ
る。セムリキ森林熱ウィルスとシンドウイルスを比較す
ると中等度ないし高度の個別部位の保存がみられるが、
異なる部位は実質的な化学的相異を示し、いくつかのプ
ロテアーゼが参画していることを示唆している。エンベ
ロープタンパク2と6の間で開裂する二塩基性arg−
arg/serまたはlys −arg /ser部位
を除いて、すべての開裂はキモトリプシン様であると考
えられる。
本発明の範囲内の化合物として意図されるジーナx (
genus)は、前記式I(式中R1はBoc、Z %
sue 、またはMeO8ucであ〕:R2は一〇H
または色原性、螢光原注、化学光性、放射性、抗原性ま
たはハプテン性のインジケータ基であシ;そしてA1、
A2、A3およびA4は前記定義のとおシである)の化
合物を包含する。前述の定義に係るジーナスに含まれる
ものとして意図される化合物のクラスは第1クラス(A
IがGinであるもの):第2クラス(AIがGluあ
るいはGluのエステルであるもの);および第3クラ
ス(AIがAsnであるもの)が含まれる。前述の3つ
のクラスの各々の範囲内で、サブクラス(そのクラスの
限定の各々が適用され、またA3およびA4はAla
s Ar8% Asn 1Asp X Oys 1Gl
n 5Glu 、 Gay 5H18s工1s 、Le
u 1Lye % Met % Phe s Pro
N Ser 、 ThrlTrp、TyrおよびVan
よプなる群から選択される)が意図される。更に1サブ
クラス(A3およびA4は更に、Aha s 017
%工1e 5Leu 1Ph13 N Ser s ’
ryrおよびValから選択される)が意図される。
genus)は、前記式I(式中R1はBoc、Z %
sue 、またはMeO8ucであ〕:R2は一〇H
または色原性、螢光原注、化学光性、放射性、抗原性ま
たはハプテン性のインジケータ基であシ;そしてA1、
A2、A3およびA4は前記定義のとおシである)の化
合物を包含する。前述の定義に係るジーナスに含まれる
ものとして意図される化合物のクラスは第1クラス(A
IがGinであるもの):第2クラス(AIがGluあ
るいはGluのエステルであるもの);および第3クラ
ス(AIがAsnであるもの)が含まれる。前述の3つ
のクラスの各々の範囲内で、サブクラス(そのクラスの
限定の各々が適用され、またA3およびA4はAla
s Ar8% Asn 1Asp X Oys 1Gl
n 5Glu 、 Gay 5H18s工1s 、Le
u 1Lye % Met % Phe s Pro
N Ser 、 ThrlTrp、TyrおよびVan
よプなる群から選択される)が意図される。更に1サブ
クラス(A3およびA4は更に、Aha s 017
%工1e 5Leu 1Ph13 N Ser s ’
ryrおよびValから選択される)が意図される。
本発明の範囲内の化合物例は次のもの(以下の式の各々
におけるR1はBoa 、Z 5Suc 、またはMs
08u(!であり;そして以下の式の各々におけるR2
は色原性、螢光原性、化学光性、放射性、抗原性または
ハプテン性のインジケータ基である)を包含する。
におけるR1はBoa 、Z 5Suc 、またはMs
08u(!であり;そして以下の式の各々におけるR2
は色原性、螢光原性、化学光性、放射性、抗原性または
ハプテン性のインジケータ基である)を包含する。
rl’−FGLQ−R2R’−PMLQ、−R2R’−
AKVQ−R2R1−FALQ−R2R1−PTI4−
R2R14VLQ、−R2R1−FLLQ−R2R1−
PRI4−R2R1−VVVQ−R2R1−F’工LQ
−R2R1−AKLQ−R2R1−LD工Q−R2R1
−FVLQ、−R2R1−A工AQ−R2R1−TQL
Q、−R2R1−FGAQ、−R2R1−AMLQ−R
2R1−TDVQ−R2fl”F’G工Q−R2R1−
ABLQ−R2R1−RHLN−R2Rj−FGVQ−
R2R4−v工LQ−R2R1−REiLN−R2R1
−GGLQ−R2R4−ALLQ−R2R1−ALLE
−R2R1−AALQ−R2Rj−AIIQ−R2R1
−工HLK−R2R1−LALQ−R2R1−AGLQ
−R2R1−FGIJ−R2R1−■ALQ、−R2R
1−AQ、IIQ−R2R”0TIJ−R2R1−VA
LQ−R2R1−KQLQ、−R2R1−GGIIIC
−R2本発明により特定される化合物は一般的に次のよ
うにしてd造される。
AKVQ−R2R1−FALQ−R2R1−PTI4−
R2R14VLQ、−R2R1−FLLQ−R2R1−
PRI4−R2R1−VVVQ−R2R1−F’工LQ
−R2R1−AKLQ−R2R1−LD工Q−R2R1
−FVLQ、−R2R1−A工AQ−R2R1−TQL
Q、−R2R1−FGAQ、−R2R1−AMLQ−R
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ABLQ−R2R1−RHLN−R2Rj−FGVQ−
R2R4−v工LQ−R2R1−REiLN−R2R1
−GGLQ−R2R4−ALLQ−R2R1−ALLE
−R2R1−AALQ−R2Rj−AIIQ−R2R1
−工HLK−R2R1−LALQ−R2R1−AGLQ
−R2R1−FGIJ−R2R1−■ALQ、−R2R
1−AQ、IIQ−R2R”0TIJ−R2R1−VA
LQ−R2R1−KQLQ、−R2R1−GGIIIC
−R2本発明により特定される化合物は一般的に次のよ
うにしてd造される。
まず、N−保護ペプチド箇たはアミノ酸を約1当麓のN
−メチルモルホリンおよび1当賃のインブチルクロロホ
ルメートと約−20℃で反応させてペプチド−イン酪酸
混合無水グな生成させる。この標準的な方法はAnde
rsonら1J−―・Cham、Soc、89:501
2(1967)に記載されている。次に、生成混合無水
物を、N、N−ジメチルホルムアミド(DMIP)また
は他の適当な不活性非プロトン溶媒中で約1当童のアミ
ノ基言有標識化合物で処理して標識N−保鏝ベプチドま
たはアミノ酸を生成させる。
−メチルモルホリンおよび1当賃のインブチルクロロホ
ルメートと約−20℃で反応させてペプチド−イン酪酸
混合無水グな生成させる。この標準的な方法はAnde
rsonら1J−―・Cham、Soc、89:501
2(1967)に記載されている。次に、生成混合無水
物を、N、N−ジメチルホルムアミド(DMIP)また
は他の適当な不活性非プロトン溶媒中で約1当童のアミ
ノ基言有標識化合物で処理して標識N−保鏝ベプチドま
たはアミノ酸を生成させる。
保1基のはずされた標識ペプチドを、前述の手順により
生成された他のN−保護ペプチドまたはアミノ酸の混合
無水物に繰返し結合することにより、よ〕大きなペプチ
ドを構築することができる。N−末端アミノ基の保護基
の除去はトリフルオロ酢酸、無水IP 、無水Hotで
処理するか、または当業者に知られた方法により行うこ
とができる。
生成された他のN−保護ペプチドまたはアミノ酸の混合
無水物に繰返し結合することにより、よ〕大きなペプチ
ドを構築することができる。N−末端アミノ基の保護基
の除去はトリフルオロ酢酸、無水IP 、無水Hotで
処理するか、または当業者に知られた方法により行うこ
とができる。
便用に一際しては、本発明のペプチド基質をピコルナウ
ィルスプロテアーゼ活性を苫有すると思われる試料とイ
ンキュベートする。そのインキュベーションは基質のプ
ロテアーゼ触媒加水分解を行わせるのに十分な時間進行
させる。インキュベーションの後、開裂したインジケー
タ基の臂漂をび用したインジケータに適した方法により
検出する。その他の場合には、インジケータ基の遊離は
連続的にモニターすることができる。試料は人間または
動物から採取した生理学的液体、例えば血清、血漿、リ
ンフ5液、腹腔敵、胸膜辰、唾液、背gl液、鼻分泌物
または膣または頚部分泌切などであってよい。あるいは
筐た、暦法性のピコルナウィルス感染の疑いのある人間
または動物に由来する増殖細胞から試料を調製すること
ができる。これらの細胞は組織培誉として増殖させるこ
とができ、また培養#fl記の培養上清lたは溶解液の
プロテアーゼ活性を本発明の基質を用いて測定すること
ができる。
ィルスプロテアーゼ活性を苫有すると思われる試料とイ
ンキュベートする。そのインキュベーションは基質のプ
ロテアーゼ触媒加水分解を行わせるのに十分な時間進行
させる。インキュベーションの後、開裂したインジケー
タ基の臂漂をび用したインジケータに適した方法により
検出する。その他の場合には、インジケータ基の遊離は
連続的にモニターすることができる。試料は人間または
動物から採取した生理学的液体、例えば血清、血漿、リ
ンフ5液、腹腔敵、胸膜辰、唾液、背gl液、鼻分泌物
または膣または頚部分泌切などであってよい。あるいは
筐た、暦法性のピコルナウィルス感染の疑いのある人間
または動物に由来する増殖細胞から試料を調製すること
ができる。これらの細胞は組織培誉として増殖させるこ
とができ、また培養#fl記の培養上清lたは溶解液の
プロテアーゼ活性を本発明の基質を用いて測定すること
ができる。
本発明の範囲の化合物の製造に適した一般的に適用可能
な手順を下記実施例の前のパラグラフIC記載する。
な手順を下記実施例の前のパラグラフIC記載する。
それら合成の手順および実施例において、特記しない限
り、部および%はすべて重量に基づき、温度はすべて摂
氏温度である。
り、部および%はすべて重量に基づき、温度はすべて摂
氏温度である。
1、 混合無水物結合方法(MA)
約1〜2tのN−保睡アミノ酸またはイプチドを20−
のテトラヒドロフラン(THF)に溶解させ、そして得
られた浴液を一20°に冷却する。
のテトラヒドロフラン(THF)に溶解させ、そして得
られた浴液を一20°に冷却する。
N−メチルモルホリン(1当t)およびイソブチルクロ
ロホルメート(1当りを添加しそして5分後に、更に1
0−の冷THFおよび1当量のトリエチルアミンを添加
する。得られた混合物を5−のDMFに溶解させた1当
量のアミン塩酸塩またはトリフルオロアセテートに直ち
に添加する。得られる反応系を一20°で1時間、次に
約23°で2時間攪拌する。得られる混合物をf過し、
そしてそれによって得られるf液を次に蒸発により約5
t11tまで濃縮する。得られる濃縮液または残留物を
酢酸エチルに溶解させ、次いで0.2N塩酸、5係重炭
酸ナトリウム溶液、および飽和水性塩化す) IJウム
で順次洗浄する。
ロホルメート(1当りを添加しそして5分後に、更に1
0−の冷THFおよび1当量のトリエチルアミンを添加
する。得られた混合物を5−のDMFに溶解させた1当
量のアミン塩酸塩またはトリフルオロアセテートに直ち
に添加する。得られる反応系を一20°で1時間、次に
約23°で2時間攪拌する。得られる混合物をf過し、
そしてそれによって得られるf液を次に蒸発により約5
t11tまで濃縮する。得られる濃縮液または残留物を
酢酸エチルに溶解させ、次いで0.2N塩酸、5係重炭
酸ナトリウム溶液、および飽和水性塩化す) IJウム
で順次洗浄する。
次に、得られた有機浴液を硫酸ナトリウムで短時間乾燥
させ、C過し、そして最後に蒸発させると粗製にプチド
生成物が残る。
させ、C過し、そして最後に蒸発させると粗製にプチド
生成物が残る。
2、 N−ヒドロキシスクシンイミド(O8u)結合
方法 N−保護アミノ酸およびイプチドのN−ヒドロキシスク
シンイミドエステルは、Andersonら、J、Am
、Ohsm、13oc、86: 1839(1964)
に記載のものと実質的に同様の手順により製造すること
ができる。O8uエステルを最少容量のジオキサンに溶
解させ、そして得られた溶液を1.5当量のトリエチル
アミンおよびアミノ# (1,5当漬)かtたttはプ
テド(1,1当量)よりなる等容量の水性浴液に添加し
て、反応混合物を形成する。
方法 N−保護アミノ酸およびイプチドのN−ヒドロキシスク
シンイミドエステルは、Andersonら、J、Am
、Ohsm、13oc、86: 1839(1964)
に記載のものと実質的に同様の手順により製造すること
ができる。O8uエステルを最少容量のジオキサンに溶
解させ、そして得られた溶液を1.5当量のトリエチル
アミンおよびアミノ# (1,5当漬)かtたttはプ
テド(1,1当量)よりなる等容量の水性浴液に添加し
て、反応混合物を形成する。
約5分後、完全な溶液が得られない場合には、その反応
混合物の少量の試験試料を水で希釈し、そしてもう1つ
の試料をジオキサンで希釈する。
混合物の少量の試験試料を水で希釈し、そしてもう1つ
の試料をジオキサンで希釈する。
得られた結果に基づき、反応混合物を次いで完全な溶液
が得られるまで適当な溶媒(水かまたはジオキサン)で
希釈する。反応が完結するまで進行した後、反応混合物
を塩酸で酸性化し、そして得られた生成物を酢酸エチル
に抽出する。
が得られるまで適当な溶媒(水かまたはジオキサン)で
希釈する。反応が完結するまで進行した後、反応混合物
を塩酸で酸性化し、そして得られた生成物を酢酸エチル
に抽出する。
次いで、得られた抽出液を0.2N塩酸、次いで飽和塩
化す) IJウム中のα2N塩酸で洗浄する。
化す) IJウム中のα2N塩酸で洗浄する。
次に、その洗浄した抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥させ
、e過し、そして最後に蒸発乾固すると祖装イプチドが
96゜ 3、 その他の結合方法 択フチドのダンシル、2,4−ジニトロフェニル、およ
びメトキシスクシニル誘導体を、選択されたクロライド
、フルオライドまたはN〜ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルを適当なペプチドと反応きせることにより製造す
る。アセチルおよびスクシニル誘導体は相当する無水物
から製造できる。ペプチド塩酸塩またはトリフルオロア
セテート塩をα25ずリモ/L//−のレベルとなるよ
う50%水性ジオキサンに浴解させ、そして得られた溶
液を00に冷却する。選択された結合剤(1,o〜1,
2当t)をジオキサンに溶解し、そして2当麓の亘炭赦
ナトリウムと共に添加する。ニンヒドリン@注物質の消
失を追跡することによ)生成反応をモニターする。
、e過し、そして最後に蒸発乾固すると祖装イプチドが
96゜ 3、 その他の結合方法 択フチドのダンシル、2,4−ジニトロフェニル、およ
びメトキシスクシニル誘導体を、選択されたクロライド
、フルオライドまたはN〜ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルを適当なペプチドと反応きせることにより製造す
る。アセチルおよびスクシニル誘導体は相当する無水物
から製造できる。ペプチド塩酸塩またはトリフルオロア
セテート塩をα25ずリモ/L//−のレベルとなるよ
う50%水性ジオキサンに浴解させ、そして得られた溶
液を00に冷却する。選択された結合剤(1,o〜1,
2当t)をジオキサンに溶解し、そして2当麓の亘炭赦
ナトリウムと共に添加する。ニンヒドリン@注物質の消
失を追跡することによ)生成反応をモニターする。
4、 メチルエステルのけん化
N−保fflメチルエステルをジオキサンに浴解させ(
1−/ξミリモル、そして等容量のj、QON水酸化ナ
トリウムを30分間かけて添加する。
1−/ξミリモル、そして等容量のj、QON水酸化ナ
トリウムを30分間かけて添加する。
薄層クロマトグラフィによ)出発物質の消失をモニター
する。生じる反応が完了するまで進行した後、当量のf
、 OON塩酸を添力OL、そしてその浴液を水で10
04となるまで希釈する。次に生成物を酢酸エチルに抽
出し、そして得られた抽出液を0.2N塩酸で洗浄し、
次いで飽和塩化ナトリウム中のα2N埴酸で洗浄する。
する。生じる反応が完了するまで進行した後、当量のf
、 OON塩酸を添力OL、そしてその浴液を水で10
04となるまで希釈する。次に生成物を酢酸エチルに抽
出し、そして得られた抽出液を0.2N塩酸で洗浄し、
次いで飽和塩化ナトリウム中のα2N埴酸で洗浄する。
次に溶媒を蒸発により除去すると粗製カルボン酸が残る
。
。
5、 Boc基の加水分解
選択されたペプチドをトリフルオロ酢酸に溶解させ、そ
して得られた浴液な約23c′で5分間攪拌す・ること
によ)、Eoc保護基をペプチドから除去する。次#′
c冷エーテルを添加する。ニーチル添加の際に沈殿が得
られたらそれをエーテルで磨砕しそして単離する。沈殿
が得られなければ、エーテルを蒸発させそしてトルエン
を添加して残留トリフルオロ酢酸を共蒸発させると保護
基のはずされたにプチドがトリフルオロ酢酸塩として得
られる。
して得られた浴液な約23c′で5分間攪拌す・ること
によ)、Eoc保護基をペプチドから除去する。次#′
c冷エーテルを添加する。ニーチル添加の際に沈殿が得
られたらそれをエーテルで磨砕しそして単離する。沈殿
が得られなければ、エーテルを蒸発させそしてトルエン
を添加して残留トリフルオロ酢酸を共蒸発させると保護
基のはずされたにプチドがトリフルオロ酢酸塩として得
られる。
あるいはまた、Boc−保護ペプチドをエタノール性塩
酸(2,0〜&5N)にm解させそして得られる溶液を
約26°で約30分攪拌し、次いで溶媒を蒸発させるこ
ともできる。すべての場合に、ペプチド塩酸塩またはト
リフルオロアセテート塩を固体水酸化カリウムと五酸化
燐の存在下に一夜真空乾燥する。
酸(2,0〜&5N)にm解させそして得られる溶液を
約26°で約30分攪拌し、次いで溶媒を蒸発させるこ
ともできる。すべての場合に、ペプチド塩酸塩またはト
リフルオロアセテート塩を固体水酸化カリウムと五酸化
燐の存在下に一夜真空乾燥する。
6、 t−ブチルエステル(Bu)の加水分解t−プ
チルヘフチドエステルをトリフルオロ酢改に浴解し、そ
して得られた溶液を約23℃で1時間攪拌する。次に清
媒を蒸発させ、そして得られる残留物をトルエンに再溶
解させる。
チルヘフチドエステルをトリフルオロ酢改に浴解し、そ
して得られた溶液を約23℃で1時間攪拌する。次に清
媒を蒸発させ、そして得られる残留物をトルエンに再溶
解させる。
2回目のトルエン蒸発工程後、残った残留物を固体水酸
化カリウムで真空乾燥する。粗製生成物を適当な醗媒、
例えばトルエンまたは酢酸エチルなどから結晶化させる
。
化カリウムで真空乾燥する。粗製生成物を適当な醗媒、
例えばトルエンまたは酢酸エチルなどから結晶化させる
。
Z 薄層クロマトグラフィ(TLO) 手順TLOを螢
光インジケータを用いて5×10cILシリカゲルプレ
ートで行う。慣用の技法により、UV光または沃素ジャ
ーを用いてスポットを可視化する。Boc基により保護
された遊離アミン基をMするにプテドをHC2蒸気にさ
らし次いでニンヒドリンで染色する。次の溶媒系がクロ
マドグ2フイに有用である。すなわち、 メタノール:クロロホルム(1:9) ブタノ−/’:I!rF酸:水(4:1:1)酢酸エチ
/L/:ヘキサン(8:2) 笑厖例1 : Sue−Ph8−Gly−Leu−Gl
n−AMCの製造既に概説した混合無水物結合方法によ
り無水Boa−Gln−OH(103f、2a5 fリ
モル)を7−アミノ−4−メチルクマリン(AMりに結
合することによりBo c −Gin−AMCを製造し
た。まず、Bo c −Gln−OHを幽tのN−メチ
ルモルホリンおよび車量のイソブチルクロロホルメート
と反応させることによF) 、Boa−Gin−OHの
混合無水物の溶液を製造し、そして得られた溶液を30
−のDMyKm解サセタAすc (5,Oos’12a
5 <リモル)に添加した。生じる反応が完了後、反応
混合物を戸通し、そしてP液を凝縮した。生成物(5?
)をP液から分離し、そして75−の熱メタノールに溶
解させた。次にこの溶液を約30−1で#縮しそして冷
却した。固体AMCを一過により浴液から分離し、そし
て得られたf液を更に、約5−の答iまで改縮した。次
にこの濃縮溶液を30−のりc10ホルムで希釈し、そ
して得られた浴液を約302のシリカゲルを含む4偲カ
ラムにかけた。残留AMCを別にクロロホルムを用いて
カラムから浴出させ、次いで生成物のBoc−Gln−
AMC(Q、 97 S’ )を′クロロホルム中2係
メタノールで浴出させることによりカラムから回収した
。生成物をメタノールから再結晶して0.46Fの精製
Boc−G]−n−AMC、m+p+ 206.5〜2
076を得た。メタノール:クロロホルム(1:9)を
用いたTLCは単一のスポット(Rfo、28)を示し
た。
光インジケータを用いて5×10cILシリカゲルプレ
ートで行う。慣用の技法により、UV光または沃素ジャ
ーを用いてスポットを可視化する。Boc基により保護
された遊離アミン基をMするにプテドをHC2蒸気にさ
らし次いでニンヒドリンで染色する。次の溶媒系がクロ
マドグ2フイに有用である。すなわち、 メタノール:クロロホルム(1:9) ブタノ−/’:I!rF酸:水(4:1:1)酢酸エチ
/L/:ヘキサン(8:2) 笑厖例1 : Sue−Ph8−Gly−Leu−Gl
n−AMCの製造既に概説した混合無水物結合方法によ
り無水Boa−Gln−OH(103f、2a5 fリ
モル)を7−アミノ−4−メチルクマリン(AMりに結
合することによりBo c −Gin−AMCを製造し
た。まず、Bo c −Gln−OHを幽tのN−メチ
ルモルホリンおよび車量のイソブチルクロロホルメート
と反応させることによF) 、Boa−Gin−OHの
混合無水物の溶液を製造し、そして得られた溶液を30
−のDMyKm解サセタAすc (5,Oos’12a
5 <リモル)に添加した。生じる反応が完了後、反応
混合物を戸通し、そしてP液を凝縮した。生成物(5?
)をP液から分離し、そして75−の熱メタノールに溶
解させた。次にこの溶液を約30−1で#縮しそして冷
却した。固体AMCを一過により浴液から分離し、そし
て得られたf液を更に、約5−の答iまで改縮した。次
にこの濃縮溶液を30−のりc10ホルムで希釈し、そ
して得られた浴液を約302のシリカゲルを含む4偲カ
ラムにかけた。残留AMCを別にクロロホルムを用いて
カラムから浴出させ、次いで生成物のBoc−Gln−
AMC(Q、 97 S’ )を′クロロホルム中2係
メタノールで浴出させることによりカラムから回収した
。生成物をメタノールから再結晶して0.46Fの精製
Boc−G]−n−AMC、m+p+ 206.5〜2
076を得た。メタノール:クロロホルム(1:9)を
用いたTLCは単一のスポット(Rfo、28)を示し
た。
分 析
020H25N306 I/cついての計算値:C,5
9,55;HS6.26;N、 10.4実測値: 0、59.70;H,6,17;N、 IQ、56約2
3°で5分間トリフルオロ酢酸で処理することにより、
Boa −G’ln−AMOの保護基をはずした。
9,55;HS6.26;N、 10.4実測値: 0、59.70;H,6,17;N、 IQ、56約2
3°で5分間トリフルオロ酢酸で処理することにより、
Boa −G’ln−AMOの保護基をはずした。
過剰のトリフルオロ酢酸を減圧で蒸発させ、そして得ら
れる残留物であるH−Gin −AMC) !Jフルオ
ロアセテートを固体水酸化カリウムで真空乾燥した。次
に得られた生成物をエーテルで洗浄し、そして固体水酸
化カリウムで再乾燥した。
れる残留物であるH−Gin −AMC) !Jフルオ
ロアセテートを固体水酸化カリウムで真空乾燥した。次
に得られた生成物をエーテルで洗浄し、そして固体水酸
化カリウムで再乾燥した。
混合無水物結合方法によすBoa−Phe−Gly−L
eu−OH(D、59f、 α 90 ミ リ
モ ル ) を H−Gln−AMC) リ
73−1r o 7 * f−ト(Q、41f、(L
9999ミリ)に添加することによP) Boa−Ph
e−G:Ly−Lsu−Gln−AMNを製造して0.
49fの粗製生成物を得た。生成物を酢酸エテルから再
結晶してα271のBo c −Phe −Gly−L
eu−Gln−AMC(m、p、234〜236°、分
解)を得た。メタノール:クロロホルム(1:9)を用
いたTLCは単一スポット(RfQ、20)を示した。
eu−OH(D、59f、 α 90 ミ リ
モ ル ) を H−Gln−AMC) リ
73−1r o 7 * f−ト(Q、41f、(L
9999ミリ)に添加することによP) Boa−Ph
e−G:Ly−Lsu−Gln−AMNを製造して0.
49fの粗製生成物を得た。生成物を酢酸エテルから再
結晶してα271のBo c −Phe −Gly−L
eu−Gln−AMC(m、p、234〜236°、分
解)を得た。メタノール:クロロホルム(1:9)を用
いたTLCは単一スポット(RfQ、20)を示した。
分 析゛
C57E(48N609についての計算値;Q、 61
.64;H,6,72;N、 11.66実測値: 0.61.44;H,6,53;N、1156約23°
でトリフルオロ酢酸で処理することによj) Boa−
Phe−Gly−Leu−Gln−AMC(0,63f
)の保護基を除去した。得られた反応混合物にトルエ
ンを添加し、次いでそれら合した溶媒を減圧蒸発させる
と残留物が残る。この残留物をトルエンに再溶解させ、
そして次に、溶媒を再度蒸発させ、残った残留物を固体
水酸化カリウムで一夜真空乾燥してcL69fの白色固
体H−Phe−G1y −Leu−Gln−AMC)リ
フルオロアセテートを得た。
.64;H,6,72;N、 11.66実測値: 0.61.44;H,6,53;N、1156約23°
でトリフルオロ酢酸で処理することによj) Boa−
Phe−Gly−Leu−Gln−AMC(0,63f
)の保護基を除去した。得られた反応混合物にトルエ
ンを添加し、次いでそれら合した溶媒を減圧蒸発させる
と残留物が残る。この残留物をトルエンに再溶解させ、
そして次に、溶媒を再度蒸発させ、残った残留物を固体
水酸化カリウムで一夜真空乾燥してcL69fの白色固
体H−Phe−G1y −Leu−Gln−AMC)リ
フルオロアセテートを得た。
1−ブタノール:酢酸:水(4:1:1)を用いたTL
Qは2つのスポット(Rfα58およびRfQ、51)
を示した。
Qは2つのスポット(Rfα58およびRfQ、51)
を示した。
4−の50%(V/v )水/ジオキサン中でH−Ph
e−Gly−Leu−Gln−AMOトリフA/オロア
セテート((L651.0.94ミリモル)の溶液を調
製しそして00VC冷却した。この浴液に固体重炭酸ナ
トリウム(0,16F、1.87ミリモル)および、コ
ハク酸無水物(α11F、1.12ミリモル)のジオキ
サン1−中の浴液を添加した。得られた反応混合物な0
6で1時間攪拌した。付加的な重炭酸ナトリウム(α1
6F、19ミリモル)およびコハク酸無水物(111ミ
リモル)をその反応混合物に添加し、次にそれを約23
°まで加温しそして1時間攪拌した。次に塩酸(α2N
、30m)をその反応混合物に添加し、そして得られた
混合物を酢ばエチルで抽出した。会−された水相および
有機相中に残留する不浴注吻貞を1別し、α2N塩酸で
洗浄し、次いで乾燥して0..56fの粗製Sue−P
he−Guy−Leu−Gln−AMCを得た。前記酢
酸エチル抽出物から残留している有機相を分離し、付加
的な0.212 ffl酸で洗浄し、そして無水硫酸ナ
トリウムで乾燥した。溶媒を減圧蒸発し、た後に残る残
留物(0,19t)の粗製Suc−Phe−Gly−L
eu−Gln−AMOを前記の既に得られている分の粗
製生成物と合一した。合一した粗製生成物(全部で0.
55f)をメタノール/酢酸エチルから結晶化して0.
58tの精製13uc−Phe−Gly−Leu−Gl
n−AMC。
e−Gly−Leu−Gln−AMOトリフA/オロア
セテート((L651.0.94ミリモル)の溶液を調
製しそして00VC冷却した。この浴液に固体重炭酸ナ
トリウム(0,16F、1.87ミリモル)および、コ
ハク酸無水物(α11F、1.12ミリモル)のジオキ
サン1−中の浴液を添加した。得られた反応混合物な0
6で1時間攪拌した。付加的な重炭酸ナトリウム(α1
6F、19ミリモル)およびコハク酸無水物(111ミ
リモル)をその反応混合物に添加し、次にそれを約23
°まで加温しそして1時間攪拌した。次に塩酸(α2N
、30m)をその反応混合物に添加し、そして得られた
混合物を酢ばエチルで抽出した。会−された水相および
有機相中に残留する不浴注吻貞を1別し、α2N塩酸で
洗浄し、次いで乾燥して0..56fの粗製Sue−P
he−Guy−Leu−Gln−AMCを得た。前記酢
酸エチル抽出物から残留している有機相を分離し、付加
的な0.212 ffl酸で洗浄し、そして無水硫酸ナ
トリウムで乾燥した。溶媒を減圧蒸発し、た後に残る残
留物(0,19t)の粗製Suc−Phe−Gly−L
eu−Gln−AMOを前記の既に得られている分の粗
製生成物と合一した。合一した粗製生成物(全部で0.
55f)をメタノール/酢酸エチルから結晶化して0.
58tの精製13uc−Phe−Gly−Leu−Gl
n−AMC。
m−p−224〜225°(215°で予め軟化)を得
た。
た。
分析
05oH55N509についての計算値:c、 59.
29;H,5,48;N、 11.53実測値: o、59.37;H% 6.17;IJN 11.31
実施例2 : 5ue−Phe−Gly−Leu−Gi
n−NA混合無水物結合方法によj) Boa−Phe
−Gly−Leu−OH(1,42r、i2525ミリ
)をH−Gln−NA HOL(tOc1%五25ミリ
モル)に結合することによF) Boa−Phs−Gl
y−Leu−Gln−NAを製造した。全部で10−の
DMIF 7f!:用いてH−Gln−NA HCLf
:溶解させた。混合無水物結合方法によυ得られる有機
相の後処理の際、一部の生成物が結晶化し、これを分離
し、水洗しそして乾燥させて0.91fのB□c−Ph
s−Guy−Leu−Gln−NA 、 m、p、23
8〜239°を得た。残った有機相を飽和塩浴液で洗浄
し、そして結晶性生成物の第2収獲物(Q、62f )
を得た。m、pe238〜239°。第1収獲物の試料
を分析した。
29;H,5,48;N、 11.53実測値: o、59.37;H% 6.17;IJN 11.31
実施例2 : 5ue−Phe−Gly−Leu−Gi
n−NA混合無水物結合方法によj) Boa−Phe
−Gly−Leu−OH(1,42r、i2525ミリ
)をH−Gln−NA HOL(tOc1%五25ミリ
モル)に結合することによF) Boa−Phs−Gl
y−Leu−Gln−NAを製造した。全部で10−の
DMIF 7f!:用いてH−Gln−NA HCLf
:溶解させた。混合無水物結合方法によυ得られる有機
相の後処理の際、一部の生成物が結晶化し、これを分離
し、水洗しそして乾燥させて0.91fのB□c−Ph
s−Guy−Leu−Gln−NA 、 m、p、23
8〜239°を得た。残った有機相を飽和塩浴液で洗浄
し、そして結晶性生成物の第2収獲物(Q、62f )
を得た。m、pe238〜239°。第1収獲物の試料
を分析した。
分 析
0!57H48N607についての計算値:c、64.
50;H,7,04;N112.20実測値: 0.64.64;H,6,96;N112.21エタノ
ール性HC1で処理することによりBoa−Phe−G
ly−Leu−Gln−NA(19o r )の保護基
をはずして0.79 tのH−Phe−Gly−Lsu
−Gln −NA HOLを得た。1−ブタノール′:
酢#R:水(4: 1: 1)を用いたTLOは主スポ
ツ) (Rfα61)および2つの微tスポツ) (R
fα71およびRfα51)を示した。
50;H,7,04;N112.20実測値: 0.64.64;H,6,96;N112.21エタノ
ール性HC1で処理することによりBoa−Phe−G
ly−Leu−Gln−NA(19o r )の保護基
をはずして0.79 tのH−Phe−Gly−Lsu
−Gln −NA HOLを得た。1−ブタノール′:
酢#R:水(4: 1: 1)を用いたTLOは主スポ
ツ) (Rfα61)および2つの微tスポツ) (R
fα71およびRfα51)を示した。
4TRtのDMF中で1(−Phe−Gly−Leu−
Gln−NA 1101([L72t、 t15 i
9モル)の浴液を調製しそして06に冷却した。コノ1
り酸無水物(cL14f。
Gln−NA 1101([L72t、 t15 i
9モル)の浴液を調製しそして06に冷却した。コノ1
り酸無水物(cL14f。
1.38ミリモル)およびトリエチルアミン(α32d
、2.30ミリモル)をこの溶液に添加し、そして得ら
れた反応混合物を0°で30分攪拌し、0.2N塩酸で
希釈し、そして酢酸エチルで抽出した。
、2.30ミリモル)をこの溶液に添加し、そして得ら
れた反応混合物を0°で30分攪拌し、0.2N塩酸で
希釈し、そして酢酸エチルで抽出した。
得られた酪酸エチル抽出液を[1,2N塩改で洗浄し、
次に冷却してα52fの5ue−Phe−Gly−Le
u−Gln−NA。
次に冷却してα52fの5ue−Phe−Gly−Le
u−Gln−NA。
m、p、230〜232°を沈殿させた。残ったP液か
ら生成物結晶の第2収獲物(α27F)、m、p。
ら生成物結晶の第2収獲物(α27F)、m、p。
260〜232.5°が得られた。生成物結晶の両収獲
物を合一し、そしてメタノールから再結晶してα532
のlfl 製5ue−Phe−Gly−Leu−Gln
−NA 1m、p。
物を合一し、そしてメタノールから再結晶してα532
のlfl 製5ue−Phe−Gly−Leu−Gln
−NA 1m、p。
238〜2395°を得た。1−ブタノール:酢酸:水
(4:11)を用いたTLCはRfα74に主たるスポ
ット、またRfα82に従たるスポットを示した。
(4:11)を用いたTLCはRfα74に主たるスポ
ット、またRfα82に従たるスポットを示した。
分析
056H44N60Bについての計算値:ON 62.
76;H,6,45;N、 12.20実測値: c、 62.71 ;H,6,75;N% 12.01
実施例3〜5:標識テトラペプチドゾロテアーゼ基質を
用いたウイルス−特異 的プロテアーゼの検定 下記実施例3〜5はウィルス感染細胞の抽出液中のウィ
ルスプロテアーゼ活性を検定するための本発明の4s−
テトラペプチドプロテアーゼ基質の便用な示すものであ
る。実施例3では、Sue−Phi−Gly−Leu−
Gln−AMOを基質として用いた。
76;H,6,45;N、 12.20実測値: c、 62.71 ;H,6,75;N% 12.01
実施例3〜5:標識テトラペプチドゾロテアーゼ基質を
用いたウイルス−特異 的プロテアーゼの検定 下記実施例3〜5はウィルス感染細胞の抽出液中のウィ
ルスプロテアーゼ活性を検定するための本発明の4s−
テトラペプチドプロテアーゼ基質の便用な示すものであ
る。実施例3では、Sue−Phi−Gly−Leu−
Gln−AMOを基質として用いた。
実施例4および5においては、Suc −Phe −G
ly−Llilu−Gln−Nムおよび8uc−Phe
−Gly−Leu−Gln−AMCの両方を角いた。実
施例4および5はNムー標識およびムMe−標識基質に
よ勺測定されるプロテアーゼ活性を相関させることがで
きることを示すものである。
ly−Llilu−Gln−Nムおよび8uc−Phe
−Gly−Leu−Gln−AMCの両方を角いた。実
施例4および5はNムー標識およびムMe−標識基質に
よ勺測定されるプロテアーゼ活性を相関させることがで
きることを示すものである。
実施例3
A、 a胞抽出液の調製
H@La−0a胞の60總プレートを全面増殖させそし
て6X 108pfu/プレートのポリオウィルス・タ
イプ2(ワクチン株)で感染させた。1時間後に、マツ
コイ(MaOoy’s)増殖培地を各プレートに添加し
、そしてそれら細胞を更に4時間インキエベートした。
て6X 108pfu/プレートのポリオウィルス・タ
イプ2(ワクチン株)で感染させた。1時間後に、マツ
コイ(MaOoy’s)増殖培地を各プレートに添加し
、そしてそれら細胞を更に4時間インキエベートした。
次に細胞をプレートから取出し、10mM塩化ナトリウ
ムおよび1.5 mM塩化マグネシウムを含む10mM
)リス(ヒドロキシメチル)アばツメタン1M衝液(声
7.3 ) K懸濁させた。得られた懸濁液を機械式細
胞ホモジナイザーで均質化し、次いで4oooxrで1
0分関連心分離して、不溶細胞破片を除去した。
ムおよび1.5 mM塩化マグネシウムを含む10mM
)リス(ヒドロキシメチル)アばツメタン1M衝液(声
7.3 ) K懸濁させた。得られた懸濁液を機械式細
胞ホモジナイザーで均質化し、次いで4oooxrで1
0分関連心分離して、不溶細胞破片を除去した。
次にその上清を311000 X tで1時間再度遠心
分離してミクロソーム(ベレット)およヒシトソル(上
清)画分を得、それらを検定用に貯えた。対照用画分を
未感染H・La −OIvi111胞を用いるほかは実
質的に同様にして調製した。
分離してミクロソーム(ベレット)およヒシトソル(上
清)画分を得、それらを検定用に貯えた。対照用画分を
未感染H・La −OIvi111胞を用いるほかは実
質的に同様にして調製した。
B、プロテアーゼ検定
全タンパク濃度をクーマシー・プリリアy)・ブルー
(Ooomaaaie Br1lliant Blue
)G−250を用いた色素結合法により測定した(Bi
o−Rad Proteinassay)。牛鹿清アル
ブミンを標準として用いた。
(Ooomaaaie Br1lliant Blue
)G−250を用いた色素結合法により測定した(Bi
o−Rad Proteinassay)。牛鹿清アル
ブミンを標準として用いた。
基質Sue−Phe−Gly−Leu−Gln−AMC
をジメチルスルホキシド中の2X10″″2M原液とし
て貯蔵した。
をジメチルスルホキシド中の2X10″″2M原液とし
て貯蔵した。
検定用溶液の構成は5mMエチレンジアミン四酢酸酢酸
TA) 、5 mMジテオトレイトール(DTT) 、
α1゜M塩化ナトリウムおよび1%ジメチルスルホキシ
ドを含有する50mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH5,
0)中の2.OXlo−4M基質とした。各検定反応は
前述の如く調製した細胞抽出液の7リコート(α01〜
α10−)を2.001R1の検定用溶液に添加するこ
とにより開始させた。遊離AMOの放出として測定され
るウィルスプロテアーゼ活性を、380nmで励起しモ
して460nmで螢光発出を測定することKよシ測定し
た。フルオロメータはフルスケールの振れが1.0X1
0″″7 M K等しくなるように標準化しそしてフル
スケールを任意に100単位に対応させた。これらの検
定結果を下記第1表に記載する。細胞抽出液調製上の変
動を相殺するために全タンAり1119あたルの活性(
単位7分)を報告することkよシ結果を正規化した。
TA) 、5 mMジテオトレイトール(DTT) 、
α1゜M塩化ナトリウムおよび1%ジメチルスルホキシ
ドを含有する50mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH5,
0)中の2.OXlo−4M基質とした。各検定反応は
前述の如く調製した細胞抽出液の7リコート(α01〜
α10−)を2.001R1の検定用溶液に添加するこ
とにより開始させた。遊離AMOの放出として測定され
るウィルスプロテアーゼ活性を、380nmで励起しモ
して460nmで螢光発出を測定することKよシ測定し
た。フルオロメータはフルスケールの振れが1.0X1
0″″7 M K等しくなるように標準化しそしてフル
スケールを任意に100単位に対応させた。これらの検
定結果を下記第1表に記載する。細胞抽出液調製上の変
動を相殺するために全タンAり1119あたルの活性(
単位7分)を報告することkよシ結果を正規化した。
第■表: 8uc−Pb+5−Gly−Leu −Gl
n−AMCの加水分解によ)測定されたポリオウィルス
P2感染細胞におけるプロテアーゼ活性 感染細胞 41 38 対照細胞 16 22 英施例4 ポリオウィルス・タイプ2に感染した■θLa−0細胞
および未感染対照の細胞抽出液を実質的ンζ実施例3に
記載されているとおりに調製した。
n−AMCの加水分解によ)測定されたポリオウィルス
P2感染細胞におけるプロテアーゼ活性 感染細胞 41 38 対照細胞 16 22 英施例4 ポリオウィルス・タイプ2に感染した■θLa−0細胞
および未感染対照の細胞抽出液を実質的ンζ実施例3に
記載されているとおりに調製した。
細胞をローラーびん内で増殖させ、そして試験培養物を
、培地5−中の5 X 10” pfuのウィルスで感
染させた後5時間インキュベートした。
、培地5−中の5 X 10” pfuのウィルスで感
染させた後5時間インキュベートした。
得られた細胞抽出液中のプロテアーゼ活性をSue −
Phe −Gly−Lau −Gln−AMOを基質と
して用いて測定した。検定手順は実質的に実施例5に記
載のものと同様としたが、ただし使用した検定用緩衝液
は5 mM DTTに代えて1 mM DTTを含有し
た。
Phe −Gly−Lau −Gln−AMOを基質と
して用いて測定した。検定手順は実質的に実施例5に記
載のものと同様としたが、ただし使用した検定用緩衝液
は5 mM DTTに代えて1 mM DTTを含有し
た。
これらの抽出液中のプロテアーゼ活性はまた5uC−P
he−Gly−Leu−Gln−NAを基質として用い
て測定した。これらの検定において、各検定混合物は5
0mM燐酸ナトリウム(−6,0)、α1M塩化ナトリ
ウム、5 mMEDTム、1 mM DTTおよび2,
5%ジメチルスルホキシドを含有する検定用緩衝液2−
中に2X10″″4M基質を含有した。検定混合物にジ
メチルスルホキシド中に2XfO−2M基質を含む原液
から基質を添加した。活性は335nmで励起しそして
410nmで射出を測定することによ)測定した。
he−Gly−Leu−Gln−NAを基質として用い
て測定した。これらの検定において、各検定混合物は5
0mM燐酸ナトリウム(−6,0)、α1M塩化ナトリ
ウム、5 mMEDTム、1 mM DTTおよび2,
5%ジメチルスルホキシドを含有する検定用緩衝液2−
中に2X10″″4M基質を含有した。検定混合物にジ
メチルスルホキシド中に2XfO−2M基質を含む原液
から基質を添加した。活性は335nmで励起しそして
410nmで射出を測定することによ)測定した。
これらのプロテアーゼ検定の結果を下記第■表忙記載す
る。
る。
第H表: Sue−Phe−Gly−Leu−Gln−
AMCおよび5uc−Phe−Gly−Leu−Gln
−NAの加水分解により測定されたポリオウィルスP2
−感染細胞のシトンル画分のプロテアーゼ 活性 感染細胞 22.5 五24対照細胞
11.4 1.86実施例5 HeLa−〇細胞を含む60raプレートを全面に増殖
させ、仄いで1.2X108pfuのポリオウィルス・
タイプ2に感染させた。1時間のインキュベーションの
後、マツコイ増殖培地を各フレートに添加しそしてそれ
ら細胞を更に2時間または4時間インキュベートした。
AMCおよび5uc−Phe−Gly−Leu−Gln
−NAの加水分解により測定されたポリオウィルスP2
−感染細胞のシトンル画分のプロテアーゼ 活性 感染細胞 22.5 五24対照細胞
11.4 1.86実施例5 HeLa−〇細胞を含む60raプレートを全面に増殖
させ、仄いで1.2X108pfuのポリオウィルス・
タイプ2に感染させた。1時間のインキュベーションの
後、マツコイ増殖培地を各フレートに添加しそしてそれ
ら細胞を更に2時間または4時間インキュベートした。
採取後、10!IIM塩化ナトリウムおよび1.5 m
M 塩化マグネシウムを含有する10mM)リス(ヒド
ロキシメチル)アミンメタン緩衝液(pH7,3)に細
胞を懸濁し、均質化しそして6,00QXfで10分間
遠心分離した。対照細胞はウィルスを添加する点を除き
実質的に同様に処理した。
M 塩化マグネシウムを含有する10mM)リス(ヒド
ロキシメチル)アミンメタン緩衝液(pH7,3)に細
胞を懸濁し、均質化しそして6,00QXfで10分間
遠心分離した。対照細胞はウィルスを添加する点を除き
実質的に同様に処理した。
得られた細胞抽出液のプロテアーゼ活性を実質的に前記
実施例3の記載のとおり、8uc−Phe−Gly−L
eu−Gln−AMCを基質として用イテ検定シタ。
実施例3の記載のとおり、8uc−Phe−Gly−L
eu−Gln−AMCを基質として用イテ検定シタ。
更に、抽出液を次のようKして、8uc −Phe −
Gly−Leu−Gln−NAを用いた比色測定手順に
より検出シた。ジメチルスルホキシド中2X 10−2
M 濃度の5uc−Phe−Gly−Lsu−Gln
−NAの原液を調製し、そして40μを基質原液、60
μtジメチルスルホキシド、および、5 mM IIC
DTA 、 1 mM DTTおよび0.10M塩化ナ
トリウムを含む4−の50mM燐酸ナトリウム緩衝液(
PI−15,0)を含む検定溶液の調製に用いた。細胞
抽出液の細胞抽出液アリコート50μtを50μtの検
定浴液とインキュベートし、そしてEarrett、A
nalBiochem、 76: 574−576(1
976)に記載の試薬および手塩を用いて呈色させた。
Gly−Leu−Gln−NAを用いた比色測定手順に
より検出シた。ジメチルスルホキシド中2X 10−2
M 濃度の5uc−Phe−Gly−Lsu−Gln
−NAの原液を調製し、そして40μを基質原液、60
μtジメチルスルホキシド、および、5 mM IIC
DTA 、 1 mM DTTおよび0.10M塩化ナ
トリウムを含む4−の50mM燐酸ナトリウム緩衝液(
PI−15,0)を含む検定溶液の調製に用いた。細胞
抽出液の細胞抽出液アリコート50μtを50μtの検
定浴液とインキュベートし、そしてEarrett、A
nalBiochem、 76: 574−576(1
976)に記載の試薬および手塩を用いて呈色させた。
得られた試料の赤色を肉眼的に格付けした。
これらの検定の結果を下記第■表に記載する。
$1ff 表: Sue−Phe−Gly−Leu−G
ln−AMCおよび+3uc −Phs −Gly−L
eu−Gln−NAの加水分解により測定されたポリオ
ウィルスP2に感染させた細胞の粗製抽出液のプロテア ーゼ活性 感染細胞(2時間) a25 12.1
++感染禰胞(4時間) 7.97
22.2 ++十十対照+艶(4
昨司) &97 1α5 +
ln−AMCおよび+3uc −Phs −Gly−L
eu−Gln−NAの加水分解により測定されたポリオ
ウィルスP2に感染させた細胞の粗製抽出液のプロテア ーゼ活性 感染細胞(2時間) a25 12.1
++感染禰胞(4時間) 7.97
22.2 ++十十対照+艶(4
昨司) &97 1α5 +
第1図は個々のピコルナウィルスタンパクに対応するR
NA領域の相対的位置を示す一般化されたピコルナウィ
ルスのRNAゲノムの概略地図である。翻訳方向は左か
ら右である。 第2図は、いくつかの知られたウイルス−特異的フロテ
アーゼ開裂認識部位間のアミノ酸配列相似性を示す概略
図である。 特許出願人 イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
・アンド・コンパニー 外2名 ピコルナウィルス ala g17 0ト橋Aθ FIC)V alm l@u(
ffi 熟) アルファウィルス 1 G、 2
NA領域の相対的位置を示す一般化されたピコルナウィ
ルスのRNAゲノムの概略地図である。翻訳方向は左か
ら右である。 第2図は、いくつかの知られたウイルス−特異的フロテ
アーゼ開裂認識部位間のアミノ酸配列相似性を示す概略
図である。 特許出願人 イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
・アンド・コンパニー 外2名 ピコルナウィルス ala g17 0ト橋Aθ FIC)V alm l@u(
ffi 熟) アルファウィルス 1 G、 2
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)ウイルス−特異的ポリペプチド前駆体を分解してウ
イルス−関連タンパクを形成するプロテアーゼを検出す
るための特異的ペプチド基質を製造する方法であつて、
その検出すべきプロテアーゼはピコルナウイルス、トガ
ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、コモウイ
ルスおよびウイルスプロテアーゼをコードするその他の
ウイルスよりなる群から選択されるウイルスにより特定
され、そして(a)ウイルスタンパク、RNA、DNA
、mRNAまたはウイルスRNAに相補的なDNAを単
離し;(b)そのタンパク、RNA、DNA、、mRN
AまたはcDNAを分析してウイルス−特異的タンパク
のポリペプチド前駆体のアミノ酸配列を決 定し、 (c)そのアミノ酸配列内にウイルス−特異的プロテア
ーゼの開裂認識部位の位置を定め;そして (d)ポリペプチド前駆体の開裂認識部位に直接隣接し
て、かつその部位の上流に位置す るアミノ酸に実質的に相当する3〜5個の アミノ酸またはアミノ酸類似体のペプチド 配列にエステルまたはアミド結合により連 結されたC−末端インジケータ部分を包含 するウイルス−特異的プロテアーゼ検出用 特異的ペプチド基質を製造する ことよりなる、前記方法。 2)C−末端インジケータ部分が色原性、螢光原性、化
学光性、放射性、抗原性またはハプテン性のインジケー
タ基である特許請求の範囲第1項記載の方法。 3)基質のペプチド配列が4個のアミノ酸またはアミノ
酸類似体よりなる特許請求の範囲第2項記載の方法。 4)基質のペプチド配列がポリペプチド前駆体の開裂認
識部位に直接隣接して、かつその部位の上流に位置する
アミノ酸と厳密に相同である特許請求の範囲第1項記載
の方法。 5)ウイルスがピコルナウイルスである特許請求の範囲
第1項記載の方法。 6)ウイルスがライノウイルスである特許請求の範囲第
5項記載の方法。 7)ウイルスが***ウイルスである特許請求の範囲第
5項記載の方法。 8)ウイルスがトガウイルスである特許請求の範囲第1
項記載の方法。 9)ウイルスがレトロウイルスである特許請求の範囲第
1項記載の方法。 10)ウイルスがヒトT−細胞リンパ向性ウイルスであ
る特許請求の範囲第9項記載の方法。 11)特許請求の範囲第1項記載の方法により製造され
た、ウイルス−特異的プロテアーゼ活性検出用特異的ペ
プチド基質。 12)特許請求の範囲第2項記載の方法により製造され
た、ウイルス−特異的プロテアーゼ活性検出用特異的ペ
プチド基質。 13)特許請求の範囲第4項記載の方法により製造され
た、ウイルス−特異的プロテアーゼ活性検出用特異的ペ
プチド基質。 14)特許請求の範囲第5項記載の方法により製造され
た、ウイルス−特異的プロテアーゼ活性検出用特異的ペ
プチド基質。 15)特許請求の範囲第8項記載の方法により製造され
た、ウイルス−特異的プロテアーゼ活性検出用特異的ペ
プチド基質。 16)特許請求の範囲第9項記載の方法により製造され
た、ウイルス−特異的プロテアーゼ活性検出用特異的ペ
プチド基質。 17)式 R^1−〔A^4A^3A^2A^1〕−R^2〔式中
、 A^1はGln、GluまたはGluのエステル、およ
びAsnよりなる群から選択されるアミノ酸残基であり
; A^2は、Ala、Leu、IleおよびValよりな
る群から選択されるアミノ酸残基であり; A^3およびA^4は、それぞれ独立してAla、Ar
g、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly
、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、
Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Valおよ
びそれらの類似体よりなる群から選択されるD−または
L−配置のアミノ酸残基であり; R^1は水素またはN−末端保護基であり;そして R^2は、−OHまたは−X(ここでXはアミノ酸残基
A^1のC−末端カルボニルとアミドまたはエステル結
合を形成しうる、そして更にそのアミドまたはエステル
結合の加水分解的開裂後に遊離のXとして独立して検出
されうる部分である)である〕で示される化合物および
その生理学的に許容しうる塩。 18)R^2がXであり、そしてXが色原性、螢光原性
、化学光性、放射性、抗原性またはハプテン性のインジ
ケータ基である特許請求の範囲第17項記載の化合物。 19)A^1がGlnである特許請求の範囲第18項記
載の化合物。 20)A^1がGluまたはGluのエステルである特
許請求の範囲第18項記載の化合物。 21)A^1がAsnである特許請求の範囲第18項記
載の化合物。 22)R^1がZ、Boc、Suc)およびMeOSu
cよりなる群から選択される特許請求の範囲第19項記
載の化合物。 23)A^3およびA^4が、それぞれ独立してAla
、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、
His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、P
ro、Ser、Thr、Tyr、Val、Trp、また
はAsnよりなる群から選択される特許請求の範囲第2
2項記載の化合物。 24)A^3およびA^4がそれぞれ独立してAla、
Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Tyrおよ
びValよりなる群から選択される特許請求の範囲第2
3項記載の化合物。 25)R^1かMeOSucまたはSucであり;A^
2がLeuであり、A^3がGlyであり、A^4がP
heであり、R^2がナフチルアミノまたは4−メチル
クマリル−7−アミノ基である特許請求の範囲第24項
記載の化合物。 26)R^1がZ、Boc、SucおよびMeOSuc
よりなる群から選択される特許請求の範囲第20項記載
の化合物。 27)A^3およびA^4がそれぞれ独立してAla、
Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、H
is、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pr
o、Ser、Thr、Tyr、Val、TrpまたはA
snよりなる群から選択される特許請求の範囲第26項
記載の化合物。 28)A^3およびA^4がそれぞれ独立してAla、
Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Tyrおよ
びValよりなる群から選択される特許請求の範囲第2
7項記載の化合物。 29)R^1がZ、Boc、SucおよびMeOSuc
よりなる群から選択される特許請求の範囲第21項記載
の化合物。 30)A^3およびA^4がそれぞれ独立してAla、
Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、H
is、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pr
o、Ser、Thr、Tyr、Val、TrpまたはA
snよりなる群から選択される特許請求の範囲第29項
記載の化合物。 31)A^3およびA^4がそれぞれ独立してAla、
Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Tyrおよ
びValよりなる群から選択される特許請求の範囲第3
0項記載の化合物。 32)(a)ある量の試料を特許請求の範囲第18項記
載の化合物と接触させることにより検定 用混合物を形成し; (b)その検定用混合物を、プロテアーゼ活性が存在す
る場合にインジケータ基の加水分 解を行わしめるのに十分な時間インキュベ ートし;そして (c)その検定用混合物中の遊離インジケータ基の有無
を検出する ことよりなる、試料中のピコルナウイルスプロテアーゼ
活性の検出方法。
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1987
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US4952493A (en) | 1990-08-28 |
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