JPS611387A - 組換えｄｎａ発現ベクタ−および遺伝子の発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

産−１だλ料理次号一 本発明は、選択可能かつ自己複製可能で、新規な組換え
ＤＮＡ発現ベクターに関し、更に詳しくは、■）ペプチ
ドまたはポリペプチドを暗号化（コード）しているヌク
レオヂド配列の解読フレーム内に存在する複製および翻
訳活性化配列、２）翻訳停止信号；３）機能的なポリペ
プチドを暗号化しているヌクレオチド配列の解読フレー
ム内に存在する翻訳開始信号、および４）付加的な翻訳
停止信号をこの順番て含むベクターに関する。上記のヌ
クレオチド配列は、転写によって翻訳可能なＲＮＡを生
成させるために用いられる。本発明または、このベクタ
ーを用いる方法にも関する。 従来技術 従来高レベルに遺伝子を発現させることのできるベクタ
ーが一般的に不足しているために、組換えＤＮＡ技術の
開発と発展には限界があった。 １ａｃ（ｏパーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら、＋９７９．プ
ロナス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　５ｃＬ）
ＵＳＡ　　７６　：５５９６およびカランテ（Ｇ　ｕａ
ｒａｎｔｅ）ら、１９８．０．セル（Ｃｅｌｌ）　２０
　：　５４３　）、ｔｒｐ（ホールウェル（Ｈａｌ　Ｉ
ｅｗｅｌ　ｌ）およびエムタージ（Ｅｍｔａｇｅ）、　
Ｉ　９８０　、ジーン（Ｇｅｎｅ）９　：２７）、バク
テリオファージλＰＬ（レモ〜（Ｒｅｍａｕｔ）ら、１
９８１．ジーン（Ｇｅｎｅ）　Ｉ　５　（１）、８１．
パーナート（Ｂ　ｅｒｎａｒｄ）ら、１９７９．ジーン
（Ｇｅｎｅ）　５　：　５９およびブロム（Ｄ　ｅｒｏ
ｍ）ら、１９８２、ノーン（Ｇｅｎｅ）　Ｉ　７　：４
５　）および旦用（ジーベル（Ｚ　１ｅｂｅｌ）ら、１
９８＋、Ｊ　　バクテリオロジ−（Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　Ｉ　４５　：　６５４　、ジ
ー（Ｌｅｅ）ら、＋９８１、Ｊ　　バクテリオロジ−（
Ｊ　、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１４６：８６１そして
ナカムラ（Ｎ　ａｋａｍｕｒａ）およびイノウｘｃ　ｒ
　ｎｏｕｙｅ）、　＋　９７９　、セル（Ｃｅｌｌ）　
Ｉ　８　：　１１０９）の各プロモーター系をそれぞれ
組換えＤＮＡベクターに挿入した例があるが、その他の
発現系は、例えあったとしても殆ど利用することができ
ない。実際、これら既知の発現ベクターを用いても、多
くのヘテロローガスな（異種の）遺伝子は全くまたは殆
ど発現されない。その様な発現の失敗は、しばしばリボ
ゾームとの結合に適格性を欠くか、または結合すること
のできないｍＲＮＡが転写されることに伴って起こる。 これは、リボゾーム結合部位を隔離してしまう不適当な
ステムアンドループ構造が形成されること、あるいはｍ
ＲＮＡ転写物が一般に不安定であること、あるいはりボ
ゾームへの結合または転写の開始を阻止する配列が存在
すること、等による。いずれの場合においても翻訳は失
敗に終わり、その結果所望のポリペプチドの発現および
生産は起こらない。 倉団ｐ目的および構成 本発明は、遺伝子に対して合成的（ｓｙｎｔｈｅｔ　ｉ
ｃ）な修飾を施すことなく、発現に関する問題を解決せ
んとするものである。その様な合成的な修飾は時間と経
費の浪費であるばかりか、実質上、ＤＮＡ配列内に誤り
が導入される危険性を増すことになる。本発明は、所望
の特定の遺伝子の配列を修飾したり変更することなく、
ｍＲＮＡ転写物の５′末端を変化させることによって上
記問題を克服するものである。 本明細書中に開示した発明の目的に鑑みて、以下の如く
語句を定義する。 組換えＤＮＡクローニングベクター・１またはそれ以」
二のＤＮＡセグメントを付加することができる、または
既に付加された、ＤＮＡ分子からなる自律的複製体であ
って、これにはプラスミドが含まれる−がこわに限定さ
れなし、１゜組換えＤＮＡ発現発現ベクター型１はそれ
以上の転写および翻訳活性化配列が挿入された組換えＤ
ＮＡクローニングベクター。 転写活性化配列・ＤＮＡのｍＲＮＡ転写物への転写を指
令し、または転写を与えるＤＮＡ配列。 翻訳活性化配列：ｍＲＮ　Ａ転写物のペプチドまたはポ
リペプチドへの翻訳を指令し、または与えるＤＮＡ配列
。 翻訳開始信号：翻訳開始コドンを暗号化しているＤＮＡ
）リプレット。 翻訳停止信号、翻訳停止コドンを暗号化しているＤＮＡ
トリプレット。 形質転換・宿主細胞にＤＮＡを導入し、遺伝型を変化さ
せること。 形質転換体：形質転換を受けた宿主受容細胞。 制限フラグメント・ｌまたは１以上の制限酵素の作用に
より生成した線状ＤＮＡ０ 機能的ポリペプヂド１回収可能な、生物活性を有するヘ
テロローガスなポリペプチドまたはその前駆物質、ヘテ
ロローガスなポリペプチドとポモ（７−カスなポリペプ
チドの一部また（」全部から成る回収可能で生物学的に
活性なポリペプチド、あ／’、；）　い（ｊヘテロロー
カスなポリペプチドと生物学的に非活性なホモ〔Ｊ−プ
ｆスなポリペプチドから成る回収ｉＪ能で、生物学的に
非活性ん−Ｃ融合ポリペプチドであ−）で、特異的に開
裂され得るしの。 融合遺伝子生成物ホモし！−カスなポリペブチ）・の一
部または全体からなる回収可能な、ヘテＣｌローガスな
ポリペプチド。 １≦Ｌ面慕にλ」炙迄−ツ土 第１図〜第４図、ブチスミｌ’１１ＮＭ　５７５の組ｑ
で模式図３゜ 第５図へ一部８図・プラスミドｐＮＭ７８９Ｂこｌ）♀
１１ｑで模式図。 第９図ブラスミｔ；’ｐＣＺ　Ｉ　Ｉ　４およびｐｃＺ
１０５．１の制限サイト地図。 第１０図プラスミド１）Ｃ７，Ｉ　１４０の制限サイＩ
・地図。 第１１図合成されたヂモンンα（アルファ）！遺伝子の
模式図。 第１２図ヌクレオヂトフラグメント′Ｆ１５の合成上程
図。 第１３図プラスミドｐＴｈ、ｌの組立て工程図。 第１４１図合成されたプロインツユリン遺伝ｒの模式図
。 第１５図プラスミドｌ）ＨＩ　７△４△１の組立てｔＱ
式図。 第１６図プラスミドｐ＋］ｒ＋ｏ４の組立て模式本発明
は組換えＤ　Ｎ　Ａ発現ベクターの製造方法−ごあ−、
て、 ａ）転写！′５よひ翻、択活性化配列、ｈ）リボゾーム
結合部位とペプチドまたはポリペブチ１〜を暗号化し、
ているヌクレオチド配列からなろＩ）　Ｎ　Ａリンカ−
であって、核ペブヂ）・またはポリペブチＦの暗鱈配列
は、該ペプヂトまたはポリペプチドのカルボキシ末端を
暗号化しているヌクレオ７−　＋；’　ｈリプし・ノド
の下流側に隣接して翻訳停止信号を、そｊ２て該停止信
号の下流側に隣接して翻訳開始信号を含むものである、
Ｉ）ＮΔリンカ−１しよび Ｃ）機能的ポリペプチドを暗号化しているヌクし・オチ
ト配列て♂ウー・て、該機能的ポリペプチドの暗号配列
は、該機能的ポリペプチドのカリレポギノ末端を暗壮化
しているヌクレオチドトリブレットト流側に隣接して翻
訳停止信号を含む乙のである、ヌクレオヂト配列 をライノｆ−ｔ−ケろことからなるへｋｌターの製造方
法（但し、該ベクターは選択ｆｉＪ能１１−」自己複製
能をイＪ゛することを条件とする）を提供４ろらのであ
る。 本発明のｌ＼クター（」、上記の配列 ５’ＣＴＡＧ，へＧ　　Ｇ　　Ｇ　′ｒＡ　ｉ’　Ｔ　
　Ａ　　Ａ　ｉ”　　Ａ　　　Ａ　ＴＧｌｌｌｌｌｌｌ
ｌｌｌｌｌ　　Ｉｌｌ Ｔ　Ｃ　Ｃ　ＣΔＴＡＡＴ’ｌ’Ａｉ”Ｉ’ＡＣＴＴＣ
ＣＣ　Δ　　ＴＴＧＧ　　Δ　に　　Ｇ　、八゛■゛Ｇ
　　Δ′Ｉ゛Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　
　Ｉｌｌ　　ＭＩＡＡＧ　　　ＧＧＴ　　　△　、へ　
Ｃ　　　ＣＴＣ　　　ＣＴ　　△　　Ｃ　Ｔ　　ＡＴ”
Ａ　　Δ　　Δ　ＴＧｉ″　ＴＣＣＣ．へ　　ｃｃｃ　
　　Ａ　ｔ″　ＧＩｌｌ　　：ｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌ
ｌ　　：ｌｌ　　ＩｌｌＡＴＴ’　ＴＡＣ　ＡΔＧ　　
Ｇ　Ｇ　ｉ’　　Ｃ　Ｇ　Ｃ：　　ｉ’ΔＣ（ここにΔ
は一ｉ゛オギノアデニル、Ｇはデオキシグアニル、（゛
はデオギノントノル、そして］゛はチミ　ーン７１しを
表イつＡ　） て示さイ１ろＸｂａｌ　　ｌＩｇｉＡ　ＩＤＮ．ヘリン
カーを、プラスミドｐｃＺ＋０１の〜Ｉ　Ｏ．２＋（ａ
ｍｌ（　ｌ−Ｘｂａｔおよび−　０　、　６　ｋｂ　Ｂ
ａｍｌｒ　Ｉ　−　ＨｇｉΔ■フラグメントにライゲー
トすることによー）で組立てることかできろ。Ｉ−Ｌ成
（刀ニブラスミド（プラスミドｐＣ７、　１　＋　４と
い−））（Ｊ、１）リボシー１１結合部位、および式 ％式％ （式中、ＭＥＴはメヂオニン、ｐｏＥは）Ｊニルアラニ
ーン、Ｐ　Ｉｌ’ｔ　Ｏ　ｉまプロリノ、ＬＩＥＵはロ
イノン、Ｇ　Ｌ　Ｕはグルタミン酸、そしてＡ　Ｓ　Ｐ
はアスパラキン酸を表わす） で示されろペプチ）・、の両者を暗月化しているヌクレ
オヂト配列の解読フレーＪ・内にＥ．ｃｏｌｉリボタン
ペク質遺伝子の転写および翻訳活性化配列を；２）前記
のペプチド暗号化配列の解読フレーム内の適当な位置に
翻訳停止信号を、３）前記翻訳停止信号の下流側に隣接
し、メチオニル−ウソ成長ホルモン（ｍｅｔ−ｂＧＨ）
を暗号化しているヌクレオチド配列の解読フレーム内に
翻訳開始信号を：そして４）ｍｅｔ−ｂ　Ｇ　Ｈ暗号配
列の解読フレーム内の適当な位置に翻訳停止信号を、そ
れぞれ上記の順序で含有している。 出発物質のプラスミドｐｃＺＩｏＩは〜１Ｏ１８ｋｂで
あり、プラスミドｐＮＭ７８９Ｂの〜０６ｋｂ　Ｘｂａ
Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメントを同じく消化したプラス
ミドｐ１Ｍ−１’　−Ａ３にライケートすることにより
組立てられる。Ｅ、ｃｏｌｉリポタンパク質の転写およ
び翻訳活性化配列および熱誘導性ランナウェイレプリコ
ンを含有する後者のプラスミドは、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　
Ｒｅｇｉｏｎａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｌ＋　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＳＰｅｏｒｉａ、　　Ｉ　ｌ１ｉｎｏｉｓに
寄託されその永久ストック力ルチャーコレクンヨンの一
部となっている菌株、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＲＶ　
３０８．／ｐＩ　Ｍ−ドー、へ３から得ることができる
。この菌株は受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５７３３の下、
ブー）スミドの好ましい供給源および保管源として利用
し得る。プラスミドｐＮＭ７８９Ｂ出発物質は第１〜８
図および後述の実施例１に例示した工程に従ってプラス
ミドｐＫＥＮ１１１から得られる。プラスミドｐＫＥＮ
ＩＩＩはＮｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｅｏｒｉａ、
　　ｒｌｌｉｎｏｉｓに寄託され、その永久ストックカ
ルチャーコレクソヨンの一部となっている菌株、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　Ｋ　Ｉ　２　　ＣＣ６２０；ｐＫＥＮ　１１１
から得ることができる。この菌株は受託番号ＮＲＲＬ　
Ｂ−１５０１１の下、プラスミドの好ましい供給源およ
び保管源として利用し得る。プラスミドｐＮＭ７８９Ｂ
もまたＥ。 ｃｏｌ　ｉリポタンパク質遺伝子の転写および翻訳活性
化配列を含有し、さらに、ｂＧＨと、該ｂＧＨのＮ−末
端に７個のポリペプチドが融合して形成された融合ポリ
ペプチドの暗号配列であって適当位置に翻訳停止信号を
有する配列をも含有している。 Ｘｂａｌ−ＢａｍＨＩフラグメント中に含まれている上
記の転写活性化配列、および融合タン・（り質の暗号配
列を、適当に開裂したプラスミドＩＩ）　Ｉ　Ｍ　、−
ドーΔ３にライゲートすることにより、前記プラスミド
ｐＣＺ１０１．＋出発物質を得る。 当業者には理解し得ることだが、上記のＸｂａｌ−Ｈｇ
ｉＡｒ　　ＤＮＡリンカ−は例示プラスミドｐｃＺ　１
　＋　４の重要な構成成分である。このリンカ−は、■
）ペプチドとりボゾーム結合部位を同時に暗号化してい
るヌクレオチド配列の解読フレーム内にある翻訳活性化
配列；２）上記ペプチドの暗号配列の解読フレーム内の
適当な位置に存在する翻訳停止信号：および３）ｍｅｔ
−ｂＧＨ暗号配列の一部に関する解読フレーム内であっ
て、上記停止信号の下流側に隣接している翻訳開始信号
、とを暗号化している。ｍｅｔ−ｂＧＨ暗号配列の残り
の部分（ａ当位置に存在している翻訳停止信号を含む）
と転写活性化配列は、」１記の如くプラスミドｐｃＺ１
０１．１の適当なフラグメントをライゲートすることに
より、容易に得られる。その様なライゲーンヨンの結果
、例示の〜１０．８ｋｂメチオニルーウン成長ホルモン
（ｍｅｔ−ｂＧＨ）発現プラスミドｐＣＺ１１４が得ら
れる。当業者ならば理解し得る様に、最初のペプチドと
機能的ｍｅｔ−ｂＧＨポリペプチドとは融合遺伝子産物
から得られたものでなく、１個のポリンストロニックｍ
ＲＮＡ転写物から別々のタンパク質として翻訳されてい
る。例示プラスミドｐｃＺＩＩ４の制限サイト地図を添
付の第９図に示す。 本発明を例示する多くのｂＧＨ発現プラスミドを組立て
ることができる。例えば、本発明のＤＮＡリンカ−配列
は、１個のｍＲＮＡ転写物から少なくとも２個の別個の
ポリペプチドを発現させるよう考慮する必要があるが、
この様な組立てに使用し得るＤＮＡ配列の数は事実」二
無限である。こメ１らの配列は完全に保護されたジデオ
キシリボヌクレオヂド組立てブロックを使用し、改良ホ
スホ）・ジエステル法で都合良く合成することができる
。 その様な合成方法は当業者周知であり、イタクラ（Ｉ　
ｔａｋｕｒａ）ら（１９７７、サイエンス（Ｓ　ｃ　１
ｅｎｃｅ）　１９８：１０５６）およびフレア（Ｃｒｅ
ａ）ら（１９７８゜プロナス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｐ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）［ＪＳΔ　７５・５７６５）の
方法に事実１４従って行なうことができる。同定された
デオキシリボヌクレオチドを含む配列（但し、限定的で
はない）を以−トに示オ・ＡＴＧ　　ＴＴＣＣＣ，’Ａ
　ＴＴＧ　　ＧＡＴ　ＧＡＴＩｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌ
ｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　ｌ１ｌＴＡＣＡＡＧ　　　
ＧＧＴ　　　Δ　Δ　ｃｃ’＋”　　△　　ｃ　　’ｒ
　　、八ＧＡＴＴΔΔ　ＡＴＧ　Ｔ’Ｔ’ＣＣＧＡ　Ｇ
ＣＣＩｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ
　　ｌ１ｌＣＴ　Ａ　　ΔＴ　Ｔ　　　Ｔ　Ａ　　ＣΔ
　Δ　Ｇ　　　ＧＣＩ’　　　ＣＧＧ△ＴＧ　ＴＣＣＴ
’ｒＧ　ＴＣＣＧＧＣＣ’ＶＧＩｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉ
ｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　ｌｌ　１ゴΔ　ＣΔ　Ｇ
Ｇ　　　ＡＡＣＡＧＧ　　　ＣＣＧ　　　ＧＡＣΔ　Ｔ
　　Ｇ　　　Ｇ　　Ａ　Ｔ　　　ＣＡ　Ｇ　　　Ｇ　　
Δ　ＧＧ　　Δ　１’　　　Ｔ　　Δ　、へＩｌｌ　　
Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　ＭＩ　　Ｉｌｌ゛■゛
７へ　Ｃに’Ｉ”　　八　　〇ＴＣＣ’ｌ″　ＣＣ’ｌ
”、へ　　Ａ　　Ｔ　ｉ”Ａ　ＴＧ　’Ｉ”　Ｔ　ｉ″
　ＣＣＴ’　ＧＣＴ　ＡＴＧ　　ＴＣＣＩｌｌ　　１１
１　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　１１１　　ｌ１ｌＴ　、へ
　ＣＡＡ、へ　　ＧＧＡ　　　ＣＧ　　Δ　　１゛、へ
　ＣΔ　ＧＧハハ（ツバ１．、＋１．ｚ　ｕＬｙｕ　ｕ
ハしハハハしＩＪｂΔ　、へ　ＣＧＣＴ　　　Ｇ　　］
’ＧＣＴ　　　３’Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉ ＴＴＧ　　　ＣＧ、八　　Ｃ５’ ＡＴＧ　　ＧＡ’Ｉ’　　ＣＡＧ　　ＴＡＡ　　ＡＴＧ
　　ＴＴＴｌｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　
Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ′１゛、へ　ＣＣＴ、へ　　Ｇ　　ｉ
″　ＣΔＴＴ　　　’Ｉ”ＡＣＡＡＡＣ：　Ｔ　Ｇ　Ｃ
Ｔ３　’ □ ０　　　　　５′ ＧＣＴ　　ＧＴＧＣＴ　　３’ ＣＧＡＣ５’ ＡＴＧＧΔＴ　　ＧＡＴ　　ＡＡＧ　　ＴＡＡ　ΔＴＧ
Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　１１１　　Ｉｌｌ　　ＩＮ　　Ｉ
ＮＴ　Ａ　ＣＣＴΔ　ＣＴ　Ａ　　’Ｊ”Ｔ’　ＣΔＴ
ＴＴＡＣＴＴＴ　　ＣＣＧ　　ＧＣＴ　　ＡＴＧ　　′
■’ｃｃ　　ｌ”Ｉ″ＧＩｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　
　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　ｌ１ｌＡＡＡ　　　ＧＧＣＣＧ
Ａ　　　ＴＡＧ　　　ＡＧＧ　　　Δ　１へ　Ｃ’Ｔ’
ＣＣＧＧＣＣＴＧ　　ＴＴｉ”　　ＧＣＣＡＡＣｌｌｌ
　　Ｉｌｌ　　ＩＮ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　ＩｌｌΔ
　ＧＧ　　　ＣＣＧ　　　ＧＡＣＡ、へΔ　　ＣＣＧ’
Ｔ”ＴＧ」−記の各配列を別個にプラスミドｐｃＺ＋０
１の〜ｌ　０．２ｋｈ　ＢａｍＨ１−Ｘｈａｌおよび〜
０．６ｋｂＢａｍＨＩ　−１１ｇ１Ａ　ｌフラグメント
にライケートすることにより、それぞれ例示プラスミド
ｒｌｃ７．１０！、１．ｐｃＺ＋０００、Ｉ］ＣＺＩ０
００．ＬＩ）ＣＺ１０６０およびｐｃＺＩ＋２０が組立
てられる。これらのプラスミドは転写さイ１ろことによ
り、第１のペブヂドとｎｅｔ−ｂ　Ｇ　Ｈの両方を暗号
化している単一のポリジストロニックｍＲＮΔをＪ−ｊ
える。 本発明は決して特定の転写活性化配列の使用に限定され
るものではない。何故ならば、ある特定の配列を選択４
−ることは、本発明の機能性（作動性）にとって臨界的
な事てないからである。先に例示したりボタンバク質活
性化配列に代わり得る転写活性化配列には、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ、　　）リプトファン（ｔｒｐ）、Ｅ、ｃｏｌｉ　　
ラクトース（ｌａｃ）、バタテリオファーンλＰ　１．
０１．、バクテリオファーノλＰＲＯＲ１Ｉｌａｃｉｌ
ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ（バチルス・サブチリス）ｖ
ｅｇｅｔａｔ　１ｖｅ（栄養物Ｘｖｅｇ）およびＳ　ｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｚｕｒｅｕｓ（ストレプ）・マ
イセス・アズレウス）ヂオストレブトン耐性（ｔｓｒ）
等の遺伝子の転写活性化配列が含まれろ。また、ｌａｃ
およびｌａｃ転写活性化配列、の如くｌまたはそれ以」
二の転写活性化配列を縦列（タンデム）に配して用いる
こともできる。 −ヒ記配列はすへて、既に確認されているか、または合
成することにより、あるいは既知プラスミドから組立て
ろことができる。 特に、トリプトファン（ｔｒｐ）転写活性化配列はプラ
スミドｐ）（Ｉ　７△４△１のＥｃｏＲｌ　−ＣＣａ　
Ｉ消化によって得ることができる。後述の実施例５の方
法に従って組立てられるプラスミドｐ）（１７△４△１
のＴａｇｌ制限部位は多重性を何するので、予めライゲ
ートしたｐＨｒ　７△４△ＩＥｃｏＲＩ’−Ｈｐａｌル
ミｌフラグメントａｌ−ＴａｇｌフラグメントとをＥＣ
０ＲＩ−ＣＱａＩ消化ｐＢＲ３２２にクローニングする
ことにより、所望のＥ　ｃｏＲＥ−Ｔ　ａｇ■フラグメ
ントを最も都合良く生成させ、増幅させることができる
。得られたプラスミドは〜４゜６ｋｂであり（プラスミ
ドｐＮＭ６０８）、を叩転写活性化配列を含何している
ので本発明の他の実施態様に係るプラスミドの組立てに
有用である。 上記ｔｒｐ活性化配列を含む例示プラスミドは、Ｉ）プ
ラスミドｐ’ＮＭ６０８の〜０．２９ｋｂ　ＥｃｏＲ１
−Ｔａｇ’ｌフラグメント；２）プラスミドｐｃＺＩ０
１の〜Ｉ　Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨｌフラグメ
ント。 ３）プラスミドｐｃＺ１０＋の〜０．６ｋｂ　ＢａｍＨ
１−１４ｇ１ＡＩフラグメント；および４）以下の、同
定されたデオキシリボヌクレオチド配列の内のいずれか
； Ｃ’Ｉ’ＣＴＴＴ　　ＧＣＣＡＡ（〕　ＧＣＴＩｌｌ　
　Ｉｌｌ　　ＩＩＩ　　Ｉｌｌ　　ｌ１ｌＧＡＧ　　Ａ
ＡＡ　　ＣＧＧ　　ＴＴＧ　　ＣＧＡをライゲートする
ことによって組立てられる。 上記のライゲーンヨンにより、それぞれ、例示の〜１０
．８ｋｂ　プラスミドｐｃＺＩ０５．１％ｐｃＺＩ０５
．２、ｐＣＺ　Ｉ　Ｏ６，Ｌ　ｐＣＺ　ｌ　ｌ　２．１
およびｐｃＺＩＩ２．２が得られる。これらのプラスミ
ドは、転写に際し、第一番目のポリペプチドとｍｅｔ−
ｂＧＨとを暗号化している単一のｍＲＮＡを与えるので
、これらもまた本発明を例示するものである。例示プラ
スミドｐｃＺ１０５．１の制限サイト地図を添付の第９
図に示す。 本発明は高度の有用性を有し、事実上、機能的なポリペ
プチドを暗号化しているあらゆるヌクレオチド配列を、
前に例示したｍｅｔ−ｂＧＨの暗号配列と置き換えて用
いろことができる。その様な暗号配列には、ヒト成長ホ
ルモン（ｈＧＨ）、ヒトブレ成長ホルモン（ｐｒｅ、−
ｈ　Ｇ　Ｈ）、ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）、哺乳類成
長ホルモン、鳥類成長ホルモン、成長ホルモン放出因子
、ヒトインシュリンＡ鎖、ヒトインシュリンＢｌ、ヒト
ブロインンユリン、ヒトプレープロインシュリン、ヒト
および非ヒトインターフ−ｒ、　Ｕノ、つ〔ｌキナーゼ
、組織ブチスミノーケノメ、η性化物質、インターＬ）
（キン［ｌ、任怠のポリベブヂトホルモン、Ｉ■）らＨ
，ｌ＋ろボリペブヂト酵素、並ひに研究また（ま商業１
、の価値＆）、９る生物学的に活性なボリベブヂトの任
、仁（のらの、を暗号化している配列か含まれる（たた
し、ニイ１らに限定されろムのではない）。 更に詳しくは、ｈＧＩ（の発現を例示ケろベクターは、
プラスミド１１ｃ７．Ｉｏｌの〜Ｉ　Ｏ，２ｋｂ　Ｆ３
ａｍｌ−１１−Ｘ　ｂａ　！フラクメントとブチスミＦ
　ｐＮ　）／１５７５の〜０　、５　ｆ３　ａｍＨｌ−
Ｆ　＋＋ａＩ）　１１フラグメンｌ−との両省を、式 ％式％ （式中１．へは）゛オキノアデニル、Ｇはデオキンクア
ニール、Ｃはデオキノノトンル、モしてＴはチミジルを
表わ４） て示されるリンカ−配列にライケートケることにより、
組１γてらねろ。得られたプラスミド（ｐＣＺ＋１４０
）は、ｌ）リホゾーム結合部位および、式二ＭＥＴＰＨ
Ｅｒ’ＲＯＬＥＵＧＴ、ＵＡＳＰΔＳＰ （式中、Ｍ　Ｉ＝：　Ｔはメヂオニン、Ｐ　ＨＥはフェ
ニルアラニン、Ｉ）　ＲＯはプロリン、Ｌ　Ｅ　ｔＪは
ロイノン、Ｇ　Ｌ、　Ｕはグルタミン酸、そしてＡＳＰ
はアスパラキノ酸を表わ−４−）で示されるペプチド、
の両者を暗号化しているヌクレオヂド配列の解読フレー
ム内にｒ　、ｃｏｌｉ、　リポタンパク質遺伝子の転写
および翻訳活性化配列、２）上記ペプチドの暗号配列の
解読フレーム内の適当位置に翻訳停止信号；３）上記停
止信号の下流側に隣接し、かつメチオニル−ヒト成長ホ
ルモン（ｍｅｔ−ｈＧＨ）を暗号化しているメクレオヂ
ト配９１１の解読フｌ、　−７、内に翻訳停止信号Ｕ’
　＋　Ｅ　＋、て４．）ｍｅＬ−ｂ　Ｇ　ＬＩ　Ｉｌｉ
号配シリの解読フレーｌ−１内のＪｇ当位置に翻訳停止
信シー）、をそイ１ぞイ１この順番て含有ｊ２ている。 上記のリンカ−配７すｊ」、前述のｌ　Ｌａｋｕｒａら
（＋９７７）およびＣｒｅａら（１９７８）の方法に実
質」−従って好都合に合成４°ろことがてき、またプラ
スミドｐＮＭ５７５出発物質は第１〜４図の工程および
実施例１の方法に従−・て組立てることができる。例示
プラスミドｐｃ７．ｌＩ４０の制限ザイト地図を添イ；
１の第１Ｏ図に示４°。 本明細書中に記した特別な態様として、プラスミドの複
製は、熱誘導性ランチウェイレプリコン（英国特許公開
番号第１．５５７．７７／Ｉ号、およびＵ１＋ｌｉｎ等
、Ｉ　９７９．Ｇｅｎｅ　６：９１に開示）によ−て確
認されろ。３０℃、特に２５°Ｃ以下の温度では、この
レプリコンは細胞当たり約ｌＯ〜１５コピー程度のかな
り低いコピー数に止まる。１ＭＬ度か３７８Ｃ以上に上
昇するとコピーコントロールが解除され、このレプリコ
ンを含むプラスミドＤＮＡは、細胞当たり１０００〜２
０００のコピー故に増幅さイ１ろ１、本明細書中に側車
しノニ特定のランナウＪ−イレプｌｌ　：ｌ：Ｉ　；ｚ
は前述のプラスミドｐ１Ｍ−１′　−Ａ３出発物質中に
含有さイ１ている。 自明の二とだが、本発明はいかなる特定のラン廿ウェイ
レプリコンにも、また特定のコピー数の突然変異体にも
限定されるものでない。その他の誘導可能なランチウェ
イレプリコンまたは高コピー数のレブジー１ンは、適当
な選択に盾ついて得るごとかでき、あるいはＩｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ　ＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｕｍｂｅ
ｒ　ＷＯ８２１０２９０１並びにビットす−（＋（１ｔ
ｔｎｅｒ）お。にびハプネ・ツク（Ｖ　ａｐｎｅｋＸ　
Ｉ　９８Ｉ、）−ン（Ｇｅｎｅ）　　Ｉ　５　：３１９
　）の示した方法に従って組立てろことかできる。更に
、Ｅ、ｃｏｌｉＢａｃｉｌｌｕｓ　、ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓその他適当な微生物宿主細胞内で機能的である
限り、−７１−ランチウェイレプリコンを用いることが
できる。その様なレプリコンの例どして、以下のもの（
ただしこれらに限定さイ１ない）を挙げることができる
Ｉ）ＭＢＩ。 Ｃｏ（Ｅｌ、ＮＲＩ、ＲＫ２、ＲＫｂ、ｐＳＣＩ　０１
、ＲＰｌ、ＲＰ４、Ｆ等からのレプリコンおよび■εｃ
ｏｌｉ、中で複製可能なバクテリオファージ；ＩＩＥＬ
＊ ７、Ｉ）ＥＬＩ０３．５ＣＰ２．５ＣＰ２　等からのレ
プリコン、およびＳ　ｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ内で複製
可能なバクテリオファージ；並びにｐＣＩ　９４、ｐＢ
Ｓｌ、１）ＥＩ９４、ｐＵＢ　Ｉ　Ｉ　Ｏ１ｐ’ｌ”　
＋　２７等からのレプリコン、およびＢａｃｉｌｌｕｓ
内で複製可能なバクテリオファージ。当業者には理解さ
れろことだが、これらのもの、並びに様々なランナウェ
イレプリコンに置き換えることにより、さらに別の本発
明の範囲内に包含される発現ベクターを組立てることが
できる。 本明細書中に例示したＤＮＡ配列やプラスミド類は、そ
の他様々な修飾を行なって使用するこ七ができる。例え
ば、遺伝暗号の縮重に基づき、何らかのアミノ酸に関す
る暗号領域のヌクレオチド配列を他のものと置き換える
ことができ、同様にター中の転写活性化配列と２番目の
翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド数も、適切な翻訳
信号（リポゾーム結合部位および第１番目の翻訳開始信
号および翻訳停止信号）が与えられる限り種々の数て選
択することかてきる。その他、本発明の範囲内で行なえ
る変更には、Ｉ）１またはそれ以上のヌクレオチドを加
えて第１番目の翻訳停止信号の解読フレームを第２番目
の翻訳開始信号に関して相対的に移動させること；２）
解読フレームを保持しなからｌまたは１以上のトリプレ
ットを第１番目の翻訳停止信号と第２番目の翻訳開始信
号の間に配すること、および３）第１番目の翻訳開始信
号と停止信号との間にヌクレオチドトリプレットを加え
ることにより第１番目のシストロン（転写活性化配列と
第１番目の翻訳停止信号の間の領域であって、これらを
含む）の長さを変えること、が含まれる。シストロンの
長さは臨界的ではないが、第１番目のシストロンはアミ
ノ酸２〜２０個を暗号化した比較的短いものであること
が好ましい。 第１番目のシストロンを構成するヌクレオチドトリブレ
ットトは、ｍＲＮＡ内に相捕的な塩基を生成させない様
に、ツノカー（Ｚ　ｕｃｋｃｒ）およびステイーグラ−
（Ｓ　ｔｉｅｇｌｅｒＸ　ｌ　９　Ｂ　＋　、ヌクレイ
ツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）９（１）・１３３）の総説に示
されている原則および外挿法に従って選ばれなければな
らない。その様な相捕的な塩基間の水素結合（ベアリン
グ、ｐａｉｒｉｎｇ）の結果、翻訳の効果を減少させろ
と考えられているステムアンドループ配置およびボール
ディング（ひた形成）が起ころ。最初のシストロンを構
成するヌクレオチドトリブレットけまた、転写に際して
第２の翻訳開始コドンの」１流の適当位置にリボゾーム
結合部位を与えるものであろごとか好ましい。このこと
は、アミノ酸を特定４−ろたけてなく、−緒になって所
望のりポゾーム結合部位を構成４゛ることのてきる、少
なくと６２個のコドンを生成せしめる様なヌクレオヂト
トリプレットを選択することによ−）で実行できろ。 当業者ならば理解し得るが、上記の修飾や変更はすへて
記述の合成法に実質」二従って行なえろ。 従って、本発明は例示の特定のＤＮＡ配列およびプラス
ミドに限定されるものではない。 本発明は更に、機能的なポリペプチドの製造方法を提供
するものであって、 ■）コンピテント細胞を、 ａ）ペプチドまたはポリペプチドを暗号化しているヌク
レオチド配列の解読フレーム内にある転写および翻訳活
性化配列、ここに、このペプチドまたはポリペプチドの
暗号配列は、該ペプチドまたはポリペプチドのカルボキ
シ末端を暗号化しているヌクレオチドトリブレットの下
流側に隣接した位置に翻訳停止信号を有するものである
、と、ｂ）該停止信号の下流側に隣接し、かつ機能的ポ
リペブチ１ζを暗号化しているヌクレオチド配列の解読
フレーム内にある翻訳開始信号、ここに、該機能的ポリ
ペプチドの暗号配列は、該機能的ポリペプチドのカルボ
キシ末端を暗号化しているヌクレオチドトリブレットの
下流側に隣接して翻訳停止信号を有するものである、 を含む選択可能で自己複製可能な組換えＤＮＡ発現ベク
ターーご形質転換し、 ２）形質転換された細胞を遺伝−ｒ−の発現に適した条
件下で倍径することからなる方法を提（ｊ（４−るもの
である。 １−記の方法は、ｍＲＮＡが不安定てあ−・たり、適切
な立体配置を有していなかったり、あるいはりボゾーム
との結合に極めて効果的である様な適切な配列を持って
いない場合に、遺伝子の発現か低レベルまたは皆無にな
るという問題を解決するしのである。即ち、本発明は、
２個のノストロノを含有する１個のｍＲＮＡ転写物を生
成さ且ることによってこの問題を解決するしのである。 本発明ベクターの第１番目のペプチドまたはポリペブヂ
ト暗号配列は第１番目のメノセーノに関４−ロンストロ
ンを含んでおり、それは、転写に際してｍＲＮＡ内にス
テムアントループのご１次構造か形成されることを回避
する様に構成されている。適切なりホゾームとの結合を
阻害し、適切な翻訳および発現を妨げるものであるとさ
れているその様な立体配置は、転写された時に相捕的な
塩基が現われない様なヌタレオヂドを選ぶことによって
避（Ｉられろ。このごとは遺伝暗号の縮重、並びに面記
の原則および方法（Ｚ　ｕｃｋｅｒおよびＳ　ｔｉｅｇ
ｌｅｒ、　１９８Ｉ）の両者に、Ｌっで実施することが
できるので、ごのことによって本発明が制限されること
は殆とない。従って本発明方法は、研究および商業」ユ
の価値を有するすべてのポリペプチドを暗号化している
ＤＮＡの発現にとって事実上有用である。 また、本発明によ４１ば、配列を付加することで不安定
なｍＲＮＡを安定化したり、リボゾームとの結合および
ｍＲＮＡの翻訳開始を妨害する様な配列を除去らしくは
移動させることもできる。 本発明の発現ベクターおよび方法は広範囲の宿主細胞、
例えば■う５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（例えばＥ
．ｃｏｌｉＫ１２、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　Ｉ　２　　ＲＶ
３０８、Ｅ、ｃｏｌｉＫｌ　　２　　　ＨＢＩ　　ＯＩ
　　、　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ　　Ｉ　　２　　　Ｃ６
００、Ｅ、ｃａｌｉ　Ｋ　Ｉ　２　　Ｃ６００Ｒｋ−Ｍ
ｋ−１Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＲＩおよびＥ、ｃｏｌｉ　
Ｋ　Ｉ　２　ＭＭ２９４）、５ｅｒｒａｔｉａおよびＰ
　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの如きグラム陰性の原核微生物
；Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えばＢ　、５ｕｂｔｉｌｉｓ、
１（、Ｌｈｕｒｉｎｇｉｃｎｓｉｓ、ｔ；よびＩ（、ｔ
ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｙａｒＨ；ｒａ（由ｑｎｓ
ｉｓ）わよびｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｔ：ｔ′ｓ　（例え
ば５ｆｒａｄｉａｅ、Ｓ　、ａｍｂｏｆａｃｉｃｎｓｌ
Ｓ　、ｌ１ｖｉｄａｎｓおよびＳｇｒｉｓｏｆｕｃｃｕ
ｓ）の如きクラム陽性のＩｉ　＋＊　ＩＩＩ微生物等に
使用することができろ。本発明の１′−ての態俤か有用
であるが、いくつかのベクターＪＳよび形質転換体が好
ましい。好ましいベクター類にはｐＣＺ１１４、ｐｃＺ
ｌｏｌ、Ｉ、ｐｃＺＩ０５．Ｉ、ｐｃＺ１０５．２、ｐ
ｃＺ１０６．１．ｐｃ７．Ｉｉ２．ｌ、ｐｃｚｌ　ｌ　
２．２およびｐｃＺ１１４０が含まね、また好ましい形
質転換体にはＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　Ｉ　２　　ＲＶ３０８
／ｐＣＺ　Ｉ　Ｉ　４、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　Ｉ　２　　
ｎＶ　３０８／Ｉ）ＣＺＩｏｌ、ｌ、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ
　ｌ　２　　ＲＶ　３０８／ＰＣＺＩ０５．Ｉ　　、　
　Ｅ、ｃｏｌｉ　　　Ｋ　　Ｉ　　２　　　ｆｌＶ　　
３　０　８／ｐｃ７．＋０６．Ｉ、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　
Ｉ　２　１えｙ３０８／Ｉ）Ｃ〕Ｚ　Ｉ　ｌ　２．１．
　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　１１７３０８／ｐＣＺ１１
４．０が含まれる。この好ましいタルーブの内、プラス
ミドｐｃＺＩ１４およびｐｃＺｌｏｌ１並びに形質転換
体Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　Ｉ　２　ＲＶ　３０８．’ｐｃＺ
ｌ１４およびＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　Ｉ　２　ＲＶ　３０８
／ｐＣ７，Ｉ　０１　、１が特に好ましい。 当業者には、自明のことだが、本発明の発現ベクターお
よび方法は、適当な宿主微生物を形質転換し、標準的な
発酵条件下で外来性タンパク質を発現ざＵ′るのに用い
ることができる。次いて生産された外来性タンパク質を
得られた発酵ブロスから常法通り単離する。以下に実施
例を挙げ本明細書中で開示した発明の詳細な説明する。 本発明の組立てにお（Ｊる実際の手法に関する説明を、
随時記述した。 ！ｍ％Ｉｌ−プラスミドＩ）ＮＭ７８９Ｂの組立てＡ　
プラスミドｐＫＢＮＯ２１およびそのＸｂａ１１３ａｍ
Ｈｌフラグメントの組立て プラスミドｐＫＥＮＯ２１（第３図における＋　０６）
のＸ　ｈａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩによる開裂で得られた−
５．１ｋｂフラグメントを出発物質として用いた。プラ
スミｆ；’ｐＫＥＮ　Ｏ２１は、ｐＫＥＮＩＩＩ（第１
図におけるｌ　０１　（Ｌｅｅら、１９８１、Ｊ、　Ｂ
ａｃｔ、　　１４．６：８６１−８６６およびＺｗｉｅ
ｂｅｌら、Ｉ　９８＋。 、１．Ｂａｃｔ１４５：６５４−６５６に記載）であつ
て、寄託微生物Ｅ、ｃｏｌｉＣＣ６２０（ＮＲＲＬ寄託
番号＋５０１１）から得ることのできろプラスミドてあ
り、Ｅ、ｃｏｌｉのりボタンバク質遺伝子を含有する〜
２　、８　ｋｂフラグメントを何する〕の誘導体である
。ごのフラグメントに関しては、Ｎａｋａ−ｍｕｒａお
よびＩ　ｎｏｕｅ（１９，７９、Ｃｅ１ｌｌ　８：Ｉ　
Ｉ　Ｏ９−１１１７）が言及している。ｐＫＥＮＯ２１
ては、ｐＢＲ３２２の単一のＥｃｏＲＩと５ａｌｌ制限
部位との間の６５０　ｂｐ（塩基対）配列がＥ、ｃｏｌ
ｉのりボタンバク質遺伝子からの配列で置換されている
。 このリポタンパク遺伝子配列は、該リポタンパク質遺伝
子の最初のトリプレット（メチオニン）の」二流側に、
プロモーター、５′非翻訳領域、↑５よびリボゾーム結
合部位を含む４６２ｂｐのΔｌａｌフラグメントを含有
している（Ｎ　ａｋａｍｕｒａおよびＩ　ｎｏｕｅ、＋
９７９）。単一のＸ　ｂａ　Ｉ制限部位はメチオニン翻
訳開始信号の１６ｂｐ前方、リボゾーム結合部位内に位
置している。構造遺伝子の翻訳路１１−コドンから１０
５ｂｐ上流に位置しているＰｖｕ［制限部位は、合成り
ＮＡリンカ−（５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ３’、Ｃｏ１
１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ供給）を付
加することにより、ＢａｍＨＩ制限部位に変換された。 このＢａｍＨ１部位に続いて、リポタンパク質の最後の
３５アミノ酸に関する暗号配列、翻訳終止信号、および
メツセンジャーＲＮＡの３′非翻訳領域に相当する配列
がある。プラスミドｐＫＥＮ。 ２１はリポタンパク質遺伝子と無関係な、約８５０ｂｐ
の余分な配列を、Ｅ、ｃｏｌｉ染色体中の、上記遺伝子
から下流位置に含有している。これらの配列は、最初に
遺伝子を単離するために用いた方法および制限酵素部位
に起因して含有されてしまったのである。 第１．２および３図に従って、プラスミドｐＫＥＮＯ２
＋は１）ＫＥＮＩＩＩから、以下の方法で導かれる・ 約５０μ９のｐＫＥＮｌｌ＋（第１図における１０１）
を、３０ＣＪｔｔＱの緩衝液（２０ｍＭ）リス−ＨＣｌ
。 １）Ｈ７，４、Ｉ　ＯｍＭＭｇＣＬおよび６ｍＭβ−メ
ルカプトエタノールを含有）中で２５単位のＨｐａｌｌ
制限酵素により、３７℃で２時間、消化する。この混合
物をフェノール・クロロホルム（５０：５０）の混合物
３００μｅて２回抽出し、回収した水層に２．５容量の
エタノールとＯｌ容量の３Ｍ酢酸すトリウムを加えて沈
殿させろ。ＤＮ’Ａペレットを１００７ｚＣの電気泳動
用緩衝液に溶かし、５％ポリアクリルアミドゲル（アク
リルアミド・ビス化合物の比率は、明記しない限り、全
てのゲルに関して２９：１である）上で分画する。この
ゲルを、臭化エヂジウム０．５μｇ／ｌｌＱ、を含有す
る溶液中て染色し、長波長の紫外光によってバンドを検
出する。 ９５０ｂｐのバンドをゲルから単離し、透析袋中て電気
溶離して回収オろ。フェノール／ＣｌＩＣ１，抽出およ
びエタノール沈殿に付した後回収したＤＮＡ（約２．５
μｇ）を２５μＱのＴＥＮ（１０ｍＭＮａＣ１、１０１
．ｍＭ）リス・ＭＣＩ（ｐＨ７，４）およびＩ　ｍ’Ｍ
エヂレンジニトリロ四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ、ｐｌ
（８，０））に溶かす。 約２μ９の９５０　ｂｐＨｐａ　ＩＩフラグメノトを、
２００μＱの緩衝液（５０ｍＭｌ４ａ−ＣＩ、６ｍＭ）
リス・ＨＣＩ（ｐＨ７、６）、６　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ
　２および６ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有）中
で、３７℃において２時間、ＡＩＬＩＩ制限酵素で消化
する。このＤＮＡをポリアクリルアミドゲル上で分画し
て生成された４６２ｂｐ　　Ａｌｕｌフラグメントを回
収し、前述の方法で精製する。この４６２ｂｐ　　ＡＩ
ｕＩフラグメント（約ｌｌ１ｉ＋）を、１５０ピコモル
のリン酸化されたＥｃｏＲＩリンカ−（５°ＧＧＡＡＴ
ＴＣＣ３’　：Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ供給）と２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有す
るｌＯμＱのＴ４１）　Ｎ　Ａリガーゼ緩衝液（６６ｍ
Ｍ）リス・Ｈｃｌ（ｐＨ７６）、Ｉ　ＯｍＭＭｇＣｌｘ
、ｌ０ｍＭジチオトレイｌ−−ルおよび０．４ｍＭＡＴ
Ｐ）に溶かす。４°Ｃで１６時間インキュベートした後
、この混合物を６５℃で１０分間加熱し、ＥｃｏＲＩ緩
衝液（１００ｍＭトリス・ＨＣＩ（ｒｌＨ７，２）、５
０ｍＭＮａＣ１゜１０ｍＭ　ＭｇＣｌ、および６ｍＭβ
−メルカプトエタノール）と４０単位のＥｃｏＲＩ酵素
を加えて１００μρに希釈する。３７℃で２時間処理し
た後、この試料を常法通りフェノール／ＣＨＣｌ３抽出
およびエタノール沈殿に付す。次いでこのＤＮＡを、０
　、１−！Ｉ’、位のＴ４１）　ＮΔリカ　セとＯ，Ｉ
７１＠のｌ）　Ｂ［え３２２（第１図におけろ１０２、
■εｃｏｔえＩて線状にした後、アルカリ性ホスファタ
ーゼ−ζ処理し〕二らの）０．ｌ１ｚｙを含イｊするｉ
’　４１１　ＮΔリカ−セ緩衝液に溶かす。４℃で１６
時間ライゲーノヨノした後、得られたＩ）　Ｎ　Ａを用
いて１５．ｃｏｌ山旧朱Ｋ　１２１−（１３１０１を常
法通り形質転換−４−ろ。形質転換体をテトラサイタリ
ンｌ　２１１’ｌ／　ｗｅを含んた家人平板−１−で選
択し、重速アルカリ性抽出法（〕−ンボイム（Ｂ　ｉｒ
ｎｂｏｉｍ）および１・−リイ−（１）（由・）、ｌ９
７９、ヌイルイック・アンット・リザ　ヂ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ｔｊｃｓｅａｒｃｈ）７：１５１３
−１５２３記載）によ−、て耐性コロニーからプラスミ
ドを単離する。４６６ｂｐＸｈａｌ　＝Ｂａｍ）ｌ　ｌ
フラと７メントを含有するプラスミド（第１図にお（ｊ
ろｌ０３）を選択し、−ト記の１．程における出発物質
と４−ろ。 ごのプラスミド（第２図における１０３）約２　ｌｉ７
を５０μＣの１−１ｉｎｄＩ［１１衝液（６０ｍＭ　　
ＮａＣｌ、１０ｍＭ）リス・ＨＣＩ（ｌｌｌＨ７，４）
、ｌ　Ｏｍｆ〜４　ＭｇＣｌ２および６ｍＭメルカプト
エタノール）中で、■］１ｎｒ１１１１酵素２千位によ
り、３７℃で１時間、消化−４−ろ。フエ、ノ　ル／Ｃ
ｌＩＣ１，，抽出およびエタノール沈殿の後、Ｉ）　Ｎ
　Ａを２００μＣの緩衝液（３００＋ｎＭ　　ＮａＣ，
Ｉ、３０ｍＭ酌酸す１・すｒ゛ツムｐＨ４，２５）、ｌ
　ｍＭ　　Ｚ、　ｎＣＩ、おＪ−び２００単位のＳｌヌ
クレア−セ（Ｍ　ｉ　ｌｃｓ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ供給））に溶かず０１５℃で１時間処理しｈ後、フエ
２７−ル／ＣＨＣｌ　３抽出して反応を止め、」、タノ
ール沈殿に付す。得らイ１だＤＮＡを２ピコモルのりん
酸化されたＢａｍ１−１１リンカ　（５°ＣＣＧ　Ｇ　
Ａ　Ｔ　ＣＣ：　Ｇ　Ｇ　３°Ｃｏ１１ａｂ−ｏｒａｔ
　ｉｖｅ　　Ｒｐｓｃａｒｃｈ供給）と２千位のＴ４Ｄ
ＮＡリカ−セを含有４′ろＴ４ＤＮＡリガ−セ緩衝液１
０μθに溶か４−ｏ４°（：て１６時間処理した後、反
応混合物を６５℃ｌＯ分間加熱してリガーゼを不活化し
、次いてＢａｍ１（ｌ酵素２０単位を含有するＢａｍ１
−＋　！緩衝液（１５０ｍＭＮａＣ！、２０ｍＭｈリス
・ＨＣｌ（ｐＨ８，０）Ｉ　０ｍＭＭｇＣｌ、および６
ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有）で１００μθに
希釈する。３７°Ｃて２時間処理（また後、この混合物
を１％アガロースゲル上で精製する。このゲルを染色し
、凍結処理の後、大きい方の一１ラグ７ンＩ・（〜４．
５ｋｂ）を溶離、回収し、次いて一７Ｊノル、／ＣＩ−
Ｉ　ＣＩ３抽出およびＪ、夕７ノ　ル沈殿によって精製
４−る。回収したフラグメン１〜はｒ（ａｍ　Ｉ−１１
帖着末端を有しており、これをＯＩ単位のｌ゛４１）　
ＮＡリガーゼを含むＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリカ−セ緩衝液
２０μＱに溶かず。４℃で１６時間処理した後、このＤ
ＮＡを用いてＥ、ｃｏｌｉＩ−（ＨＩ　ＯＩを形質転換
する。 形質転換体を１００μｇ／ｙｐｔ１にお（ｊろアノピノ
リン耐性（Ａｐ７）に関して選択し、ｌＯμＭＰ、ｌ！
のテトラザイクリンに対する感受性（Ｔｃ”）に括づい
てスクリーン４゛る。Ａｐγ’Ｉ”ｃ”を示−４゛コ（
！ニーから前記Ｂ　ｉｒｎｂｏｉｍ法で調製し）ご数個
のプラスミドを、Ｈｉｎｄｌ１１部位の不存在と単一の
Ｉ３　ａｍ　１１１部位の存在とに関して調へろ。Ｅｃ
ｏＩ−ｔｌ、５ａｉｌ連続ｌ肖化（こより４．６６　ｂ
ｐフラグメントと３０５ｂｐフラタメントを得る。これ
らの特徴を自］°ろプラスミド（第２図における１０４
）を選択し、次いで、ＩＩ）ｐブＯモーターの上流に位
置４′ろＥＣｏＲｌ部位を１−１ｉｎｄｌｌｌ制限部位
に変換すべく、修飾４′ろ、。 ２μ９のプラスミド（第２図にお（Ｊる１０４）を１０
０１ＩＱのＥｃｏＲ１緩衝液中で、３７℃において１０
分間、Ｅ　ｃｏＴＺ、’　Ｉ　Ｏ、２単位て消化づ＝る
。６５０Ｃて１０分間加熱４゛ろことにより反応を停止
１−７た後、フｆ７ノ　−ル／　ＣＨＣｌ　３抽出、お
よびエタノール沈殿に付し、ｉ′４られたＩ）　Ｎ　Ａ
を１０００千位／ｍＱのＳｌヌクレアーゼを含有する２
００Ｉｌ１２のＳ１ヌクレア−セ緩衝液に溶かし、１２
℃で１時間反応させろ。フェアノール、”　ＣＩ”（Ｃ
Ｉ　３抽出して反応を止め、エタノール沈殿に付す。得
られたＩ）　Ｎ　Ａを２０ピコモルのりん酸化さイ１人
二ｆｌｉｎｄ！Ｉ！リンカ−（５’ＣＣＡＡＧＣＴＴＧ
Ｇ３°、Ｃｏ１１ａｂｏｒａＬｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ
供給）と２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含自オろＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ緩衝液１０μＱに再ｅｆＡずろ。４°（：
て１６時間処理した後、この混合物を６５°Ｃで１０分
間加熱し、ｌＯ中位の１−１ｉｎｄ■酵素を含有するＨ
ｉｎｄＴＩＩ緩衝液により１５０μＱに希釈して３７℃
で２時間インキュｌ＼−用・し、次いて１％アカ［Ｊ　
スゲル上で分画する。最大のバンド（１箇所切断された
プラスミドに相当）を常法通り回収して精製し、Ｔ４リ
ガ＝−ゼ０．２単位を含有するＴ４リガーゼ緩衝液２０
　Ｉｌρに溶かし、４℃で１６時間インキュへ−トシた
後、Ｅ、ｃｏｌｉＨｒ３１０１の形質転換に用いる。ア
ノピンリン耐性に関して形質転換体を選択１２、単離し
たプラスミドを制限酵素分析によって常法通り分析する
。 ５００ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩフラグメン
トを有するプラスミド（第２図における１０５）を選択
し、ｌｐｐ遺伝子の３°領域付加物のためのクローニン
グベクターとして用いる。 約２）ｔｇのプラスミド（第２図におｌ（ＭＣ＋１０５
）を５０μｍ１！の５ａｌｌ制限緩衝液（１５０ｍＭＮ
ａＣ１，６ｍＭトリス−［−１ＣＩ（ｐＨ７，９）、６
ｍＭＭｇＣｌ、および６ｍＭβ−メルカプトエタ、／−
ル）中で、５ａ１１２単位により、３７℃で１時間消化
し、ＢａｍＨＩ２単位を含むＢａｍｌ−１１１衝液中て
１５（］μσに希釈する。３７℃で１時間処理した後、
アルカリ性ホスファターゼ２５単位を加え、次いて６５
℃において１時間、インキコベーソヨンを続（Ｊろ。 目的物フェノール／ＣＨＣｌ３抽出、エタノール沈殿に
付し、ＴＥＮに溶かして１ｐｐ３″フラグメントのため
のクローニングベクターとして用いる。 ＋ｐｐ３’領域を含むフラグメントを得るために、ｐＫ
ＥＮｌ　１１（第３図における１０１）を２００μ夕の
Ｈｐａｌ緩衝液（２０ｍＭＫＣＩ、ｌ０ｍＭトリス・Ｈ
ＣＩ（叶１７．４）、Ｉ　ＯｍＭＭｇｃ１２および６ｍ
Ｍメルカプトエタノール）中で、Ｈｌ）ａｌｌＯ単位に
より、３７°Ｃで２時間消化する。フェノール／ＣＨＣ
ｌ３抽出、エタノール沈殿の後、得られたＤＮＡを２０
ピコモルのりん酸化された５ａｌＩリンカ−（５’ＧＧ
ＴＣＧＡＣＣ３°、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ供給）とＴ４ＤＮΔリガーゼ２単位を含ん
だＴ　４１）　ＮΔリガーゼ緩衝液１０７ｚ（に溶かし
、次いて４℃で１６時間インキコベートする。６５°Ｃ
て１０分間加熱してリガーゼを不活化する。得られた物
質を５ａｌｌｌＯ単位を含んだ５ａｉｌ緩衝液てｌ００
７ｚ（ｉに希釈し、３７℃で１時間インキユヘートした
後、ＰｖｕＩＩ制限酵素ｌＯ単位を含んたＰｖｕｎ緩衝
液（６０ｍＭＮａＣ１，６ｍＭ）リス・ＨＣｌ（ＩＩＩ
Ｔ−１７，５）、６ｍＭＭｇＣＬおよび６ｍＭメルカブ
トエタ７ノ−ル）中で３００μＱに希釈ケる。３７℃で
１時間処理した後、ＤＮＡを５％ポリアクリルアミドゲ
ル」二で分画する。約０．５ｔｉｆｌの９５０ｂｐフラ
グメントを回収して精製し、Ｔト〕Ｎに溶かす。このフ
ラグメント０２μりを２０ピコモルのりん酸化されたＢ
ａｍ［−１１リンカ−（５’ＣＣＧＧＡ１”　ＣＣＧ　
Ｇ　３　’、Ｃｏ１１ａｂｏｒａＬｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａ
ｒＣｈ供給）および−Ｔ　４１）　Ｎ　Ａリガーゼ２弔
位を告白４〜ろ１゛４ＤＮＡリカーゼ緩衝液中で２０μ
Ｑに希釈１２．４℃て１６時間イノキコベー　トする。 次いて、得られたＤＮＡを６５℃で１０分間力［１熱し
、ＢａｍＨＩ２０単位を含んたｒ３　ａｍｌ−１１ＦＪ
Ｕ衝液中て１（１０Ｉｚｅに希釈して３７°Ｃて２時間
インキコ”：　−１−１，た後、５％ポリアクリルアミ
ドゲルＦで分画して過剰のリンカ−分子を除く。得られ
た、＋３ａｍＨｌおよび５ａｉｌ粘着末端を有する９５
０ｂｐフラグメントを常法通り精製し、前述のクローニ
ングヘクタ−０゜２１ｔ９とＴ４ＤＮＡリガーゼ０２単
位とを含有−４゛るＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μＱ
に溶かす。 ４℃で１６時間インキコヘーンヨンした後、このＤＮＡ
を用いてＥ、ｃｏｌｉＫ　ｌ　２ＨＢ　Ｉ　ＯＩを形質
転換オろ。アンピノリン耐性の形質転換体からプラスミ
ドを調製し、Ｓ　ａｔ　Ｉ　−Ｂａｍ１−１１フラグメ
ントについて常法通り分析する。得られた所望のプラス
ミド（〜５．２ｋｂ）を１）ＫＥＮＯ２１（第３図にも
（Ｊる１０６）と称する。 １０７ノ９のｐＫＥＮＯ２１を３７°Ｃにおいて、２０
０μ夕のＸ　ｈａ　Ｉ　／　Ｂ　ａｍＨＩ緩衝液（＋　
５０ｍＭＮａＣ１、ｌ０ｍＭ１・リス−ＨＣＩ（１１Ｈ
８）、ｌ０ｍＭＭｇＣｌ、および６ｍＭメルカプトエタ
ノール）中で、１０１．単位のＢａｍ１−１１により、
１時間、次いで１０単位のＸｂａｌに、１、す、更に１
時間（３７°Ｃ）消化する。 次いて、所望のＸ　ｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ
をアルカリ性ホスファターゼ２．５単位により、６５℃
で１５時間処理し、フェノール／ＣＨＣｌ３抽出してエ
タノール沈殿に付して集め、以後の使用に備えてＴＥＮ
５０μρに溶かす（第３図における１０７）。 Ｂ　プラスミドｐＮＭ５７５の組立て プラスミド阻ｒｐＥＤ５０ｃｈＧＨ８００（第４図にお
ける＋０８、マノセル（ｔｖＴａｒｔｉａｌ）ら、ｌ９
７９、ザイ上ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０５　：６０２
−６０７に記載〕を、ヒト成長」：ルモン遺伝子部分の
暗号配列を含有するＤＮＡフラグメントの供給源として
用いた。このフラグメントは合成的に組立てることもで
き（イタクラ（Ｉ　ｔａｋｕｒａ）ら、１９７７、およ
びフレア（Ｃｒｅａ）ら、＋９７８）、あるいはり゛ノ
ドマン（Ｇ　ｏｏｄｍａｎ）ら（＋９７９、メソッド・
イン・エンザイモロノ−（Ｍｃｔｈｏｃｌｓ　ｉｎ　ｒ
すｒｖｔｙｍ。 ｌｏｇｙ）６８　ニア　５−９０）の示しノー周知の方
法論に従い、ヒト脳−ド垂体から、ヒト成長ホルモンを
暗号化しているｍＲＮＡを単離する方法によ−、てし得
ることができる。プラスミｌ”ｐｔｒｐＥ　ｌ）　５０
　ｃｈＧＨ３００のヒト成長ホルモン遺伝子部分は、該
遺伝子の翻訳終止コＩ・ンから６ｂｐ下流１ゴ１１−の
Ｓｍａｔ制限部位を含有している。この部位を、以■ｚ
の方法でＩ３ａｍ０１部位に変換した。即ち、このプラ
スミｌ”　６　ｔｔ　ｙを、２００μρのＳｍａｌ制限
緩衝液（１５ｍＭ＋−リス何−＋ｃ＋（ｐｉ−＋ｓ、Ｏ
）、６　ｍＭＭｇｃ　Ｉｔ、１５ｍＭＫｃＩおよび６ｍ
Ｍβメルカプト工４タノー＋１．、　）中で３７°（゛
において１５時間、Ｓｍａ１６１ｉ位で消化した。消化
完ｒ後、フェノール／ＣｌｌＣｌ。 抽出を行い、エタ７）−ル沈殿によってＤＮＡを回収（
２、次いてｉ’　Ｅ　Ｎ　２４μρに溶かした。１゛４
ＤＮＡリガ一ゼ２単位を含むリガーゼ緩衝液ｌ６ＩＩＱ
中に−１−記の消化プラスミド０５μｇ（０２ピコモル
となる）を入れ、４０ピコモルのりん酸化されカニＢａ
ｍＨＩアダプターフラグメツ１−　（Ｃｏｌｌａｂｏｒ
ａｔｉｖｅ　　１ｔｅｓｅａｒｃｈ供給）を加えた。こ
の混合物を２２℃で２時間、４℃で１６時間インキコヘ
ー　トし、更に６５°Ｃで１０分間加熱した。ＢａｍＩ
−（１制限酵素で常法通り消化することにより、Ｂａ１
Ｉｌ■］Ｉ粘着末端を生成させた。この酵素は該リンカ
−配列およびクローンされたヒト成長ポルモンｃＤＮＡ
配列の開始部分にあるＢａｍＨ１部位の雨音を開裂する
。こうして得たＢａｍＨＩ粘着末端を有する６９１ｂｐ
フラクメントを６％ポリアクリルアミドケル上で分離し
、次いで常法通り回収した。回収したＤＮＡフラグメン
トを（緩衝液２０μσ中でＴ４　ＤＮＡリガーゼ０２単
位により、前記の条件「において）、＋３　ａｍｌＩｌ
消化およびアルカリヤ１ポスフアタ　材処理を施したｐ
ｒＮ’３２２ｃ第４図にお（」ろＩｏ　２）０．２μｇ
（こライザー　トシノニ。４℃て１６時間処理した後、
この物質を使用し、ウニ。 ノノンク（Ｗｃｎｓｉｎｋ）ら（＋９７４、セル（Ｃｅ
ｌｌ）３３１５−３２５）の方法に実質Ｌ　１ｊＬ−３
て、■すＣ０１１閑株、■Δ２２１　（ＮＲＲｌ、、、
　Ｎｏ、　＋３１５０　］　４）を形質転換した。形質
転換体をアンビンリン１１００ｔ１／ｌｌＱを含む寒天
＝１１板１−て選択し７ノご後、常法通りプラスミドを
単離し、制限酵素分１１↑ｊｌｉ４ひに電気／ノに動分
析により、同定１刀こ。所望のプラスミド（ｐＮＭ５７
５と呼称、第４図にお（）る１０９］ｊ、約７００ｂｐ
のＢａｍＨｌフラグメントをｒ＜−６して）ｊｌ）、こ
れを以後の使用にｆｉｉｉｉえて常法通り増幅さＵノこ
。 Ｃプラスミｌ”ｐＮ　Ｍ　７０２の組立ど成熟ヒト成長
ホルモンのＤＮＡ配列は、第１番１」のヌグレオヂトか
ら４７ｈｌ）の位置に１個のＦｎｔ＋Ｄ　１１部位をＭ
　４−ろ。２５７１ｇのｌ）Ｎ　Ｍ　５７５をＲａｍ＋
−＋　ｌ　’ＩＵ衝液中てＢａｍ１ｌ　ｌ　２５　Ｑｉ
位により、３７℃て１時間消化した。６％ポリアクリル
アミドケルからｒ３ａｍｌ−１ｌ粘着末端を有する６　
９１ｂｐフラクメントを常法通り単離し、精製した。精
製後、じ／３の該フラグメント（プラスミド８μ７に相
当）を１００ｕＱのＦｎｕＤＩｌ緩衝液（６ｍＭＮａＣ
１，６ｍＭトリス弓（Ｃ１（ｐＨ７，４）、６ｍＭＭｇ
ＣＩ２および６ｍＭβ−メルカプトエタノール）中にお
いて、ＦｎｕＤ１１２．５単位により、３７℃で１５時
間消化（７ｋ。６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳
動し、標亭的な回収方法に従って、遺伝子の後方の、１
７５アミ２）酸の暗号配列を含有（２、翻訳終止信号が
後続している５３８ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離し
た。７ １ｐｐブロモ　ター領域とヒト成長ホルモンの暗号領域
とを結合させるために、ホスホトリエステル法によ−・
てく重鎖ＤＮＡフラグメント（第５図＋、：　Ｊ’；　
Ｌ＋る１１０）を合成した。この二重鎖ＤＮＡフラグメ
ント（第５図における１１０）は、以下に示す配列を有
゛ケろ Ｘｂａｌ ５　°　　　ＣＴ　Δ　ＧＡＧＧＧＴ、へ　Ｔ　′Ｆ　
Ａ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　−３’　　　　　　　　ＴＣ
ＣＣＡＴΔΔＴＴ　Ａ　ＴＴ　Ａ−ＧＴＴＣＣＣＡＴＴ
ＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴ−１１１１１１１１１１１
１１１’１ｌｌｌｌｌｌｌＣＡ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　
Ａ　Ａ　ＣＣＴ　Ａ　ＣＴ　Ａ　ＣＴ　ＡＣＴ　Ａ　−
Ａ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＣＣＡ　Ａ　ＣＣＡ　Ｔ　ＴＣ
ＣＣ’Ｉｆ”　Ｔ　Ａ　Ｔ−’Ｉ’　Ｔ　ＣＡ　Ａ　Ｇ
　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　ＡＡ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ａ
ＡＴＡ−ＣＣΔＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧＣＴＡ
Ｔ−Ｇ　Ｇ　Ｔ　ＣＣＧ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　ＣＴ　
Ｇ　Ｔｉ”　Ｇ　ＣＧ　Ａ　Ｔ　ＡＧＣＴＣＣＧ　　３
’　　　ＦｎｕＤＩ１ＣＧΔＧＧＣ５’ このフラグメントは認められている方法論、ホスホトリ
エステル法に従って以下のセグメント１）ＣＴΔＧＡＧ
ＧＧＴΔＴ ２）ＴΔＡＴＡＡＴＧＴＴＣＣ ３）　ＣＡ　Ｔ　’Ｉ’　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ
４）ＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＣ ５）ＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣ ６）ＴＴΔＴＣＣＡＧＧＣ ７）ＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧ ８　）　ＣＴ　ＡＴ　Ｇ　ＣＴ　ＣＣＧ９）ＣＡＴＴＡ
ＴＴＡＡＴＡＣＣＣＴ ｌｏ）ＡＴＧＧＧＡＡ ＋Ｉ）ＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡ １２）ＧＧＴＴＧＧＧＡＡ １３）ＧＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴ ＋４）ＧＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＴ ＋５）ＣＧＧＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＴ を調製し、それによって製造した。 に記の如く調製したセグメントを使用し、Ｔ４リガーゼ
を触媒とする結合反応を、以下の如く段階的に行った・ ａ）５′−非りん酸化セグメント１を５°−りん酸化セ
グメント２に、５°−りん酸化セグメント９の存在下、
Ｔ４リガーゼを用いて結合させ、ＤＮＡ二重鎖構造１を
得た（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、１９７９、メッソド
・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６８　：Ｉ　Ｏ９−１５１）
。 この二重鎖構造を、１５％ポリアクリルアミドゲル上、
プレパラティブーゲル電気泳動によって単離しノこ。 ｂ）　　５′−りん酸化セグメント３を５°−りん酸化
セグメント４に、５′−りん酸化セグメント１１の存在
下、Ｔ４リガーゼを用いて結合さ且てＤＮＡ二重鎖構造
２を得、次いてこれを１５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で精製した。 ｃ）５゛−りん酸化セグメント５を５′りん酸化セグメ
ント６に、５゛−りん酸化セグメント１２および１３の
存在下、Ｔ４リガーゼて結合させてＤＮＡ二重鎖構造３
を得、次いでこれを１５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動て精製した。 ｄ）５゛−りん酸化セグメント７を５°りん酸化セグメ
ント８に、５゛−りん酸化セグメント１４および５′−
非りん酸化セグメント１５の存在下、Ｔ４リガーゼで結
合させてＤＮＡ二重鎖構造４を得、次いでこれを１５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。 ｅ）次いでＤＮＡ二重鎖構造２．３および４をＴ４リガ
ーゼで結合させてＤＮＡ二重鎖構造５を得、次いでこれ
を１５％アクリルアミドゲル電気泳動て精製した。 ｆ）５゛−りん酸化セグメント１０１．とＤＮＡ二重鎖
構造５を、′ｒ゛４リカ二ゼの存在下、ＤＮＡ二重鎖構
造１に加えた。得られたＤＮＡ二重鎖構造（第５図にお
ける＋１０）を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって精製した。次に、このＤＮＡ二重鎖構造を、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナ−Ｐ３２ ゼと〔γ　　　）ＡＴＰとにより、確立されている方法
に従って酵素的にりん酸化した。 発現プラスミドｐＮＭ７０２は、プラスミドｐＫ、ＥＮ
Ｏ２１（第５図における１０７）のＸｂａＩ　−Ｂａｍ
ＨｌフラグメントＯｌピコモル（０，４７ｚｙ）、合成
りＮＡフラグメント（第５図における＋１０）０．０２
５ピコモル、および５３８ｂｐフラグメント（第５図に
おける１０９）０．３ピコモル（０，０８μｇ）をライ
ゲーンヨン用緩衝液２４μρ中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
１５単位を用いて結合させることにより、組立てた。４
℃で１６時間インキュベートした後、この混合物を用い
てＥ、Ｃｏ１１ＪＡ２２１を前記の如く形質転換した。 形質転換体を１００７Ｂ／Ｍρのアンピシリンを含んへ
寒天平板して選択し、所望の発現プラスミドの好ましい
供給源として常法通り培養した。 ヒト成長ホルモンの発現を標準的なラジオイムノアッセ
イ法（Ｔｗｏｍｅｙら、１９７４、ＣＣ１１ｎＣｈｅ、
　　２０：３８９−３９１）によ−・て検出したところ
、細胞当たり、少なくとら２百万分子、存在することが
分かった。 Ｄ５プラスミドｐＮＭ７８９の組）：Ｔ、てヒト成長ホ
ルモンのための発現プラスミドであるプラスミドｐＮＭ
７０２（第６図における１１１）を、ＭｅｉＰｈｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｉ、ｅｕΔｓｐ−△５ｐＡｓＴｌ−ＡＳ＋）しｙ
ｓ−ｂＧＨのための発現プラスミドの組立てにおける出
発物質として用いた。 プラスミドｐＢＰ３４８（第６図にわ（（ろ１１２、Ｍ
ｉｌｌｅｒら、ｌ９８０、ｊ　、　　Ｂ　ｉｏｌ、　　
Ｃｈｅｍ、　　２５５７５２１〜７５２４に記載）を、
ウシ成長ホルモン遺伝子の部分的な暗号配列を含む２つ
のＤＮＡセグメントの供給源として用いた。このプラス
ミドは、ｐＢＲ３２２の■ンｓｔｌ制限部位に８３１ｂ
＋’）のウシ成長ホルモンの暗号配列がり［１−）され
たちのである。Ｍｉｌｌｅｒらの方法以外に、このウシ
成長ホルモンのための配列は、合成法（Ｉ　ｔａｋｕｒ
ａら、１９７７、およびＣｒｃａら、ｌ９７８）あるい
は、今日では日常的に行なわれているＧ　ｏｏｄｍａｎ
ら（１９７９）の、ウソの脳下垂体から単離したメソセ
ンジャーＲＮＡを用いる方法によって得られる。 ヒト成長ホルモンの暗号配列とウシ成長ホルモンの暗号
配列とは非常によく似ており、多くのポモロノーを示す
。ウシ成長ホルモンのための発現プラスミドを組立てる
上で特に有用なフラグメンｔ−ｉ、ｔ、　Ｐ　ＶＵ　Ｉ
Ｔ制限酵素消化によって生成したフラグメントである。 生成したフラグメントの大きさは、ヒト成長ホルモンの
場合は４９７ｂｐ出あり、ウシ成長ホルモンの場合は４
９４　ｂｐであ）で、こ１１１ら両配列の、同じ解読フ
レーム内に、対応する制限部位が現れる。 ｐＮＭ７０２（第６図にお番」るＩ　Ｉ　Ｉ）Ｉ　Ｏμ
７を、Ｐｖｕｆｌ緩衝液（６０ｍＭＮａＣＬ　６ｍＭ　
トリス・Ｉ（Ｃ１（ｐＨ７，５）、６　ｍＭ　Ｍ　ｇ　
ＣＩ　ｖおよび６ｍＭβ−メルカプ）・エタノール）中
てＰｖｕｌｌｌ中位により、３７°Ｃにおいて１０分間
部分〆（”ｊ化シｊ−０６５℃で１０分間加熱して反応
を停止１゛、さｕ−ノニ後、ＤＮＡをアルカリ性ホスフ
ァターゼで処理し、フラグメントを１％アカロースゲル
１−で分離させろ１．４９７ｂｐのＰＶＬＩ１１フラタ
メントを失ったＩ）ＮΔに相当′４−る大きさの線状Ｄ
　Ｎ　Ａフラグメント（第６図にお（トろ１１３）（切
断部位が１個のブチスミｌＳよすしやや

【νく移動する
）を常法通り分離して精製し、中間体プラスミド（第６
図におけるｌ１１）の組立てに用い７こ。 プラスミドｐＨＰ３４８の４９４ｂｐＰ〜□ｕｌｌフラ
タメノ１−ｍｌ：、このプラスミドを・、Ｐｖｔ＋　Ｉ
ｉ　ｌ　（１中位を含ＴＩ’　ｔろＰ　ｖｕ　ＩＴ　ｅ
衝液２　（］　（ｌ　ｔｔ　Ｃ中（：：３７”Ｃに」、
；いて１時間消化」ろごとに、Ｊ、す、凋製しノー１、
このフラグメントを６％ポリアクリルフ′ミトゲ月川′
で分離し２、所望の４９４ｈｐフラグメン］・（第６１
ｋｌにＪ’；ｔｌろ１１２より）を常法通ｔ）検出し、
精製（ノー。 中間体ブチスミ）・（第６図にね（＋ろ１１４）を、プ
ラスミドｐＮＮ４７０２のＰ　ｖｕ　ＩＴフラクメント
０２μ９と４９４ｔ＋ｐフラグメント０．０５μ９とを
、Ｔ　４１）　Ｎ　Ａリカ−ゼ２甲位を告白４−る’Ｔ
”４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μａ中で４℃において１
６時間反応さ且ろことによって組立てた。形質転換、ア
ンピノリン耐性に基づく形質転換体の選択の後、このプ
ラスミドを、４９４　ｂｐＰｖｕｌＩフラクメントの存
在Ｊ３よび適切な方向性に関し、常法通り分析した。、
４９４　ｈｐＰｖｕＩｌフラクメントと４４０ｂｐＸｂ
ａ　Ｉ−８ｍａ　ｔフコ２クメントとを含打４−るブチ
スミ）・をＹ１後の（吏用のために選択し）こ３、中間
体プラスミド（第７図にしく＋る１１４）１０１１ｇを
、Ｐ　ＶＵＩｔ　緩衝液２００１１Ｃ中でＰｖｕｌｌｌ
単位に、１−リ、３７°（゛において５分間消化しまた
。６５℃で１０分間加熱した後、この混合物を１％アガ
ロースゲル−１４に展開さ■、１分子中に唯１個のＰｖ
ｕＩＩ切断部位を白ｌろ線状１）　Ｎ　Ａを回収し、精
製しノー。この回収物（約３μｇ）をＸ　ｈａ　ｌ　５
　単位で完全に消化し、アルカリ性ホスファターゼで処
理した。 こ杓２らフラグメントを１％アガロ　スゲルー１−に展
開させ、最乙大きいフラグメント（Ｘｂａ１部位から、
ヒトおよびウシ成長ポルモノに関する配列中の最初のＰ
ｖｕＵ部位に至る、１０９ｂｐフラグメントが失われた
しのに相当する）を常法通り回収した（第７図における
１１５）。 最初のＰｖｕ１１部位までの、ウソ成長ホルモンの初め
の部分の２３アミノ酸についてのＤ　Ｎ　Ａ配列（６９
ｂｐ）は２個の１−１ｐａ１１部位を含有しており、そ
れらの内、初めの部位は、暗号配列中第１番目から数え
て２３ｂｐの位置にある。−・方、６３ｂｐフラグメン
ｌ−（第７図における１１６）を、ホスホトリエステル
法て合成した。このフラグメントは１ｐｐリホゾ−ム結
合部位中のＸｂａ１部位からΔ′Ｉ″Ｇ翻訳開始信号ま
での＋９ｂｐの配列と、それに続くＰｈｅ−Ｐ　ｒｏ−
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓ＋１−Ｌｙｓの
暗号配列（２４ｂｐ）およびウシ成長ポルモノの暗号配
列中、Ｐｈｅから最初のＨｐａ　１１部位までの２０個
のヌクレオチドに相当する。このフラグメントは以下の
配列を有する。 Ｌ匝Ｉ ５’　　ＣＴＡＧＡＧ　ＧＧＴＡＴＴΔＡＴＡＡＴＧ−
３’　　　　　　　　Ｔ　ＣＣＣＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡ
　Ｃ−ＴＴＣＣＣＡＴ’ｌ”ＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡ
ＴＡ−１１１１１１１１１１１１１１１，１１１１１１
１ΔＡ　Ｇ　Ｇ　ＧＴ　Ａ　／’、ＣＣＴＡ　ＣＴ／’
、ＣＴＡ　ＣＴ　ＡＴ　−ΔＧ　ＴＴ　ＣＣＣＡ　Ｇ　
ＣＣＡ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　ＣＣＴ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｃ−ＴＣＡ
ＡＧＧＧＴＣＧＧＴＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧ−３゛　旦氾
− ＧＣ５゜ この６３ｂｐの一７ラグメントを合成するために、下記
の９セグメントを調製した。 １）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＣ ３）ＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＴ ４）ＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＣ ５）ＣＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣ６）ＡＴＧＧＧ
ＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＣＴ ７’）ＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡ８）ＡＴＧＧ
ＣＴＧＧＧＡＡＣ ９）ＣＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣ 上記の如く調製したセグメントを使用し、Ｔ４リカ−ゼ
て触媒される結合反応を下記の様に段階的に行った。 ａ）５゛−非りん酸化セグメントｌを５°　りん酸化セ
グメント２に、５゛−りん酸化セグメント６の存在下、
Ｔ４リガーゼを用いて結合させてＤＮＡ二重鎖構造ｌを
形成させ、これを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で精製した。 ｂ）５′−りん酸化セグメント３，４および５を、５゛
−りん酸化セグメント７および８、並びに５°−非りん
酸化セグメント９の存在下、Ｔ４リガーゼを用いて結合
させてＤＮＡ二重鎖構造２を形成させ、これを１５％ポ
リアクリルアミドケル電気泳動で精製する。 Ｃ）次いて、二重鎖構造１および２をＴ４リガーゼで結
合させてＤＮＡ二重鎖構造（第７図における１１６）を
得、これを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精
製した。次に、このＤＮＡ二重鎖構造を、Ｔ４ポリヌク
レオヂトキナーゼと〔γ−Ｐ３２〕ＡＴＰとを使用し、
確立されている方法に従って酵素的にりん酸化した。 」二重のＨｐａｌＴ部位からＰｖｕｒ１部位に至る４６
ｂｐのＤＮＡフラグメントは、合成的に組立てるか、あ
るいは、元々の供給源であるプラスミドＩ）ＢＰ３４８
から得ろことができる。そこで、１００μｇのプラスミ
ドｐＢＰ３４８をＰｖｕＩＩ緩衝液４００μρ中てＰｖ
ｕｌ１５０単位により、３７℃において２時間消化した
。フェノール抽出およびエタノール沈殿の後、このＤＮ
ＡをＰｓｔｌ緩衝液（５０ｍＭＮａＣＬ　　６ｍＭｌ−
リス・Ｈ’ＣＩ（ｐＨ７，４）、６ｍＭＭｇＣＩ、およ
び６１ＩＩＭβ−メルカプトエタノール）４００μσ中
に溶かしＰｓｔ１５０単位て３７℃において２時間処理
した。これらＤＮＡフラグメントを６％ポリアクリルア
ミドゲル上に展開し、所望の４６ｂｐ配列を含有する１
３５ｂｐのセグメントを回収し、標準的な方法に従って
精製した。回収したＤＮＡのＩ／３（３３μｙに相当）
を、Ｈｐａ［Ｉ緩衝液（２０ｍＭ）リス・ＨＣＩ（ｐＨ
７，４）、７ｍＭＭｇＣｌ９．６ｍＭβ−メルカプトエ
タノール月００ｘ（１中、Ｈｐａｎ制限酵素１単位によ
り、３７℃で４０分間、限定的に消化した。６５°Ｃて
１０分間加熱した後、このＩ）ＮΔフラクメノトを適当
ｌｊサイズマーカーと一緒に５％アクリルアミドゲル（
アクリルアミドヒス化合物の比率−１９１）上に展開さ
せた。この１３５ｂｐフラグメント（第７図における＋
１２から得たもの）のＩ−１ｐａ　１１部分消化で得た
所望の４６ｂｐフラグメントを、標準的な方法で精製し
た。 プラスミトヘクタ−のＸｂａｌ−Ｐｖｕｌｌフラクメン
ト（第７図にお１）るＩ　ｌ　５）０．２７Ｂ、６３ｈ
ｐの合成フラグメンｌ−（第７図におけるｌｌ６）３．
２ピコモルおよび４６ｂｐフラグメン）・（第７図にお
ける＋１２から得たもの）０５ピコモルを、ライノｒ−
ンヨン用緩衝液１０７１ｆｊ中で′Ｔ”　４　Ｉ）　Ｎ
Δリカ−セ２単位と共に、４℃において１６時間インギ
コ△、−トシた。このライケーノヨンミソクスを用いて
Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＪＡ２２ｉを形質転換し、得られた形
質転換体（所望のプラスミド’Ｔ；’＋ＮＭ　７８９を
含むもの）をアンピノリン耐性に培づいて選択した。 ブチスミｌ”ｌＩＮＭ７８９（第７図におＲ，’：　ｌ
　ｌ　７）の同定は、４９４ｂｐのＰｖｕｌＩフラグメ
ントと１０９ｂｐのＸｂａｌ−ＰｖｕｌＴフラグメント
の両者の存在を常法通すスクジーニンクすることによっ
て行っノこ。 Ｅ、ブチスミＦｐＮＭ７８９Ｂの最終的な組立てプラス
ミＦ’ｐＮ　Ｍ　７８９　（第８図における１１７）を
完全にラン成長ホルモンのものに変換するには、１個の
アミノ酸フトンを変える必要がある。このことは、ｐＮ
Ｍ７８９のＰｖｕｌｌからＢａｍ１−（１までの２８ｂ
ｐフラクメントを除去して配列。 ５”　　　　　　　　　　　　　３゛ ＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧ ｌ：１ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ を有オろ合成二重鎖フラグメント（第８図におけろｌｌ
８）に置換えることにより、行うことができろ。 ｐＮＭ７８９１０ＩＩＬｊＩをＰｖｕＩＩ緩衝液２００
μＱ中て、ＰｖｕＩＩＩ単位により、３７°Ｃで５分間
消化した。６５℃で１０分間加熱した後、この混合物に
Ｂａｍ１−１［緩衝液を加えて３００μρに希釈し、Ｂ
ａｍＨＩ　Ｉ　Ｏ中位により、３７℃で１時間処理して
完全に消化し、アルカリ性ホスファターセ５単位で処理
した後、６５°Ｃて■時間インキニベー　１・した。こ
イ１らＤＮＡフラグメントを１％アカＣＪ　−スゲルー
して分離し、１箇所を切断されたブチスミｌＳ’ｐＮ　
Ｍ　７８９の大きさのＩ）ＮΔフラクメント（第８図に
おける＋１９）を常法通り精製した。このフラクメン）
・０２μ７と合成−２ラクメントとをリカ　ゼ緩衝液２
０μσ中でＴ　＝１リガーゼ２中位によりライケートシ
ノー。ごのソイケ　ンヨノは４°ＣてＩ夜行なわれた。 形質転換しノニ後、数個のプラスミドを単離し、適切な
ｌ’ｖｕＩｌフラ′ツノ７・）・（１９４ｂｐ）とＸ　
ｈａ　Ｉ−Ｆ３　ａｍＨｌフフクメ：／１−（６２８ｈ
ｐ）との存在に関してスクジーニノ′７′シノー３、」
１．己のフラグメントを含有オろプラスミドは、所望の
ブう・スミド、ｌ’ｌＮＭ７８９Ｂ（第８図に」；（ｊ
る１２０）を構成していた。 及施−廻−２−プラスミドｐｃＺ１０１．＋、＋；よび
ＦＬ、ｃ。 １ｉＫ　ｌ　２　Ｉｔ＼７３０８．／ｐｃＺ＋０１の組
Ｓ’ｒ、　−Ｌ、ヘ　プラスミドｐＩＭ−ビーΔ３のＪ
）つ離細菌Ｅ、ｃｏｉｉＫ　ｌ　２／ｐＩＭ−１’　　
Δ３（ＮＲＲｌ、、Ｂ−１５７３３）をＴＹブロス（１
％トリプトン、０５％酵母エキスおよび０．５％塩化ナ
トリウム、ｒ＋ｌ（７，４）中で、カナマイノン５０μ
９の存在下、微生物学的な常法に従い、２５℃において
培養した。調製したばかりのブロスによ−）てこの培養
物を１、１０１．の割合で希釈した後、３７℃で３時間
インキクへ　トシ、次いで、培養物約０　、５　ｙｔ（
ｌを１．５ｓＣのエンベンドルフヂューブに移し、約１
５秒間遠心した。特に明記しない限り、全ての操作は室
温て行−・たらのとオろ。得らＳまた一１二澄を先端の
細いアスピレータ−て注意深く取除き、細胞ぺし・ソト
を調製し）屓に゛かりのリゾチー１、溶液（２μ９／１
７ρリゾチ　Ｊ５．５（１ｍＭグルー１−ス、１０１．
ＴＩＭＥｌ）　Ｔ△（ンアミン四酢酸）および２５ｍＭ
トリス・ｔｌ（川（ｐ＋−＋ｓ））約１００７１ｆ７に
再ｐｓ＋、た。約２００μρのアルカリ性５ＤＳ（トデ
ノル硫酸すｌ・リウム、）溶液（０，２ＮＮａＯＩ（Ｓ
　Ｉ％Ｓ　Ｉ）　Ｓ　）を加え、このヂコーブを静かに
転倒させた後、０℃で完全に溶解オろまて保持した（〜
５分間）。次いで、３Ｍ酢酸ナトリウム約１５０μ夕を
加え、数秒間転倒させることにより、チューブの内容物
を静かに混合した。 このチューブを少なくとも６０分間、０℃に保持した後
、１５分間遠心することに、１；す、殆んど透明な」二
澄液を得た。この」二澄液を第２の遠心管に移し、３倍
容量の冷１００％エタノールを加えた。このチューブを
ドライアイスーエタノールトに５分間載置した後、析出
した沈殿を遠心して集め（５分間）、」二澄液を吸引除
去した。集めたペレットをＴＥ（１０１．ｍＭｌ・リス
・ｔ（ＣＩ（ｐｉ−１８、０）およびＩｍＭＥＤＴＡ）
Ｉ　ＯＯμ（ｌに溶かした。こイ１は所望のプラスミド
ｐ１Ｍ−１’−Δ３１）　Ｎ　Ａで構成されていた。 Ｂ、プラスミドｐＮＭ７８９ＢのＸ　ｂａ　Ｉ　−Ｂａ
ｍＨ１消化、および〜０．６ｋｂ　　Ｘｂａｌ−１３ａ
ｍＨＩフラグメントの生成 プラスミドｐＮＭ７８９ＢＤＮＡ約５１１ｇの１旧５ａ
ｌｔ緩衝液※５０μＱ中溶液を、各々１０単位のＢａｍ
Ｈ制限酵素お上びＸｂａｌ制限酵素と共に３７℃て約１
時間インキュベートした。３Ｍ酢酸ナトリウ１、（ＪＩ
Ｈ７，０）５μＱを加えた後、１００％エタ７ノール３
倍容徂を加えてＤＮＡを析出させた。 所望のＤＮＡ消化物をＴＥ緩衝液１００μｇに溶かし、
以後の使用に備えて０℃で保存した。 ※■−目Ｓ　ａｌｔ緩衝液は次の各成分から常法通り調
製しノニ：Ｉ　００ｍＭＮａＣ１，２０ｍＭトリス・Ｈ
ＣＩ（ｐＨ８，０）、Ｉ　０ｍＭＭｇＣＩ２および５ｍ
Ｍβ−メルカプトエタノール。 Ｃ，プラスミドＩ）ＩＭ−ビーＡ３のＸ　ｂａ　Ｉ　−
ＢａｍＨｌ消化 所望の消化は、プラスミドｐＮＭ７８９Ｂのかわりにプ
ラスミドｐＩＭ−１’−Ａ３を用いろ外は実質上、実施
例２Ｂと同様にして行った。所望のＤＮＡを１゛Ｅ緩衝
液１００μｇに溶かし、以後の使用に備えて０℃で保存
した。 Ｄ、ライゲーション並びに形質転換 プラスミドｐ１Ｍ−１”−Ａ３消化物約１μ７、プラス
ミドｐＮＭ７８９ＢのＸｂａｌ　−Ｂａｍｌ−Ｉ　Ｉ消
化物＋７１．水４．０ｐＱ１ＡＴＰ５　μＣ（５ｍＭ）
、ライゲーノヨンミソクス※５μｇおよびＴ４ＤＮΔリ
カーゼ５単位を２０℃で２時間インキコヘートした。６
５℃で２分間インキコベートし、水冷した後、得られた
ライゲーション混合物を用いて実質上Ｗｅｉｎｓｉｎｋ
（１９７４、Ｃｅ１１３　：３１５）の方法に従い、カ
ナマイシン５０μｇ／ｘＱを含んたＴＹ平板（１％トリ
プトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム
および１．５％寒天、ｐＨ７，４）上でＥ、ｃｏｌｉＫ
　Ｉ　２ＲＶ３０８を形質転換した。細菌、Ｅ、ｃｏｌ
ｉＫ　Ｉ　２　ＲＶ　３０８菌株はＮｏｒｔｈｅｒｎ　
　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ（Ｐｃｏｒｉａ、　　Ｉ　ｌ１ｉｎｏｉｓ
）に寄託され、その永久ストックカルヂャーコレクンヨ
ンの一部を構成しており、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ１５
６２４の下、誰でも利用することができる。 アガロースゲル電気泳動（Ｍａｎｉａ日Ｓら、１９８２
）等、日常的な試験法により、得られた形質転換体の内
のあるものは所望の〜１０．８ｋｂプラスミドのみを含
有していることが示された。その様な形質転換体（Ｅ、
ｃｏｌｉＫ　１２　ＲＶ　３０８　／ｐＣＺ＋０１とい
う）を選択し、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上に
おき、微生物学的な常法に従って培養した。得られた細
胞を、実質上実施例ＩＡと同様な、プラスミドｐｃＺ１
０１の単離に用いた。 ※ライゲーションミックスは次の各成分から調製した：
５００ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，８）、２００ｍＭ
ジチオトレイトールおよびＩ　Ｏ０ｍＭＭｇＣＩ２゜ 害膚桝−多　プラスミドｐｃ７．１１４およびＥ、ｃ。 １ｉＫＩ２１えＶ３０８／ｐＣＺＩＩ４の組立て、へ、
プラスミドｐｃＺｌｏ＋の〜Ｉ　０　、２　ｋｂｒ：３
　ａｍＨｌ−Ｘｂａｌフラグメントの組立て プラスミドｐＮＭ７８９Ｂの代わりにブチスミｔ”ｐｃ
ＺｌｏＩを用いろ外は、実質−１一実施例２Ｂと同様に
して所望のフラグメントを組立゛Ｃた。所望の−１，０
、２ｋｈＢａｍｌ目−Ｘｂａｌ制限フラグメン）・をア
ガロ−スケル電気泳動（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２
）によって常法通り分離し５てＱｉ離し７、次いてＩ”
　Ｅ緩衝液約１００μσに溶か１９、以後の使用に備え
マーＯ″Ｃで保ａしノこ。 Ｂ　プラスミドｐｃＺ］０１の〜０　、６　ｋｌ】Ｆ３
　ａｍｌ−（１−ｔｉｇｉＡ　Ｉフラグメントのイ旧；
（でプラスミドｐＮ　Ｍ　７８９　ＢおよびＸｂａｌ制
（！（シ酵素の代わりにブチスミｔ”ｐＣＺ　Ｉ　ＯＩ
わよひト（ｇ１ΔＩ制限酵素をそイ１それ使用ずろ外は
、実質１、実施例２　Ｆ３と同様にして所望のフラグメ
ントを絹ダしてノニ。所望の〜０　、６　ｋｈＢａｍ＋
−■　−ＩＩ　ｇｉ　Ａ　Ｉ　ｉｉ＋１限フラグメント
をアガロースケル電気泳動（ｈＬ＋旧ａｔ　ｉｓら、Ｉ
　９８２）によ−、て常法通り分離してりｔ離し、ＴＥ
緩衝液約１００１ｔｉ２に溶かして以後の使用のために
０℃゛で保ｑした。 Ｃ，ＤＮＡリンカ−配列の組立て ５’　　ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡ　　ＡＴＧ
１１１１１１１１１１＋＋１１１１　　　ｌ１１３°　
　　　　ＴＣＣＣＡＴＡＡＴＴＡＴ　　ＴＡＣＴ　Ｔ　
Ｇ　　Ｇ　Ａ　Ｇ　　Ｇ　Ａ　Ｔ　　Ｇ　Ａ　Ｔ’　　
Ｔ　Ａ　Ａｌ１１　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　
　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＡＡＣＣＴ　ＣＣＴ　Ａ　　Ｃ
Ｔ　Ａ　　Ａ　Ｔ　’Ｔ’ＡＴＧ　　ＴＴＣＣＣＡ　　
ＧＣＣＡＴＧＩｌｌ　　　１８　　　Ｉｌｌ　　　Ｉｌ
ｌ　　　Ｉ１１′Ｉ″ＡＣＡＡＧ　　ＧＧＴ　　ＣＧＧ
　　ＴＡＣ１’　ＣＣＴ　Ｔ　Ｇ　　Ｔ　ＣＣＧ　Ｇ　
ＣＣＴ　ＧＩｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　１１１　　　
　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＡ　Ｇ　Ｇ　　ＡＡＣＡＧＧ　
　ＣＣＣＧＡＣＴＴＴ　　ＧＣＣＡＡＣＧＣＴ　　ＧＴ
ＧＣＴ３゜１１１　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　
　Ｉｌｌ　　　　ＩＡＡ、Ａ　　ＣＧＧ　　ＴＴＧ　　
ＣＧＡ　　Ｃ５“所望のリンカ−配列を、実質上、Ｉ　
ｔａｋｕｒａら（１９７７）および（’：ｒｅａら（＋
９７８）らの教下した方法に従い、改良ホスホトリエス
テル法１、二よって常法通り合成した。上記の合成法は
実施例１に詳しく示さ君てい似。 ■）　ライゲーンヨｌンおよび形質転換実施例３ＣのＤ
　Ｎ　Ａリンカ　約２０ピコモル、プラスミドｐｃＺ、
ｌ０１０〜Ｉ　Ｏ、，２ｋｂ１３ａｍＨＩＸ　ｂａ　ｌ
フラグメント１μフおよびブチスミＦ’　Ｉ）　Ｃ７゜
１０１の−０，６ｋｂＢａｍｌ−ｆ　ｌ−ｌ−１−ｌ、
Ａ、　ｌ−１ラグメンｔ□　０　、５７１ｙをフイゲー
トし、得らイ′１ノこプラスミドを用して実質−１１、
実施例２　ｒ〕と同はにし、てＪ−：　、　ｃｏｌｉＫ
Ｉ　：Ｈ？Ｖ３０８を形質転換しノ、二。 得られノこ形質転換体の内あるしのは、−Ｊ”ガ［！−
スケル電気泳動（Ｍａｎｉａｌｉｓら、１９８２）等の
連邦の試験により、所望の〜Ｉ０．８ｋｂｌ０ｌスミト
のみを含％Ｔ　ｌ−ていることか）：さｔｌハロ　その
様−「質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２　ＴえＶ　３
０８、−”Ｉ）Ｃ７，＋１４という）を選択し、適当な
抗生物質を含有４′る′）゛Ｙ寒天七にのり、微生物学
的な′１；；法を用いて培谷し　ノこ３、　得　ｌη１
　ノこ細胞（」　、　　Ｓ　　Ｉ−）Ｓ　　ノＴ　ノ１
　屯′＜（ン２ト重）Ｊ、　　１１１Δわ、Ｊ、び他の
試験に、Ｊ、−・て、ｍ　（！１．−　ｂ　（Ｊ　）Ｉ
　’ｉ：　Ｓ＋し・ヘルて発現するごとが示されｊ−１
３ブフスミＦ’ｐＣＺ１１４は熱的に誘導可能なラン→
°つＪ−，１′シ・プリコノを含イ１しているので、ｍ
ｅ　Ｌ　　ｂ　Ｇ　Ｈｑ”ｒ発現は、培養温度約３７°
Ｃで最大となる。 ｇ施１ｈ２−４−　プラスミドｌ）ｃ、７．　ｌ　ＯＩ
　、　　ＩおよびＩ　、ｃｏ１ｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐ
ＣＺ１０１．Ｉの組立て 実施例３（Ｌのリッカー配列の化イー）りに、配列。 ５　’　　　Ｃ’Ｊ゛　Ａ　　Ｇ　　Ａ　　Ｇ　　Ｇ　
　Ｇ　　Ｔ　　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ａ　　Ａ　　’Ｉ’　Ａ　
　　　Ａ　　Ｔ　Ｇ１１１１１１１１１１１１　　　　
ｌ１１３　’　　　　　　ｉ’　ＣＣＣＡ　Ｔ　Ａ　Ａ
　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ｔ　　′Ｉ”　Ａ　ＣＴ　Ｔ　ＣＣＣＡ
　　ＴＴ　Ｇ　　Ｇ　Ａ　Ｔ　　Ｇ　Ａ　Ｔｌ１ｌ　　
　　Ｉｌｌ　　　　１１１　　　　ＭＩ　　　　Ｉｌｌ
ΔＡＧ　ＧＧ′Ｆ　ＡＡＣＣＴＡ　　Ｃ’ｆ’ＡＧΔｉ
”　　１’ΔＡ　　ＡＴＧ　　’Ｉ’ｌ″ＣＣＣＡｌ１
１　　　１１１　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　
ｌ”ＣＴ　Ａ　　Ａｉ”ｉ”　　′ｒＡ　Ｃ，Ａ、Ａ　
ＡＧＧ　Ｇ　Ｔｃ　ｃ　ＣＡ　Ｔｃ　　Ｔ　Ｃｃ　　Ｔ
　Ｔ　ｃ　　’ｒ　ｃ　ｃＩｌｌ　　　　１１　ｌ　　
　　Ｉｌｌ　　　　ｌｉｌ　　　　ｌ１ｌＣＧ　ａ　　
′ｒΔ０　ＡＧＧ　　ＡＡＣＡＧＧＧ　Ｇ　ＣＣ：　Ｔ
Ｇ　　Ｔ　ＴＴ　　Ｇ　ＣＣＡΔＣｌ１ｌ　　　　１１
１　　　１１　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌ（”　ＣＧ
　　Ｇ　Ａ　ＣΔＡＡ　　ＣＧＧ　　ＴＴＧＧ　ＣＴＧ
　ｉ”　Ｇ　ＣＴ　　３“ Ｉｌｌ　　　　１ｌｌｉｌ ＣＧＡＣ５′ て示されるＤＮリンカ−配列を用いる外は、実質上、実
施例３と同様にして所望の組立てを行った。 −七で特定したリンカ−配列は、ｌ　ｔａｋｕｒａら（
１９７７）およびＣｒｅａら（＋９７８）の常法に実質
」−従って組立てることができる。に記の合成法は実施
例１に示されている。 所望の形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２　ＲＶ　３
０８／１１ＣＺ’１０１．１という）を適当な抗生物質
を含んだＴＹ寒天上にのせ、以後のプラスミドｐｃＺＩ
０１１の生産および単離のために常法通り培養した。 この形質転換体もまた、ＳＤＳゲル電気泳動およびＲＩ
Ａ等の試験により、ｍｅｔ−ｂＧＨを高レベルで発現す
ることが示された。プリスミＦ’ｐＣＺ　１０１、■は
熱的に誘導可能なランチウェイし・プリコンを含有して
いるので、ｍｅｔ−ｂＧＨの発現は、培養温度約３７℃
で最大となる。 実施例５　プラスミドｐＨｌ７△４△１の組立て プラスミドｐＨｒ７△４△１の組立て模式図の一部は添
付の第１５図に示されている。 Ａ、プラスミドｐＢＲＨｔｒｐの組立てプラスミドｐＧ
ＭＩは△ＬＥ１４１３欠損を含むＥ、ｃｏｌｉトリプト
ファンオペロン（ミオザリ（Ｍｉｏｚｚａｒｉ）ら、１
９７８、Ｊ、パイテリオロジー（ＪＢ　ａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ）、１４５７〜１４６６）を担持しており、従
って、ｔｒｐリーダー配列の最初の６個のアミノ酸およ
びｔｒｐＥポリペブヂドの終わりの３分の１を含んでい
る融合蛋白質（以後これらを合わせてＬＥ’という）、
並びにｔｒｐＤポリペプチドの全配列を、いずれもｔｒ
ｐプロモーター／オペレーター系のコントロール下で発
現させる。Ｅ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２Ｗ３１１０ｔｎａ２
ｔｒｐ△１０２／ｐＧＭ１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔ
ｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに
寄託され（ＡＴＣＣＮｏ、　　３１６２２）でおり、ｐ
ＧＭＩはこの菌株から下記の如く、常法に従って分離す
ることができる。 約２０μ２のこのプラスミドを、このプラスミドを５箇
所で切断する制限酵素ＰｖｕｌＴで消化した。 次いでこの遺伝子フラグメントを、後にＥｃｏＲＩ開裂
部位を含有するプラスミドヘクローンするために、Ｅｃ
ｏＲＩリンカ−（配列：ｐＣＡ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ａ　ＴＴ
ＣＡＴＧで示される自己相補性（ｓｅｌｆ　　ｃｏｍｐ
ｌｅｍｅｎｔａｒｙ）オリゴヌクレオチド）と結合させ
てＥＣ０ＲＩ開裂部位を作成した。ｐＧＭＩから得たＤ
ＮＡフラグメント２０１１ｇを、５°−リン酸化合成オ
リゴヌクレオチドＩ）ＣＡ　Ｔ　ＧΔＡＴＴＣＡＴＧ（
２００ピコモル）の存在下、２０μａのＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＩ−１７，６，０，５
ｎ１．（Ａ　Ｔ　Ｐ　、　　Ｉ　ＯｍＭＭｇＣｌｘ、５
ｍＭジチオトレイトール）中、４℃で一夜、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（１０単位）で処理した。次いで、溶液を７０
℃で１０分間加熱してライゲーションを停止させた。こ
のリンカ−をＥｃｏＲＩ消化によって開裂し、そのＥｃ
ｏＲＩ末端を有するフラグメントを５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法（以後ｒＰＡＧＥＪと呼称）で分離
した。まず最初にエヂジウムブロマイドにより染色し、
次いで紫外光によってフラグメントの位置を定め、所望
の部分をゲルから切り取ることにより、３つの最も大き
いフラグメントをゲルから分離した。各ゲルフラグメン
トを３００ｕ（ｌの、０．ＩＸＴＢＥと共に透析袋に入
れ、０．ＩＸＴＢＥ緩衝液中（ＴＨＥ緩衝液：水ＩＱ中
にトリス塩基１０．８ｇ、ホウ酸５．５ｇおよびＮ　ａ
　２　Ｅ　Ｄ　ＴＡｏ、０９ｇを含有）１時間、１００
■における電気泳動に付した。透析袋中の水溶液を集め
、フェノール抽出並びにクロロホルム抽出を行い、塩化
ナトリウム濃度を、０．２Ｍに調節した。次いで、エタ
ノール沈殿の後、ＤＮＡを水中に回収した。 このＥｃｏＲＩ粘着末端を持ったｔｒｐプロモーター７
／オペレーター−含有フラグメントをテトラサイクリン
感受性プラスミドに該プロモーター／オペレーターを挿
入し、テトラサイクリン感受性プラスミドをテトラサイ
クリン耐性プラスミドにすることにより、同定した。以
後に述べるＤＮＡフラグメントの単離は全て上記の如く
、ＰＡＧＥを行い、次いで電気溶離する方法で行った。 Ｂ、ｔｒｐプロモーター／オペレーターのコントロール
下でテトラサイクリン耐性を発現するプラスミドｐＢ　
ＲＨｔｒｐの組立て、並びに上記ｒＡＪで単離したｔｒ
ｐプロモーター／オペレーター含有ＤＮＡフラグメント
の同定および増幅 プラスミドｐＢＲＨＩ（ロドリゲッッ（Ｒｏｄｒｉｇｕ
ｅＺ）ら、１９７９、ヌクレイツク・アシッド・リザー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ）６．３２６７−３２８７、ＡＴＣＣＮｏ、３７０７
０）ｆｊ、７ンビンリノ耐性を発現４−ろと共に、テト
ラザイクリン耐性遺伝子を含有しているが、これはプロ
モーターを伴っていないので、その耐性を発現すること
はない。従って、このプラスミドはテトラザイクリン感
受性である。そのＩ　ｃｏＲＩ部位にプ［Ｊモーター／
オペレーター系を導入してこのプラスミドをテトラザイ
クリン耐性にすることができる。 プラスミドｐＢＲＨＩをＥｃｏｌｌ（Ｉで消化した。 フェノール抽出、次いでクロロホルム抽出オることによ
り酵素を除去し、エタノール沈殿の後、ＤＮＡを水中に
回収しノー。得られた１）ＮＡ分子を、実施例５Ａで得
た３種のＤＮＡフラグメントの各々と、別々の反応混合
物中で混合し、前述の如く（こしてｒ　４１）　Ｎ　Ａ
リプノ−ゼてライプ　１・しノニ。ごの反応混合物中の
Ｉ）ＮＡを用いで標準的１法（バージフィールド（Ｈｃ
ｒｓｈｆｉｃｌｄ）ら、１９７４、プロナス（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔ、　Ａｃａｒｌ、　Ｓｃｉ、）ＵＳΔ７１：
３４５５−３４５９）に従い、コンビプントＥｃｏｌｉ
Ｋ　＋　２菌抹２９４（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５６２５）
を脂質転換し、次いてこの細菌を、アンピシリン２０μ
ｙ／ｒｒｒＱおよびテ［・ラサイクリン５μｇ／靜を含
んたＬＢ平板上においた（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８
２）。 数個のテトラザイクリン耐性コロニーを選択Ｉ７、その
プラスミドＩ）　Ｎ　Ａを分離してｐＢＲＨｔｒｐと命
名した。所望のフラグメントの存在を制限酵素分析で確
認した。プラスミドｐｒ３　ＲＨｔｒｉ）はβ−ラクタ
マーゼを発現し、アンピンリン耐性を与え、さらにｔｒ
ｐプロモーター／オペレーターを含むＤＮＡフラグメン
トを含有している。このＤＮＡフラグメントはまた、ｔ
ｒｐリーダー配列の最初の６個のアミノ酸とｔｒｐＥポ
リペプチドの後方のおよそ３分の１の融合物である第１
番目のタンパク質（Ｌ四と呼称）、ＬｒｐＤポリペプチ
ドのおよそ前半分に対応する第２番目のタンパク質（Ｉ
）′と呼称）、およびテトラザイクリン耐性遺伝子によ
って暗号化された第３番目のタンパク質、をも暗号化し
ている。 ＣプラスミドｐｓＯＭ７△２の組立て プラスミｌ”　ｐ　Ｂ　ＲＨｔ　ｒｌ）をＥｃｏＲＩ制
限酵素で消化し、得られたフラグメントをＪＮＡ　Ｇ　
Ｅおよび電気溶離法で弔離し、ＥｃｏＲ１消化プラスミ
Ｆ’ｌｌ）ＳＯＭ　Ｉ　　ｌ　（Ｉ　ｔａｋｕｒａら、
１９７７、Ｓｃｉ、Ｉ　９８：ｌ０５６、アメリカ特許
番号第４．３６６２４６号、イギリス特許出願公告番掃
第２．００７，６７６Ａ号）と混合した。ごの混合物を
Ｔ４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼてライプ−卜しそのｌ）ＮＡ
で前述の如くにしてＥ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２菌株２９４
を形質転換１刀−８形質転換した細菌をアンピノリンを
含ｆ１４〜ろ＼［′板１−で選択し、得られたアンピノ
リン耐性：’Ｉ　Ｃ民Ｌ　−を、：ｌ：ｌ　Ｃ１二−ハ
イブリダイセーノコン（タルエンスティン（Ｇ　ｒｕｅ
ｎｓｔｃｉｎ）ら、１９７５、ブｒＪナス（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔ　　Δｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳ△７２　：　
：（９５１−３９６５）ニＪ、ラチスクリ　−’−ノブ
し八３．１）１３Ｒｔ（ｔｒｐから単離し、３２　ｐて
放射活Ｆ−ｔ　？、Ｎ　Ｊジ）標識に１．、。 ｔｒｐブ〔ノモーター／′オペレーター含有フラクメン
トを−１−５己の実験でプローブと（、て用１　”　／
コ、コロニニハイプリダイゼ　ノヨンで陽性を示した数
個のコ１に−を選択した３、ブチスミ）・Ｌ）　Ｎ　Ａ
分単離し、１３ｇ１ＩＩおよびＢａｍＨＩ酵素を用いて
ご４重消化して行う制限酵素分析により、挿入フラグメ
ントの方向性を決定した。適切な方向性のｔｒｐプロモ
ーター／オペＩノーターフラグメントを持った所望のプ
ラスミドを含むコ「Ｊニーを１０μｇ／＊Ｑのアンピノ
リンを含んたり、　［３培地で増殖させた。所望のプラ
スミドをｐＳＯＭ７△２と命名し、以上に述へる組立て
に用いた。 Ｄ　プラスミドｌ）ｉ’　ｒｐ　２４の組立て１）　　
ＬＥ’ポリペプチドの遠位領域を暗号化している遺伝子
フラグメントであって、その暗号鎖の５゛並びに３゛末
端にそれぞれＥ（ｇｌｌＪおよびＥｃ。 ｒｔ　＋制限部位を何するフラグメントの組立てプラス
ミドｐｓＯＭ７△２ヲＩ（ｉｎｄｌｌｌ消化した後、Ｌ
Ｅ’暗号領域内のＢｇｌ口制限部位を越えて消化が行な
わイ１ろ様な条件を選んでラムダゴ、キソヌクし・アー
ゼ（５゛から３°へのエキソヌクレアーゼ）で消化した
。約２０７１＠のＨｉｎｄＩＩｌ消化ｐｓＯＭ７１＼２
を緩衝液（２０ｍＭグリンン緩衝液、ｐＨ９、６，１ｍ
ＭＭｇｃｌ７、ＩｍＭβ　メルカプＩ−ｓ−タノール）
ニ溶かした。得られた混合物をラトダエキソヌクレアー
ゼ５単位により、室温で６０分間処理した。 得られた反応混合物をフェノール抽出、クロロホルム抽
出した後、エタノール沈殿を行った。 ＬＥ’遺伝子フラグメントの遠位末端にＥｃｏＲＩ残分
（ｒｅｓｉｄｕｅ）を形成するために、改良ホスホトリ
エステル法（Ｃｒｅａら、＋　９７８）に従ってプライ
マー、”ｐｃｃＴＧＴＧｃＡＴＧΔＴを合成し、ラムダ
エギソヌクレアーゼ消化によって生成したＬＥ’遺伝子
フラグメントの１本鎖末端にハイブリダイズさせた。こ
のハイブリダイゼーションは、エキソヌクレアーゼ処理
したプラスミドｐＳＯＭ７△２のＨｉｎｄｌｌｌ消化物
２０μ２を水２０μｇに溶解し、上記の５゛−りん酸化
オリゴヌクし・オヂド約８０ピコモルを含有する６７１
（！の溶液と混合することにより行った。合成フラグメ
ントはＬＥ゛暗号配列の３′末端に結合し、残るＬＥ’
フラグメントの１本鎖を、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴ
ＰおよびｄＣＴＰを用いてクレノーポリメラーゼｌで充
填したークｌツノーポリメラーゼｌｉＪ：ＤＮＡポリメ
ラーゼＩのタンパク分解的開裂で得られるフラグメント
てある。これは５°−３’（５“から３”への）ポリメ
ラーゼ作用および３’−５’工キソヌクレアーゼ作用を
有４−るが、親酵素の有する５′−・３′工キソヌクレ
アーゼ作用は持たない（ＫｏｒｎｂｅｒｇＳ　１９７４
、Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　　ａｎｄ　　ｃｏ、　。 ５ＦＯ１９８）。 すなわち、反応混合物を５０℃に加熱し、徐々に１０℃
まで冷却し、その後４μρのクレノー酵素を加えた。室
温で１５分間インキュベーションした後、３７℃で３０
分間インキュベーションし、０．２５ＭＥＤＴＡ５μＱ
を加えて反応を停止させた。反応混合物をフェノール抽
出、クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿に付した
。次いでＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌｒｌで開裂させ、フラ
グメントをＰＡＧＥで分離した。ゲルをオートラジオダ
ラムにかけたところ、約４７０ｂｐという予測された長
さの３２ｐラベル−フラグメントが存在することがわか
った。これを電気溶出（溶離）法で回収した。 概説した様に、このフラグメントＬＥ’（ｄ）は８ｇｌ
＋１末端と、プライマーの開始点に符号する平滑末端と
を有している。 ２）プラスミドｐ’ｒｈαｌの組立て プラスミドｐＴｈα１は、チモンン（ザイモノン）アル
ファ１のための合成遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２２に
挿入することにより、組立てた。チモシンアルファ１暗
号ＤＮＡは、添イ；１の第１１図において両頭矢印（−
’−）で指示した１６個のオリゴヌクレオヂド（’ｒ　
、−’ｒ　＋ｅ）の合成、およびそれらのライゲーショ
ンにより合成した。Ｎ末端にｍｅｔ　（メヂオニン）Ａ
　’Ｉ”　Ｇを挿入し、５゛末端を、ＥｃｏＲＩとＢａ
ｍＨＩで開裂したプラスミドに結合し易くするために、
１本鎖粘着末端を持つ様に調整した。 容易に理解されるであろうが、組換えプラスミドの分析
（同定）には、遺伝子の中心にあるＢｇｌｎ部位が役立
つ。 オリゴデオキノリボヌクレオチドＦ１〜’Ｉ’＋ｅは、
完全に保護されたトリデオキンリポヌクし・オチド組立
てブロックを用いて、改良ホスホトリエステル法（Ｉ　
ｔａｋｕｒａら、１９７７およびＣｒｅａら、１９７８
）に従って合成された。種々のオリゴデオキンリボヌク
レオチドを表１に示す。 上記の化合物の合成は、添付の第１２図に総括した、下
記のフラグメントＴ＋５に関する合成方法で代表されろ
。Ｔ　Ｉ６の合成に用いた種々のヌクレオヂドフラグメ
ントを、図面に数字で表した。また、採用した略号は次
の通りである・ＴＰＳＴｅ−２、／１．６−）リイソプ
ロピルベンゼンスルホニルテトラゾ−ル；ＢＳＡ−ベン
ゼンスルホン酸：ＴＬＣ−薄層クロマトグラフィ−、Ｈ
Ｐ　Ｌ　Ｃ−高速液体クロマトグラフィ−、ＤＭＴ＝４
．４”−ジメトキントリヂル、ＣＥ−２−シアノエチル
；Ｒ＝１）−クロロフェニル、　Ｂ　７．　＝ベンゾイ
ル：Ａｎ−アニソイル。 １Ｂｕ−イソブヂリル；Ｐ）・−ピリノン；Ａｃ０）ｊ
−酢酸：ＥｈＮ＝）リエヂルアミン。 完全に保護されたトリデオキンリボヌクレオチト（４Ｘ
８５ｘｈ、０．０５ｍＭ）および（２）（１８０靜、０
　、１　ｍＭ）を、７　：　３　（ｖ／　ｖ）のクロロ
ポルム／メタノール中で２％ＢＳＡ（それぞれ１０１．
および２ｏｍＣ）により、０℃で１０分間処理し、５゛
の水酸基を脱保護した。重炭酸アンモニウム飽和水溶液
（２ＩＩＩ（りを加えて反応を止め、り［１０ホルム（
２５ｚＲ）で抽出した後、水洗した（２　Ｘ　Ｉ　Ｏｚ
ρ）。有機層を硫酸マグネノウムで乾燥し、少量（約５
に０）になるまで濃縮した後、石油エーテル（３５゛〜
６０℃留分）を加えて沈殿さＵた。無色の沈殿を遠心分
離して集め、真空デツケータ内で乾燥すると、いずれち
ンリカゲルＴ　Ｌ　Ｃ（Ｍ（！ｒｃｋ　６０　Ｆ　２５
４、クロロポルム／メタノール、９１）てホモノーニア
ス（均一）１．、ｆ（６）および（８）を得た。 ｌ・リマ−（玉里体）（１）および（３Ｘ２７０ｒｙｇ
、０．１５ｍＭ；Ｉ　４５Ｂ、０．０７５ｍＭ）をトす
］−チルアミン／ピリノン／水（１：３：ｌ、〜・／〜
・、ｌ　０７Ｑ）により室温で２５分間処理オろことに
より、ホスホノエステル、（５）および（７）に変換し
た。しｌ−タリーエバポレーターを用いて反応剤を留去
し、残留物を無水ピリノンと共に繰返１−　ｉｊ（留４
−るごとにより（３Ｘｌ（Ｌ＋の乾燥した。トリマ　（
８）（００５ｍＭ）とトす７−（７）とを無水ピリジン
（３ｍＣ）中で’Ｉ゛ＰＳＴｅ（５０１１ｇ、Ｏ，１５
ｍＭ）と混合し、この反応混合物を、減圧下に、室温で
２時間放置した。Ｔ　Ｌ　Ｃ分析の結果、）・リマ−（
８）の９５％かヘキザマー生成物に変換していることが
わかった（１０％硫酸水溶液を噴霧し、６０℃に加熱す
ることにより、ＤＭＴ塙を検出して観察した）。 この反応物に水（Ｉ　ｍ（２）を加えてクエンヂングし
、溶媒を減圧蒸留した。］・ルエノと共に共沸蒸留して
ピリジノを除いた後、トリマー（４）および（２）に関
して記述した如く、２％ＢＳＡ（８ｘｇ）でこのｌ＼キ
ザマ−の５゛位を脱保護した。この生成物（１０）をソ
リ力ゲル力ラム（Ｍｅｒｃｋ　　６０　Ｈ１３５Ｘ５ｃ
ｚ）にかけ、タロロポルム、／メタノール（９８，２〜
９５：５．〜・／〜・）による段階的傾斜溶出により精
製した。生成物（１０）を含む両分を蒸発乾固１゜た。 同様に、トリマー（５）を（６）につなぎ、完全に保護
さイ］ｋ生成物を直接、ノリカケルで精製した。この生
成物の３”末端を、）・リエヂルアミン／ビリノン／水
を用いて前述の如く脱保護してフラグメント（９）を得
た。 最後に、ヘキザマ−（９）と（ｌＯ）とを、無水ピリジ
ン（２＊Ｑ）中、′Ｉ’　Ｐ　Ｓ　Ｔｅ（７５＠ｇ、０
．２２５ｍＭ）を縮合剤とじ℃用いて結合さ且た。反応
完了後（周囲温度で４時間）、混合物をロータリーエバ
ポレーターで蒸留し、残留物をシリカゲルクロマトグラ
フィーにかけた。石油エーテルを加えると生成物（Ｉ　
Ｉ　Ｘｌ　６０ｍｇ）が析出した。こうして得たものは
Ｔ　Ｌ　Ｃでホモジーニアスであった。化合物（１１）
の一部（２０ｚｇ）をピリジノ（０５好）に入れ、濃水
酸化アンモニウム処理（７ｍ１２．８時間、６０°Ｃ）
および８０％酢酸処理（１５分間、周囲温度）をこの順
序で行うことにより、完全に脱保護した。酢酸を留去し
た後、固型残留物を４％水酸化アンモニウム水溶液（Ｖ
／Ｖ、４ｙＱ）に溶かし、エチルエーテル（３ｙ、２ｚ
ρ）で抽出した。水層を１〜２屏ρに濃縮し、その一部
をＨＰ　Ｌ　Ｃにかけて（１２）を精製した。主ピーク
に相当する両分をプール化（約２Ａｔｓ＋単位）、約５
ＭＱに濃縮した。この最終生成物（１２）を、Ｂｉｏ−
ｇｅｔ　　Ｐ−２（］、５ｙ、１００ｃｍ）にかけ、２
０％エタノール水溶液で溶離して脱塩処理し、減圧上乾
固した後、水（２００μＣ）に再懸濁してＡ　ｔ５４＝
　Ｉ　Ｏの溶液とした。化合物（１２）の配列を２次元
配列決定法で確認した。 ソマトスタチン（Ｉ　ｔａｋｕｒａら、＋９７７）、イ
ンシュリン（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９）および成長
ホルモン（Ｇｏｅｄｄｅｌら、ｌ９７９、Ｎａｔｕｒｅ
２８１　：５４４）に関して既に詳細に述べられている
方法に従って、１６個の合成オリゴヌクレオチドから、
完全なチモンンα１遺伝子を組立てた。１０μｇづつの
オリゴヌクレオチドＴ、〜Ｔ１５を、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｉ　９７９）のＰ３
２ ｒｒ存在下（７）　−ＡＴＰ（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎ
ｄＮｕｃｌｅａｒ）で定量的にリン酸化し、比活性的Ｉ
Ｃｉ／ｍｍｏｌのものを得た。この放射性同位元素でラ
ベルしたフラグメントを２０％ポリアクリルアミド／７
Ｍ尿素ゲル電気泳動法で精製し、溶出したフラグメント
の配列を、２次元電気泳動法／部分的ヘビ毒消化物のホ
モクロマトグラフィー法（Ｊａｙら、１９７４、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　　Ｉ　：３３１
）に従って確認した。フラグメントＴ１及びＴＩ８は、
以後のライゲ〜ンヨン反応に伴う望ましくない重合反応
を最小用度にとどめるため、りん酸化せずにおいた。こ
れらのオリゴヌクレオチド（各２μ９を、公知の手法（
Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｉ　９７９）に従い、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼによって、４フラグメントからなる４つのグルー
プに組立てた（第１３図参照）。こうして得た生成物を
７Ｍの尿素を含んだ１５％ポリアクリルアミドゲルによ
るゲル電気泳動法で精製した（マクサム（Ｍａｘａｍ）
およびギルバート（Ｇ　１ｌｂｅｒｔ）、ｌ９７７、プ
ロナス（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳ　Ａ　７１　：
３４５５）。単離した４種の生成物をライケートし、反
応混合物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で
解析した。デモノンアルファ１遺伝子の大きさく９０〜
＋０５塩基対）のＤＮＡを電気溶離して得た。 プラスミドＩ＞ＢＲ３２２（０，５１ｔｇ＞をＢａｍＨ
ＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア−セで処理し、
生成したフラグメントをポリアクリルアミドゲル電気泳
動法で分離した。大きいフラグメントを電気溶離したゲ
ルから回収し、組立てた合成りＮＡとライケートした（
ゲラデル（Ｇｃｅｄｄｅｌ）ら、１９７９、ネイヂ−？
　−（Ｎａｔｕｒｅ）２８１：５４４　１９７９）。こ
の混合物をＥ、ｃｏｌｉＫ　ｌ　２菌ｆｉｉ２９４（Ａ
ＴＣＣＮｏ、３１４４６）の形質転換に用いた。この形
質転換混合物の５％を２０μｇ／πＱのアンピンリンを
含んたＬＢ平板上においた。得られた４つのアンピンリ
ン耐性コロニーはテトラザイクリン感受性であり、テト
ラサイクリン耐性遺伝子への挿入を示唆した。これらの
コロニーから得られたプラスミドを分析した結果、との
場合にも、このプラスミド（ｐＴｈαｌと命名）は、（
ａ）ｐＢ　Ｒ３２２自身には含まれていないＢｇ１１１
部位を含んでおり（第１１図に示すチモンンアルファｌ
遺伝子の存在を示唆している）、（ｂ）ＢａｍＨＩ／Ｅ
ｃｏＲＩ開裂で生じた約１０５個の塩基対から成るフラ
グメントを含んでいた。プラスミドｐＴｈαＩの組立て
図（縮尺通りでない）を添付の第１３図に示す。図中、
黒点（）は５°−ホスフェート基を表している。 ３）処理ｐ’ｒｈαｌとＬＥ’（ｄ）フラグメントの反
応 プラスミドｐＴｈαｌは、アンピノリン耐性を特定する
遺伝子と、その５°暗号鎖末端がＥｃｏＲＩ部位に、ま
たその３°末端がＢａｍＨ１部位にクロ−ンされた、デ
モノンα１を特定オろ構造遺伝子を含有している。この
デモノン遺伝１′−は＋３　ｇ　ｌ　＋１部位を□ａｔ
、ている。先に調製したＬ　Ｅ“（ｄ）フラグメントを
受（１入れることができろプラスミドを調製４′ろため
に、このｐＴｈαＩをＥｃｏＲＩ消化し、次いて、ｄ’
ｌ”ＴＰおよびｄＡＴＰを加えてクレノーポリメラーゼ
１反応に付し、ＢｃｏＲ１残分を平滑化［また３、得ら
れ）こ生成物をＦ（ｇｉｌｌ消化オろと、アンピノリン
耐性に関Ａ′ろ遺伝子と、その両方の末端に、１３ｇ１
ｌ！枯着残分と平滑末端とを（］オる直線状Ｄ　Ｎ　Ａ
フラグメントが得らノまた。Ｋｌら４１に生成物を′Ｉ
′４１カーセの存在下、Ｂｇｌｉ粘着末端と平滑末端と
を有するＬＥ’（ｄ）フラクメン）・と反応さ且ろこと
に、Ｌｉ）再環化し、ブチスミＦ’ｐＴｒｐ　２４を得
た。この様に１−で、平滑末端結合か行なわｈた箇１Ｔ
ｉｌｘＥｃｏＲ１部位が再生成されろ。 ト〕　ブチスミｌ”９５０Ｍ７△２△４の組立てｐＴ　
ｒｐ　２４をＢｇｌｌＩとＩ４：　ｃｏ　Ｔ’ｌ　ｌで
順次消化１７、次いてＰΔ（ニド〕にか！−Ｊ、電気溶
離オることにより、Ｌ　ｒ”：　’　（ｄ）ポ１１ペプ
チドのコドンであ−、て、その暗号鎖の３′末端に隣接
するｌεｃｏＲＩ粘着末端と、Ｂｇｌｌｌ粘着末喘を有
するコドンを持ったフラグメントを得た。ごのＬＥ’（
ｄ）フラグメントをプラスミドｐｓＯＭ７△２のＢｇ１
１１部位にクローンして、トリプトファンプロモーター
／オペレ　ターのコントロール士に発現される１、Ｅ゛
ポリペブチ・／ソマトスフチン融合タンパ）７質を形成
さｌることがてきろ。そのためには、（Ｉ）トリブトフ
Ｙノブロモータ　／オペレーターから遠位のＥｃｏＲ１
部位を開裂４−ろた？８Ｊ）に９５０Ｍ７△７の部分的
Ｅｃ。 ＲＩ消化を行う、（２）コドンの解読フレームを適切に
保持オろと共にＥ　ｃｏＲＩ開裂部位を再生成オる様な
プライマ　配ダリの適切な選択が必要である。 ４゛なわぢ、プラスミドｐｓＯＭ７．ｚ＼２（１６μの
を、２０ｍＭトリス（１））−１７、５ン、５　ｍＭ　
Ｍ　ｇ　ＣＩ　２．００２％Ｎ　Ｐ　、　０洗浄剤およ
びｌ　Ｏ０ｍＭＮａＣ１・（Ａむ緩衝液２００μρて希
釈し７．０．５単位のＥｃｏＲｌで処理した。３７℃で
１５分経過した後、反応混合物をフェノール抽出、クロ
ロホルム抽出およびエタ７）−ル沈殿に付し、次いてＢ
ｇｌｌｌで消化（７た。得られたフラグメントの人きい
力をｌ゛八に　ｒ＞法および電気溶離法て１１１離しノ
ー３、この″ノー′／タメノトは＋、ト：’ポリペプチ
ドの近位の末’ｔ（ｐｒｏｘｉｍａｌ　　ｅｎｄ）部分
、叩トン、＋３［’ＨＩＩ１部ｆ？＋の−Ｉ流部！−’
ｌに関する二））・ンｌ　Ｌ　Ｅ“（＋））、、１を△
んている。、次いで二〇）フラグｊン）４、’Ｉ”／Ｉ
Ｉ）ＮＡＩブｆ−セ！７’ｙｇｉ−白゛１・、Ｌｌ）旧
、　Ｅ　’　（ｒｌ）にライク−）Ｌ、プラスミドｐＳ
（’）Ｍ７△２△４を杉成させ、これを１・：　ｃｎｌ
　ｉ菌株２９・１に導入４゛ろと、ｌ・リブトファン−
１°〔１モ　ターフ／オペレーターの＝１）ｌ−Ｌ−１
−ルトに、：＋１’、　’：’：に再ｔ１ηＹ戊さイ１
へ１．ＩＣボリベブヂドとツマトスシーｒ−７から成る
融合々リバ′ノ質か効率良・；（１産さｊｌ、１５、Ｆ
　テトヤザイタリン耐性を特定左；″、逍伝ｒを囲んで
３”末端にＰｓｆ、ｌ残茫を、またそｃ゛・５“末端（
、二Ｂｇ　ｌ　ＩＩ残基を６′−４−る線状ＤＮＡ（］
）組）ｌ／′でプラスミドｐＢＲ３２２をＩＩ　ｉ　ｎ
ｄ　ＩＩＩ　？ｔ’ｆ化し、突出じたＩｆ　ｉ　ｎｄ　
ＩＩＩ末端を８１フタレア　セｌ−消化した１、このＳ
１ヌクレア−セ消化は、１０７ＢのＩＩ　ｉ　ｎｄ　［
１１開裂ｐｒＨｔ３２２を５ｌｌｌｉ衝液（０，３ＭＮ
ａｃｌ、１ｍＭＺｎＣ１？、２５ｍＭ酢酸すｌ・リウシ
・、ｐｌ、＋　４　、５）、３０７１０中、３００中位
のＳｌヌ′７レアーセで、１５℃に１３いて３ｏ　ｌ、
：）間処理オろごとにより行った。３０ｘＳｌヌー７レ
ア−ゼ停止１−４溶液（０，８Ｍ＋・リス塩卸１．５０
ｍＭＥＤ′ｒ”、Ａ）ｌ　ＩノＱを１叫えろこ−（５−
より反応を終丁さ４−！た。この混合物を）Ｊ、　、／
　−ル抽出、りＬＴ　ｃｔホルｌ＼抽出、およびエタノ
　ル沈殿に付し、次いて既述した様に（７てＥｃｏＲＩ
消化［、た。Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ法、次いで電気溶離１グ、
を適用して得られたフラグメントは、ＥｃｏＲＩ情着末
端情事末端端を有し、その暗号鎖がヌクし・オチト、デ
ミノンから開始さイするｔ−１のてあ１）た。この、ヂ
ミジ、／から姶まろＳ１消化ＨｉｎｄｌＩｌ桟！今をり
し・ノーボリメラーセｌ処理ＢｇＩＩＩ残分と混合し、
ライゲーソヨｊンする、二、と１−よ−・てＲｇ　Ｉ　
ｆＪ　ｉ、ＩＪ限部位を再構成するごとができろ１、 そこで、実施例５Ｃで得たフ゛ラスミドｐｓｏＭ７△２
をＢｇ！ｎ消化し、得ら４１１１８ｇ　ｌ　［＋粘着末
輸；を、４種のデオギノヌクレオチドトリポスー？ユー
−ト全てを使用ｌ１、々し・）−ボリメラーセＩて処理
することにより゛重鎖としまた。この生成物をＥＣＯＲ
Ｉで開裂し、ＰＡＧＥにかけ、小さいフラグメントを電
気溶離すると、トリプトファンプロモーター／オペレー
ターと、Ｂｇ１１１部位から４二流の、ＬＥ’ｒ近位」
配列に関するコドン（「Ｌ　Ｅ’　（ｐ）　Ｉ）を持っ
た直線状ＤＮＡ片が得られた。この生成物ｉ、ＪＥｃｏ
ＲＩ末端と、Ｂｇ１１１部位の充填により生成した平滑
末端とを有する。しかしながら、このＢｇｌ■部位は、
該平滑末端を上記Ｓ１消化１１ｉｎｄｆｆｌフラグメン
トの平滑末端にライゲートオろごとにより再構成される
。すなわち、これら２種のフラグメントをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼの存在下にライゲトして再環化したプラスミドｐ
ｌ−ＩＫＹ１０１．を形成させ、コンピテントＥ、ｃｏ
ｌｉ閑株２９４細胞に導入し、形質転換することにより
、増幅さＵた。組換えプラスミドｐＩ４ＫＹ１０１．を
担持しているテトラサイクリン耐性細胞を選択し、その
プラスミドＤＮＡを抽出した。ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔ
ｌ消化、次いでＰＡＧＥ法および電気溶離法により大き
いフラグメントを単離し、ＰｓｔｌおよびＢｇｌＵ両粘
着末端を有する所望の直線状ＤＮＡ片を得た。こうして
ｐＨＫＹｌｏから調製されたＤＮＡフラグメントは複製
起源を有しており、従って、ｔｒｐＬＥ’ポリペプチド
融合タンパク質の暗号遺伝子およびテトラサイクリン耐
性に関する暗号遺伝子の両方力ｔ　ｒｐプロモーター／
オペレーターでコン）・ロールされる、プラスミドｐＨ
ｌ７△４△Ｉの組立て要素の１つとして有用である。 Ｇ、ｔｒｌｌｌプロモーター／オペレーターををする直
線状Ｄ　Ｎ　Ａの組立て 実施例５Ｅで得たプラスミドｐｓＯＭ７△２△４をＥｃ
ｏＲＩ部分消化、次いてｐｓｔｌ消化に付した。得られ
たフラグメントはｔｒｐプロモーター／オペレーターを
含有しており、これをＰＡＧＥ法にかけ、電気溶離する
ことにより単離した。ソマトスフチン遺伝子の５″末端
に隣接したＥｃｏＲ１部位で開裂され、アンピンリン耐
性遺伝子と、ｔｒｐプロモーター／オペレーターとの間
にあるＥｃ。 Ｒｒ部位では開裂されていないフラグメントを得るため
に、ＥｃｏＲ１部分消化が必要であった。アンピンリン
耐性遺伝子中のｐｓｔ１部位を切断することにより失わ
れたアンピンリン耐性は、に記実施例５Ｆで得た最終的
な吐ＩＫＹ１０１．直線状り’ＮＡ誘導体とのライゲー
ションによって回復することができる。 １−１　、プロインツユリンの３２Ｎ−末端アミノ酸を
暗号化している合成遺伝子の製造 プロインツユリンの最初の３２アミノ酸の暗号遺伝子を
組立てるために、第１段階として表２に示ｔ　Ｉ　８個
のオリゴヌクレオヂトを調製した。最終的に組立てられ
た遺伝子の全ヌクし・オヂド配列を第１４図に示す。 表λ ヒトプロインンコリンのための合成オリゴヌクレオヂト 合成ヌクレオチドは、第１４図において角括弧で囲み、
アンダーラインをトｔ　して示されている。 これらのオリゴヌクレオチドは、Ｃｒｅａら（１９７８
）、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９７５１，１，Ｒｉｏｔ、
　　Ｃｈｃｍ２５０：４５９２）およびＩ　Ｌａｋｕｒ
ａら（１９７５１、■、八へ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、
　９７　ニア　３２７）の常法に従って合成された。こ
れらオリゴヌクし・オチドの内幾つかは、Ｃｒｅａら（
＋９７８）およびＧ　ｏｅｄｄｅｌら（１，９７９）に
よって以前に示された、ヒト−インンユリンＢ鎖のため
の遺伝子の組立てに用いられたものである。２個のオリ
ゴヌタレオヂｌ’　（１３５゛とＢ　Ｉ　Ｏ’）は、Ｈ
ｐａ　ＩＩと末端のＢａｍ１４１およびＥｃｏＲ１制限
部位を与える。この末端部位はタローニンクにおいて特
に白”用である。 １−（１−１−１８の８個のオリゴヌクレオチド（」ヒ
トインノコリンＢ鎖遺伝子の左側子分を相ＩＺてろのに
既に用いられており（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９）、
Ｂ鎖遺伝子の１−１３アミノ酸を白し、Ｎ末端に付加的
なメチオニンの暗号配列を含有している。 Ｂ鎖遺伝子の右半分は、オリゴヌクレオチドＢ１、Ｂ７
、Ｂ３、ＢいＢ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９およびＢ、
。を、実質上、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９７９）の教示し
た方法に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼにより、ライゲーシ
ョンすることによって組立てられた。得られた遺伝子フ
ラグメントは、ヒトーインツユリンＢ鎖の１４−３０ア
ミノ酸単位および架橋鎖の最初のアルギニンを暗号化し
ている。この遺伝子配列には、ヒトーインンユリン遺伝
子配列中のＨｐａ■部位と同じ解読フレーム内の同じ位
置に、Ｈｐａ■か組込まＡ１ている。ライゲー　トした
遺伝子フレームをポリアクリルアミドケル電気泳動法で
精製した後、最も大きいＤＮＡのバンドを溶離し、この
フラグメントをＨｉｎｄＴＩＩ−ＢａｍＴＩ　Ｉ切断プ
ラスミドｐＢＲ３２２に挿入した。得られたブチスミＦ
（ｐＢ３と命名）を形質転換によってＥ．ｃｏｌｉＫ１
２２９４内に挿入した。このプラスミドは抗生物質アン
ピノリンおよびテトラサイクリンに対する耐性を付、＋
５シ、従って、所望のヌクレオチド配列を含有している
ことかわかった。 ｐＢ３の５８塩苓対Ｈ１ｎｄｌｌｌ　−Ｂ　ａｍＨＩフ
ラグメントと、ｐＢ　Ｈｌ　（Ｇ　ｏｅｄｄｅｌらによ
り開示、１９７９）の４６塩基対ＥｃｏＩｊ　ｌ　−Ｉ
Ｉ　１ｎｄｌｌｌフラタメントとをライケート（２、Ｅ
ｃｏＲｌおよびＢａｍＩ（Ｉ末端を有するフラグメント
を得た。このフラグメントを常法通り、ＥｃｏＲｌおよ
びＢａｍ１−ＴＩ制限プラスミドｐＢＲ３２２にライゲ
ー　トし、得らＳまたブチスミ）”（１）Ｉ８３と命名
）を、次いてト〕、Ｃ（１１ｉＫ　ｌ　２２９４にクロ
ーンし５た。常法通り増幅さｌて単離した後、ブチスミ
ｔ：’ｐｌＢ３をＥｃｏＲｌとｌ−（ｐａ　ＩＩで消化
することにより、メチオニンによ−、て先行されている
プロインノコリンのトＪ末端アミ２〕酸を暗号化してい
る合成遺伝子フラグメンｌ−（第１５図におけるフラグ
メント１）が得られた。二の合成遺伝ｒをポリアクリル
アミドケル電気泳動法に上、す、常法通り単離した。 ■　ヒトーブロインンユリンの５０−Ｃ末端アミノ酸を
暗号化１２ているｃＤＮＡの単離所望のｃＤＮＡを得る
ための反応式は添（ｑｊの第１６図に示されている。こ
の図に従って説明オろと、ＢａｍＨ１認識配列と約２０
残基からなる３゜ボリヂミンル酸ｌ・ラクトの両者を含
有するデカヌクし・オヂド、ｐＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴ
ＴＴ’、、Ｔを合成し、ｃｌ）ＮΔの合成におけるΔＭ
Ｖ逆転写酵素用のブライマーとして用いた。このプライ
マーは、’ｒＰＴ　ｔ　、５　ｘ　ｌ　Ｏ’μｍｏｌを
含有する反応液０６１中で、ＲａｍＨｌデカヌクレオチ
ド１μｍｏ１にデオキシヌクレオチド末端転移酵素（タ
ー＝ミナルトランスフゴラ　ゼ）（Ｅ　ｎｚｏ　　Ｒｉ
ｏｃｈｅｍ、　２００単位）を作用し、調製した。この
反応は、チャン（Ｃｈａｎｇ）ら（１９７８、ネイチ’
ｖ　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２７５　：６１７）の緩衝系
において３７℃で１時間を要して行−）た。 ヒトー島細胞腫（インスリノーマ）組織はＩｎ５ｔｉｕ
ｙｅ　　ｆｉｉｒ　　Ｄｉａｂｅｔｅｓｆｏｒｓｃｈｕ
ｎｇ（Ｍｕｃｎｃｈｃｎ、　　ＷｅｓｔＧ　ｅｒｍａｎ
ｙ）から供給された。当業者ならば理解し得る様に、ヒ
ト島細胞腫（インスリノーマ）組織は容易に入手てき、
また、その他数多くの医療関係の機関から得ることがで
きる。ヒＩ・島細胞腫組織のポリＡｎ＋ＲＮＡ（２、５
μｇ）を、ウールリッヒ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）ら（＋９７
７、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）　Ｉ　９６：１３
１３）の方法と実質上同様にして単離し、次いでウィソ
ケンス（Ｗｉｃｋｅｎｓ）ら（＋　９７８、Ｊバイオロ
ジカル・ケミストリー（、Ｉ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
）２５３：２４８３）の方法と実質上同様にして二重鎖
ｃＤＮＡに変換した。即ち、反応容５１８０μρ中に１
５１１１Ｍトリス・ＨＣＩ（４２℃におけるｐＨ＝８．
３）、２１ｍＭＫＣｌ、８ｍＭＭｇＣｌ７．３０ｍＭｌ
−メルカプトエタノール、２ｍＭのブライマーｄＣＣＧ
　Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＣＧ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　、、Ｔおよび１　
ｍＭｄＮＴＰｓを含有する反応液を、０℃でプレインキ
ユヘートシた。ＡＭＶ逆転写酵素を加えてがらごの混合
物を４２℃で１５分間インキュベートした。 次いで得られたＲＮＡ／ＤＮＡを常法通り変性した。 補助ｃＤＮＡ鎖の合成は、２５ＴＩＭ　）リス・Ｈｃｌ
（ｐＨ８，３）、３５ｍＭＫＣｌ、４ｍＭＭｇＣＬ、１
５ｍＭβ−メルカプトエタノール、Ｉ　ｍＭｄＮ　Ｔ　
Ｐ　ｓおよび９単位のクレノーポリメラーゼ１を含有す
る容量１５０μｇの反応液中で行った。この混合物を１
５℃で９０分、次いで４℃で１５時間インキュベートし
た。次いで、Ｓ１ヌクレアーゼ（ＭｉｌｅｓＬ　ａｂｏ
ｒａＬｏｒｉｅｓ、　Ｅ　］ｋｈａｒＬ、Ｉ　ｎｄｉａ
ｎａ）　Ｉ　ＯＯ単位により、実質Ｊ、Ｗｉｃｋｅｎｓ
ら（１９７８）の方法に従い、３７℃で２時間Ｓｌヌク
レアーゼ消化を行った。二重鎖ｃＤＮＡ（０，，３７μ
９）を８％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動に付
し、５００塩基対より大きいＤＮＡフラグメントを溶離
した。 実質上マイゼル（ＭａｉｚｅｌＸＩ　９７１、メッソド
・イン・ヴアイａロジイ−（Ｍｅｔｈ、　Ｖｉｒｏｌ、
　）５　：　１８０）の方法に従い、デオキシヌクレオ
チド末端転移酵素を使用してこのフラグメントの３°末
端にオリゴデオキシノチジル酸残基を付加した。次いで
、このｄＣ末端を有するｃＤＮＡフラグメントを、まず
Ｐｓｔｌ制限酵素で消化し、次いで、デオキシヌクレオ
チド末端転移酵素を用いてデオキシグアニジル酸を末端
に付加しておいたｐＢＲ３２２にアニールした。得られ
たプラスミドを用いてＥ。 ．ｃｏ１ｉＫ１２　２９４を形質転換し、生産された細
胞をＬＢおよびＴＥＴ培地にのせた。テトラサイクリン
耐性でアンシピリン感受性のコロニーを単離し、３個の
Ｐｓｔｌ制限部位を有するプラスミドをスクリーンした
。この様な制限部位型は、プロインシュリン遺伝子であ
ることを示すものである（ンユアース（Ｓｕｒｅｓ）ら
、１９８０、ザイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０８　：
５７）。１−）のプラスミド（ｐＨ１１０４と命名）は
、６００塩基対の挿入部分を有し、予期されるＰｓｔｌ
制限型を示し、かつ３゛ポリＡとｃＤ’ＮＡの製造中に
導入されたポリＧＣとの間に１個のＢａｍＨ１部位を含
有している。挿入体のある、ヌクレオチド配列を第１４
図に示す。　　　−Ｊ　ヒト−プロインシュリンの暗号
遺伝子の組立て ヒト−プロインシュリンの暗号遺伝子の組立て模式図は
添付の第１５図に示されている。 プロインシュリンの最初の３１アミノ酸を暗号化してい
る合成遺伝子セグメント（第１５図におけるフラグメン
トＩ）は、曲記の如く、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩおよびＨｐａｌｌを使用し、５０μ９のプラスミド
ｐｌＢ３から回収した。このフラグメントはプロインシ
ュリンの“プレ配列”の代わりにメヂオニンのＡＴＧ配
列をも含有している。 アミノ酸３２〜８６を暗号化しているｃＤＮＡ遺伝子セ
グメント、並びにｍＲＮＡの翻訳停止信号および３′非
翻訳領域は、プラスミドｐＨＩ　１０４を、まずＢａｍ
ＨＩ、次いでＨｐａｎ制限酵素で処理することにより、
該プラスミドから回収した。 この２つのフラグメントを、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法および電気溶離法によって単離した。これらの
遺伝子フラグメントを、リガーゼ緩衝液２０μρ中でＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて、４℃で２４時間処理するこ
とにより結合させた。 この混合物を水５０μＱで希釈し、フェノールおよびク
ロロホルムの各々で抽出してエタノール沈殿に付した。 得られたＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素
で処理し、これらの部位を再生させると共に、遺伝子ポ
リマーを除去した。組立てられたプロインシュリン遺伝
子をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単離し、
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＢ
’Ｒ３２２にライゲートした（Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使
用）。得らイ１ノこ■）ＮΔを用いてｒｌ、ｃｏｌｉＫ
　Ｉ　２　２９４を形質転換し、生成したコロニーをテ
］・ラザイクリン感受性とアンノビリン耐性とに関して
スクリーンした。その様な＝１０ニーから単離されたプ
ラスミドｐＨ＋　３は、後のヌクレオチド配列決定によ
−て確認された所望のプロイン：、−’−１リン遺伝子
を含有１．ていた１、ｌ＜、ヒト−プロインノコリンを
含有→−ろギメラタンパク質の発現のためのプラスミド
の組立てメヂオニンを暗号化しているＮ末端コト：／を
持つ完全なヒト　プロインツユリン遺伝子を、プラスミ
ドｐＩＩ＋　３のＥＣ０ＲＩおよびＢａｍＨ１制限酵素
処理により、該プラスミドから回収（７た。所望のフラ
グメントをゲル電気泳動法で精製し、次いて、プラスミ
Ｆ’ｐＳＯＭ７△２△４のＰ　ｓｔ　ｌ−Ｅ　ｃｏＲ１
部分消化物（実施例５Ｇで調製したしの）とプラスミド
ｐＨＫＹ１０１．のＰｓｉ　ｌ　−Ｂｇｌ　ＩＩｌフラ
グメント内大きい方のもの（実施例５Ｆで調製したもの
）とに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートした。 即ち、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍｆ−（１末端を有する完
全なヒト−プロインシュリン遺伝子約１μ？、Ｐｓｔｌ
　−ＥｃｏＲｌ（部分消化）ｐｓＯＭ７△２△４フラク
メノト４ツノｇおよびｐＨＫＹ１０１．のＰｓｔ　ｌ　
−Ｂ　ｇｌ　ｌ’、Ｉ　フラグメント約１μ９を、ライ
ゲーション緩衝液中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用し、４
℃で２４時間ライゲー　トシた。ライゲートしたｃ＋　
ＮΔ混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉＫ　ｌ　２　２９４を
形質転換しノコ。アンノビリンおよびテトラザイクリン
のい４′れに対しても増殖したコロニーを選択すると、
ごイ１（」所望のプラスミドｐＩ−Ｉ　１７△４△１を
含有しており、かつｔｒｐＬＥ’−プロインツユリン融
合タンパク質に関して予想される分子量のタンパク質を
発現していることか見出された。このタンパク質を発現
するプロインツユリン、ｌ）　ＨＩ７△４△１は、挿入
遺伝子およびベクターの両者に関し、そのＤＮＡ配列並
びに制限部位を完全に確認された。プラスミドｐＨＩ　
７△４△１は添付の第１５図に示されており、これはア
ンノビリンおよびテトラザイクリン耐性が回復されてい
るのて選択が容易である。 笈権例瓜−プラスミＪ”ｐＮ　Ｍ　６０８　ｒ；　、及
びＥ＋Ｃ０１ｉＫｌ　２ＲＶ３０８／ｐＮＭ６０８の組
立てΔ　プラスミドｐＨ１７△４△１の〜２５３　ｂｐ
Ｅｃｏｒえｌ　−１−１ｐａ　Ｉフラグメン１−の組立
てプラスミドｒａｔ（＋　７△４△ＩＤＮ、へ約５１１
７、（１０Ｘ）制限緩衝液※ｌ０ｔｔＱ、水８０μＱお
よびＨｐａ１制限酵素５１１１２（５１位）を３７℃で
約１時間インギコヘートシた。７０°Ｃて５分間、イン
キコヘーノヨンオることにより、反応を停止１ｔ　を刀
二。、混合物を水りで冷却した後、１Ｍ）リス・ｎ　Ｃ
１（ＰＩ−１７２）約＋２ｕＱ、水７ＩＩＱおよびＥｃ
ｏＲＩ制限酵素１ＩＩＱ（１０単位）を加えた。得られ
た混合物を、まず３７℃で１時間、次いで７０°Ｃで５
分間イノキコヘートシた。水」−で冷却した後、得らイ
またＤＮＡをフェノール、およびクロロホルムイソアミ
ルアルコール（２４，＋１）混液の各々で抽出し、次い
でエタノール沈殿に付した。所望の〜２５３ｂｐＥ　ｃ
ｏＲＩ　−Ｈｐａ　ｌフラグメントを常法通り、７ｖリ
アクリルアミ）パゲル電気泳動法て分離し、電気溶離法
て回収してエタノール沈殿に付し、次いて′ｒｐ：緩衝
液約１０／ｌ（に溶かし、以後の使用に備えて０℃で保
存した。 ※　Ｈｐａｌ制限酵素用の制限緩衝液（１０１．Ｘ）は
次の成分から調製されろ　１００ｍＭ）リス・Ｉ−（Ｃ
Ｉ（＋）Ｈ７）、　　ｌ　　０　０ｍＭＭｇＣｌ、、　
　６０ｍＭ　β　−メ　ルプＪブトエタノールおよび２
００ｍＭ　ＫＣｌ０Ｂ、プラスミドｐＨｌ　７△４△ｌ
の〜３４　ｈｐｆ（ｐａｌ−Ｔａｇｌフラグメン］・の
組 立てプラスミドｐＨ１７△４△ｌ約２０１ｆ：’）（５
’Ｘ）ＥｃｏＲＩ制限緩衝液※３２μ（！中溶液、水＋
９８μρおよびＥｃｏＲＩ制限酵素４μρ（２０単位）
を３７℃で約１時間インキコベートシた。７０℃で５分
間インキコへ−１−＋、て反応を止めた。得られた８６
２　ｂｐＥｃｏＲＩフラグメントを６％ポリアクリルア
ミドゲル上電気泳動、次いで電気溶離にかけて単離し、
エタノール沈殿に付した。次いでこのフラグメントをＨ
ｐａｌ制限酵素１６単位を含有するＨ１’）ａｌ緩衝液
約１００μρに溶かした。３７℃で１５時間処理した後
、Ｔａｇｌ制限酵素７５単位を加え、得られたフラグメ
ントを７．５％ポリアクリルアミドゲル上で常法通り分
離した。電気溶離法によって所望の〜３４　ｂｐＨｐａ
　ｌ−１，’ａｇ　Ｉ　７ラグメントを回収し、エタノ
ール沈殿に付した後、ＴＥ緩衝液５μＱに溶かした。 ※　ＥｃｏＲＩ制限酵素用の制限緩衝液（５Ｘ）は次の
成分から調製された２５０ｍＭＮａＣｌ、５００ｍＭト
リス・ＭＣＩ（＋）Ｈ７，２）、２５ｍＭＭｇＣＬおよ
び３０ｍＭβ−メルカプトエタノール。 Ｃ，プラスミドＩ）ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ　−Ｃｌａ
　Ｉ消化 プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ約５１ｔ’ｉ、ＣｌａＩ
反応ミックス※１０μρ、水７７．５μＱおよびＣ１ａ
ｌ制限酵素７．５ｄ（１５単位）を３７℃で約１時間イ
ンキユヘートした。７０℃で５分間インキュベートして
反応を止めた。この混合物を氷上て冷却した後、１Ｍト
リス・ＨＣＩ（［）８７．２）約１２５ｔｔＱ、１ＭＮ
ａＣ１６，２５μｆ！、０．１ＭＭｇＣ１２２，５μｇ
およびＥＣ０ＲＩ制限酵素１μρ（１０単位）を加えた
。得られた混合物をまず３７°Ｃで１時間、次いて７０
°Ｃで５分間インキコベートした。水冷後、得られたＤ
ＮＡを１％アガロースゲル上電気泳動にかけた。大きい
フラグメントを溶離して回収し、エタノール沈殿に付し
た後、約２０μＣのＴＥ緩衝液に溶かし、以後の使用に
備えて０°Ｃで保存した。 ※　Ｃ１ａｌ制限酵素のための制限ミックス（１０Ｘ）
は次の成分から調製した　］ＯＯｍＭ）リス・ＨＣＩ（
ｐＨ７，４）、ｌ　ＯＯｍＭＭｇＣＩ２および６０ｍＭ
β−メルカプトエタノール。 Ｄ　ライゲーションおよび形質転換 実施例２Ｄと実質上同様にして、実施例６Ａの〜２５３
　ｂｐＥｃｏＲＩ　−Ｈｐａ　ｒフラグメント約０．２
／Ｉｇ、実施例６ＢのＨｐａ　Ｉ　−Ｔａｇ　Ｔフラグ
メント０５μ２および実施例６ＣのＥｃｏＲｒ　−Ｃ１
ａ　Ｉ消化物０．１μ９をライゲートし、Ｅ　、ｃｏｌ
ｉＫ　Ｉ　２　ＲＶ３０８の形質転換に用いた。得られ
た形質転換体の内、あるものは、通常のアガロースゲル
電気泳動法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、＋９８２）等の試験
の結果、所望の〜４．６ｋｂプラスミドのみを含有して
いた。 その様な形質転換体（Ｅ’、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２　ＲＶ
　３０　Ｂ／ｐＮＭ６０８と命名）を選択し、適当な抗
生物質を含有するＴＹ寒天上にのせ、微生物学上の常法
に従って培養した。プラスミドｐＮＭ６０８は、プラス
ミドｐＨＩ　７△４△Ｉの〜２８７　ｂｐＥｃｏＲＩ−
Ｃ１ａｌ（Ｔａｇｌ）フラグメントを含有しており、そ
の好ましい供給源である。 実施例７　プラスミＦｌ）ＣＺＩ０５．１およびＥ。 ｃｏｌｉＫ　１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ　Ｉ　Ｏ５，１の
組立てＡ　プラスミドｐＮＭ６０８のＥｃｏＲｌ　−Ｃ
ｌａ　Ｉ消化および〜０　、２８８ｋｂＥｃｏＲＩ　−
Ｔａｇ、Ｉ　７ラグメント（プラスミドｐＨＩ　７△４
△ｌの０２８８ｋｂＥｃｏＲＩ　−Ｔａｇ　Ｉフラグメ
ントと同一）の生成Ｍｅｄｉｕｍ　　Ｓ　ａｌｔ緩衝液
※５０μＱ中に入れたプラスミドｐＮＭ６０８ＤＮＡ約
５μ７を各１０単位のＥｃｏＲＩ制限酵素およびＣ１ａ
ｌ制限酵素と一緒に３７℃で約１時間インキ、べ−トシ
た。３Ｍ酢酸すトリウム（ｐＨ７，０）５μρを加えた
後、３倍容の１００％エタノールを加えてＤＮＡを沈殿
させた。所望のＤＮＡ消化物をＴＥ緩衝液Ｉ００μＱに
溶かし、以後の使用に備えて０℃で保存した。 ※　Ｍｅｄｉｕｍ　　　Ｓ　ａｆｔ緩衝液は次の成分か
ら調製した：５０ｍＭＮａＣｌ、１００ｍＭトリス・Ｈ
ＣＩ（ｐＨ７、５’）、６ｍＭＭｇＣＬおよび２ｍＭβ
−メルカプトエタノール。 Ｂ、ＤＮＡリンカ−配列の組立て ５’　　ＣＧＡＣＡ　　ＡＴＧ　　ＴＴＣＣＣＡＩＩ’
　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１１３°　　
　ＴＧＴ　　ＴＡＣＡＡＧ　　ＧＧＴＴＴＧ　　ＧＡＧ
　　ＧＡＴ　　ＧＡＴ　　ＴＡＡＩｌｌ　　　　Ｉｌｌ
　　　　ｉ　ｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１１ＡＡＣ
ＣＴＣＣＴＡ　　ＣＴＡ、ＡＴＴＡＴＧ　　ＴＴＣＣＣ
Ａ　　ＧＣＣＡＴＧＩｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　’Ｉ
Ｉ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＴＡＣＡＡＣＧＧＴ　
　ＣＧＧ　　ＴＡＣＴＣＣＴＴＧ　　ＴＣＣＧＧＣＣＴ
Ｇ Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　
　　　ｌ１ｌＡＧＧ　　ＡＡＣＡＧＧ　　ＣＣＧ　　Ｇ
ＡＧΔＡＡ　　ＣＧＧ　　ＴＴＧ　　ＣＧＡ　　Ｃ５’
所望のリンカ−配列を、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９７７
）およびＣｒｅａら（＋９７８）の方法に実質上従って
改良ホスホトリエステル法により、常法通り合成した。 Ｃ，ライゲーシヨンおよび形質転換 実施例２Ｄと実施上同様にして、実施例７ＢのＤ　Ｎ　
Ａリンカ−約２０ピコモル、実施例７ＡのｐＮＭ６０８
消化物１μ？、プラスミド１）ＣＺｌ、０＋の〜Ｉ　０
．２ｋｂＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ１フラグメント（Ｘｂａ
ｌ制限酵素とその緩衝液の代わりにＥｃｏＲＩ制限酵素
と適当な緩衝液を用いる外は実施例２Ｂと同様にして調
製したもの）０５μ９および実施例３Ｂのプラスミドｐ
ｃｚ＋ｏ＋の〜０，６ｋｂＢａｍＨｌ　−Ｈｇ１Ａ　ｌ
フラグメント１μ９をライゲートし、得られノごプラス
ミドを用いてト；、ｃｏｌｉＫｆ２［（Ｖ２Ｏ３を形質
転換した。 得られた形質転換体の内いくつかは、通常のアガロース
ケル電気泳動法（ＭａｎｉａＬｉｓら、＋９８２）その
他の試験の結果、所望の〜１０．８ｋｂプラスミドのみ
を含有していた。その様な形質転換体（Ｅ、ｃｏｉｉＫ
１２ＲＶ３０８／１）ＣＺＩ０５．ｌと命名）を選択し
、適当な抗生物質を含んたＴＹ寒天」−にのせ、微生物
学上の常法に従って培養した。得られた細胞は、ＳＤＳ
ゲル電憩電動泳動びＲ，Ｉ　Ａ等の試験により、ｍｅｔ
−ｂ　Ｇ　Ｈを高レベルで発現することが示された。プ
ラスミドｐｃｚｉｏｓ、＋は熱誘導性のランナウェイレ
プリコンを含有しているので、ｍｅｔ　−ｂ　Ｇ　Ｈの
発現は培養温度約３７℃のとき、最大となる。 実施例８　プラスミドｐｃＺ１０５．２およびＥ。 ｃｏ１ｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐｃＺ１０５．２の組立て
実施例７におけるリンカ−配列の代わりに配列５’　　
ＣＧＡＣＡ　　ＡＴＧ　　ＴＴＣＣＣＡｌ１１　　　　
Ｉｌｌ　　　　１１１　　　　ｌ１１３°　　　ＴＧＴ
　　ＴＡＣＡＡＧ　　ＧＧＴＴＴＧ　　ＧＡ’ｌ’　　
ＧＡＴ　　ＧＡＴ　　ＴＡＡＩｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　
　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＡＡＣＣＴＡ
　　ＣＴ’Ａ　　ＣＴＡ　　ＡＴＴＡＴＧ　　ＴＴＣＣ
ＣＡ　　ＧＣＣＡＴＧＩｌｌ　Ｉｌｌ　Ｉｌｌ　Ｉｌｌ
　ｌ１ｌＴＡＣＡＡＧ　　ＧＧＴ　　ＣＧＧ　　ＴＡＣ
］’ＣＣＴＴＧ　　ＴＣＣＧＧＣＣＴＧＩｌｌ　　　　
Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　１１１Ａ
ＧＧ　　　ＡＡＣＡＧＧ　　　ＣＣＧ　　　ＧＡＣＴＴ
Ｔ　　ＧＣＣＡＡＣＧＣＴ　　ＧＴＧＣＴ３゜Ｉｌｌ　
　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉ
ＡＡＡ　　ＣＧＧ　　ＴＴＧ　　ＣＧＡ　　Ｃ５’で示
されるＤＮＡリンカ−配列を用いる外は実施例７と実質
−１ユ同様にＣて所望の組立てを行う。上記の特定のリ
ンカ−配列は、Ｉ　ｔａｋｃ＋ｒａら（１９７７）およ
びＣｒｅａら（＋９７８）の通常の方法と実質１−同様
にして組立てろことができろ。上記の合成法も実施例１
に示されている。 以後のｐｃ７．１０１．２，２の生産および単離のため
に、所望の形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ、ｌ　２　ＩＩ
　Ｖ　３０８／ｐＣＺＩ０５．２と称する）を適当な抗
生物質を含んだＴＹ寒天上にのせ、常法通り培養（７た
３、この形質転換体もＳＤＳゲル電気泳動およびＲＩ　
Ａ等の試験の結果、ｎｅｔ　−ｂＧ　Ｈを高レベルに発
現することが示された。プラスミドｐｃＺ１０５．２は
熱的に誘導可能なランナウェイレプリコンを含有してい
るので、ｍｅｔ−ｂＧＨの発現は培養温度約３７℃のと
き、最大となる。 櫂１１−　プラスミドｐｃＺＩ０６１およびＥｃｏ１ｉ
Ｋ１２ＲＶ３０８／Ｉ）ＣＺＩ０６．１の組立て実施例
７におけるリンカ−配列の代わりに配列５’　　　ＣＧ
ＡＣＣＡＴＧ　　　ＧＡＴ　　ＣＡＧＩｌｌ　　　　１
１１　　　　ＩＩＩ　　　　ｌ１１３’　　　　　ＴＧ
ＧＴΔＣＣＴＡ　　ＧＴＣＧ　Ａ　Ｇ　　　Ｔ　Ａ　Ａ
　　　Ａ　Ｔ　Ｇ　　　Ｔ　Ｔ　ＣＣＣＧＩｌｌ　　　
　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌ
ＣＴＣＡＴＴ　　　ＴＡＣＡＡＧ　　　ＧＧＣＧＣＴ　
　　ＡＴＧ　　　ＴＣＣＴＴＧ　　　ＴＣＣＩｌｌ　　
　　Ｉｌｌ　　　　’ｌ’　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１
ｌＣＧＡ　　　ＴＡＣＡＧＧ　　　ＡＡＣＡＧＧＣＧＧ
　　　ＧＡＧ　　　ＡＡＡ　　　ＣＧＧ　　　ＴＴＧＧ
ＣＴ　　　ＧＴＧＣＴ　　３’ ＣＧＡ　　　Ｃ５゜ で示されろＤＮＡ配列を用いる外は実施例７と実質−１
−同様にして所望の組立てを行う。上記の特定のリンカ
−配列は、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９７７）およびＣｒ
ｅａら（＋９７８）の通常の方法と実質上同様にして組
立てることができる。上記の合成法も実施例１に示され
ている。 以後のｐｃＺＩ０６．１の生産および単離のために、所
望の形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ　ｌ　２　ＲＶ　３０
８／ｐｃＺＩ０６．１と称する）を適当な抗生物質を含
んたＴＹ寒天」−にのせ、常法通り培養した。この形質
転換体もＳＤＳゲル電気泳動およびＲＩＡ等の試験の結
果、ｍｅｔ−ｂＧＨを高レベルに発現することが示され
た。プラスミドｐｃＺＩ０６．ｌは熱的に誘導可能なラ
ンチウェイし・プリコンを含有しているので、ｍｅｔ−
ｂＧＨの発現は培養温度約３７℃のとき、最大となる。 実施例１０　プラスミドｐｃＺ１１２．ＩおよびＥ、ｃ
ｏｌｉＫ　１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ　Ｉ　Ｉ　２．１の
組立て 実施例７におけるリンカ−配列の代わりに、配列： ５’　　ＣＧＡＣＣＡＴＧ　　ＧＡＴ　　ＧＡＴＩｌｌ
　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　ｌ１１３’　　　　ＴＧＧ　
　ＴＡＣＣＴＡ　　ＣＴＡＡＡＧ　　ＴＡＡ　　ＡＴＧ
　　ＴＴＴ　　ＣＣＧＩｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　
Ｉｌｌ　　ｌ１ｌＴＴＣＡＴＴ　　ＴＡＣＡＡＡ　　Ｇ
ＧＣＣＧＡ　　ＴＡＣＡＧＧ　　ＡＡＣＡＧＧＣｃｃ　
　ＧＡＧ　　ＡＡＡ　　ＣＧＧ　　ＴＴＧ（、ＣＴ　　
ＧＴＧＣＴ　　３“ ＣＧＡ　　Ｃ５’ で示されるＤＮＡ配列を用いる外は実施例７と実質上同
様にして所望の組立てを行う。上記の特定のリンカ−配
列は、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（４９７７）およびＣｒｅａ
ら（１９７８）の通常の方法と実質上同様にして組立て
ることができる。上記の合成法も実施例１に示されてい
る。 以後のＩ）ＣＺ１１２．１の生産および単離のために、
所望の形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２ＲＶ３０８
／ｐＣＺＩ　Ｉ　２．１と称する）を適当な抗生物質を
含んだＴＹ寒天上にのせ、常法通り培養した。この形質
転換体もＳＤＳゲル電気泳動およびＲＩＡ等の試験の結
果、ｍｅｔ−ｂＧＨを高レベルに発現することが示され
た。プラスミドｐｃＺＩ１．２．１は熱的に誘導可能な
ランチウェイレプリコンを含有しているので、ｍｅｔ−
ｂＧＨの発現は培養温度約３７℃のとき、最大となる。 実施例１１　　プラスミドｐｃｚＩ　１２．２およびＥ
、ｃｏｌｉＫｌ　２ＲＶ３０　Ｂ／ｐＣＺ　１１２．２
の組立て 実施例７におけるリンカ−配列の代わりに、配列： ５°　ＣＧＡＣＣＡＴＣＧＡＴ　　（１；ＡＴＩｌｌ　
　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　ｌ１１３’　　　　１’ＧＧ　
　ＴＡＣＣＴＡ　　ＣＴＡＡＡＧ　　ＧＡＧ　　ＴＡＡ
　　ＡＴＧ　　ＴＴＴＩｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　
Ｉｌｌ　　ｌ１ｌＴＴＣＣＴＣＡＣＣＴＡＣ、ＡＡＡ ＣＣＧ　　ＧＣＴ　　ＡＴＧ　　ＴＣＣＴＴＧＩｌｌ　
　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　ｌ１ｌＧＧＣＣＧＡ
　　ＴＡＣＡＧＧ　　ＡＡＣＡＧＧ　　ＣＣＧ　　ＧＡ
Ｇ　　ＡＡＡ　　ＣＧＧＡＡＣＧＣＴ　　ＧＴＧＣＴ　
　３゜ Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　１ ＴＴＧ　　ＣＧＡ　　Ｃ５゜ で示されるＤＮＡ配列を用いる外は実施例７と実質上同
様にして所望の組立てを行う。上記の特定のリンカ−配
列は、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９７７）およびＣｒｅａ
ら（１９７８）の通常の方法と実質」二同様に１、て組
立てることがてきる。」二重の合成法も実施例１に示さ
れている。 以後のｐｃｚｌ　１２．２の生産および単離のために、
所望の形質転換体（Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０．８／
ｐｃＺ１１２．２と称する）を適当な抗生物質を含んだ
ＴＹ寒天上にのせ、常法通）培養した。この形質転換体
もＳＤＳゲル電気泳動およびＲＩＡ等の試験の結果、ｍ
ｅｔ−ｂＧＨを高レベルに発現することが示された。プ
ラスミドｐＣＺＩ　１２．２は熱的に誘導可能なランナ
ウェイレプリコンを含有しているのて、ｍｅｔ−ｂＧＨ
の発現は培養温度約３７℃のとき、最大となる。 実施例１２　プラスミドｐｃＺＩ０００およびＥ、ｃｏ
ｌｉＫ　ｌ　２ＲＶ３０８／ｐＣＺ　１０００の組立て 実施例３Ｃにおけるリンカ−配列の代わりに、配列： ５°　ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡ　　ＡＴＧｉ
　１１１１１　Ｉ　１１　Ｉ　］　１　　１１１３’　
　　　　　ＴＣＣＣＡＴＡＡＴＴＡＴ　　ＴＡＣＧＡＴ
　　ＣＡＧ　　ＧＡＧ　　ＧＡＴ　　ＴＡＡＩｌｌ　　
　　Ｉｌｌ　　　　Ｉ’ｌｌ　　　　ｆｉｌ　　　　ｌ
１ｌＣＴＡ　ＧＴＣＣＴＣＣＴＡ　　ＡＴＴＴＡＣＡＡ
Ａ　　ＧＧＡ　　Ｃ，ＧＡ　　ＴＡＣゴＣＣＴ　Ｔ　　
Ｇ　　　　Ｔ　　ＣＣＧ　　Ｇ　　ＣＣＴ　　ＧＩｌｌ
　ＩＭ　ＩＩ”　ＩＩ　’ＩＩ Ａ　Ｇ　Ｇ　　　Ａ　Ａ　ＣＡ　Ｇ　Ｇ　　　ＣＣＧ　
　　Ｇ　Ａ　ＣＴＴＴ　　　　ＧＣＣＡＡＣＧＣＴ　　
　　Ｇ　　ゴＧＣＴ３゜Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　
’ｌ’　　　　１１１　　　１ΔＡΔ　　ＣＧＧ　　’
］”ＴＧ　　ＣＧＡ　Ｃ５゜で示されろｌ）ＮΔリンカ
−配列を用いろ外は実施例３と実質上同様にして所望の
組入ｆてを行う。上記の特定のリンカ−配列は、Ｉ　ｔ
ａｋｕｒａら（１９７７）およびＣｒｅａら（＋　９７
８）の通常のｊｊ法と実質」」同様にして組立てること
かできろ。−１−記の合成法ら実施例１に示されている
。 以後のｐｃＺＩｏｏｏの生産および単離のために、所望
の形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２　ｎ’、Ｉ　３
０８、、’ｐｃｚ＋ｏｏｏと称する）を適当な抗生物質
を含んだＴＹ寒天−１，にのせ、常法通り培養した。こ
の形質転換体らＳＤＳゲル電気泳動およびＲＩ　Ａ等の
試験の結果、ｍｅｔ　−ｂ　Ｇ　Ｈを高し・ベルに発現
することが示された。プラスミドρＣ７，Ｉ　Ｏ００は
熱的に誘導可能なランチウェイレプリコンを含有してい
るので、ｍｅｔ−ｂＧＨの発現は培養温度約３７℃のと
き、最大となる。 実−施−例↓−１プラスミドｐＣＺ　Ｉ　Ｏ００，１お
よびＥ、ｃｏｌｉＫｌ　２ＲＶ３０８／ｐｃＺ＋０００
．１の組立て 実施例３Ｃにお（」るリンカ−配列の代わりに、配列 ５°　ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡ　　ＡＴＧ１
１１’１ｌｌｌｌｌｌｌ　　ｌ１１ ３°　　　　　′Ｊ″ＣＣＣＡ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　ＴΔ
Ｔ　　ＴＡＧＧＡＴＣΔＧＴ’Ａハ　ＡＴＧ　　ＴＴＴ
ｊｊｊ　　ｊｊｊ　　１ｊｊ　　ｊｊ　Ｉ　ｊｊ　１Ｃ
ＴＡ　　ＧＴＣＡＴＴ　　ＴＡＣＡＡＡＣＣＧ　　ＧＣ
Ｔ　　ＡＴＧ　　ＴＣＣＴＴＧＩｌｌ　　Ｍｌ　　’Ｉ
Ｉ　　Ｍｌ　　’ＩＩＧＧＣＣＧ八　′ＦΔＣＡＧＧ　
　ＡＡＣ′ｌＩ’ｃｃ　　ＧＧＣＣＴＧ　　ＴＴ’ｌ”
　　ＧＣＣＩｌｌ　　１１１　　Ｉｌｌ　　Ｉｌｌ　　
ｌ１ｌＡＧＧ　　ＣＣＧ　　ＧＡＣＡＡＡ　　ＣＧＧＡ
ＡＣＧＣＴ　ＧＴＧＣＴ　　３゜ Ｉｌｌ　　　　ＩＩ’　　　　Ｉ Ｔ’ＦＧ　　ＣＧＡ　　Ｃ５’ で示されるＤＮＡリンカ−配列を用いる外は実施例３と
実質上同様にして所望の組立てを行う。上記の特定のリ
ンカ−配列は、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９７７）および
Ｃｒｅａら（＋９７８）の通常の方法と実質上同様にし
て組立てることができる。上記の合成法ら実施例１にボ
されている３、 以後のＩ）ＣＺ　１０００．１の４１ｐ７および単離の
ために、所望の形質転換体（ｌう。ｃｏｌｉＫ　ｌ　２
　ＲＶ　３０８／１）Ｃ１，１０００，１と称する）を
適当な抗生物質を含ん人立ＴＹ寒天」二にのり、常法通
り培養し、八。 この形質転換体もＳＤＳゲル電気泳動およびＩ’ｔ　Ｉ
Δ等の試験の結果、ｍｅ［−ｂＧＨを高１ノベルに発現
することが示された。ブチスミＦ’ｐＣＺ　Ｉ　Ｏ００
１は熱的に誘導ｒＩＪ能なランナ・クエイＬ、プリコン
を含有しているのて、ｍｅｔ−ｂ　Ｇ　Ｉ−１の発現は
培＃温度約３７℃のとき、最大となる。 宋１綻剋−↓−４−プラスミドｐｃ７．１０６０および
Ｅ、ｃｏｌｉＫＩ　２ＲＶ３０８／ｒ）ＣＺＩ　０６０
の組立て 実施例３Ｃにお（するリンカ−配列の代わりに、配列 ５°　Ｃ’ＩＩ’　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ａ　
ｉ”　Ｔ　ＡΔＴＡ　　ΔＴＧ１１！１！１１１１１１
１　　　　ｌ１１３　’　　　　　　Ｔ　ＣＣＣＡ　Ｔ
　Ａ　Ａ　１”　’ＩＩ″Ａ’ｌ’　　ＴＡＣＧΔＴ　
ＧＡＴ　　ＡＡＧ　　ＴＡΔ　ＡＴＧｌｌｌ　　Ｉｌｌ
　　　Ｉｌｌ　　　１１１　　ｌ１ｌＣ′ｌ”Ａ　　Ｃ
ＴＡ　　Ｔ’ｒＣＡＴＴ　　ＴΔ０’１’　ｉ’　ＣＣ
ＣＡ　　　Ｇ　ＣＣＡＴＧ　　　ＴＣＣ：１１１１１１
１：１：１１１１ ＡＡＧ　　　ＧＧＴ　　　ＣＧＧ　　　ＴＡＣＡＧＧＴ
　Ｔ　Ｇ　　　ｉ’　ＣＣＧ　Ｇ　ＣＣＴＧ　　　Ｔ　
ｉ’　Ｔ１リリ１１１１１１１１１１ ＡＡＣＡＧＧ　　　ＣＣＧ　　　ＧΔＣＡ、ＡＡＧＣＣ
ＡＡＣＧＣ’ｌ″　ＧＴＧＣＴ　　３’Ｉｌｌ　１．閣
１１１） ＣＧＧ　　ＴＴＧ　　ＣＧＡ　　Ｃ５“て示されるＩ）
　Ｎ’　Ａリンカ−配列を用いる外は実施例３と実質」
二同様にして所望の組立てを行う。上記の特定のリンカ
−配列は、ｌ　ｔａｋｕｒａら（１９７７）およびＣｒ
ｅａら（１９７Ｂ）の通常の方法と実質、上回様にして
組立てろことができる。上記の合成法し実施例１に示さ
れている。 以後のｐＣ７，＋０６０の生産および単離のために、所
望の形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２　ＲＶ　３０
８／ｐｃｚ　１．０６０と称する）を適当な抗生物質を
含んだＴＹ寒天上にのせ、常法通り培養した。この形質
転換体もＳＤＳゲル電気泳動およびＲＩＡ等の試験の結
果、ｍｅｔ−ｂＧＩ−１を高し・ベルに発現することが
示された。プラスミドｐｃｚ＋ｏｅｏは熱的に誘導可能
なランチウェイレプリコンを含有しているのて、ｍｅｔ
−ｂＧＨの発現は培養温度約３７℃のとき、最大となる
。 聚靴鯉り晃　プラスミドｐｃ／、１１２０およびＥ、ｃ
ｏ１ｉＫＩ２ＲＶ３０８／１）ＣＺＩ　１２０の組立て 実施例３Ｃにおけるリンカ−配列の代わりに、配列： ５°　ＣＴＡＧＡＧＧＧ’ｌ’ＡＴＴＡＡＴＡ　　ＡＴ
Ｇｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ　　　　１１３　’　　　
　　　Ｔ　ＣＣＣＡ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　’ｒΔＴ’ｌ”
ＡＣＧＡＴ　　ＧＡＴ　　ＡＡＧ　　ＴＡＡ　　ΔＴＧ
Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　
　　　ｌ１ｌＣＴ　　Δ　　　ＣＴＡ　　　　ゴＴＣＡ
ＴＴ　　　　Ｔ　　Δ　ＣＴＴＴ　ＣＣＧ　　ＧＣＴ　
　ＡＴＧ　　ＴＣＣＩｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉｌ
ｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＡＡＡ　　ＧＧＣＣＧ
Ａ　　ＴＡＣΔＧＧＴＴＧ　　ＴＣＣＧＧＣＣＴＧ　　
１”Ｔ’ｆ”Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｉｌｌ　　
　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＡＡＣＡＧＧ　　　　ＣＣＧ
　　　　ＧＡＣＡ、へΔＧ　ＣＣＡ　Ａ　ＣＧ　ＣＴ　
　Ｇ　Ｔ　Ｇ　ＣＴ　　３　’Ｉｌｌ　　　　Ｉｌｌ　
　　　ＩＩ” ＣＧＧ　　Ｔ’ｌ’Ｇ　　ＣＧＡ　　Ｃ５’で示される
ＤＮＡリッカー配列を用いる外は実施例３と実質」二同
様にして所望の組立てを行う。上記の特定のリンカ−配
列は、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９７７）およびＣ’ｒｅ
ａら（１９７８）の通常の方法と実質上同様にして組立
てることができる。」二重の合成法ら実施例１に示され
ている。 以後のｐｃＺ１１２０の生産および単離のために、所望
の形質転換体（Ｅ、ｃｏｌｉＫ　Ｉ　２　ＲＶ　３０８
／Ｉ）ＣＺＩＩ２０と称する）を適当な抗生物質を含ん
だＴＶ寒天上にのせ、常法通り培養した。この形質転換
体もＳＤＳゲル電気泳動およびＲＩＡ等の試験の結果、
ｍｅｔ−ｂＧＨを高し・ベルに発現することか示された
。プラスミドｐｃＺ１１２０は熱的に誘導可能なランチ
ウェイレプリコンを含有しているので、ｍｅｔ−ｂＧＨ
の発現は培養温度約３７℃のとき、最大となる。 寒塵辺±ρ−プラスミドｐｃＺＩＩ４０およびＥ．ｃｏ
ｌｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＣＺＩ　１４０の組立て Ａ　プラスミドｐＮＭ５７５のＢ　ａｍＨＩ　−Ｆ　ｎ
ｕＤ■消化および〜０．５ｋｂＢａｍＨＩ−ＦｎｕＤＵ
フラグメントの生成 Ｍｅｄｉｕｍ　　５ａｌｔ緩衝液※５０ｕ（ｌ中に入れ
たプラスミドｐＮＭ５７５（実施例ＩＢ″ＣＩ製）約５
μ２をｆ５１０単位の１３ａｍｌ−１１制限酵素わ、Ｊ
：びＦｎｕｌ）ＩＩ制限酵素と共に３７°Ｃで約１時間
インギコヘートした。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＩ−１７
，０）５７ｚＱを加えた後、２倍容の１００％エタノー
ルを加えてＤＮＡを沈殿させた。所望のＤ　Ｎ　Ａ消化
物をＴＥ緩衝液１００μＱに溶かし、以後の使用に備え
て０℃で保存した。 ※　Ｍｅｄｉｕｍ　　５ａｌｔ用緩衝液は次の成分から
調製した：５０ｍＭＮａＣ１、ｌＯＯｍＭｔ−リス・Ｉ
−Ｉ　ＣＩ（ｐＨ８）、ｌ　ＯｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｇ　ｌ　
２および６−ｍＭβ−メルカプトエタノール。 Ｂ、ＤＮＡリンカ−配列の組立て ５’　　ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡΔ１゛Δ　ＡＴＧ
ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ　　　　ｌ１１３’　　　　
　　ＴＣＣＣＡＴＡＡｉ”ｒＡＴ　　ＴＡＣＡＡＧ　　
ＧＧＴ　　ＡＡＣＣＴＣＣＴＡＧＡＴ　　ＴＡＡ　　Ａ
ＴＧ　　ＴＴＣＣＣＡｌ１１　　　　Ｉｌｌ　　　　Ｉ
ｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　ｌ１ｌＣＴＡ　　ＡＴＴ　
　ＴＡＣＡＡＧ　　ＧＧＴＡＣＣＡＴＴ　　　ＣＣＣＴ
ＴＡ　　　ＴＣＣＩｌｌ　　　　１１１．１１１　　　
　Ｉｌｌ　　　　ｌ１１１”　Ｇ　Ｇ　　　ＴＡＡ　　
ＧＧＧ　　　ＡＡｉ’　　　ＡＧＧＡＧＧ　　　Ｃ’ｒ
ｉ’　　ＴＴＴ　　　ＧＡＣＡＡＣＩｌｌ　　　　Ｉｌ
ｌ　　　　Ｉｌｌ　　　、１１１　　　　ｌ１ｌＴＣＣ
Ｇ　　Δ　△　　　、へ　Δ　Ａ　　　　ＣＴＧ　　　
　ＴＴＧＧＣＴ　　ＡＴＧ　　ＣＴＣＣＧ　　　３’Ｉ
ｌｌ　　　　Ｉｌｌ　　　　’ＩＩ　　　　１１ＣＧＡ
　　ＴＡＣＧＡＧ　　ＧＣ５’ 上記特定のリンカ−配列を、Ｉ　ｔａｋｕｒａら（１９
７７）およびＣｒｅａら（＋９７８）の方法に実質上従
って合成した。−１−記の方法も実施例Ｉに示されてい
る。 Ｃ，ライゲーションおよび形質転換 実質上、実施例２Ｄと同様にして、実施例１６ＢのＤＮ
Ａリンカ＝約２０ピコモル、実施例１６ＡのＢａｍＨｌ
　−ＦｎｕＤ　Ｕ消化物Ｉｎおよび実施例３Ａの〜ｌ　
０．２ｋｂＢａｍＨＩ−Ｘｂａｌフラグメント０．５μ
ｇをライゲートし、得られたプラスミドを使用し、Ｅ、
ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８を形質転換した。 得られた形質転換体の内いくつかは、通常のアガロース
ゲル電気泳動法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、＋　９８２）で
、所望の〜１０．８ｋｂプラスミドのみを含存している
ことが示された。その様な形質転換体（ｌε、）ｌｉＫ
　Ｉ　２ＲＶ３０８／１）ＣＺ　Ｉ　Ｉ　４０と称４−
る）を選択し、適当な抗生物質を含んたｉ”Ｙ寒天」二
にのせ、微生物学上の常法に従って培養１．た。得られ
た細飽は、ＳＤＳゲル電気泳動およびＲＩ　Ａ等の試験
により、ｍｅｔ−ｂＧ［Ｉを高レベルで発現することが
示された。プラスミドｐＣＺＩＩ４０は熱誘導性のラン
チウェイレプリコンを自存しているのて、ｍｅｔ−ｂＧ
Ｈの発現は培養温度約３７℃のとき、最大となる。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図はプラスミドｐＮＭ５７５の組立て模式
図、第５図〜第８図はプラスミドｐＮＭ７８９Ｂの組立
て模式図、第９図はプラスミドｐＣＺ１１４およびｐｃ
Ｚ１０５．１の制限サイト地図、第１θ図はプラスミド
ｐＣＺ１１４０の制限サイト地図、第１１図は合成され
たザイモノンα１遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸
配列の模式図、第１２図はヌクレオヂドフラグメントＴ
１５の合成工ｆ呈図、第１３図はプラスミドｐＴｈαＩ
の組立て模式図、第１４図は合成されたプロインシコリ
ンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列の模式図、第１５
図はプラスミドｐＨＩ　７△４△Ｉの組立て模式図、第
１６図はプラスミドＰＩ−（＋１０４の組立て模式図で
ある。 特許出願人　イーライ・リリ　・アンドカンパニー 代理　人　弁理士　青白　葆　外１名 ＦＩＧ、　１ ｐＫＥＮｌｌｌ　　　　　　　　　　　ｐＢＲ３２２Ｆ
ＩＧ、　２ プラスミド１１０３（Ｆ４　１） ＦＩＧ、　３ Ｓａｌ　Ｉ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、７ １１４（日９６） ＦＩＧ、　８ ａｌｌ ＦＩＧ、　９ ｃＺ１１４ Ｂｓｔ　ＥＩＩ ｐｃｚ１０５．１ ＦＩＧ、　１０ ５凌ＲＩ Ｂｓｔ　ＥＩＩ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）ペプチド又はポリペプチドを暗号化しているヌ
   クレオチド配列の解読フレーム内にある転写および翻訳
   活性化配列（ここに、このペプチドまたはポリペプチド
   の暗号配列は、該ペプチドまたはポリペプチドのカルボ
   キシ末端を暗号化しているヌクレオチドトリプレットの
   下流側に隣接した位置に翻訳停止信号を有する）および
   、 ｂ）該停止信号の下流側に隣接し、かつ機能的ポリペプ
   チドを暗号化しているヌクレオチド配列の解読フレーム
   内にある翻訳開始信号（ここに、この機能的ポリペプチ
   ドの暗号配列は、該機能的ポリペプチドのカルボキシ末
   端を暗号化しているヌクレオチドトリプレットの下流側
   に隣接して翻訳停止信号を有する） を含有する組換えＤＮＡ発現ベクターであって、選択可
   能かつ自己複製可能なベクター。 ２、ペプチドまたはポリペプチドを暗号化しているヌク
   レオチド配列中に機能的な翻訳活性化配列が含有されて
   いるものである第１項に記載のベクター。 ３、プラスミドである第１項または第２項に記載のベク
   ター。 ４、ペプチドまたはポリペプチドの暗号配列が、２〜２
   ０個のアミノ酸を暗号化したものである第１、第２また
   は第３項のいずれかに記載のベクター。 ５、ペプチドまたはポリペプチドの暗号配列が、【アミ
   ノ酸配列があります】 （上記の配列において、ＭＥＴはメチオニン、ＰＨＥは
   フェニルアラニン、ＰＲＯはプロリン、ＬＥＵはロイシ
   ン、ＧＬＵはグルタミン酸、ＡＳＰはアスパラギン酸、
   そしてＧＬＮはグルタミンを表わす） で示されるものである第１項〜第４項のいずれかに記載
   のベクター。 ６、転写活性化配列が、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン転
   写活性化配列、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質転写活性化
   配列、Ｅ．ｃｏｌｉラクトース転写活性化配列、バクテ
   リオファージλＰ＿ＬＯ＿Ｌ転写活性化配列、バクテリ
   オファージλＰ＿ＲＯ＿Ｒ、バチルス・サブチリス・ベ
   ジタティブまたは、ストレプトマイシス・アズレウスの
   チオストレプトン耐性転写活性化配列の内のいずれかで
   ある第１項〜第５項のいずれかに記載のベクター。 ７、１またはそれ以上のＥ．ｃｏｌｉ翻訳活性化配列を
   タンデムに配列して含有するものである第６項に記載の
   ベクター。 ８、転写活性化配列がＥ．ｃｏｌｉトリプトファン転写
   活性化配列またはＥ．ｃｏｌｉリポタンパク質転写活性
   化配列である第６項または第７項のいずれかに記載のベ
   クター。 ９、機能的ポリペプチドの暗号配列が、ウシ成長ホルモ
   ン、ヒト成長ホルモン、ヒト−プレ成長ホルモン、ブタ
   成長ホルモン、哺乳類成長ホルモン、鳥類成長ホルモン
   、ヒト−インシュリンＡ鎖、ヒト−インシュリンＢ鎖、
   ヒト−プロインシュリン、ヒト−プレ−プロインシュリ
   ン、インターフェロン、ウロキナーゼ、ヒト組織プラス
   ミノーゲン活性化物質、成長ホルモン放出因子またはイ
   ンターロイキンIIの暗号配列である第１項〜第８項のい
   ずれかに記載のベクター。 １０、機能的ポリペプチドの暗号配列が生物学的に活性
   なポリペプチドを暗号化したものである第１項〜第９項
   のいずれかに記載のベクター。 １１、プラスミドｐＣＺ１１４、ｐＣＺ１０１．１、ｐ
   ＣＺ１０００、ｐＣＺ１０００．１、ｐＣＺ１０６０、
   ｐＣＺ１１２０、ｐＣＺ１０５．１、ｐＣＺ１０５．２
   、ｐＣＺ１０６．１、ｐＣＺ１１２．１、ｐＣＺ１１２
   ．２またはｐＣＺ１１４０である第１項〜第１０項のい
   ずれかに記載のベクター。 １２、第１項〜第１０項のいずれかに記載のベクターで
   あって、さらに、ペプチドまたはポリペプチドの暗号配
   列の翻訳停止信号と、機能的ポリペプチドの暗号配列の
   翻訳開始信号との間に、１または２個のヌクレオチド対
   を有するものであるベクター。 １３、ペプチドまたはポリペプチドの暗号配列の翻訳停
   止信号と、機能的ポリペプチドの暗号配列の翻訳開始信
   号との間に、さらに少なくとも１個のヌクレオチドトリ
   プレットを有するものである第１項〜第１０項のいずれ
   かに記載のベクター。 １４、プラスミドｐＣＺ１０１。 １５、第１項〜第１３項のいずれかに記載の組換えＤＮ
   Ａ発現ベクターによって形質転換された細胞。 １６、原核細胞である第１５項に記載の細胞。 １７、Ｅ．ｃｏｌｉ、バチルスまたはストレプトマイセ
   スの細胞である第１６項に記載の細胞。 １８、Ｅ．ｃｏｌｉに１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ１１４、
   Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ１０１．１、Ｅ
   ．ｃｏ１ｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ１０００、Ｅ．ｃ
   ｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ１０００．１、Ｅ．ｃ
   ｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ１０６０、Ｅ．ｃｏｌ
   ｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ１１２０、Ｅ．ｃｏｌｉＫ
   １２ＲＶ３０８／ｐＣＺ１０５１、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２
   ＲＶ３０８／ｐＣＺ１０５．２、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２Ｒ
   Ｖ３０／ｐＣＺ１０６．１、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３
   ０８／ｐＣＺ１１２．ｌ、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０
   ８／ｐＣＺ１１２．２またはＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３
   ０８／ｐＣＺ１１４０である第１７項に記載の細胞。 １９、機能的ポリペプチドの製造方法であって、１）第
   １項〜第１３項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ発現ベ
   クターで細胞を形質転換し、２）形質転換された細胞を
   、遺伝子の発現に好適な条件下で培養することからなる
   方法。