CN109136248A - 多靶点编辑载体及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多靶点编辑载体，包括Cpfl蛋白表达元件和至少两个sgRNA转录元件。多靶点编辑载体通过共表达Cpfl蛋白与多个sgRNA，实现了对基因组不同靶位点的同时编辑，提高了基因编辑的效率，降低了基因编辑的脱靶效应，提高了基因编辑的精确度。本发明还公开了一种上述多靶点编辑载体的构建方法，通过两步Golden Gate克隆将多个sgRNA顺次串联至到带有Cpfl蛋白表达元件和荧光表达元件的第二载体，得到上述的多靶点编辑载体。上述构建方法步骤简单，简化了实验设计过程，降低了基因编辑的成本。本发明还公开了包括上述多靶位点载体的试剂盒，能够用于高效率和低脱靶的多靶点的共同编辑。

Description

多靶点编辑载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种多靶点编辑载体及其构建方法和应用。
背景技术
基因编辑技术是一种可以对基因组或转录产物进行精确修饰的技术，可完成基因定点突变、片段的敲除或敲入等。在后基因组时代，基因编辑技术已成为生命科学领域的重要研究内容。传统的基因编辑技术以胚胎干细胞和基因重组为基础进行生物基因组定向修饰，但是该技术存在打靶效率低，实验周期长及应用范围窄等缺点。随着基因编辑技术的不断发展，人工核酸酶介导的基因编辑技术开始被广泛应用，该技术通过特异性地识别并裂解靶DNA双链，激发细胞内源性的修复机制实现基因定向改造，与传统基因编辑技术相比，基因编辑新技术打靶效率高、构建成本低、应用范围广，极大地促进了生命科学和医学领域的研究进程。目前基因组编辑新技术主要包括以下几种：人工核酶介导的锌指核酸酶(Zincfinger nucleases，ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effectors nuclease，TALEN)技术、成簇规律的间隔短回文重复相关蛋白9核酸酶(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associatedprotein-9nuclease，CRISPR/Cas9)技术、CRISPR/Cpf1技术以及结构引导的核酸酶(Structure-guided nuclease，SGN)技术。
使用CRISPR做基因敲除非常快捷有效，天然的Cas9蛋白具有RuvC和HNH两个内切酶功能域，当提供正确的sgRNA靶向时，可以造成目标序列的双链DNA断裂，依赖于细胞的同源重组和非同源末端连接的修复机制，切断的DNA可以进行再连接。依靠非同源末端连接修复途径容易造成数个碱基的***和缺失，因此可以造成编码基因的读码框发生改变。当提供两条sgRNA时，可以实现将这两个sgRNA靶向位点之间的序列删除，可以用于敲除非编码序列。当给细胞提供与断点两端同源的模板时，依靠细胞同源重组的修复途径，可以使目标序列发生替换，实现一段DNA序列的靶向***。
虽然CRISPR***的扩展性好，可以针对不同的序列设计不同的sgRNA实现基因组编辑、基因表达调控，以及染色质标记功能，但是在同一个细胞中并行完成多个序列的同时靶向功能仍然具有挑战性。现有的CRISPR***难以并行的主要原因是多条sgRNA导入同一细胞难以实现。通过质粒的瞬时转染办法，很难将多个质粒均匀导入细胞。传统方法同时导入多个DNA片段进入细胞有显微注射和病毒感染。显微注射需要特殊的仪器，且操作通量低，对于需要大量细胞的实验无法使用。通过病毒感染对操作者的技术要求较高，同时具有一定的危险性，且病毒感染也具有一定程度的随机性和异质性，无法完全保证所有的DNA会进入同一个细胞。
CRISPR/Cas9基因编辑***的特异性决定于sgRNA上的识别序列(～20nt)。然而，在复杂的生物基因组中，sgRNA的识别序列可能会与非靶点DNA发生局部匹配，导致CRISPR/Cas9***的高脱靶效应(Off-target effects)，严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。
中国专利文献CN106520824A中公开了一种多靶点编辑***，将Csy4蛋白及其对应识别序列应用于CRISPR/Cas9***中。具体通过将两个或两个以上的sgRNA串联在一个表达盒中，每个sgRNA的首端和前一个sgRNA的尾端由Csy4切割识别序列连接，利用Csy4蛋白能够切割并识别对应的RNA序列，使得多个sgRNA在同一个表达盒中同时转录后，可以被切割成独立的片段，实现对基因组的多靶点编辑。上述多靶点编辑***虽然通过将多个sgRNA压缩在一个载体上实现了对基因组多位点的编辑，但多靶点编辑***在应用时，需要分别构建表达Csy4-Cas9核苷酸序列的重组表达剪刀载体，以及能够转录靶向不同位点的sgRNA的靶点载体，剪刀载体需要同时表达Csy4和Cas9两种蛋白序列，显著增加了载体的大小，降低了载体的转染效率，增加了基因编辑的难度；另一方面，应用上述多靶点编辑***需要同时共转染剪刀载体和靶点载体，相对于单一载体转染，其转染效率受到限制，并且难以保障两种载体转染以稳定比例转入目标细胞，不仅降低了基因编辑的效率，同时增加了实验成本和实验操作步骤；最后，以CRISPR/Cas9***进行基因编辑，易产生脱靶效应，导致基因编辑的精确度低。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中用于基因编辑的多靶点编辑***存在的基因编辑难度高、基因编辑效率有限、易产生脱靶效应，以及实验成本高和实验操作步骤繁琐的问题；从而提供一种能够显著降低基因编辑的脱靶效应、提高基因编辑效率且简化了实验操作步骤的CRISPR/Cpfl多靶点编辑载体及其构建方法和应用。
本发明提供了一种多靶点编辑载体，包括Cpfl蛋白表达元件和至少两个sgRNA转录元件。
所述的多靶点编辑载体，还包括荧光表达元件。
所述的多靶点编辑载体，所述荧光表达元件为EGFP编码基因。
所述的多靶点编辑载体，所述Cpfl蛋白表达元件是以人和小鼠的偏好密码子优化后的Cpfl蛋白编码基因。
所述的多靶点编辑载体，所述Cpfl蛋白选自AsCpf1蛋白或LbCpf1蛋白。
所述的多靶点编辑载体，所述AsCpf1蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LbCpf1蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的多靶点编辑载体，所述sgRNA转录元件包括由5’端至3’端顺次连接的U6启动子和crRNA序列，所述crRNA序列包括5’端至3’端顺次连接的sgRNA序列和同向重复序列，所述同向重复序列为Cpf1蛋白的识别和结合序列。
本发明提供了一种所述的多靶点编辑载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)在基因组上确定至少两个目标靶点或靶标基因，在所述目标靶点或靶标基因的两侧找到Cpfl蛋白识别的PAM位点，依据所述PAM位点设计sgRNA序列；
(2)针对所述sgRNA序列设计靶向配对引物，将所述靶向配对引物退火合成靶向短片段，利用Golden Gate克隆法将所述靶向短片段分别连接至带有U6启动子和同向重复序列的第一载体，得到至少两个中间载体，其中每个所述中间载体包括由5’端至3’端顺次连接的U6启动子、sgRNA序列和同向重复序列；
(3)利用Golden Gate克隆法将所述中间载体的sgRNA转录元件连接至带有Cpfl蛋白表达元件和荧光表达元件的第二载体，得到所述多靶点编辑载体。
所述的多靶点编辑载体的构建方法，所述第一载体选自pUC57-AsCpf1、pUC57-LbCpf1、pEGFP-N1-AsCpf1和pEGFP-N1-LbCpf1中的至少一种；所述第二载体选自pEGFP-N1-AsCpf1、pEGFP-N1-LbCpf1或者以pEGFP-N1-AsCpf1或pEGFP-N1-LbCpf1作为第一载体构建的中间载体。
所述的多靶点编辑载体的构建方法，所述pEGFP-N1-AsCpf1包括核苷酸序列如SEQID NO.1所示的AsCpf1蛋白编码基因；所述pEGFP-N1-LbCpf1包括核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的LbCpf1蛋白编码基因。
所述的多靶点编辑载体的构建方法，所述靶向短片段通过BsmBI或BsaI限制性内切酶连接至所述第一载体；所述中间载体的sgRNA转录元件通过BbsI限制性内切酶连接至所述第二载体。
本发明提供了一种用于多靶点编辑的试剂盒，所述试剂盒包括上述的多靶点编辑载体，或应用上述的构建方法得到的多靶点编辑载体。
本发明提供了一种基因编辑的方法，所述方法应用上述的多靶点编辑载体或上述的试剂盒。
所述的多靶点编辑载体在制备基因诊断和/或基因治疗的药物中的应用。
本发明中“Golden Gate克隆法”是指IIS型限制性核酸内切酶介导的克隆策略，IIS型限制性内切酶能够特异识别双链DNA上的靶位点，并在靶位点下游非特异性地对DNA双链进行切割，在DNA双链的5’或3’端产生粘性末端。“Golden Gate克隆法”通过在同一反应体系中，利用IIS型限制性核酸内切酶，在识别位点之外切开DNA，产生含粘性末端的DNA片段，同时用连接酶将几个DNA片段按照既定的顺序连接，拼接成不含酶识别位点的DNA片段，就像一个线性拼图被正确地拼接在一起，使多个目的DNA片段按照设定的顺序实现“无缝”连接。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供的多靶点编辑载体，包括Cpfl蛋白表达元件和至少两个sgRNA转录元件。多靶点载体在导入哺乳动物细胞或哺乳动物体内后，Cpfl蛋白表达元件和sgRNA转录元件在细胞内共表达，然后利用多个sgRNA靶向基因组上不同位置处的目标靶位点，介导Cpfl蛋白结合并对靶位点的DNA双链进行定向剪切；进而在细胞内源DNA修复途径作用下，通过目标序列NHEJ(Non-homologous end joining,非同源末端连接)或HR(homologousrecombination，同源重组)定向修饰，实现对基因组多靶位点的有效编辑。
本发明提供的多靶点编辑载体利用单一载体实现对多个基因或同一基因上多个位点的同时编辑，简化了实验设计步骤，降低了实验成本；另一方面，单一载体的转染效率显著高于现有的利用多条载体进行编辑的多靶点编辑***，且保障了细胞内表达Cpfl蛋白与sgRNA的均一性，有利于提高基因编辑的效率。多靶位点编辑载体编码Cpfl蛋白，其分子量小于Cas9蛋白，剪切DNA所需的crRNA长度短，有利于实现多个基因的同时编辑，同时能够降低将CRISPR/Cpf1***递送至编辑对象的难度；另外，Cpfl能够识别富含胸腺嘧啶(T)的PAM序列(Protospacer adjacent motif)，可以扩展CRISPR的编辑范围；Cpf1的剪切位点离PAM序列较远，提高了载体的基因编辑效率；此外，Cpf1剪切会产生黏性末端，可促进目的基因通过非同源重组的方式***靶定位点，显著降低了基因编辑的脱靶效应。
本发明为基因组多靶位点编辑***提供了一种新的载体，能够实现对基因组多靶位点的精准、高效率的快速编辑，在利用多位点实现对单一基因的编辑时，多条sgRNA的协同作用使其效果优于单一sgRNA的编辑效果，避免了单一sgRNA在靶位点切割时易被细胞修复为未切割状态或不移码突变导致的敲除失败，也即避免基因的脱靶效应，实现对基因的高精度编辑。
2、本发明提供的多靶点编辑载体，还包括荧光表达元件，具体为EGFP编码基因，载体通过EGFP绿色荧光蛋白能够将转染成功的细胞与未转染成功的细胞分开，经过流式筛选，最终可以得到完全转入所有多靶点编辑载体的细胞，用于下游的基因编辑、基因表达调控和基因标记等实验。
3、本发明提供的多靶点编辑载体，Cpfl蛋白表达元件是以人和小鼠的偏好密码子优化后的Cpfl蛋白编码基因，其核苷酸序列具体为SEQ ID NO.1所示的密码子优化后的AsCpf1基因序列，或SEQ ID NO.2所示的密码子优化后的LbCpf1基因序列。通过密码子优化使Cpfl蛋白编码基因兼顾人和小鼠的蛋白表达***，提高了Cpfl基因在人源和鼠源细胞中的表达效率以及Cpfl基因的稳定性。
4、本发明提供的多靶点编辑载体，在每条sgRNA的5’端连接U6启动子，形成独立的sgRNA转录元件，保证了每一条sgRNA的高效转录。
5、本发明提供了一种上述多靶点编辑载体的构建方法，利用Golden Gate克隆法首先将由sgRNA序列合成的靶向短片段转入第一载体，使每条sgRNA的5’端连上U6启动子，然后继续将U6启动子-sgRNA通过Golden Gate克隆法连接到带有Cpfl蛋白表达元件和荧光表达元件的第二载体，得到最终的目标载体。上述的构建方法利用两步Golden Gate克隆实现了多个sgRNA的迅速串联，简化了载体构建步骤，提高了载体构建的效率，降低了载体构建成本；另一方面，Golden Gate克隆法应用IIS型限制性核酸内切酶，通过设计不同sgRNA片段两端的碱基序列，能够将多个sgRNA按预定顺序连接在一起，且连接完成后不引入额外的酶切位点。
6、本发明提供的用于多靶点编辑的试剂盒，包括上述的多靶点编辑载体，能够实现基因组内多靶位点的同时编辑，且基因编辑效率高、实验步骤简单，脱靶效应低。
7、本发明提供的多靶点编辑载体在制备基因诊断和/或基因治疗的药物中的应用，具有效率高、成本低、效果稳定以及准确度高等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中pUC57-AsCpf1的载体图谱；
图2为本发明实施例2中构建得到的中间载体pEGFP-AsCpf1-DNMT1的载体图谱；
图3为本发明实施例2中构建得到的目标载体pEGFP-AsCpf1-DNMT1-HPRT1-CCR5-AAVS1的载体图谱；
图4为本发明实验例1中多靶点编辑载体转染细胞后的荧光检测结果图；
图5为本发明实验例1中基因编辑检测引物扩增DNMT1、HPRT1、CCR5和AAVS1后的琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
图6为本发明实验例1和对比例1中多靶点编辑载体(pEGFP-AsCpf1-DNMT1-HPRT1-CCR5-AAVS1)和单一基因编辑载体(pEGFP-AsCpf1-DNMT1、pEGFP-AsCpf1-HPRT1、pEGFP-AsCpf1-CCR5、pEGFP-AsCpf1-AAVS1)的基因编辑的酶切检测结果图；
图7为本发明实验例2中多靶点编辑载体pEGFP-AsCpf1-ABCG1对位点1、位点2和位点3的编辑的酶切检测结果图；
图8为多靶点编辑载体(pEGFP-AsCpf1-ABCG1)和单一位点编辑载体(pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g1、pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g2和pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g3)对基因ABCG1的编辑的酶切检测结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得，本发明中所有引物合成、测序和基因合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例1
本实施例提供一种Cpf1重组表达质粒的构建方法，其中Cpf1为密码子优化的AsCpf1或LbCpf1，具体包括以下步骤：
1、密码子优化
以氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.BV3L6)来源的Cpf1(简称为AsCpf1)使用密码子优化软件(保存于苏州金唯智生物科技有限公司)，选择人和小鼠作为优化物种，依据人和小鼠的偏好密码子，对Cpf1原始序列中密码子与人密码子使用偏好和与小鼠密码子使用偏好不同的密码子位点进行替换，得到优化后的AsCpf1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
使用上述密码子优化方法对毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium ND2006)来源的Cpf1(简称为LbCpf1)进行优化，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的优化序列。
优化后的AsCpf1和LbCpf1基因由于兼顾了人和小鼠的使用偏好密码子，使其在人源以及鼠源的细胞中均具有高的表达效率和高的基因稳定性。
2、构建第一载体pEGFP-N1-AsCpf1和pEGFP-N1-LbCpf1
(1)将步骤1中得到的优化后的序列在5’端添加CMV启动子后进行人工合成，得到5’-CMV启动子-AsCpf1-3’序列与5’-CMV启动子-LbCpf1-3’序列；同时将人源的U6启动子序列与表1所示的同向重复序列(Direct Repeats，简称：DR)反向互补后，进行基因合成，得到5’-DR(识别AsCpf1，反向互补)-U6启动子(反向互补)-3’序列和5’-DR(识别LbCpf1，反向互补)-U6启动子(反向互补)-3’序列，同向重复序列上具有BsmBI识别位点。
(2)载体pEGFP-N1(武汉淼灵生物科技有限公司，货号：M00116)的AseI酶切位点的5’端预先引入两个BbsI酶切位点，利用5’AseI和3’BamHI限制性内切酶切开后，通过同源重组的方法将步骤(1)合成的U6启动子、DR、CMV启动子和优化后的AsCpf1或LbCpf1基因与pEGFP-N1载体相连接，使最终载体上连接有以5’-BbsI-BbsI-DR(反向互补)-U6启动子(反向互补)-CMV启动子-Cpf1-3’顺序连接的片段。其中，由CMV启动子起始的Cpf1表达和由U6启动子起始的crRNA转录具有相反的起始方向。
(3)将步骤(2)中得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后用含有卡那霉素抗性(KanR)的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，经过酶切和测序验证后得到构建成功的第一载体pEGFP-N1-AsCpf1和pEGFP-N1-LbCpf1。
3、构建第一载体pUC57-AsCpf1和pUC57-LbCpf1
采用步骤2中所示的方法将载体pUC57用EcoRI和HindIII切开后，将步骤(1)中合成的U6启动子和DR通过同源重组的方法连接到pUC57上，使最终载体上具有以5’-BbsI-DR(反向互补)-U6启动子(反向互补)-BbsI-3’顺序连接的片段，分别制得第一载体pUC57-AsCpf1和pUC57-LbCpf1，pUC57-AsCpf1的载体图谱如图1所示。
表1识别AsCpf1和LbCpf1的同向重复序列
实施例2
本实施例提供一种多靶点编辑载体及其构建方法，多靶点编辑载体的核心包括Cpfl蛋白表达元件和4个sgRNA转录元件，具体包括以下步骤：
1、确定目标靶点，设计sgRNA序列
以人基因组上的DNMT1、HPRT1、CCR5和AAVS1基因作为靶标基因，利用在线设计工具(http://rgenome.net)，在上述四个基因的编码链和非编码链上找到Cpf1的PAM位点5’-TTTN-3’，并根据PAM位点设计相应的向导序列(也即sgRNA序列)，其中DNMT1的sgRNA序列如SEQ ID.3所示，HPRT1的sgRNA序列如SEQ ID.4所示，CCR5的sgRNA序列如SEQ ID.5所示，AAVS1的sgRNA序列如SEQ ID.6所示。
2、设计引物，合成靶向短片段
针对步骤1中得到的sgRNA序列设计配对引物，分别为针对DNMT1基因sgRNA序列的引物对DNMT1-F和DNMT1-R，针对HPRT1基因sgRNA序列的引物对HPRT1-F和HPRT1-R，针对CCR5基因sgRNA序列的引物对CCR5-F和CCR5-R，针对AAVS1基因sgRNA序列的引物对AAVS1-F和AAVS1-R，配对引物的序列如表2所示。
表2针对不同靶标基因sgRNA序列的配对引物
DNMT1-F AGATCTGATGGTCCATGTCTGTTACTC
DNMT1-R AAAAGAGTAACAGACATGGACCATCAG
HPRT1-F AGATTGTCCCCTGTTGACTGGTCATTC
HPRT1-R AAAAGAATGACCAGTCAACAGGGGACA
CCR5-F AGATGCCTGAATAATTGCAGTAGCTCT
CCR5-R AAAAAGAGCTACTGCAATTATTCAGGC
AAVS1-F AGATCTTACGATGGAGCCAGAGAGGAT
AAVS1-R AAAAATCCTCTCTGGCTCCATCGTAAG
将表1所示的配对引物分别退火，形成4个双链的靶向短片段，退火的反应体系如表3所示，退火的反应条件为：98℃保持5min；98℃降到25℃(每20s降1℃)；16℃保持5min。
表3退火的反应体系
Pfu buffer(5X) 4.0μl
Forward Primer,10μM 5.0μl
Reverse Primer,10μM 5.0μl
ddH<sub>2</sub>O 6.0μl
3、构建中间载体
(1)步骤2中的配对引物退火后得到的靶向短片段的5’端和3’端各有4个碱基的突出，分别通过Golden Gate克隆，利用IIs型限制性内切酶BsmBI将DNMT1的靶向短片段与实施例1中构建的pEGFP-N1-AsCpf1连接起来，使DNMT1的sgRNA序列连接至pEGFP-N1-AsCpf1载体的同向重复序列部分和U6启动子之间，构建中间载体pEGFP-AsCpf1-DNMT1，pEGFP-AsCpf1-DNMT1的载体图谱如图2所示；将HPRT1、CCR5和AAVS1通过IIs型限制性内切酶BsmBI分别连接至pUC57-AsCpf1载体的同向重复序列(DR)和U6启动子之间，构建中间载体pUC57-AsCpf1-HPRT1、pUC57-AsCpf1-CCR5和pUC57-AsCpf1-AAVS1。Golden Gate克隆使用酶切连接的反应体系如表4所示，反应条件为37℃保持5min，16℃保持10min(3个循环)；37℃消化1h，80℃保持5min，4℃保持1min。
表4酶切连接的反应体系
Vector,25ng/μl 3μl
Annealed Oligos,10μM 5μl
T4 DNA ligase buffer(10×) 2μl
T4 ligase 1μl
BsmBI 1μl
ddH<sub>2</sub>0 8μl
Total 20ul 20μl
(2)各取10μl步骤(1)中构建pEGFP-AsCpf1-DNMT1、pUC57-AsCpf1-HPRT1、pUC57-AsCpf1-CCR5以及pUC57-AsCpf1-AAVS1的酶切连接的反应液，与50μl的TOP10感受态细胞充分混匀后，冰浴30min，然后42℃冰浴90s后，冰上放置2min；然后将上述混合液涂布于含有卡那霉素抗性(KanR)的LB平板上，37℃恒温培养12-16h后每个样品挑取5个克隆摇菌后进行酶切和测序验证，测序引物为U6-5’-GACTATCATATGCTTACCGT-3’，获得正确克隆后，按照AxyPrep质粒抽提试剂盒AP-MN-P-250操作步骤抽提质粒，得到构建正确的中间载体，中间载体-20℃保存。
3、构建目标载体
(1)将步骤2中得到的构建正确的中间载体混合，按照表5所示的酶切连接的反应体系构建目标载体，利用IIs型限制性内切酶BbsI将pUC57-AsCpf1-HPRT1上的5’-DR(反向互补)-HPRT1(反向互补)-U6(反向互补)-3’、pUC57-AsCpf1-CCR5上的5’-DR(反向互补)-CCR5(反向互列)-U6(反向互补)-3’，和pUC57-AsCpf1-AAVS1上的5’-DR(反向互补)-AAVS1(反向互补)-U6(反向互补)-3’连接到pEGFP-AsCpf1-DNMT1上，使DNMT1、HPRT1、CCR5和AAVS1四个sgRNA的转录元件顺序串联在一起，构建pEGFP-AsCpf1-DNMT1-HPRT1-CCR5-AAVS1目标载体，目标载体图谱如图3所示；反应条件为37℃保持5min，16℃保持10min(6-15个循环)；37℃消化30min，80℃保持5min，4℃保持1min。
表5目标载体构建的反应体系
(2)各取10μl步骤(1)中构建目标载体的酶切连接的反应液，与50μl的TOP10感受态细胞充分混匀后，冰浴30min，然后42℃冰浴90s后，冰上放置2min；然后将上述混合液涂布于含有卡那霉素抗性(KanR)的LB平板上，37℃恒温培养12-16h后每个样品挑取5个克隆摇菌后进行酶切和测序验证，经测序验证获得正确克隆后，按照AxyPrep质粒抽提试剂盒AP-MN-P-250操作步骤抽提质粒，得到构建正确的目标载体，目标载体-20℃保存。
实施例3
本实施例提供一种多靶点编辑载体pEGFP-AsCpf1-ABCG1及其构建方法，本实施例构建的pEGFP-AsCpf1-ABCG1与实施例2构建的pEGFP-AsCpf1-DNMT1-HPRT1-CCR5-AAVS1的区别在于：本实施例中以ABCG1基因上的三个不同位点作为目标靶点，分别设计sgRNA序列，其中位点1(ABCG1-g1)的sgRNA序列如SEQ ID.7所示，位点2(ABCG1-g2)的sgRNA序列如SEQID.8所示，位点3(ABCG1-g3)的sgRNA序列如SEQ ID.9所示。
本实施例提供的构建方法与实施例2提供的构建方法的区别在于：本实施例中针对三个不同的靶位点设计不同的sgRNA序列的配对引物，配对引物的序列如表6所示。
表6针对ABCG1基因上不同靶位点sgRNA的配对引物
实验例1
本实验例对实施例2中构建的多靶点载体pEGFP-AsCpf1-DNMT1-HPRT1-CCR5-AAVS1的基因编辑效果进行检测，具体包括以下步骤：
1、转染目标细胞
(1)将293T细胞(购买于上海中科院细胞库)置于含有10％FBS的DMEM培养基的培养皿(直径为10cm)，37℃、5％CO2培养箱中培养，待293T细胞培养至80-90％融合时，弃培养基，用2mLPBS缓冲液洗涤两次。
(2)向培养皿中继续加入1mL胰酶(Trypsin-EDTA)，37℃静置1-2min待细胞被消化后，加入含10％FBS的DMEM培养基，吹打混匀形成单细胞悬液，并将单细胞悬液接种于6孔板，每孔约2×105个细胞，37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
(3)观察6孔板中的细胞融合至70-80％时，更换6孔板中含血清的培养基为不含血清的DMEM培养基，然后加入4μg构建好的质粒pEGFP-AsCpf1-DNMT1-HPRT1-CCR5-AAVS1(转染试剂为lipofectamine 3000，按照说明书进行操作)，转染后的细胞37℃、5％CO2培养箱中培养6h，更换为新的含有10％FBS的DMEM培养基，继续培养48h，每个样品重复2次。在荧光显微镜下观察转染效率，因为荧光标记基因EGFP与AsCpf1和靶向不同位点的sgRNA通过同一载体转入细胞内，因此通过绿色荧光能够实现对转入多靶点编辑载体的细胞进行标记，图4为多靶点编辑载体转染细胞后的荧光检测结果，图4结果显示：在细胞内明显可见绿色荧光，且荧光强度强，表达绿色荧光的细胞所占比例大，荧光统计多靶点编辑载体的细胞转染效率可达70％以上。
2、扩增基因编辑片段
(1)使用基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，货号：DP304-03)提取步骤1中转染多靶点编辑载体的293T细胞，得到编辑后的基因组DNA。
(2)以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，使用表7所示的基因编辑检测引物进行扩增，其中引物DNMT1-Test-F和DNMT1-Test-R特异性扩增DNMT1的基因编辑片段，引物HPRT1-Test-F和HPRT1-Test-R特异性扩增HPRT1的基因编辑片段，引物CCR5-Test-F和CCR5-Test-R特异性扩增CCR5的基因编辑片段，引物AAVS1-Test-F和AAVS1-Test-R特异性扩增AAVS1的基因编辑片段；扩增反应的反应体系如表8所示，反应条件为96℃保持5min；96℃保持30s，64℃保持30s(每循环降低0.5℃),72℃保持30s(15个循环)；96℃保持30s，59℃保持30s，72℃保持30s；72℃保持5min(30个循环)。PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图5所示，使用表7中提供的检测引物，能够分别特异性扩增得到DNMT1、HPRT1、CCR5和AAVS1的目标条带。
表7基因编辑检测引物
表8基因编辑片段扩增的反应体系
Pfu buffer(5X) 20μl
Mutation Test-F,20μM 1μl
Mutation Test-R,20μM 1μl
dNTP,10μM 1μl
Pfu 1μl
Template,100～200ng/μl 1μl
ddH<sub>2</sub>O 75μl
Total 100μl
3、基因编辑结果检测
(1)将步骤2中扩增的PCR产物用胶回收试剂盒回收后，取400-600ng的回收产物，加入T7E1buffer(T7核酸内切酶I)4μl，最后用ddH2O补充至40μl体系，然后将上述反应体系进行退火反应，退火反应的条件为：98℃保持5min；98℃降到25℃(每20s降1℃)；16℃保持5min。
(2)将步骤(1)中退火后的样品一分为二，分别加入0.5μl T7E1和ddH2O，37℃反应30min，然后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，T7E1在基因编辑后的错配位置切割双链DNA，经琼脂糖凝胶检测，若基因片段有切开的条带，说明基因被成功编辑产生错配碱基。
图6显示T7E1的酶切检测结果，图6中泳道1-泳道4分别代表pEGFP-AsCpf1-DNMT1-HPRT1-CCR5-AAVS1载体编辑后的DNMT1、HPRT1、CCR5和AAVS1的T7E1酶切结果。由图6可知：基因编辑后DNMT1、HPRT1、CCR5和AAVS1的扩增片段均能被T7E1切开，说明在293T细胞中转染pEGFP-AsCpf1-DNMT1-HPRT1-CCR5-AAVS1后，AAVS1、DNMT1、HPRT1和CCR5四个靶标基因同时被成功编辑。
实验例2
本实验例以实施例1中所示的检测方法，对pEGFP-AsCpf1-ABCG1载体的基因编辑效率进行检测，用表9所示的基因编辑的检测引物对目标区域进行PCR扩增，将PCR扩增产物回收后进行退回反应，然后使用T7E1进行酶切检测，检测结果如图7所示，图7中泳道1-泳道3分别代表pEGFP-AsCpf1-ABCG1载体编辑后的位点1-位点3的酶切结果。由图7可知：基因编辑后的位点1、位点2和位点3能被T7E1切开，说明pEGFP-AsCpf1-ABCG1载体对三个位点均成功编辑。
将回收的三个位点的PCR扩增产物连接pUC57载体(保存于金唯智生物科技公司)，转化DH5α感受态细菌，涂布37℃的氨苄抗性的LB平板培养基，培养过夜。次日挑取若干单菌落接种于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培养液中，250rpm，37℃恒温摇床培养后送测序，统计送测序的单克隆中产生基因位点(DNMT1、HPRT1、CCR5、AAVS1)突变的克隆比例，即为多靶点编辑载体对各基因的编辑效率。基因编辑效率的统计结果为：位点1(61％)，位点2(76％)，位点3(67％)，多靶点编辑载体对各位点均具有高的编辑效率。
表9 ABCG1基因各靶位点的编辑检测引物
ABCG1-g1g2-Test-F TGCTCCTGCAGTGGAAGAAG
ABCG1-g1g2-Test-R CACATGCCAGAAACAGGCAC
ABCG1-g3-Test-F GCTTCCTCACTCTGAGACGG
ABCG1-g3-Test-R CTCTCCCCTGGACTACTGCT
对比例1
1、按照实施例2中所示的载体构建方法分别构建载体pEGFP-AsCpf1-DNMT1、pEGFP-AsCpf1-HPRT1、pEGFP-AsCpf1-CCR5和pEGFP-AsCpf1-AAVS1。
2、依据实验例1中所示的细胞转染的方法分别将相同摩尔数的pEGFP-AsCpf1-DNMT1、pEGFP-AsCpf1-HPRT1、pEGFP-AsCpf1-CCR5、pEGFP-AsCpf1-AAVS1和pEGFP-AsCpf1-DNMT1-HPRT1-CCR5-AAVS1五种载体转染293T细胞。
3、依据实施例1中提供的基因编辑结果的检测方法验证步骤2中五种载体的基因编辑效果，图6中泳道5-泳道8分别代表pEGFP-AsCpf1-DNMT1、pEGFP-AsCpf1-HPRT1、pEGFP-AsCpf1-CCR5、pEGFP-AsCpf1-AAVS1载体编辑后的DNMT1、HPRT1、CCR5和AAVS1的T7E1酶切结果。
通过实施例2中提供的挑取单克隆测序的方法，比较单一基因编辑载体与多靶点编辑载体对基因的编辑效率。测序统计结果显示：pEGFP-AsCpf1-DNMT1-HPRT1-CCR5-AAVS1对四个基因的编辑效率分别为DNMT1(27％)、HPRT1(60％)、CCR5(73％)、AAVS1(71％)；单一基因编辑载体对四个基因的编辑效率分别为DNMT1(0％)、HPRT1(64％)、CCR5(71％)、AAVS1(63％)。因此，与单一基因编辑载体相比，多靶点编辑载体pEGFP-AsCpf1-DNMT1-HPRT1-CCR5-AAVS1对四个基因的编辑均有着至少相同水平的编辑效率，因此，应用多靶位点编辑载体能够同时实现对多个靶标基因的高效编辑，简化了多基因编辑的步骤，降低了多基因编辑的成本。
对比例2
1、按照实施例2中所示的载体构建方法分别构建载体pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g1、pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g2和pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g3。
2、依据实验例2中所示的细胞转染的方法分别将相同摩尔数的pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g1、pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g2、pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g3和pEGFP-AsCpf1-ABCG1四种载体转染293T细胞。
3、依据实施例2中提供的基因编辑结果的检测方法验证步骤2中四种载体的基因编辑效果，检测引物使用ABCG1-Test-F(序列：5’-TGCTCCTGCAGTGGAAGAAG-3’)和ABCG1-Test-R(序列：5’-CTCTCCCCTGGACTACTGCT-3’)引物对。检测结果如图8所示，图8中泳道1代表多靶点编辑载体pEGFP-AsCpf1-ABCG1进行基因编辑后的T7E1酶切检测结果，泳道2-4分别代表pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g1、pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g2和pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g3的单一位点编辑载体进行基因编辑后的T7E1酶切检测结果。由图8可知，单一位点编辑载体与多靶点编辑载体pEGFP-AsCpf1-ABCG1编辑后，基因ABCG1均产生位点突变，说明基因编辑成功。
通过实施例2中提供的挑取单克隆测序的方法，比较单一位点编辑载体与多靶点编辑载体对基因的编辑效率。测序统计结果显示：pEGFP-AsCpf1-ABCG1的编辑效率为89％，pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g1、pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g2和pEGFP-AsCpf1-ABCG1-g3的编辑效率分别为62％、70％和69％。说明应用本发明提供的多靶点编辑载体pEGFP-AsCpf1-ABCG1，能够显著提高对单基因的编辑效率。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
&lt;110&gt; 苏州金唯智生物科技有限公司
&lt;120&gt; 多靶点编辑载体及其构建方法和应用
&lt;130&gt; SHA201700370
&lt;160&gt; 9
&lt;170&gt; PatentIn version 3.3
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 3924
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列（AsCpf1）
&lt;400&gt; 1
atgacacagt tcgagggctt taccaacctg tatcaggtga gcaagacact gcggtttgag 60
ctgatcccac agggcaagac cctgaagcac atccaggagc agggcttcat cgaggaggac 120
aaggcccgca atgatcacta caaggagctg aagcccatca tcgatcggat ctacaagacc 180
tatgccgacc agtgcctgca gctggtgcag ctggattggg agaacctgag cgccgccatc 240
gactcctata gaaaggagaa aaccgaggag acaaggaacg ccctgatcga ggagcaggcc 300
acatatcgca atgccatcca cgactacttc atcggccgga cagacaacct gaccgatgcc 360
atcaataaga gacacgccga gatctacaag ggcctgttca aggccgagct gtttaatggc 420
aaggtgctga agcagctggg caccgtgacc acaaccgagc acgagaacgc cctgctgcgg 480
agcttcgaca agtttacaac ctacttctcc ggcttttatg agaacaggaa gaacgtgttc 540
agcgccgagg atatcagcac agccatccca caccgcatcg tgcaggacaa cttccccaag 600
tttaaggaga attgtcacat cttcacacgc ctgatcaccg ccgtgcccag cctgcgggag 660
cactttgaga acgtgaagaa ggccatcggc atcttcgtga gcacctccat cgaggaggtg 720
ttttccttcc ctttttataa ccagctgctg acacagaccc agatcgacct gtataaccag 780
ctgctgggag gaatctctcg ggaggcaggc accgagaaga tcaagggcct gaacgaggtg 840
ctgaatctgg ccatccagaa gaatgatgag acagcccaca tcatcgcctc cctgccacac 900
agattcatcc ccctgtttaa gcagatcctg tccgatagga acaccctgtc tttcatcctg 960
gaggagttta agagcgacga ggaagtgatc cagtccttct gcaagtacaa gacactgctg 1020
agaaacgaga acgtgctgga gacagccgag gccctgttta acgagctgaa cagcatcgac 1080
ctgacacaca tcttcatcag ccacaagaag ctggagacaa tcagcagcgc cctgtgcgac 1140
cactgggata cactgaggaa tgccctgtat gagcggagaa tctccgagct gacaggcaag 1200
atcaccaagt ctgccaagga gaaggtgcag cgcagcctga agcacgagga tatcaacctg 1260
caggagatca tctctgccgc aggcaaggag ctgagcgagg ccttcaagca gaaaaccagc 1320
gagatcctgt cccacgcaca cgccgccctg gatcagccac tgcctacaac cctgaagaag 1380
caggaggaga aggagatcct gaagtctcag ctggacagcc tgctgggcct gtaccacctg 1440
ctggactggt ttgccgtgga tgagtccaac gaggtggacc ccgagttctc tgcccggctg 1500
accggcatca agctggagat ggagccttct ctgagcttct acaacaaggc cagaaattat 1560
gccaccaaga agccctactc cgtggagaag ttcaagctga actttcagat gcctacactg 1620
gcctctggct gggacgtgaa taaggagaag aacaatggcg ccatcctgtt tgtgaagaac 1680
ggcctgtact atctgggcat catgccaaag cagaagggca ggtataaggc cctgagcttc 1740
gagcccacag agaaaaccag cgagggcttt gataagatgt actatgacta cttccctgat 1800
gccgccaaga tgatcccaaa gtgcagcacc cagctgaagg ccgtgacagc ccactttcag 1860
acccacacaa cccccatcct gctgtccaac aatttcatcg agcctctgga gatcacaaag 1920
gagatctacg acctgaacaa tcctgagaag gagccaaaga agtttcagac agcctacgcc 1980
aagaaaaccg gcgaccagaa gggctacaga gaggccctgt gcaagtggat cgacttcaca 2040
agggattttc tgtccaagta taccaagaca acctctatcg atctgtctag cctgcggcca 2100
tcctctcagt ataaggacct gggcgagtac tatgccgagc tgaatcccct gctgtaccac 2160
atcagcttcc agagaatcgc cgagaaggag atcatggatg ccgtggagac aggcaagctg 2220
tacctgttcc agatctataa caaggacttt gccaagggcc accacggcaa gcctaatctg 2280
cacacactgt attggaccgg cctgttttct ccagagaacc tggccaagac aagcatcaag 2340
ctgaatggcc aggccgagct gttctaccgc cctaagtcca ggatgaagag gatggcacac 2400
cggctgggag agaagatgct gaacaagaag ctgaaggatc agaaaacccc aatccccgac 2460
accctgtacc aggagctgta cgactatgtg aatcacagac tgtcccacga cctgtctgat 2520
gaggccaggg ccctgctgcc caacgtgatc accaaggagg tgtctcacga gatcatcaag 2580
gataggcgct ttaccagcga caagttcttt ttccacgtgc ctatcacact gaactatcag 2640
gccgccaatt ccccatctaa gttcaaccag agggtgaatg cctacctgaa ggagcacccc 2700
gagacaccta tcatcggcat cgatcggggc gagagaaacc tgatctatat cacagtgatc 2760
gactccaccg gcaagatcct ggagcagcgg agcctgaaca ccatccagca gtttgattac 2820
cagaagaagc tggacaacag ggagaaggag agggtggcag caaggcaggc ctggtctgtg 2880
gtgggcacaa tcaaggatct gaagcagggc tatctgagcc aggtcatcca cgagatcgtg 2940
gacctgatga tccactacca ggccgtggtg gtgctggaga acctgaattt cggctttaag 3000
agcaagagga ccggcatcgc cgagaaggcc gtgtaccagc agttcgagaa gatgctgatc 3060
gataagctga attgcctggt gctgaaggac tatccagcag agaaagtggg aggcgtgctg 3120
aacccatacc agctgacaga ccagttcacc tcctttgcca agatgggcac ccagtctggc 3180
ttcctgtttt acgtgcctgc cccatataca tctaagatcg atcccctgac cggcttcgtg 3240
gaccccttcg tgtggaaaac catcaagaat cacgagagcc gcaagcactt cctggagggc 3300
ttcgactttc tgcactacga cgtgaaaacc ggcgacttca tcctgcactt taagatgaac 3360
agaaatctgt ccttccagag gggcctgccc ggctttatgc ctgcatggga tatcgtgttc 3420
gagaagaacg agacacagtt tgacgccaag ggcacccctt tcatcgccgg caagagaatc 3480
gtgccagtga tcgagaatca cagattcacc ggcagatacc gggacctgta tcctgccaac 3540
gagctgatcg ccctgctgga ggagaagggc atcgtgttca gggatggctc caacatcctg 3600
ccaaagctgc tggagaatga cgattctcac gccatcgaca ccatggtggc cctgatccgc 3660
agcgtgctgc agatgcggaa ctccaatgcc gccacaggcg aggactatat caacagcccc 3720
gtgcgcgatc tgaatggcgt gtgcttcgac tcccggtttc agaacccaga gtggcccatg 3780
gacgccgatg ccaatggcgc ctaccacatc gccctgaagg gccagctgct gctgaatcac 3840
ctgaaggaga gcaaggatct gaagctgcag aacggcatct ccaatcagga ctggctggcc 3900
tacatccagg agctgcgcaa caaa 3924
&lt;210&gt; 2
&lt;211&gt; 3687
&lt;212&gt; DNA
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&lt;400&gt; 2
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gagaagagag ccgaggatta taagggcgtg aagaagctgc tggatcgcta ctatctgtct 180
tttatcaacg acgtgctgca cagcatcaag ctgaagaatc tgaacaatta catcagcctg 240
ttccggaaga aaaccagaac cgagaaggag aataaggagc tggagaacct ggagatcaat 300
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aagtacgcca agtgcctgca gaagatcgac aaggacgatg tgaacggcaa ttacgagaag 1740
atcaactata agctgctgcc cggccctaat aagatgctgc caaaggtgtt cttttctaag 1800
aagtggatgg cctactataa ccccagcgag gacatccaga agatctacaa gaatggcaca 1860
ttcaagaagg gcgatatgtt taacctgaat gactgtcaca agctgatcga cttctttaag 1920
gatagcatct cccggtatcc aaagtggtcc aatgcctacg atttcaactt ttctgagaca 1980
gagaagtata aggacatcgc cggcttttac agagaggtgg aggagcaggg ctataaggtg 2040
agcttcgagt ctgccagcaa gaaggaggtg gataagctgg tggaggaggg caagctgtat 2100
atgttccaga tctataacaa ggacttttcc gataagtctc acggcacacc caatctgcac 2160
accatgtact tcaagctgct gtttgacgag aacaatcacg gacagatcag gctgagcgga 2220
ggagcagagc tgttcatgag gcgcgcctcc ctgaagaagg aggagctggt ggtgcaccca 2280
gccaactccc ctatcgccaa caagaatcca gataatccca agaaaaccac aaccctgtcc 2340
tacgacgtgt ataaggataa gaggttttct gaggaccagt acgagctgca catcccaatc 2400
gccatcaata agtgccccaa gaacatcttc aagatcaata cagaggtgcg cgtgctgctg 2460
aagcacgacg ataaccccta tgtgatcggc atcgataggg gcgagcgcaa tctgctgtat 2520
atcgtggtgg tggacggcaa gggcaacatc gtggagcagt attccctgaa cgagatcatc 2580
aacaacttca acggcatcag gatcaagaca gattaccact ctctgctgga caagaaggag 2640
aaggagaggt tcgaggcccg ccagaactgg acctccatcg agaatatcaa ggagctgaag 2700
gccggctata tctctcaggt ggtgcacaag atctgcgagc tggtggagaa gtacgatgcc 2760
gtgatcgccc tggaggacct gaactctggc tttaagaata gccgcgtgaa ggtggagaag 2820
caggtgtatc agaagttcga gaagatgctg atcgataagc tgaactacat ggtggacaag 2880
aagtctaatc cttgtgcaac aggcggcgcc ctgaagggct atcagatcac caataagttc 2940
gagagcttta agtccatgtc tacccagaac ggcttcatct tttacatccc tgcctggctg 3000
acatccaaga tcgatccatc taccggcttt gtgaacctgc tgaaaaccaa gtataccagc 3060
atcgccgatt ccaagaagtt catcagctcc tttgacagga tcatgtacgt gcccgaggag 3120
gatctgttcg agtttgccct ggactataag aacttctctc gcacagacgc cgattacatc 3180
aagaagtgga agctgtactc ctacggcaac cggatcagaa tcttccggaa tcctaagaag 3240
aacaacgtgt tcgactggga ggaggtgtgc ctgaccagcg cctataagga gctgttcaac 3300
aagtacggca tcaattatca gcagggcgat atcagagccc tgctgtgcga gcagtccgac 3360
aaggccttct actctagctt tatggccctg atgagcctga tgctgcagat gcggaacagc 3420
atcacaggcc gcaccgacgt ggattttctg atcagccctg tgaagaactc cgacggcatc 3480
ttctacgata gccggaacta tgaggcccag gagaatgcca tcctgccaaa gaacgccgac 3540
gccaatggcg cctataacat cgccagaaag gtgctgtggg ccatcggcca gttcaagaag 3600
gccgaggacg agaagctgga taaggtgaag atcgccatct ctaacaagga gtggctggag 3660
tacgcccaga ccagcgtgaa gcacaaa 3687
&lt;210&gt; 3
&lt;211&gt; 23
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列（DNMT1）
&lt;400&gt; 3
ctgatggtcc atgtctgtta ctc 23
&lt;210&gt; 4
&lt;211&gt; 23
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列（HPRT1）
&lt;400&gt; 4
tgtcccctgt tgactggtca ttc 23
&lt;210&gt; 5
&lt;211&gt; 23
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列（CCR5）
&lt;400&gt; 5
gcctgaataa ttgcagtagc tct 23
&lt;210&gt; 6
&lt;211&gt; 23
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列（AAVS1）
&lt;400&gt; 6
cttacgatgg agccagagag gat 23
&lt;210&gt; 7
&lt;211&gt; 23
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列（ABCG1-g1）
&lt;400&gt; 7
acggacctgc tgaatggaca tct 23
&lt;210&gt; 8
&lt;211&gt; 23
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列（ABCG1-g2）
&lt;400&gt; 8
agggtccttc aggaaccgaa tag 23
&lt;210&gt; 9
&lt;211&gt; 23
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列（ABCG1-g3）
&lt;400&gt; 9
actcaccact attgaacttc ccg 23

Claims (14)

1.一种多靶点编辑载体，其特征在于，包括Cpfl蛋白表达元件和至少两个sgRNA转录元件。
2.根据权利要求1所述的多靶点编辑载体，其特征在于，还包括荧光表达元件。
3.根据权利要求2所述的多靶点编辑载体，其特征在于，所述荧光表达元件为EGFP编码基因。
4.根据权利要求1-3任一项所述的多靶点编辑载体，其特征在于，所述Cpfl蛋白表达元件是以人和小鼠的偏好密码子优化后的Cpfl蛋白编码基因。
5.根据权利要求4所述的多靶点编辑载体，其特征在于，所述Cpfl蛋白选自AsCpf1蛋白或LbCpf1蛋白。
6.根据权利要求5所述的多靶点编辑载体，其特征在于，所述AsCpf1蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LbCpf1蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求1-6任一项所述的多靶点编辑载体，其特征在于，所述sgRNA转录元件包括由5’端至3’端顺次连接的U6启动子和crRNA序列，所述crRNA序列包括5’端至3’端顺次连接的sgRNA序列和同向重复序列，所述同向重复序列为Cpf1蛋白的识别和结合序列。
8.一种权利要求1-7任一项所述的多靶点编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在基因组上确定至少两个目标靶点或靶标基因，在所述目标靶点或靶标基因的两侧找到Cpfl蛋白识别的PAM位点，依据所述PAM位点设计sgRNA序列；
(2)针对所述sgRNA序列设计靶向配对引物，将所述靶向配对引物退火合成靶向短片段，利用Golden Gate克隆法将所述靶向短片段分别连接至带有U6启动子和同向重复序列的第一载体，得到至少两个中间载体，其中每个所述中间载体包括由5’端至3’端顺次连接的U6启动子、sgRNA序列和同向重复序列；
(3)利用Golden Gate克隆法将所述中间载体的sgRNA转录元件连接至带有Cpfl蛋白表达元件和荧光表达元件的第二载体，得到所述多靶点编辑载体。
9.根据权利要求8所述的多靶点编辑载体的构建方法，其特征在于，
所述第一载体选自pUC57-AsCpf1、pUC57-LbCpf1、pEGFP-N1-AsCpf1和pEGFP-N1-LbCpf1中的至少一种；
所述第二载体选自pEGFP-N1-AsCpf1、pEGFP-N1-LbCpf1或者以pEGFP-N1-AsCpf1或pEGFP-N1-LbCpf1作为第一载体构建的中间载体。
10.根据权利要求9所述的多靶点编辑载体的构建方法，其特征在于，所述pEGFP-N1-AsCpf1包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的AsCpf1蛋白编码基因；所述pEGFP-N1-LbCpf1包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的LbCpf1蛋白编码基因。
11.根据权利要求8-10任一项所述的多靶点编辑载体的构建方法，其特征在于，所述靶向短片段通过BsmBI或BsaI限制性内切酶连接至所述第一载体；所述中间载体的sgRNA转录元件通过BbsI限制性内切酶连接至所述第二载体。
12.一种用于多靶点编辑的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-7任一项所述的多靶点编辑载体，或应用权利要求8-11任一项所述的构建方法得到的多靶点编辑载体。
13.一种基因编辑的方法，其特征在于，所述方法应用权利要求1-7任一项所述的多靶点编辑载体或权利要求12所述的试剂盒。
14.权利要求1-7任一项所述的多靶点编辑载体在制备基因诊断和/或基因治疗的药物中的应用。
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