JPS61115100A - Dc-79 and preparation thereof - Google Patents

Dc-79 and preparation thereof

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JPS61115100A
JPS61115100A JP59236478A JP23647884A JPS61115100A JP S61115100 A JPS61115100 A JP S61115100A JP 59236478 A JP59236478 A JP 59236478A JP 23647884 A JP23647884 A JP 23647884A JP S61115100 A JPS61115100 A JP S61115100A
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JP
Japan
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absorption spectrum
culture
analysis
glucose
methanol
Prior art date
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Pending
Application number
JP59236478A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Fusao Tomita
房男 冨田
Tatsuya Tamaoki
玉沖 達也
Isao Kawamoto
勲 川本
Kozo Asano
行蔵 浅野
Makoto Morimoto
森本 眞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Publication of JPS61115100A publication Critical patent/JPS61115100A/en
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

NEW MATERIAL:Antibiotic DC-79. Having the following physical and chemical properties. (In the case of DC-79-A). Molecular weight: 6,000 (gel filtration). UV: maximum absorption (0.1 N HCl) at 420 nm, and maximum absorption (0.1 NaOH) at 530 nm. Amino acid analysis: aspartic acid, serine, glutamic acid, proline, glycine, alanine, stine, valine, methionine, isoleucine, etc. Saccharide analysis: cellobiose, mannose, arabinose, xylose, and glucose. Easily soluble in water and methanol, slighyly soluble in ethanol, acetone, ethyl acetate, chloroform, benzene, hexane, etc. USE:An antibacterial agent and a carcinostatic agent. PREPARATION:A strain [e.g., DO-79 (FERM p-7928), etc.] capable of producing DC-79-A or B, belonging to the genus Streptomyces, is cultivated preferably by submerged spinner culture under preferably conditions at 28-38 deg.C at 6-8 pH usally for 1-7 days.

Description

【発明の詳細な説明】 −11よΩ五厘盟互一 本発明は抗菌ふよび制癌作用を有するDC−79並びに
その製造法に関する。DC−79は実験室。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to DC-79, which has antibacterial and anticancer effects, and a method for producing the same. DC-79 is a laboratory.

病院等における器具の殺菌又は洗剤等として有用である
It is useful as a sterilizer or detergent for equipment in hospitals, etc.

発明の目的 広範囲の抗菌活性を有しあるいは制癌作用を示す物質は
常に求められている。この目的のために東京都町田市の
土壌から新しい!1(以下DO−79株という)が分離
された。
OBJECTS OF THE INVENTION There is a constant need for substances that have a wide range of antibacterial activity or exhibit anticancer activity. New from the soil of Machida City, Tokyo for this purpose! 1 (hereinafter referred to as DO-79 strain) was isolated.

問題点を ゛ るための 役 本発明によるとストレプトマイセス属に属する微生物を
用いることにより抗菌および制癌活性を有する新規物質
DC−79(DC−79−AおよびDC−79−B)を
ず尋ることができる。
According to the present invention, by using microorganisms belonging to the genus Streptomyces, a new substance DC-79 (DC-79-A and DC-79-B) having antibacterial and anticancer activities has been produced. You can ask.

次にDC−79−AおよびDC−79−Bの物理化学的
性質を示す。
Next, the physicochemical properties of DC-79-A and DC-79-B are shown.

(I  DC−79−Aの物理化学的性質(イ)分子量
:6QOQ(ゲルー過法)(ロ)紫外部吸収スペクトル
;42Qnmに吸収極大(0,IN  )icJ!>、
530nmに吸収極大(0,lN  Na0H)を示す
(第1図)。
(Physicochemical properties of I DC-79-A (a) Molecular weight: 6QOQ (gel-filtration method) (b) Ultraviolet absorption spectrum: Maximum absorption at 42Qnm (0,IN)icJ!>,
It shows an absorption maximum (0,1N NaOH) at 530 nm (Fig. 1).

(ハ)赤外部吸収スペクトル:KBr法により測定(第
2図)。
(c) Infrared absorption spectrum: Measured by KBr method (Figure 2).

(ニ)  アミノ酸分析:Asp、Thr、Ser。(d) Amino acid analysis: Asp, Thr, Ser.

Glu、Pro、Gly、Ala。Glu, Pro, Gly, Ala.

Cys、Vat、 Mat、Ile。Cys, Vat, Mat, Ile.

Leu、Tyr、Phe、His。Leu, Tyr, Phe, His.

Lys、’Trp、Arg (ホ)糖分析:セロビオース、マンノース、アラビノー
ス、キシロース、グルコース (へ)溶解性:水、メタノールによく溶けるが、エタノ
ール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン
、ヘキサン1こはほとんど溶けない。
Lys, 'Trp, Arg (E) Sugar analysis: cellobiose, mannose, arabinose, xylose, glucose Almost insoluble.

(2)DC−79−Bの物理化学的性質(イ)分子量:
8900 (ゲルー過法)(ロ)紫外部吸収スペクトル
:42Qnmに吸収極大(0,1N  MCI”)、5
30nm!、:吸収掻大(0,IN  Na0H)を示
す(第3図)。
(2) Physicochemical properties of DC-79-B (a) Molecular weight:
8900 (Gel-filtration method) (b) Ultraviolet absorption spectrum: absorption maximum at 42Qnm (0,1N MCI"), 5
30nm! , : indicates absorption strength (0, IN NaOH) (Fig. 3).

(ハ)赤外部吸収スペクトル:KBr法により測定(第
4図)。
(c) Infrared absorption spectrum: Measured by KBr method (Figure 4).

(ニ) アミノ酸分析:Asp、Thr、Ser。(d) Amino acid analysis: Asp, Thr, Ser.

Glu、Pro、Gly、Ala。Glu, Pro, Gly, Ala.

Cys、Val、Met、I Ie。Cys, Val, Met, IIe.

Leu、Tyr、Phe、His。Leu, Tyr, Phe, His.

Lys、Trp、Arg (ホ)Ii分析:セロビオース、マンノース、アラビノ
ース、キシロース、グルコース (へ)溶解性:水、メタノールによ(溶けるが、エタノ
ール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン
、ヘキサンにはほとんど溶けない。
Lys, Trp, Arg (e)Ii analysis: Cellobiose, mannose, arabinose, xylose, glucose (to) Solubility: Soluble in water and methanol, but hardly in ethanol, acetone, ethyl acetate, chloroform, benzene, hexane Insoluble.

DC−79−AおよびDC−79−Bと類縁と考えられ
る既知化合物と比較をしてみると、クロモフォアを持つ
蛋白性抗生物質に属することが示唆された。そこでクロ
モフォアの単離を行いその紫外部吸収スペクトルを測定
したところ、420 nm、2’70nm(sh)、2
40nm(0,IN  HCI  MeOH)、530
nm。
Comparison with known compounds considered to be related to DC-79-A and DC-79-B suggested that they belong to protein antibiotics with chromophores. Therefore, when we isolated the chromophore and measured its ultraviolet absorption spectrum, we found that 420 nm, 2'70 nm (sh), 2
40nm (0, IN HCI MeOH), 530
nm.

320nm、242nm (0,1N  NaOHMe
OH)に吸収極大を示した。類似の値を示すものとして
、ラルゴマイシン(largomycin)は420n
m、272nm (0,IN  HCjり。
320nm, 242nm (0,1N NaOHMe
OH) showed an absorption maximum. Showing similar values, largomycin is 420n
m, 272 nm (0,IN HCjri.

288nm、525nm (0,IN  Na0H)に
、プルラリン(plurallin)は244 nm。
288 nm, 525 nm (0, IN NaOH), and 244 nm for pluralin.

2?1nm、   430nm(0,IN  HCIl
MeOH)、245nm、270nm、415nm(0
,1N  NaOH>に吸収極大を示すことが報告され
ている。これらはいずれもDC−79−AおよびDC−
79−Bのクロモフォアとは区別することができる。ま
たアミノ酸組成もラルゴマイシンのそれとは第1表に示
すように明らかに区別することができる。
2?1nm, 430nm (0,IN HCl
MeOH), 245 nm, 270 nm, 415 nm (0
, 1N NaOH> has been reported to show an absorption maximum. Both of these are DC-79-A and DC-
It can be distinguished from the chromophore of 79-B. Furthermore, the amino acid composition can be clearly distinguished from that of largomycin as shown in Table 1.

クロモフォアの単離はDC−79−Aの粉末を氷酢酸で
抽出し、抽出物を乾固後クロロホルムに溶解した。この
溶液を水(pH2,0>で抽出し、抽出液を凍結乾燥し
て濃縮した。これを少量のメタノールに溶かして薄層ク
ロマトグラフィー(シリカゲル)で精製単離した(使っ
た溶媒はクロロホルム:メタノール−アンモニア=90
:8:2、容量比)。アミノ酸分析は上記の粉末を12
N  HCIで110℃、24時間加水分解後アミノ酸
分析計LC−2O3AC(日本電子)を用いて測定した
。また糖の分析は上記粉末をIN  H2So、 、1
00℃、6時間加水分解し、2N  NaOHで中和後
アミノ酸分析計LC−2O5AC(日本電子)を用いて
測定した。
The chromophore was isolated by extracting the powder of DC-79-A with glacial acetic acid, drying the extract, and then dissolving it in chloroform. This solution was extracted with water (pH 2.0>), and the extract was lyophilized and concentrated. This was dissolved in a small amount of methanol and purified and isolated using thin layer chromatography (silica gel) (the solvent used was chloroform: Methanol-ammonia = 90
:8:2, capacity ratio). For amino acid analysis, the above powder was
After hydrolysis with N HCI at 110° C. for 24 hours, it was measured using an amino acid analyzer LC-2O3AC (JEOL Ltd.). In addition, for sugar analysis, the above powder was mixed with IN H2So, , 1
Hydrolyzed at 00°C for 6 hours, neutralized with 2N NaOH, and then measured using an amino acid analyzer LC-2O5AC (JEOL Ltd.).

Asp     9    8     20Thr 
   10   15     20Ser、    
9   10     16Glu    22   
10     3TPro    39  100  
   16Gly    14   22     2
4Ala    12   12     28Cys
     8   13      0Va l   
  9   13     27Met     l 
    l       2IIe    5    
5     10Leu     8   12   
  20Tyr    trace   trace 
      4Pha     3    5    
 10His   6  6   4 L’lS     4    5     13Trp
    trace   trace       4
数値はモル比を示す。
Asp 9 8 20Thr
10 15 20Ser,
9 10 16 Glu 22
10 3TPro 39 100
16Gly 14 22 2
4Ala 12 12 28Cys
8 13 0Va l
9 13 27 Met l
l 2IIe 5
5 10Leu 8 12
20Tyr trace trace
4Pha 3 5
10His 6 6 4 L'lS 4 5 13Trp
trace trace 4
Numerical values indicate molar ratios.

次にDC−79−AおよびDC−79−Bの生物学的性
質について説明する。
Next, the biological properties of DC-79-A and DC-79-B will be explained.

(^)抗菌活性 各種細菌に対する最少生育阻止濃度(MI(2)を第2
表に示す。
(^) Antibacterial activity Minimum inhibitory concentration (MI (2) for various bacteria)
Shown in the table.

第   2   表 抗菌活性はパクト・トリプトン(Difco社製)3g
、肉エキス3g、酵母エキスtg。
Table 2 Antibacterial activity is 3g of Pacto Tryptone (manufactured by Difco)
, meat extract 3g, yeast extract tg.

グルコース1g、寒天16gをljの水に溶解して作成
した培地(pH7)を用いて寒天希釈法で測定した。D
C−79−AおよびDC−79−Bは同じMICを示し
た。
It was measured by the agar dilution method using a medium (pH 7) prepared by dissolving 1 g of glucose and 16 g of agar in lj of water. D
C-79-A and DC-79-B showed the same MIC.

(B)急性毒性  ゛ マウスに対する腹腔投与におけるDC−79(DC−7
9−AとDC−79−Bの比はほぼ!:lのものであっ
た)の急性毒性の値(L Dso )は約175■/k
gであった。
(B) Acute toxicity ゛DC-79 upon intraperitoneal administration to mice (DC-7
The ratio between 9-A and DC-79-B is almost the same! The acute toxicity value (L Dso ) of
It was g.

((2)抗癌活性 リンホサイティック・リエケミアP388腫瘍に対する
治療効果 体重的22gのCDF1雄マウス1群5匹に、リンホサ
イティフク・リエケミア(Lynpho−cyic 1
eukeIllia) P 388 N癌細胞lXl0
’個を腹腔内移植した。移植後24時間目にDC−79
(DC−79−AとDC−79−8の比はほぼ1:lの
ものであった)の燐酸緩衝生理食塩水(以下PBSとい
う)0.2mlを1回腹腔内に投与した。
((2) Anticancer activity Therapeutic effect on Lymphocytic liechemia P388 tumor One group of 5 CDF1 male mice weighing 22 g were injected with Lymphocytic liechemia (Lynpho-cyic 1).
eukeIllia) P 388 N cancer cell lXl0
' were transplanted intraperitoneally. DC-79 24 hours after transplantation
(The ratio of DC-79-A to DC-79-8 was approximately 1:1) 0.2 ml of phosphate buffered saline (hereinafter referred to as PBS) was intraperitoneally administered once.

PBSの組成はN a C10,3%、KCl0.02
%、Nag HPo、1.15%。
The composition of PBS is NaCl 10.3%, KCl 0.02
%, Nag HPo, 1.15%.

KHs PO45%、KH−PO,0,02%。KHs PO 45%, KH-PO, 0.02%.

pH7,0である。The pH is 7.0.

PBS溶液O0移植後の平均生存日数およびT/C(T
 :試験例の平均生存日数、C:対照の平均生存日数)
を第3表に示す。
Average survival days and T/C (T
: Average survival days of test cases, C: Average survival days of controls)
are shown in Table 3.

第   3   表 DC−79013− (対照) DC−795014,71,13 DC−7910016,91,30 DC−7915017,81,37 次にDo−79株の菌学的特徴および生理学的性質を示
す。
Table 3 DC-79013- (Control) DC-795014, 71, 13 DC-7910016, 91, 30 DC-7915017, 81, 37 Next, the mycological characteristics and physiological properties of the Do-79 strain are shown.

(^)Do−79株の菌学的性質 本発明の生産菌は、一般に放線菌の生育に用いられる種
々の天然培地で良好な生育を示すが、合成培地において
は普通もしくは貧弱な生育を示す。気中菌糸の着生はき
わめて貧弱で、わずかに着生したのはスターチ寒天培地
およびプリドへム・ゴツトリーブ寒天培地(炭素源が、
D−7ラクトース、イノシトールおよびラフィノースの
場合)などである。
(^) Mycological properties of strain Do-79 The producing bacteria of the present invention shows good growth on various natural media generally used for the growth of actinomycetes, but shows normal or poor growth on synthetic media. . Aerial mycelium colonization was extremely poor, and only a small amount of aerial mycelial colonization occurred on starch agar and Pridhem-Gottlieb agar (where the carbon source was
D-7 lactose, inositol and raffinose).

基生菌糸は、イースト・麦芽およびとツキ−・トレスナ
ー寒天培地では***状の生育を示す。
The basal hyphae exhibit ridge-like growth on yeast malt and Totsuki-Trössner agar media.

その色調は、赤味がかった茶色や黄馬色を呈し、これら
は培地中に生成される可溶性色素と同様、酸性では無色
〜黄色に、アルカリ性では赤〜紫色へと変化するpHイ
ンディケータ−である。また、メラニン様色素の生成も
ある。
Its color is reddish brown or yellow, and like the soluble pigments produced in the culture medium, it is a pH indicator that changes from colorless to yellow in acidic conditions and red to purple in alkaline conditions. . There is also the production of melanin-like pigments.

1子は、気中菌糸より単純分枝した先端に、20個以上
の連鎖を形成し、らせん状(spiral)を呈する。
A single offspring forms a chain of 20 or more at the tip of a simple branch from the aerial hyphae, exhibiting a spiral shape.

胞子の形態は桿型〜楕円型で大きさは0.9〜0.7X
O15〜0.6μであり、電子顕微鏡観察によれば、表
面は平滑(sn+ooth )であり、鞭毛は認められ
ない。また胞子嚢も見い出されない。
The shape of the spore is rod-shaped to oval, and the size is 0.9-0.7X.
According to electron microscopy, the surface is smooth (sn+ooth) and no flagella are observed. Also, no sporangia were found.

(B)各種培地上での生育状態 各種培地上において28℃、2週間培養した時の生育お
よび色の特徴を下記に示す。
(B) Growth status on various media The characteristics of growth and color when cultured on various media at 28°C for 2 weeks are shown below.

色の表示はCo1or l(armony Manua
l(ContainerCorporation or
 America)による色の分類に従ったものである
Color display is Co1 or l (armony Manua
l(Container Corporation or
This is in accordance with the color classification by the United States.

なお、可溶性色素は前述のごと<pHインディケータ−
である。
In addition, the soluble dye is as described above.
It is.

(1)シークロース・硝酸塩寒天培地 生育:中程度、***状 気中菌糸とその色:貧弱、ホヮイ) (a)基土菌糸の
色ニライト・メロンイエロー(3ea)−ライト・アイ
ポリ−(2Ca)可溶性色素:な し く2)グルコース・アスパラギン寒天培地生育;貧弱〜
中程度、粒状 気中菌糸とその色:な し 基土菌糸の色:クリーム(1!’1ca)可溶性色#:
な し く3)  グリセリン・アスパラギン寒天培地生育:良
好、***状 気中菌糸とその色:な し 基土菌糸の色:フレッシュピンク(5ca)−アプリコ
ツト(4ie) 可溶性色素:な し く4)スターチ寒天培地 生育:良好〜中程度、粒状〜***状 気中菌糸とその色:貧弱、ホヮイ) (a)基土菌糸の
色:パールピンク(3Caiパステルオレンジ(41(
2) 可溶性色素ニブライト・イエロー(3na)−ブライト
・マリーゴールド(3pa)(5)チロシン寒天培地 生育:貧弱〜中程度、***状 気中菌糸とその色:な し 基土菌糸の色;ビーバー(31i) 可溶性色素ニライトブラウン (6)栄養寒天培地 生育:貧弱〜中程度、***状 気中菌糸とその色:な し 基土菌糸の色:ピスケッ) (2ec)可溶性色素:な
 し く7)イースト・麦芽寒天培地 生育:良好、***状 気中−系とその色:な し 基土菌糸の色:カメル(3ie)−パxフルオレンジ(
41(2) 可溶性色素ニライトブラウン (8)オートミール寒天培地 生育:中程度、粒状〜***状 気中菌糸とその色;な し 基土菌糸の色ニルゼット・オレンジ<3nc)−アンバ
ー(3pe) 可溶性色素ニライト・マスタード・タン(2ie)−ト
パーズ(3ne) ((2)各種生理的性質 DO−79株の生理的諸性質を以下に示す。
(1) Sea crose/nitrate agar medium Growth: Moderate, elevated aerial hyphae and their color: poor, whey) (a) Substrate hyphae color: Nirite/Melon Yellow (3ea) - Light/Ipoly (2Ca) Soluble pigment: None 2) Growth on glucose/asparagine agar medium; poor ~
Medium, granular aerial mycelium and its color: none Substrate mycelium color: cream (1!'1ca) Soluble color #:
3) Glycerin/asparagine agar medium Growth: Good, raised aerial hyphae and their color: None Substrate hyphae color: Fresh pink (5ca) - Apricot (4ie) Soluble pigment: None 4) Starch agar medium Growth: Good to moderate, granular to raised aerial hyphae and their color: poor, whey) (a) Color of substratum hyphae: Pearl pink (3Cai pastel orange (41 (
2) Soluble pigment Nibrite Yellow (3na) - Bright Marigold (3pa) (5) Tyrosine agar medium Growth: Poor to moderate, raised aerial hyphae and their color: None Color of substratum hyphae: Beaver ( 31i) Soluble pigment nilight brown (6) Growth on nutrient agar medium: poor to moderate, raised aerial hyphae and their color: none Color of substratum hyphae: Pisquet) (2ec) Soluble pigment: none 7) Yeast・Growth on malt agar medium: Good, raised aerial system and its color: None Color of substratum hyphae: Camel (3ie) - Pa x Full Orange (
41 (2) Soluble pigment Nilite Brown (8) Oatmeal agar medium Growth: Medium, granular to raised aerial hyphae and their color; None Substrate hyphae color Nirzet Orange <3nc) - Amber (3pe) Soluble Pigments nyrite, mustard, tan (2ie) - topaz (3ne) ((2) Various physiological properties Various physiological properties of the DO-79 strain are shown below.

生育温度範囲については、2日後の結果脱脂牛乳、ゼラ
チンおよび繊維素への作用については28℃、1ケ月後
、その他は28℃で3週間後の観察結果を示した。
Regarding the growth temperature range, the results after 2 days showed the effects on skim milk, gelatin and cellulose at 28°C after 1 month, and the other results after 3 weeks at 28°C.

(1)  炭素源の資化性:D−グルコース、D−マン
ニトール、D−フラクトース、メ リビオース、マンノースは資化するが、D−キシロース
、1−イノシトールお よびラフィノースの資化性は低り、L −アラビノース、L−ラムノースおよ びシークロースは資化しない。
(1) Assimilation of carbon sources: D-glucose, D-mannitol, D-fructose, melibiose, and mannose are assimilated, but assimilation of D-xylose, 1-inositol, and raffinose is low, and L- Arabinose, L-rhamnose and seucrose are not assimilated.

(2)ゼラチンの液化:液化しない (3)  脱脂牛乳の凝固、ペプトン化:ペプトン化し
たが、凝固はわずかである。
(2) Liquefaction of gelatin: Not liquefied (3) Coagulation and peptonization of skim milk: Peptonization occurred, but coagulation was slight.

(4)  繊維素の分解作用:ごくわずかにある(5)
スターチの加水分解作用:ある (6)生育温度範囲:22〜28℃である。
(4) Cellulose decomposition effect: very slight (5)
Starch hydrolysis action: Yes (6) Growth temperature range: 22-28°C.

至適温度範囲は、28〜31℃である。The optimum temperature range is 28-31°C.

(7)  メラニン様色素の生成:あるDO−79株は
、中温菌であり、気中菌糸の形成能は低いが、形成した
場合には気中菌糸より単純分枝した胞子柄に20個以上
の胞子鎖を作る。また、菌糸の分断は認められない。一
方、細胞壁の分析により、LLWのジアミノピメリン酸
を含有することから、線菌は、放線菌目のストレプトマ
イセス属に分類される。
(7) Production of melanin-like pigments: A certain DO-79 strain is a mesophilic bacterium and has a low ability to form aerial hyphae, but when it does form, it produces more than 20 hyphae on a sporophyte that is simply branched from the aerial hyphae. Create a spore chain. In addition, no division of hyphae was observed. On the other hand, since cell wall analysis shows that it contains LLW diaminopimelic acid, Streptomyces is classified into the genus Streptomyces in the order Actinobacteria.

本株はストレプトマイセスSp。This strain is Streptomyces Sp.

(Streptomyces sρ、>Do−79と命
名され、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌
寄第772? 号として寄託されている。
(It was named Streptomyces sρ, >Do-79, and has been deposited with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology as Microbiology Research Institute No. 772?).

次にDC−79の製造法について説明する。Next, a method for manufacturing DC-79 will be explained.

本発明によればストレプトマイセス属に属しDC−79
を生産する能力を有する微生物はいずれも用いうる。具
体的にはストレプトマイセスsp、Do−79(微工研
菌寄第7922 号)が用いられる。
According to the present invention, DC-79 belongs to the genus Streptomyces.
Any microorganism capable of producing can be used. Specifically, Streptomyces sp, Do-79 (Feikoken Bacterial Serial No. 7922) is used.

その他本発明を実施するのに有用な微生物は代謝生産物
の生産性を増加せしめるために公知の手法において人口
的方法、例えば、紫外線照射、X線照射、あるいは変異
誘起物質による変異処理法によって変異される。本発明
にふいてはDC−79を生産する能力を有する限り該変
異株も用いることができる。
Other microorganisms useful in carrying out the present invention may be mutated by artificial methods, such as ultraviolet irradiation, be done. In the present invention, such mutant strains can also be used as long as they have the ability to produce DC-79.

本発明の培養においては通常の放線菌の培養法が一般に
用いられる。培養培地としては炭素源、窒素源、無機物
等を程よく含有していれば天然培地又は合成培地のいず
れも用いられる。炭素源としてはブドウ糖、*粉、グリ
セロール、マンノース、フラクトース、ンュークロース
、糖蜜などがtll独または組み合わせて用いられる。
In the cultivation of the present invention, ordinary methods for culturing actinomycetes are generally used. As the culture medium, either a natural medium or a synthetic medium can be used as long as it contains appropriate amounts of carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances, etc. As the carbon source, glucose, powder, glycerol, mannose, fructose, nuclose, molasses, etc. are used alone or in combination.

さらに菌の資化能によって炭化水素、アルコール類や有
機酸なども用いられる。窒素源としては塩化アンセン。
Furthermore, hydrocarbons, alcohols, organic acids, etc. may also be used depending on the assimilation ability of the bacteria. Anthene chloride is used as a nitrogen source.

硫酸アンモン、硝酸アンモン、硝酸ソータ、尿素、ペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチ
ープ・リカー、大豆粉。
Ammonium sulfate, ammonium nitrate, nitrate sorter, urea, peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, corn steep liquor, soy flour.

カザミノ酸などが単独または組み合わせて用いられる。Casamino acids and the like are used alone or in combination.

無機物としては、食塩、塩化カリウム、硫酸第1鉄、硫
酸亜鉛、硫酸マンガン。
Inorganic substances include table salt, potassium chloride, ferrous sulfate, zinc sulfate, and manganese sulfate.

硫酸銅、炭酸カルシウム、燐酸塩などの塩類が用いられ
る。その他必要に応じてDC−79の生産を促進する物
質例えばビオチン、ビタミン等を適当に添加することが
できる。
Salts such as copper sulfate, calcium carbonate, and phosphates are used. Other substances that promote the production of DC-79, such as biotin, vitamins, etc., may be added as appropriate.

培養法としては、液体培養法、とくに深部攪拌培養法が
もっとも適している。培養温度は25〜40℃、とくに
28〜38℃が好適で、培地のpHはアンモニア水や炭
酸アンモニア水などを添加して、pH4〜10、好まし
くは6〜8で培養を行うことが望ましい。
The most suitable culture method is a liquid culture method, especially a deep agitation culture method. The culture temperature is preferably 25 to 40°C, particularly 28 to 38°C, and the pH of the medium is preferably 4 to 10, preferably 6 to 8, by adding aqueous ammonia or aqueous ammonia carbonate.

液体培養で通常1日ないし7日培養を行うと、DC−7
9が培養液中に生成蓄積される。培養液中の生成量が最
大に達したときに培養を停止し、菌体を戸別して得られ
る培養液中よりDC−79を精製単離する。
When cultured in liquid culture for usually 1 to 7 days, DC-7
9 is produced and accumulated in the culture solution. When the production amount in the culture solution reaches the maximum, the culture is stopped, and the cells are separated from each other, and DC-79 is purified and isolated from the obtained culture solution.

培養p液からのDC−79の単離精製には、微生物代謝
生産物を、その培養液から単離するためにふつう用いら
れる分離、精製の方法が利用される。例えば、培養生産
物を培養液と菌体とにp過、遠心分離等によって分離し
、菌体を除去した液を非イオン性多孔性樹脂例えばHP
−20(三菱化成製)等で処理して、活性成分を吸着さ
せた後、メタノール、アセトンなどを用いて溶出させる
。この溶出液をイオン交換樹脂例えばDEAEセファセ
ル(Pharmacia社製)に吸着させる。次いで活
性成分を食塩、塩化アンモンなどの水溶液で溶出する。
Isolation and purification of DC-79 from culture p fluid utilizes separation and purification methods commonly used to isolate metabolic products of microorganisms from their culture fluids. For example, the culture product is separated into a culture solution and bacterial cells by p-filtration, centrifugation, etc., and the liquid from which the bacterial cells are removed is injected into a nonionic porous resin such as HP.
-20 (manufactured by Mitsubishi Kasei) or the like to adsorb the active ingredient, and then elute it using methanol, acetone, or the like. This eluate is adsorbed onto an ion exchange resin such as DEAE Sephacel (manufactured by Pharmacia). The active ingredient is then eluted with an aqueous solution of common salt, ammonium chloride, or the like.

活性画分を集め硫安などの塩を加えて沈殿後透析してか
ら凍結乾燥して粗粉末を得る。さらにこれをヒドロキシ
ルアパタイトを用いてカラムクロマトを行いDC−79
−AとDC−79−Bに分離することができる。
The active fractions are collected and precipitated by adding a salt such as ammonium sulfate, followed by dialysis and freeze-drying to obtain a crude powder. Further, this was subjected to column chromatography using hydroxylapatite and DC-79
-A and DC-79-B.

このようにして得られたDC−79−AおよびDC−7
9−Bは、セファデックス、シリカゲルなどを用いる各
種クロマトグラフィー等によってさらに純度を高めるこ
とができる。
DC-79-A and DC-7 thus obtained
The purity of 9-B can be further increased by various chromatography methods using Sephadex, silica gel, etc.

以下に本発明の態様が実施例で示される。Aspects of the present invention are illustrated below in Examples.

実施例 種菌としてストレプトマイセスsp、DO−79を用い
る。該菌株211容量の三角フラスコ中のバクト・トリ
プトン(Difco社製)5g/j!、酵母エキス5 
g /’ 1 、肉エキス3g/l、可溶性澱粉10g
/j!、グルコース10g/ji、炭酸カルシウム5g
/lの組成を有する種培地(p H7,2殺菌前) 3
00ffllに植菌し、30℃で48時間振盪(20O
rpm)培養する。得られる種培養を301容量のジャ
ーファーメンタ−中の下記組成の発酵培地151に植菌
し、30℃で通気攪拌方式(回転数25Orpm;通気
量15 j! 7m1n)により培養を行う。
EXAMPLE Streptomyces sp, DO-79 is used as the inoculum. Bacto-tryptone (manufactured by Difco) in a 211-volume Erlenmeyer flask of the strain 5 g/j! , yeast extract 5
g/' 1, meat extract 3g/l, soluble starch 10g
/j! , glucose 10g/ji, calcium carbonate 5g
/l seed medium (pH 7.2 before sterilization) 3
00ffll and shaken at 30℃ for 48 hours (20O
rpm). The obtained seed culture is inoculated into a fermentation medium 151 having the following composition in a 301 volume Jar Fermentor, and culture is carried out at 30° C. using an aeration stirring method (number of revolutions: 25 rpm; aeration volume: 15 j!7 ml).

発酵培地組成:グリ40−ル50g/j!。Fermentation medium composition: Guri 40-le 50g/j! .

KH2PO40,5g/L MgSO4・7aq0、5
 g / 1、コーン・スチープ・リカー20g/l、
炭酸カルシウム5g/1(pH7,0、殺菌前にNaO
Hで#illり。
KH2PO40.5g/L MgSO4・7aq0.5
g/1, corn steep liquor 20g/l,
Calcium carbonate 5g/1 (pH 7.0, NaO before sterilization)
#ill with H.

培養中の培地のpHは、アンモニア水を用いてp H6
,5〜7.5に調節しながら72時間培養する。
The pH of the medium during culture is adjusted to pH6 using ammonia water.
, 5 to 7.5 for 72 hours.

培養液より菌体を戸別し、P液131を得る。Bacterial cells are separated from the culture solution to obtain P solution 131.

−液13Nを21の非イオン性多孔性樹脂HP−20(
@品名、三菱化I!λ製)に通塔して活性物質を吸着さ
せ水洗後さらに1・・’35メタノール溶液で洗い不純
物を除去し、次いで80%メタノールで溶出する。溶出
画分を濃縮後HP−20に再度吸着させ、同様の操作を
行った。次にDEAEセファセル(CI−type)2
00mlに通塔し非吸着成分を70%飽和硫安で濃縮後
、透析、凍結乾燥によって粗粉末を得る。さらにセファ
デックスG −75CPharmacia社製)カラム
クロマト後先と同様にして粉末を得る。この粉末を0.
1M燐酸rIk衡液(p H6,8)溶解し、同波で平
衡化したヒドロキシルアパタイト(生化学工業製)に通
塔し、非吸着成分(DC−79−A)と0.1mM〜0
.3M燐酸緩衝液による濃度勾配法で溶出される成分(
DC−79−B)をそれぞれ5■、3I1g得る。
- Add 13N of liquid to 21% of nonionic porous resin HP-20 (
@Product name, Mitsubishika I! After washing with water, impurities are removed by washing with a 1...'35 methanol solution, and then eluting with 80% methanol. After concentrating the eluted fraction, it was again adsorbed onto HP-20, and the same operation was performed. Next, DEAE Sephacel (CI-type) 2
After concentrating the unadsorbed components with 70% saturated ammonium sulfate, a crude powder is obtained by dialysis and freeze-drying. Further, after column chromatography (Sephadex G-75CPharmacia), a powder is obtained in the same manner as above. Add this powder to 0.
It was dissolved in 1M phosphoric acid rIk equilibrium solution (pH 6,8) and passed through a column of hydroxyl apatite (manufactured by Seikagaku Corporation) equilibrated with the same wave.
.. Components eluted by concentration gradient method using 3M phosphate buffer (
DC-79-B) was obtained in amounts of 5 g and 3I, respectively.

これらは電気泳動的に均一の蛋白であった。ここで得ら
れた同成分をCon −A  5apharose(P
hara+acia社製) カラムクロマトなどを行っ
て糖と蛋白との分離を試みたが、分離できなかったので
これらは糖蛋白であると結論した。
These were electrophoretically homogeneous proteins. The same component obtained here was mixed with Con-A 5apharose (P
Hara+acia) Column chromatography was performed to try to separate sugars and proteins, but since they could not be separated, it was concluded that they were glycoproteins.

発明の効果 本発明により抗菌および制癌作用を有する新規物質、D
C−79を得ることができる。
Effects of the Invention The present invention provides a novel substance with antibacterial and anticancer effects, D
C-79 can be obtained.

【図面の簡単な説明】 第1図はDC−79−Aの紫外部吸収スペクトルを示す
。 第2図はDC−79−Aの光外部吸収スペクトルを示す
。 第3図はDC−79−Bの紫外部吸収スペクトルを示す
。 第4図はDC−79−Bの光外部吸収スペクトルを示す
。 特許出願人 (102)協和醗酵工業株式会社ゝ、」し
/ 手  続  補  正  書 昭和59年12月2g日 1、事件の表示 昭和59年特許願第236478号 2、発明の名称 DC−79右よびその製造法 3、補正をする者 事件との関係  特許出願人 郵便番号 lOO 住 所  東京都千代田区大手町−丁目6番1号名称 
(102)協和醗酵工業株式会社明細書の特許請求の範
囲及び発明の詳細な説明の欄 5、補正の内容 (11特許請求の範囲 「別紙の通り」 (2)明細書第4頁13行、第5頁8行及び第7頁(3
)同書第6頁6−8行 r(0,1N  HCIlMeOH)、245nm。 270nm、415nm(0,lN  Na0H)Jを
「(MeOH) 、 2’45 nm、 270 nm
。 415nm(0,1N  HCjり、257nm。 320nm、540nm(0,1N  NaO’H)J
に訂正する。 (4)同書第8頁第2表中 「サルモネラ・タイホーサ」を「サルモネラ・ティフィ
」に訂正する。 特許請求の範囲 (1)次の物理化学的性質を有するDC−79−A(イ
)分子量:6000 (ゲル濾過法)(ロ)紫外部吸収
スペクトル:42Qnmに吸収極大(0,IN  HC
I>、530nmに吸収極大(0,1N  Na0H)
を示す(第1図)。 (ハ)赤外吸収スペクトル:KBr法により測定(第2
図)。 (ニ)アミノ酸分析:アスパラギン酸(Asp)。 トレオニン(Thr)、セリフ(Set)。 グルタミン酸(Glu)、プロリン (Pro)、グリシン(Gly)、アラニン(Ala)
、システ47(CSH)。 バリン(Val)、メチオニン(Me t)。 インロインン(Ile)、ロイシン (Leu)、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(
Phe)、ヒスチジン (His)、 リジン(Lys)、)リプトファン(T
rp>、アルギニン(Arg)(ホ)糖分析:セロビオ
ース、マンノース、アラビノース、キノロース、グルコ
ース (へ)溶解性:水、メタノールによく溶けるが、エタノ
ール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン
、ヘキサンにはほとんど溶けない。 (2)次の物理化学的性質を存するDC−79〜B(イ
)分子量:8900 (ゲル濾過法)(ロ)紫外部吸収
スペクトル:4201mに吸収極大(0,1N  H(
1り、530nmに吸収極大(0,lN  Na0H)
を示す(第3図)。 (ハ)赤外部吸収スペクトル:KBr法により測定(第
4図)。 (ニ)アミノ酸分析:Asp、Thr、Ser。 Glu、Pro、Gly、Ala。 旦ヱ上上、Val、Met、Ile。 Leu、Tyr、Phe、H+ s。 Lys、Trp、Arg (ホ)糖分析:セロビオース、マンノース、アラビノー
ス、キシロース、グルコース (へ)溶解性:水、メタノールによく溶けるが、エタノ
ール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン
、へキサンにはほとんど溶けない。 (3)  ストレプトマイセス属に属し、DC−79−
AまたはDC−79−Bを生産する能力を有する微生物
を培地に培養し、培養物中にDC−79−AまたはDC
−79−Bを生成させ、該培養物から蓄積したDC−7
9−AまたはDC−79−Bを採取することを特徴とす
るDC−79の製造法。
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows the ultraviolet absorption spectrum of DC-79-A. FIG. 2 shows the optical external absorption spectrum of DC-79-A. FIG. 3 shows the ultraviolet absorption spectrum of DC-79-B. FIG. 4 shows the optical external absorption spectrum of DC-79-B. Patent Applicant (102) Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. / Procedural Amendment Written December 2g, 1982 1, Case Description 1982 Patent Application No. 236478 2, Name of Invention DC-79 Right Patent applicant postal code lOO Address 6-1 Otemachi-chome, Chiyoda-ku, Tokyo Name
(102) Scope of Claims and Detailed Description of the Invention column 5 of Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Specification, Contents of Amendment (11 Claims “As attached” (2) Page 4, line 13 of the specification, Page 5, line 8 and page 7 (3
) Ibid., page 6, lines 6-8 r (0,1N HCIlMeOH), 245 nm. 270nm, 415nm (0,1N NaOH)
. 415nm (0,1N HCj, 257nm. 320nm, 540nm (0,1N NaO'H)J
Correct. (4) "Salmonella taihosa" in Table 2 on page 8 of the same book is corrected to "Salmonella typhi." Claims (1) DC-79-A having the following physicochemical properties (a) Molecular weight: 6000 (gel filtration method) (b) Ultraviolet absorption spectrum: absorption maximum at 42Q nm (0,IN HC
I>, maximum absorption at 530 nm (0,1N NaOH)
(Figure 1). (c) Infrared absorption spectrum: Measured by KBr method (second
figure). (d) Amino acid analysis: aspartic acid (Asp). Threonine (Thr), Serif (Set). Glutamic acid (Glu), proline (Pro), glycine (Gly), alanine (Ala)
, System 47 (CSH). Valine (Val), methionine (Met). Inloin (Ile), Leucine (Leu), Tyrosine (Tyr), Phenylalanine (
Phe), histidine (His), lysine (Lys),) liptophan (T
rp>, arginine (Arg) (ho)sugar analysis: cellobiose, mannose, arabinose, quinolose, glucose (to) Solubility: Well soluble in water and methanol, but not in ethanol, acetone, ethyl acetate, chloroform, benzene, hexane Almost insoluble. (2) DC-79 to B with the following physicochemical properties (a) Molecular weight: 8900 (gel filtration method) (b) Ultraviolet absorption spectrum: absorption maximum at 4201 m (0,1N H(
1, maximum absorption at 530 nm (0,1N NaOH)
(Figure 3). (c) Infrared absorption spectrum: Measured by KBr method (Figure 4). (d) Amino acid analysis: Asp, Thr, Ser. Glu, Pro, Gly, Ala. Val, Met, Ile. Leu, Tyr, Phe, H+s. Lys, Trp, Arg (E) Sugar analysis: cellobiose, mannose, arabinose, xylose, glucose Insoluble. (3) Belongs to the genus Streptomyces, DC-79-
A microorganism having the ability to produce A or DC-79-B is cultured in a medium, and the culture contains DC-79-A or DC-79-B.
-79-B and accumulated DC-7 from the culture.
A method for producing DC-79, which comprises collecting 9-A or DC-79-B.

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] (1)次の物理化学的性質を有するDC−79−A(イ
)分子量:6000(ゲルろ過法) (ロ)紫外部吸収スペクトル:420nmに吸収極大(
0.1N HCl)、530nmに吸収極大(0.1N
 NaOH)を示す(第1 図)。 (ハ)赤外部吸収スペクトル:KBr法により測定(第
2図)。 (ニ)アミノ酸分析:アスパラギン酸(Asp)、トレ
オニン(Thr)、セリン(Ser)、グルタミン酸(
Glu)、プロリン (Pro)、グリシン(Gly)、アラ ニン(Ala)、シスチン(Cys)、 バリン(Val)、メチオニン(Met)、イソロイシ
ン(Ile)、ロイシン (Leu)、チロシン(Tyr)、フェ ニルアラニン(Phe)、ヒスチジン (His)、リジン(Lys)、トリプ トファン(Trp)、アルギニン(Arg)(ホ)糖分
析:セロビオース、マンノース、アラビノース、キシロ
ース、グルコース (ヘ)溶解性:水、メタノールによく溶けるが、エタノ
ール、アセトン、酢酸エチル、ク ロロホルム、ベンゼン、ヘキサンにはほ とんど溶けない。
(1) DC-79-A with the following physicochemical properties (a) Molecular weight: 6000 (gel filtration method) (b) Ultraviolet absorption spectrum: absorption maximum at 420 nm (
0.1N HCl), absorption maximum at 530nm (0.1N
(Figure 1). (c) Infrared absorption spectrum: Measured by KBr method (Figure 2). (d) Amino acid analysis: aspartic acid (Asp), threonine (Thr), serine (Ser), glutamic acid (
Glu), proline (Pro), glycine (Gly), alanine (Ala), cystine (Cys), valine (Val), methionine (Met), isoleucine (Ile), leucine (Leu), tyrosine (Tyr), phenylalanine ( Phe), histidine (His), lysine (Lys), tryptophan (Trp), arginine (Arg) (E) Sugar analysis: cellobiose, mannose, arabinose, xylose, glucose (H) Solubility: Well soluble in water and methanol, but Almost insoluble in , ethanol, acetone, ethyl acetate, chloroform, benzene, and hexane.
(2)次の物理化学的性質を有するDC−79−B(イ
)分子量:8900(ゲルろ過法) (ロ)紫外部吸収スペクトル:420nmに吸収極大(
0.1N HCl)、530nmに吸収極大(0.1N
 NaOH)を示す(第3 図)。 (ハ)赤外部吸収スペクトル:KBr法により測定(第
4図)。 (ニ)アミノ酸分析:Asp、Thr、Ser、Glu
、Pro、Gly、Ala、 Cys、Val、Met、Ile、 Leu、Tyr、Phe、His、 Lys、Trp、Arg (ホ)糖分析:セロビオース、マンノース、アラビノー
ス、キシロース、グルコース (ヘ)溶解性:水、メタノールによく溶けるが、エタノ
ール、アセトン、酢酸エチル、ク ロロホルム、ベンゼン、ヘキサンにはほ とんど溶けない。
(2) DC-79-B with the following physicochemical properties (a) Molecular weight: 8900 (gel filtration method) (b) Ultraviolet absorption spectrum: absorption maximum at 420 nm (
0.1N HCl), absorption maximum at 530nm (0.1N
(Figure 3). (c) Infrared absorption spectrum: Measured by KBr method (Figure 4). (d) Amino acid analysis: Asp, Thr, Ser, Glu
, Pro, Gly, Ala, Cys, Val, Met, He, Leu, Tyr, Phe, His, Lys, Trp, Arg (e) Sugar analysis: cellobiose, mannose, arabinose, xylose, glucose (h) Solubility: water It is well soluble in methanol, but almost insoluble in ethanol, acetone, ethyl acetate, chloroform, benzene, and hexane.
(3)ストレプトマイセス属に属し、DC−79−Aま
たはDC−79−Bを生産する能力を有する微生物を培
地に培養し、培養物中にDC−79−AまたはDC−7
9−Bを生成させ、該培養物から蓄積したDC−79−
AまたはDC−79−Bを採取することを特徴とするD
C−79の製造法。
(3) A microorganism belonging to the genus Streptomyces and having the ability to produce DC-79-A or DC-79-B is cultured in a medium, and DC-79-A or DC-7 is added to the culture.
9-B and accumulated DC-79- from the culture.
D characterized by collecting A or DC-79-B
Method for producing C-79.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4877615A (en) * 1988-09-23 1989-10-31 Microlife Technics, Inc. Antifungal product

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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