JPS61100197A - バクテリオフアージｔ７のプロモーターおよび遺伝子配列を利用する新規発現系 - Google Patents
バクテリオフアージｔ７のプロモーターおよび遺伝子配列を利用する新規発現系Info
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- JPS61100197A JPS61100197A JP60228563A JP22856385A JPS61100197A JP S61100197 A JPS61100197 A JP S61100197A JP 60228563 A JP60228563 A JP 60228563A JP 22856385 A JP22856385 A JP 22856385A JP S61100197 A JPS61100197 A JP S61100197A
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
いまや、遺伝子工学の技術によって、宿主細胞に１異種
−（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ） ポリペプチド、
すなわち、その種の細胞によって通常は生産されること
のないポリはプチビを作らせることが可能になった。イ
タクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）らによって５ｃｉｅｎｃｅ１
９８：１０５６（１９７７）に記載されたソマトスタチ
ン、ボッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）らがＰｒｏ、Ｎａｔ、
Ａｃａｄ。
−（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ） ポリペプチド、
すなわち、その種の細胞によって通常は生産されること
のないポリはプチビを作らせることが可能になった。イ
タクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）らによって５ｃｉｅｎｃｅ１
９８：１０５６（１９７７）に記載されたソマトスタチ
ン、ボッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）らがＰｒｏ、Ｎａｔ、
Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７６ ： １０６ （１９７９）に発
表したヒトインシュリンの成分であるＡ鎖およびＢ鎖、
ボッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）らによりＮａｔｕｒｅ ２
８１ ： ４１１（１９８０）に発表されたヒト成長ホ
ルモン、同じくボッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）らがＮｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
表したヒトインシュリンの成分であるＡ鎖およびＢ鎖、
ボッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）らによりＮａｔｕｒｅ ２
８１ ： ４１１（１９８０）に発表されたヒト成長ホ
ルモン、同じくボッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）らがＮｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
８：４０５７（１９８０）に発表したヒト繊維芽球イン
ター７エｏ７、ａ−ン（Ｌａｗｎ）らのＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、９：６１０３（１９８１） に
よるヒト血清アルブミンなど、数多くの哨乳類のポリペ
プチドがＪｃｏｌｉによって生産されてきている。
ター７エｏ７、ａ−ン（Ｌａｗｎ）らのＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、９：６１０３（１９８１） に
よるヒト血清アルブミンなど、数多くの哨乳類のポリペ
プチドがＪｃｏｌｉによって生産されてきている。
宿主細胞に特定の異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ）
ポリはプチビを生産あるいは発現させるために、ポリペ
プチドをコードする構造配列（通常コーディング配列ま
たは遺伝子ともよばれる）を、遺伝子が読み取られメツ
センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写されるときに関与
するプロモーター配列の近くに配置する方法がよく用い
られる。遺伝子のｍＲＮＡへの転写は、ＲＮＡ ポリメ
ラーゼとして知られている酵素がプロモーター配列と接
し、相互作用することにより起こる。すなわちＲＮＡ
ポリメラーゼはそれ以後、遺伝子に沿って動き、その遺
伝子によって特定されるｍＲＮＡ分子を合成する。その
後、ｍＲＮＡは、リポソーム、トランスファーＲＮＡを
どの細胞内成分によって特異なポリペプチドに翻訳され
るのである。
ポリはプチビを生産あるいは発現させるために、ポリペ
プチドをコードする構造配列（通常コーディング配列ま
たは遺伝子ともよばれる）を、遺伝子が読み取られメツ
センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写されるときに関与
するプロモーター配列の近くに配置する方法がよく用い
られる。遺伝子のｍＲＮＡへの転写は、ＲＮＡ ポリメ
ラーゼとして知られている酵素がプロモーター配列と接
し、相互作用することにより起こる。すなわちＲＮＡ
ポリメラーゼはそれ以後、遺伝子に沿って動き、その遺
伝子によって特定されるｍＲＮＡ分子を合成する。その
後、ｍＲＮＡは、リポソーム、トランスファーＲＮＡを
どの細胞内成分によって特異なポリペプチドに翻訳され
るのである。
多くのプロモーター配列がＥ、ＣＯ’ｌｉにおける外来
遺伝子（つまり通常は存在しない遺伝子）の発現に用い
られてきており、例えばすなわち、バンクマン（Ｂａｃ
ｋｍａｎ）とブタ７−ン（Ｐｔａｓｈｎｅ）がＣｅ１１
１３ ： ６５ （１９７８）で発表した１ａｃプロモ
ーター、ハレウエル（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ）とエンテー
ジ（ｈ：ｍｔａｇｅ）のＧｅｎｅ ９ ： ２７ （１
９８０）によるｔｒｐプ０−Ｔ−一ター、そしてバーナ
ーＩ−” （Ｂｅｒｎａｒｄ）らのＧｅｎｅ ５： ５
９（１９７９）によるラムダファージＰＬ プロモータ
ーなどを挙げることができる。
遺伝子（つまり通常は存在しない遺伝子）の発現に用い
られてきており、例えばすなわち、バンクマン（Ｂａｃ
ｋｍａｎ）とブタ７−ン（Ｐｔａｓｈｎｅ）がＣｅ１１
１３ ： ６５ （１９７８）で発表した１ａｃプロモ
ーター、ハレウエル（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ）とエンテー
ジ（ｈ：ｍｔａｇｅ）のＧｅｎｅ ９ ： ２７ （１
９８０）によるｔｒｐプ０−Ｔ−一ター、そしてバーナ
ーＩ−” （Ｂｅｒｎａｒｄ）らのＧｅｎｅ ５： ５
９（１９７９）によるラムダファージＰＬ プロモータ
ーなどを挙げることができる。
多（の遺伝子プロモーター系オはレータ−系カ誘導可能
である。すなわちそれらの活性は特定物質あるいは条件
の存否により十分変化し５る。例えばＥＥ、ｃｏｌｉの
１ａＣプロモーター系はラクトースが存在しないと活性
が低い。すなわち、この条件下では抑制されている。し
かしながら、ラクトースそれ自身あるいはインプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトシ１−’（ＩＰＴＧ）といった
インデューサーの存在下ではｌａｃプロモーター系の抑
制は解除され、隣接したプロモーターの遺伝子配クリの
転写活性を高める。このことは例えばＪ、ミラー（Ｍｉ
ｌｌｅｒ）とＷ、レツニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ ）
のＴｈｅ ０ｐｅｒｏｎ、第２版、コールドスプリング
ハーバ−ラボ、ニューヨーク（１９８２）を参照のこと
。他の誘導可能なプロモーター系はｔｒｐプロモーター
〔トリプトファンが過剰に存在すると活性は比較的低い
が、トリプトファン濃度が低かったり、３−β−インド
リルアクリル酸が存在すると活性が上がる；前述のハレ
ウエル（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ）とエンテージ（Ｅｍｔａ
ｇｅ）を見よ〕や、ラムダファージＰＬ プロモーター
〔温度感受性ミュータントラムダリプレッサー存在下で
、約３０℃では活性が低いが４１℃になると高い活性を
示す：バーナート” （Ｂｅｒｎａｒｄ）らの前述の論
文をみよ〕などである。
である。すなわちそれらの活性は特定物質あるいは条件
の存否により十分変化し５る。例えばＥＥ、ｃｏｌｉの
１ａＣプロモーター系はラクトースが存在しないと活性
が低い。すなわち、この条件下では抑制されている。し
かしながら、ラクトースそれ自身あるいはインプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトシ１−’（ＩＰＴＧ）といった
インデューサーの存在下ではｌａｃプロモーター系の抑
制は解除され、隣接したプロモーターの遺伝子配クリの
転写活性を高める。このことは例えばＪ、ミラー（Ｍｉ
ｌｌｅｒ）とＷ、レツニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ ）
のＴｈｅ ０ｐｅｒｏｎ、第２版、コールドスプリング
ハーバ−ラボ、ニューヨーク（１９８２）を参照のこと
。他の誘導可能なプロモーター系はｔｒｐプロモーター
〔トリプトファンが過剰に存在すると活性は比較的低い
が、トリプトファン濃度が低かったり、３−β−インド
リルアクリル酸が存在すると活性が上がる；前述のハレ
ウエル（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ）とエンテージ（Ｅｍｔａ
ｇｅ）を見よ〕や、ラムダファージＰＬ プロモーター
〔温度感受性ミュータントラムダリプレッサー存在下で
、約３０℃では活性が低いが４１℃になると高い活性を
示す：バーナート” （Ｂｅｒｎａｒｄ）らの前述の論
文をみよ〕などである。
バクテリオファージＴ７のＤＮＡ中に存在するプロモー
ター領域は特に興味深い。というのは、該バクテリオフ
ァージによって例えばＥ、ｃｏｌｉのような細菌細胞が
感染されると、感染細胞はほとんどまもな（宿主細胞の
要求に光って全く事実上不必要なＴ７バクテリオフアー
ジポリ纜プチドのみを生産するようになる。この現象は
一般に、バクテリオファージＴ７プロモーターとバクテ
リオファージＲＮＡ ポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＪリメ
ラーゼ）との極めて強い相互作用に帰結する。関連した
作用として、バクテリオファージＴ ７ ＤＮＡには、
Ｅ、ｃｏｌｉ ＲＮＡｙｔ？リメラーゼと結合すること
によってそれを不活性化し、その結果、Ｅ、ｃｏｌｉＤ
ＮＡ の転写を減する蛋白をコードすることが知られて
いる。この２つが原因で、Ｅ、ｃｏｌｉの蛋白合成系が
、感染後まもなくバクテリオファージの蛋白のみを合成
するようになる。
ター領域は特に興味深い。というのは、該バクテリオフ
ァージによって例えばＥ、ｃｏｌｉのような細菌細胞が
感染されると、感染細胞はほとんどまもな（宿主細胞の
要求に光って全く事実上不必要なＴ７バクテリオフアー
ジポリ纜プチドのみを生産するようになる。この現象は
一般に、バクテリオファージＴ７プロモーターとバクテ
リオファージＲＮＡ ポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＪリメ
ラーゼ）との極めて強い相互作用に帰結する。関連した
作用として、バクテリオファージＴ ７ ＤＮＡには、
Ｅ、ｃｏｌｉ ＲＮＡｙｔ？リメラーゼと結合すること
によってそれを不活性化し、その結果、Ｅ、ｃｏｌｉＤ
ＮＡ の転写を減する蛋白をコードすることが知られて
いる。この２つが原因で、Ｅ、ｃｏｌｉの蛋白合成系が
、感染後まもなくバクテリオファージの蛋白のみを合成
するようになる。
それゆえ、バクテリオファージ要求性蛋白のみを直接合
成するバクテリオファージＴ７に用いられた方法は医学
的なあるいは診察上のまたは他の目的で必要とされるポ
ＩＪ ハプチドの合成に利用しうるものである。
成するバクテリオファージＴ７に用いられた方法は医学
的なあるいは診察上のまたは他の目的で必要とされるポ
ＩＪ ハプチドの合成に利用しうるものである。
細菌中でクローンした遺伝子の転写を指示するためにバ
クテリオファージＴ７プロモーターを使用することは、
マクアリスター（ＭｃＡｌｌｌｓｔｅｒ）らが、Ｔ、Ｍ
ｏｌ、Ｂｉｏｌ、、１５３：５２７（１９８１）で示し
ている。この雑文は、Ｔ７プロモーターに直結した転写
の開始に必要なＴ ７ ＲＮＡ＋？＋７メラーゼが、感
染によっであるいはクローン化Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子
により細胞に供給されねばならないことを条件としてい
る。この雑文には、この結果を達成するための特別な方
法は何１つ記載されていない。
クテリオファージＴ７プロモーターを使用することは、
マクアリスター（ＭｃＡｌｌｌｓｔｅｒ）らが、Ｔ、Ｍ
ｏｌ、Ｂｉｏｌ、、１５３：５２７（１９８１）で示し
ている。この雑文は、Ｔ７プロモーターに直結した転写
の開始に必要なＴ ７ ＲＮＡ＋？＋７メラーゼが、感
染によっであるいはクローン化Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子
により細胞に供給されねばならないことを条件としてい
る。この雑文には、この結果を達成するための特別な方
法は何１つ記載されていない。
感染によるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの供給は、それが感
染時のみ短期間合成されること、そして高いしばルで蓄
積されないことによりその利用が限定されるものと思わ
れる。第２に、Ｔ７バクテリオフアージの感染は、バク
テリオファージＤＮＡそれ自身に存在するプロモーター
領域およびクローンした遺伝子のプロモーターに対する
、Ｔ７ＲＮＡ ポリメラーゼの自然な拮抗を伴うもので
ある。また、感染した細胞は短時間に溶菌し、溶菌前に
は求めるポリペプチドがほとんど生産されないので、本
法は実用的でないと考えられる。
染時のみ短期間合成されること、そして高いしばルで蓄
積されないことによりその利用が限定されるものと思わ
れる。第２に、Ｔ７バクテリオフアージの感染は、バク
テリオファージＤＮＡそれ自身に存在するプロモーター
領域およびクローンした遺伝子のプロモーターに対する
、Ｔ７ＲＮＡ ポリメラーゼの自然な拮抗を伴うもので
ある。また、感染した細胞は短時間に溶菌し、溶菌前に
は求めるポリペプチドがほとんど生産されないので、本
法は実用的でないと考えられる。
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｔ ７ Ｇｅｎｅ
１）のクロー二／グおよび発現はその後の雑文に記載さ
れている（ｐ、ダバフル−（Ｄａｖａｎｌｏｏ ）ら、
Ｐｒｏ 。
１）のクロー二／グおよび発現はその後の雑文に記載さ
れている（ｐ、ダバフル−（Ｄａｖａｎｌｏｏ ）ら、
Ｐｒｏ 。
Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ｓｔ ：２０３
５（１９８４））、＝）しかしながら、Ｔ７プロモータ
ーと同方向のＴ７Ｇθｎθ１を含むプラスミドにおいて
は、とのＴ７プロモーターもほとんど無効であると、こ
の雑文の著者は指摘している。彼らは、そのようなプラ
スミドを完全に転写させることにより、Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼが、プロモーターと完全なＴ７Ｇｏｎｅ ｌの
両方を含むクローンしたフラグメントからそれ自身のｍ
ＲＮＡを直接合成しうろことを理論化した。そのような
解釈は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのレベルおよびプ
ラスミドゝの転写速度における自己触媒的な増大に到る
ものと、彼らは主張している。すなわち、彼らの設定す
る条件では、細胞はほとんど致死的なのである。
５（１９８４））、＝）しかしながら、Ｔ７プロモータ
ーと同方向のＴ７Ｇθｎθ１を含むプラスミドにおいて
は、とのＴ７プロモーターもほとんど無効であると、こ
の雑文の著者は指摘している。彼らは、そのようなプラ
スミドを完全に転写させることにより、Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼが、プロモーターと完全なＴ７Ｇｏｎｅ ｌの
両方を含むクローンしたフラグメントからそれ自身のｍ
ＲＮＡを直接合成しうろことを理論化した。そのような
解釈は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのレベルおよびプ
ラスミドゝの転写速度における自己触媒的な増大に到る
ものと、彼らは主張している。すなわち、彼らの設定す
る条件では、細胞はほとんど致死的なのである。
上記著者はおそらく活性のあるＴ７ＲＮＡ ポリメラー
ゼ分子１個でこの反応を起こすのに十分であると信じて
おり、それゆえＴ７プロモーター領域および’ｒ７
ＲＮＡ 、ｄ＋）メラーゼ遺伝子の両方を含むプラスミ
ドは、クローンしたＴ７ＲＮＡ ポリメラーゼ遺伝子が
絶対的に発現しない場合のみ安定である、という解釈を
述べている。
ゼ分子１個でこの反応を起こすのに十分であると信じて
おり、それゆえＴ７プロモーター領域および’ｒ７
ＲＮＡ 、ｄ＋）メラーゼ遺伝子の両方を含むプラスミ
ドは、クローンしたＴ７ＲＮＡ ポリメラーゼ遺伝子が
絶対的に発現しない場合のみ安定である、という解釈を
述べている。
そしてこのような状況を達成するのは困難あるいは不可
能であると結論付けている。従って、彼らはＴ７Ｇｅｎ
θ１の転写を太向浩ために細菌のプロモーター配列を利
用したが、造成したプラスミド９には完全なＴ７プロモ
ーター領域を含まないことを極めて注意深く確認した。
能であると結論付けている。従って、彼らはＴ７Ｇｅｎ
θ１の転写を太向浩ために細菌のプロモーター配列を利
用したが、造成したプラスミド９には完全なＴ７プロモ
ーター領域を含まないことを極めて注意深く確認した。
バクテリオファージＤＮＡは、いかなるプロモーター領
域も含まないＴ７ Ｇｅｎｅ １コ一デイング配列を
すべて含むフラグメントを容易に単離しうるような、適
当な位置にある制御酵素認識部位をもたないため、本法
の達成は困難である。
域も含まないＴ７ Ｇｅｎｅ １コ一デイング配列を
すべて含むフラグメントを容易に単離しうるような、適
当な位置にある制御酵素認識部位をもたないため、本法
の達成は困難である。
結局、’ｌ’７Ｇｅｎｅ１転写可能コーディング配列と
Ｔ７プロモーター領域の両方を含む配列が、同じプラス
ミド上でクローンされることはありそうもない、と彼ら
は述べている。 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのためのプロ
モーターなＴ７ジー／１゜と共に１つのプラスミド中に
挿入する彼らの試みは、ポリメラーゼ遺伝子を転写する
のに必要な方向と逆方向の転写を指示するプロモーター
であるような配列をもたらしたに過ぎない。
Ｔ７プロモーター領域の両方を含む配列が、同じプラス
ミド上でクローンされることはありそうもない、と彼ら
は述べている。 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのためのプロ
モーターなＴ７ジー／１゜と共に１つのプラスミド中に
挿入する彼らの試みは、ポリメラーゼ遺伝子を転写する
のに必要な方向と逆方向の転写を指示するプロモーター
であるような配列をもたらしたに過ぎない。
それゆえ、Ｔ７フアージプロモーター制御下に外来遺伝
子を入れるという潜在的な利点は理解できるが、Ｔ７プ
ロモーターを有する系へのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの供
給を実現しうるような便利か非致死的方法（ｎｏｎ−１
ｅｔｈａｌ ｍｅｔｈｏｄ）は開発されていない。本発
明はこの問題に対する解決を与えるものである。
子を入れるという潜在的な利点は理解できるが、Ｔ７プ
ロモーターを有する系へのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの供
給を実現しうるような便利か非致死的方法（ｎｏｎ−１
ｅｔｈａｌ ｍｅｔｈｏｄ）は開発されていない。本発
明はこの問題に対する解決を与えるものである。
このような系は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの合成が制御
可能な宿主特異的なプロモーターによって引き起こされ
る限り、各種の細菌や酵母、哨乳類あるいは植物セルラ
インのようないかなる宿主中においても作用することが
できる。
可能な宿主特異的なプロモーターによって引き起こされ
る限り、各種の細菌や酵母、哨乳類あるいは植物セルラ
インのようないかなる宿主中においても作用することが
できる。
即ち、本発明は、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子の上流に位置し且つ該遺伝子と同じ転写方
向（即ち、配向）にある誘導可能な適合性プロモーター
領域を有する組換えプラスミドベクターを含み、さらに
異種ポＩＪ Ｏプチビを特定する構造ＤＮＡ配列の上
流に位置し且つ該ＤＮＡ配列と同じ転写方向にあるバク
テリオファージＴ７プロモーター領域を含む宿主細胞で
あって、該Ｔ７プロモーター領域と該構造ＤＮＡ配列と
が上記組換えプラスミーベクター上にあるか、あるいは
第二の組換えプラスミドベクター中にある該宿主細胞を
、異種ポリペプチドの発現に適する条件下で培養するこ
とから成る、適切な宿主内で異種ポリペプチドを生産す
る方法を提供する。
ラーゼ遺伝子の上流に位置し且つ該遺伝子と同じ転写方
向（即ち、配向）にある誘導可能な適合性プロモーター
領域を有する組換えプラスミドベクターを含み、さらに
異種ポＩＪ Ｏプチビを特定する構造ＤＮＡ配列の上
流に位置し且つ該ＤＮＡ配列と同じ転写方向にあるバク
テリオファージＴ７プロモーター領域を含む宿主細胞で
あって、該Ｔ７プロモーター領域と該構造ＤＮＡ配列と
が上記組換えプラスミーベクター上にあるか、あるいは
第二の組換えプラスミドベクター中にある該宿主細胞を
、異種ポリペプチドの発現に適する条件下で培養するこ
とから成る、適切な宿主内で異種ポリペプチドを生産す
る方法を提供する。
適切な宿主中で異種ポリペプチド９を生産する本方法の
１つの特徴は、 ａ）バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子
の上流にあり且つ該遺伝子と同じ配向（即ち、転写方向
ンにある誘導可能な適合性プロモーター領域を有してい
る第１の組換えプラスミド＃ばフタ−；および ｂ）異種ポリはプチビを特定する構造ＤＮＡ配列の上流
にあり且つ該遺伝子と同じ転写方向にあるバクテリオフ
ァージＴ７プロモーター領域を有している第２の組換え
プラスミド１ベクター、の各々の１またはそれ以上のコ
ピーを含む宿主細胞を、異種ポリペプチドの発現に好ま
しい適切な条件下に培養することからなる。
１つの特徴は、 ａ）バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子
の上流にあり且つ該遺伝子と同じ配向（即ち、転写方向
ンにある誘導可能な適合性プロモーター領域を有してい
る第１の組換えプラスミド＃ばフタ−；および ｂ）異種ポリはプチビを特定する構造ＤＮＡ配列の上流
にあり且つ該遺伝子と同じ転写方向にあるバクテリオフ
ァージＴ７プロモーター領域を有している第２の組換え
プラスミド１ベクター、の各々の１またはそれ以上のコ
ピーを含む宿主細胞を、異種ポリペプチドの発現に好ま
しい適切な条件下に培養することからなる。
適切な宿主中で異種ポリペプチドを生産する本方法の第
２の特徴は、組換えプラスミドベクターの１またはそれ
以上のコピーを含む宿主細胞を、異種ポＩＪ ＜プチド
の発現に好ましい条件下に培養 １することからなり、
該ベクターは ａ）バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子
の上流にあり且つ該遺伝子と同じ転写方向にある、誘導
可能な適合性プロモーター領域；および ｂ）異種ポリペプチドをコート８する構造ＤＮＡ配列の
上流にあり且つ該配列と同じ転写方向にあるバクテリオ
ファージＴ７プロモーター領域、を有している。
２の特徴は、組換えプラスミドベクターの１またはそれ
以上のコピーを含む宿主細胞を、異種ポＩＪ ＜プチド
の発現に好ましい条件下に培養 １することからなり、
該ベクターは ａ）バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子
の上流にあり且つ該遺伝子と同じ転写方向にある、誘導
可能な適合性プロモーター領域；および ｂ）異種ポリペプチドをコート８する構造ＤＮＡ配列の
上流にあり且つ該配列と同じ転写方向にあるバクテリオ
ファージＴ７プロモーター領域、を有している。
この、第２の方法において、バクテリオファージＴ７プ
ロモーター領域は組みかえプラスミド９ベクター中でバ
クテリオファージＴ７ ＲＮＡ４リメラーゼ遺伝子の転
写に必要な方向と同じ向きあるいは逆方向に存在しうる
。バクテリオファージＴ７プロモーター領域が、バクテ
リオファージＴ７ＲＮＡ４リメラーゼ遺伝子の転写に必
要な向きと同方向あるいは逆方向に向いている場合に、
我々は構造ＤＮＡ配列を良好に発現させることができた
。
ロモーター領域は組みかえプラスミド９ベクター中でバ
クテリオファージＴ７ ＲＮＡ４リメラーゼ遺伝子の転
写に必要な方向と同じ向きあるいは逆方向に存在しうる
。バクテリオファージＴ７プロモーター領域が、バクテ
リオファージＴ７ＲＮＡ４リメラーゼ遺伝子の転写に必
要な向きと同方向あるいは逆方向に向いている場合に、
我々は構造ＤＮＡ配列を良好に発現させることができた
。
さらに我々は、誘導可能な細菌のプロモーター系を有す
る例えばＥ、Ｃ０１ｉのような細菌宿主細胞を用いて構
造ＤＮＡ配列を特に良好に発現させることができた。
る例えばＥ、Ｃ０１ｉのような細菌宿主細胞を用いて構
造ＤＮＡ配列を特に良好に発現させることができた。
本発明の他の特徴は、所望するポリペプチドを特定する
構造ＤＮＡ配列と結合し、且つ該配列と同じ転写方向に
あるバクテリオファージＴ７プロモーター領域を有する
Ｄ４ＪＡ フラグメントである。
構造ＤＮＡ配列と結合し、且つ該配列と同じ転写方向に
あるバクテリオファージＴ７プロモーター領域を有する
Ｄ４ＪＡ フラグメントである。
このようなりＮＡ フラグメントは好ましくは、宿主（
例えば細菌）ａ胞を形質転換するのに適している組換え
プラスミドベクター中に含まれている。
例えば細菌）ａ胞を形質転換するのに適している組換え
プラスミドベクター中に含まれている。
本発明の更に他の特徴は、
ａ）バクテリオファージＴ７ＲＮＡ、ｔ？リメラーゼ遺
伝子と結合し、且つ遺伝子と同じ転写方向にある誘導可
能な（例えば細菌の）プロモーター領域；および ｂ）所望するポリペプチドを特定する構造ＤＮＡ配列の
上流にあり且つ該配列と同じ転写方向にあるバクテリオ
ファージＴ７プロモーターｆｉｔ、を有しているＤＮＡ
フラグメントである。
伝子と結合し、且つ遺伝子と同じ転写方向にある誘導可
能な（例えば細菌の）プロモーター領域；および ｂ）所望するポリペプチドを特定する構造ＤＮＡ配列の
上流にあり且つ該配列と同じ転写方向にあるバクテリオ
ファージＴ７プロモーターｆｉｔ、を有しているＤＮＡ
フラグメントである。
このようなりＮＡフラグメントは、好ましくは宿主、例
えば細菌の細胞を形質転換するのに適している組換えプ
ラスミドベクター中に含まれている。特に、バクテリオ
ファージＴ７プロモーター領域は、バクテリオファーｕ
Ｔ７ＲＮＡ；ｔ？リメラ−ゼ遺伝子を転写するのに必要
な方向と逆方向に向いていることが好ましい。
えば細菌の細胞を形質転換するのに適している組換えプ
ラスミドベクター中に含まれている。特に、バクテリオ
ファージＴ７プロモーター領域は、バクテリオファーｕ
Ｔ７ＲＮＡ；ｔ？リメラ−ゼ遺伝子を転写するのに必要
な方向と逆方向に向いていることが好ましい。
本発明の他の特徴は、組換えプラスミドベクターの少な
くとも１つのコピーを有している形質転換された宿主細
胞、特に細菌であって、該ベクターは、所望するｙｇ
＋）ペプチドを特定する構造ＤＮＡ配列と結合し、且つ
該配列と同じ転写方向にあるバクテリオファージＴ７プ
ロモーター領域を有している形質転換された宿主細胞で
ある。そのような形質転換された宿主細胞、例えば細胞
は、バクテリオファージＴ７ＲＮＡｙｔ？’Ｊメラーゼ
遺伝子と結合し且つ該遺伝子と同じ転写方向にある誘導
可能な適合性プロモーター領域を有する第２の組換えプ
ラスミドベクターの少なくとも１つのコピーを更に含ん
でいることが好ましい。
くとも１つのコピーを有している形質転換された宿主細
胞、特に細菌であって、該ベクターは、所望するｙｇ
＋）ペプチドを特定する構造ＤＮＡ配列と結合し、且つ
該配列と同じ転写方向にあるバクテリオファージＴ７プ
ロモーター領域を有している形質転換された宿主細胞で
ある。そのような形質転換された宿主細胞、例えば細胞
は、バクテリオファージＴ７ＲＮＡｙｔ？’Ｊメラーゼ
遺伝子と結合し且つ該遺伝子と同じ転写方向にある誘導
可能な適合性プロモーター領域を有する第２の組換えプ
ラスミドベクターの少なくとも１つのコピーを更に含ん
でいることが好ましい。
本発明の更に他の特徴は、
ａ）バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子
の上流にあり且つ該遺伝子と同じ転写方向にある誘導可
能な適合性プロモーター領域；および ｂ）所望するポリペプチドを特定する構造ＤＮＡ配列の
上流にあり且つ該配列と同じ転写方向にあるバクテリオ
ファージＴ７プロモーター領域、を有している組換えプ
ラスミドベクターの少なくとも１つのコピーを有する形
質転換された宿主、例えば細菌である。
の上流にあり且つ該遺伝子と同じ転写方向にある誘導可
能な適合性プロモーター領域；および ｂ）所望するポリペプチドを特定する構造ＤＮＡ配列の
上流にあり且つ該配列と同じ転写方向にあるバクテリオ
ファージＴ７プロモーター領域、を有している組換えプ
ラスミドベクターの少なくとも１つのコピーを有する形
質転換された宿主、例えば細菌である。
このような形質転換された細菌においては、組換えプラ
スミドベクター中に存在するバクテリオファージＴ７プ
ロモーターは、同じ（該ベクター中に存在するバクテリ
オファージＴ７ ＲＮＡ、ｔリメラーゼ遺伝子の転写に
必要な方向と反対の方向性を有することが好ましい。
スミドベクター中に存在するバクテリオファージＴ７プ
ロモーターは、同じ（該ベクター中に存在するバクテリ
オファージＴ７ ＲＮＡ、ｔリメラーゼ遺伝子の転写に
必要な方向と反対の方向性を有することが好ましい。
所望するポリ−＜プチドとは例えば天然のポリペプチド
（例えばインターフェロン）、またはそのフラグメント
に由来するこれと機能的に同等な類似体である。
（例えばインターフェロン）、またはそのフラグメント
に由来するこれと機能的に同等な類似体である。
本発明の更に別の特徴は、バクテリオファージＴ７プロ
モーター領域および該領域の下流、好ましくは直後に、
所望のポ１７＜プチドを特定する構造ＤＮＡ配夕ＩＪを
挿入するためのホリリ／カー配列を有している組換えプ
ラスミドベクターである。
モーター領域および該領域の下流、好ましくは直後に、
所望のポ１７＜プチドを特定する構造ＤＮＡ配夕ＩＪを
挿入するためのホリリ／カー配列を有している組換えプ
ラスミドベクターである。
バクテリオファージＴ７ＤＮＡは、アメリカンタイプカ
ルチャーコレクション（ストック番号゛１１３０３Ｂ７
）に含まれる数種の起源より得られた野生株のファージ
Ｔ７より抽出した。精製したバクテリオファー：）ＤＮ
Ａの単離は、本質的にはＴ。
ルチャーコレクション（ストック番号゛１１３０３Ｂ７
）に含まれる数種の起源より得られた野生株のファージ
Ｔ７より抽出した。精製したバクテリオファー：）ＤＮ
Ａの単離は、本質的にはＴ。
マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らのモレキュラー・
クロー二°ンク、コールドスプリングハーバーラホラト
リー、ｐｐ、７６７８５（１９８２）に従った。こうし
て得られたＤＮＡは、求めるＴ７バクテリオフアージプ
ロモーターおよび構造遺伝子フラグメントを得るため各
種の制限エンドヌクレアーゼで分解した（例えば、本明
細書中の方法の項目にあるように）。バクテリオファー
ジＴ７の完全なりＮＡ配列は既矧で、それらはすなわち
、ダン（Ｄｕｎｎ ）、Ｊ、Ｊ、およびスタブイア−（
Ｓｔｕｄｉｅｒ）、ｒ、ｗ、、のＪ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ
、ｌ ６６ ： ４９７ （１９８３）に依る。本明細
書中で使用する記名法は、この雑文に記載されている。
クロー二°ンク、コールドスプリングハーバーラホラト
リー、ｐｐ、７６７８５（１９８２）に従った。こうし
て得られたＤＮＡは、求めるＴ７バクテリオフアージプ
ロモーターおよび構造遺伝子フラグメントを得るため各
種の制限エンドヌクレアーゼで分解した（例えば、本明
細書中の方法の項目にあるように）。バクテリオファー
ジＴ７の完全なりＮＡ配列は既矧で、それらはすなわち
、ダン（Ｄｕｎｎ ）、Ｊ、Ｊ、およびスタブイア−（
Ｓｔｕｄｉｅｒ）、ｒ、ｗ、、のＪ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ
、ｌ ６６ ： ４９７ （１９８３）に依る。本明細
書中で使用する記名法は、この雑文に記載されている。
Ｔ７プロモーターはその強度が異なることが認められて
おり、これを基に３つの種類に分けられる。これらのう
ち最も強いのはクラス■プロモーターであり、このクラ
スのプロモーターは本発明の目的には格好の材料である
。クラス■のプロモーターのひとつは、遺伝子１０蛋白
（ｇｅｎｅ １０ｐｒｏｔｅｉｎ） （Ｔ ７φ１０）
の発現を調節し、本発明に利用されている。全く思いが
けないことに、同一プラスミド上のバクテリオファージ
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子とバクテリオファージＴ
７プロモーター領域の両者を有する系は、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ。
おり、これを基に３つの種類に分けられる。これらのう
ち最も強いのはクラス■プロモーターであり、このクラ
スのプロモーターは本発明の目的には格好の材料である
。クラス■のプロモーターのひとつは、遺伝子１０蛋白
（ｇｅｎｅ １０ｐｒｏｔｅｉｎ） （Ｔ ７φ１０）
の発現を調節し、本発明に利用されている。全く思いが
けないことに、同一プラスミド上のバクテリオファージ
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子とバクテリオファージＴ
７プロモーター領域の両者を有する系は、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８１：２０３５（１９８４）
で示唆された致死性を認めなかった。事実、バクテリオ
ファージＴ７ＤＮＡ中に存在する格好の制限酵素認識部
位によって、本発明に必４用いられているモーター領域
（Ｔ７φ１．ＬＡ）は、さらに所望する２ ＋）ペプチ
ドに対する遺伝子の転写開始に用いられるＴ７プロモー
ター領域でもある。上で議論したようＫこの造成は、Ｔ
７ＲＮＡ ポリメラーゼのレベルおよびプラスミド９の
転写の速度を共に自己触媒的に増大させる結果、Ｐ ｒ
ｏ、Ｎａｔｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
で示唆された致死性を認めなかった。事実、バクテリオ
ファージＴ７ＤＮＡ中に存在する格好の制限酵素認識部
位によって、本発明に必４用いられているモーター領域
（Ｔ７φ１．ＬＡ）は、さらに所望する２ ＋）ペプチ
ドに対する遺伝子の転写開始に用いられるＴ７プロモー
ター領域でもある。上で議論したようＫこの造成は、Ｔ
７ＲＮＡ ポリメラーゼのレベルおよびプラスミド９の
転写の速度を共に自己触媒的に増大させる結果、Ｐ ｒ
ｏ、Ｎａｔｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ ８１ ：２０３５（１９８４） で示唆された
ように細胞を死に至らしめる。驚いたことに、この不完
全性は実際にはｆｆ１ｉ（せず、しかも、その結果は前
述の示唆と逆になった。
ように細胞を死に至らしめる。驚いたことに、この不完
全性は実際にはｆｆ１ｉ（せず、しかも、その結果は前
述の示唆と逆になった。
以下の記述は、求めるポリペプチドをコードする遺伝子
の発現がどのようにしてバクテリオファージＴ７プロモ
ーター領域の制御下で起こりつるのか、２つの概観を詳
述している。これらの見方は「デュアル・プラスミド９
・システム」、そして「シングル・プラスミド９・シス
テム」と定義される。
の発現がどのようにしてバクテリオファージＴ７プロモ
ーター領域の制御下で起こりつるのか、２つの概観を詳
述している。これらの見方は「デュアル・プラスミド９
・システム」、そして「シングル・プラスミド９・シス
テム」と定義される。
Ｔ７ＲＮＡ ポリメラーゼが宿主特異的な調節をするプ
ロモーターの制御下にあり、異質な蛋白に対する塩基配
列がＴ７プロモーター配列の制御下にある限り、細菌、
酵母、哺乳類、植物といった各種の宿主細胞中でそのよ
うな系が作用することは可能である。
ロモーターの制御下にあり、異質な蛋白に対する塩基配
列がＴ７プロモーター配列の制御下にある限り、細菌、
酵母、哺乳類、植物といった各種の宿主細胞中でそのよ
うな系が作用することは可能である。
デュアル・プラスミド・システム
この系は、選択された宿主中で適合しうる任意の２つの
ベクター上で機能しつる。これらベクターは都合のよい
位置に制限酵素認識部位を含み。
ベクター上で機能しつる。これらベクターは都合のよい
位置に制限酵素認識部位を含み。
組みかえＤＮＡの実験によ（みられる適当な薬剤選択マ
ーカーをもつ。ベクターの適合性、すなわち、同一宿主
細胞内にそれらが共存しうる能力は、複製の過程そして
、それぞれのベクターの役割分配による。これらのプロ
セスのうちのいずれかにおいて少なくともひとつの共通
の段階を有するよ５なプラスミドは鏡台することになり
、従ってプラスミド不適合性に到る。例えばＣＯＩ Ｅ
１誘導体であるｐＢＲ３２２はｐＡＣＹＣ−１８４と適
合しうろことが知られている【チャンク（ｃｈａｎｇ）
、Ａ、Ｃ，Ｙ、。
ーカーをもつ。ベクターの適合性、すなわち、同一宿主
細胞内にそれらが共存しうる能力は、複製の過程そして
、それぞれのベクターの役割分配による。これらのプロ
セスのうちのいずれかにおいて少なくともひとつの共通
の段階を有するよ５なプラスミドは鏡台することになり
、従ってプラスミド不適合性に到る。例えばＣＯＩ Ｅ
１誘導体であるｐＢＲ３２２はｐＡＣＹＣ−１８４と適
合しうろことが知られている【チャンク（ｃｈａｎｇ）
、Ａ、Ｃ，Ｙ、。
：Ｉ ｘ ｙ （Ｃｏｈｅｎ）、Ｓ、Ｎ、、 Ｊ、Ｂ
ａｃｔ、 １３４ ： １１４１（１９７８））。
ａｃｔ、 １３４ ： １１４１（１９７８））。
デュアルプラスミドシステム造成への第一ステップとし
て、±ｓｃ ＵＶ互プロモーターをｐＢＲ３２２にクロ
ーンした。これによって、特異的な制限酵素認識部位に
、ｌａｃ ＵＶｓプロモーターの直接制御下に所望の遺
伝子を位置させることができる。
て、±ｓｃ ＵＶ互プロモーターをｐＢＲ３２２にクロ
ーンした。これによって、特異的な制限酵素認識部位に
、ｌａｃ ＵＶｓプロモーターの直接制御下に所望の遺
伝子を位置させることができる。
Ｔ７Ｇｅｎｅｌを、１ａｃ ＵＶ５ プロモーター近
傍のこの制限酵素認識部位にクローンすることで、工Ｐ
ＴＧによるｌａｃ ＵＶ５ プロモーターの誘導によ
るＴ７ＲＮＡ ポリメラーゼ合成を促進させることがで
きた。ｌａｃ ＵＶ５プロモーターは、ＲＮＡポリメラ
ーゼの相互作用部位に２つの変異を起こし、その結果、
ＣＡＰ−ｃＡＭＰ制御を自由にする。この変異は、ＲＮ
Ａ ４リメラーゼ遺伝子と構造ＤＮＡ配列の系を強める
作用をし、それによって構造ＤＮＡ配列の転写の増大を
もたらす。この特性は、野生株１ａｃ Ｐよりもはるか
に強力なプロモーター活性を呈する。機能的に実行可能
な系を得るためにはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発
現を強く制御しなければならない。それゆえ染色体上に
位置する１ａｃＩｑ リプレッサーを有する７Ｂ主細
胞中にプラスミドを形質転換し、維持した。この菌株は
野生株１ａｃ ｌ よりもｌａｃ ＋７プレツサ一分
子を約１０倍も生産する。Ｅ、ｃｏｌｉ ＲＢ７９１は
、コネチカット（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃａ ｔ ）州、ニ
ュー鴫ヘヴン（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ） 、 ニー ／
Ｉ／医科大学（Ｙａｌｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈ
ｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、 Ｅ ｃｏｌｉジ
エネテイツク・ストック・センターのバーバラ・バンク
マン（Ｂａｒｂａｒａ Ｂａｃｋｍｅｎ）博士が所持す
る有用なｌａｃ １９株である。
傍のこの制限酵素認識部位にクローンすることで、工Ｐ
ＴＧによるｌａｃ ＵＶ５ プロモーターの誘導によ
るＴ７ＲＮＡ ポリメラーゼ合成を促進させることがで
きた。ｌａｃ ＵＶ５プロモーターは、ＲＮＡポリメラ
ーゼの相互作用部位に２つの変異を起こし、その結果、
ＣＡＰ−ｃＡＭＰ制御を自由にする。この変異は、ＲＮ
Ａ ４リメラーゼ遺伝子と構造ＤＮＡ配列の系を強める
作用をし、それによって構造ＤＮＡ配列の転写の増大を
もたらす。この特性は、野生株１ａｃ Ｐよりもはるか
に強力なプロモーター活性を呈する。機能的に実行可能
な系を得るためにはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発
現を強く制御しなければならない。それゆえ染色体上に
位置する１ａｃＩｑ リプレッサーを有する７Ｂ主細
胞中にプラスミドを形質転換し、維持した。この菌株は
野生株１ａｃ ｌ よりもｌａｃ ＋７プレツサ一分
子を約１０倍も生産する。Ｅ、ｃｏｌｉ ＲＢ７９１は
、コネチカット（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃａ ｔ ）州、ニ
ュー鴫ヘヴン（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ） 、 ニー ／
Ｉ／医科大学（Ｙａｌｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈ
ｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、 Ｅ ｃｏｌｉジ
エネテイツク・ストック・センターのバーバラ・バンク
マン（Ｂａｒｂａｒａ Ｂａｃｋｍｅｎ）博士が所持す
る有用なｌａｃ １９株である。
Ｉｑのバックグランドはプラスミドから生じる特性（ｐ
、ダパ７Ａ／ −（Ｄａｖａｎ １ｏｏ ）らｔ前出３
および、どの時期に染色体上に位置したかの両者を考
慮して適宜作用させるべきである。実際、プラスミド９
上に機能的Ｉｑ遺伝子を導入することによって、所望す
る任意のＥ ｃｏｌｉ株をこの系に対して適仕するよう
にし５る。塀論的には、この系が１または少数コピー型
（ｆｏｒｍａｔ）として存在するような場合には、■ｑ
バックグランドは強制的なものではない。このよ５な系
はプロモーターの強さおよび遺伝子コピー数の両方を操
作することによって効果的に制御することができ、例え
ば１ａｃｔ＋バックグランドによって供給されるリプレ
ッサー分子の数は、誘導時までＴ７Ｇｅｎｅ１合成を効
果的に抑制するのに十分である。
、ダパ７Ａ／ −（Ｄａｖａｎ １ｏｏ ）らｔ前出３
および、どの時期に染色体上に位置したかの両者を考
慮して適宜作用させるべきである。実際、プラスミド９
上に機能的Ｉｑ遺伝子を導入することによって、所望す
る任意のＥ ｃｏｌｉ株をこの系に対して適仕するよう
にし５る。塀論的には、この系が１または少数コピー型
（ｆｏｒｍａｔ）として存在するような場合には、■ｑ
バックグランドは強制的なものではない。このよ５な系
はプロモーターの強さおよび遺伝子コピー数の両方を操
作することによって効果的に制御することができ、例え
ば１ａｃｔ＋バックグランドによって供給されるリプレ
ッサー分子の数は、誘導時までＴ７Ｇｅｎｅ１合成を効
果的に抑制するのに十分である。
Ｅ、ｃｏｌｉにおけるＴ７Ｇｅｎｅｌの発現制御は、抑
制されたｌａＣｐｏ系に制限されない。種々の調節因子
が適当なＥ、ｃｏ１ｉ宿主の存在下で与えられる発現調
節に用（・５る。例えば、バクテリオファージラムダＰ
Ｌ系は、プロモーターが温度感受性リプレッサー（ｅｇ
、ＣＩ ８５７）により制資叩されるとき用いられるか
もしれない。Ｔ’７ Ｇｅｎｅ １の発現は、もし温
度感受性リプレッサーにより調節されるならば、温度上
昇によって誘導される。
制されたｌａＣｐｏ系に制限されない。種々の調節因子
が適当なＥ、ｃｏ１ｉ宿主の存在下で与えられる発現調
節に用（・５る。例えば、バクテリオファージラムダＰ
Ｌ系は、プロモーターが温度感受性リプレッサー（ｅｇ
、ＣＩ ８５７）により制資叩されるとき用いられるか
もしれない。Ｔ’７ Ｇｅｎｅ １の発現は、もし温
度感受性リプレッサーにより調節されるならば、温度上
昇によって誘導される。
選択されたＴ７フアージプロモーターをコードするフラ
グメント（Ｔ７φ１０）は、一連の制限酵素反応により
単離され、任意の求めるポリペプチドをコードする遺伝
子を挿入しつるような適当な制限部位を作るために、
ｐＢＲ３２２ベクターにクローンした。求める蛋白の
遺伝子がいったん挿入され特徴がわかると、Ｔ７プロモ
ーターおよび求める遺伝子のでき上がったＤＮＡ配列が
ｐＢＲ３２２を基にするベクターに適合性なプラスミド
ベクターに転写される。これらの細胞はＩＰＴＧで誘導
されると、求める蛋白を生産する。
グメント（Ｔ７φ１０）は、一連の制限酵素反応により
単離され、任意の求めるポリペプチドをコードする遺伝
子を挿入しつるような適当な制限部位を作るために、
ｐＢＲ３２２ベクターにクローンした。求める蛋白の
遺伝子がいったん挿入され特徴がわかると、Ｔ７プロモ
ーターおよび求める遺伝子のでき上がったＤＮＡ配列が
ｐＢＲ３２２を基にするベクターに適合性なプラスミド
ベクターに転写される。これらの細胞はＩＰＴＧで誘導
されると、求める蛋白を生産する。
ｐＲＲＢ２０ と命名されたプラスミドは２二Ｕｖ５
プロモーターとＴ７Ｇｅｎｅｌ（前出）を含み、特異的
な制限部位で切ったのち平滑末端とし、次いでファージ
Ｔ７プロモーターと求める遺伝子を含むフラグメント（
上述したｐＢＲ３２２をもとにしたクローンより得られ
る）を求める部位にライゲーションさせろ。その結果、
Ｔ７発現系に必要な全ての機能的要素を含んだ、単一の
ｐＢＲ３２２を基としたプラスミドが得られた。
プロモーターとＴ７Ｇｅｎｅｌ（前出）を含み、特異的
な制限部位で切ったのち平滑末端とし、次いでファージ
Ｔ７プロモーターと求める遺伝子を含むフラグメント（
上述したｐＢＲ３２２をもとにしたクローンより得られ
る）を求める部位にライゲーションさせろ。その結果、
Ｔ７発現系に必要な全ての機能的要素を含んだ、単一の
ｐＢＲ３２２を基としたプラスミドが得られた。
これらのプラスミドは、１ａｃ−Ｊ’を含む宿主に形質
転換させると、安定なりローンを単離することができろ
。これらクローンは、 工ＰＴＧの誘導により、求める
蛋白を大量に生産することを発見した。
転換させると、安定なりローンを単離することができろ
。これらクローンは、 工ＰＴＧの誘導により、求める
蛋白を大量に生産することを発見した。
この単一なプラスミド９系において、我々は、１ａｃＵ
Ｖ５プロモーターとＴ７ Ｇｏｎｅ ｌのＤＮＡ配列
と同じ転写方向を向゛いたＴ７φ１０および所望する遺
伝子のＤＮＡ配列、或いは転写方向と反対の方向性を有
する上記ＤＮＡ配列を有するプラスミド９を発見した。
Ｖ５プロモーターとＴ７ Ｇｏｎｅ ｌのＤＮＡ配列
と同じ転写方向を向゛いたＴ７φ１０および所望する遺
伝子のＤＮＡ配列、或いは転写方向と反対の方向性を有
する上記ＤＮＡ配列を有するプラスミド９を発見した。
いずれのプラスミビ型を有する株も生存可能で有用であ
った。
った。
材料および実験方法
菌株
Ｋ１２の誘導体Ｅ、ｃｏ１ｉ ２９４を、Ｔ７遺伝子を
１ａＣプロモーター制御下においたときとＤＮＡ配列決
定実験以外のすべてのクローニングに宿主として用いた
。Ｅ、ｃｏｌｉ ２９４ （匣Ａ″″占竺Ｒ−。
１ａＣプロモーター制御下においたときとＤＮＡ配列決
定実験以外のすべてのクローニングに宿主として用いた
。Ｅ、ｃｏｌｉ ２９４ （匣Ａ″″占竺Ｒ−。
ｔｈｉ−、ｐｒｏ−）の遺伝子型はポリバー（Ｂｏｌｉ
ｖａｒ）とバック−ｑ ｙ （Ｂｃｃｋｍａｎ） 、
１９７９年に記載されている。Ｔ７遺伝子をｌａｃ制御
下においたときのＴ７遺伝子のクローニングにおける宿
主にはＥ、 ｃｏｌｉＤ １２１０ （Ｅ、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯ１の誘導体）を用（・た。
ｖａｒ）とバック−ｑ ｙ （Ｂｃｃｋｍａｎ） 、
１９７９年に記載されている。Ｔ７遺伝子をｌａｃ制御
下においたときのＴ７遺伝子のクローニングにおける宿
主にはＥ、 ｃｏｌｉＤ １２１０ （Ｅ、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯ１の誘導体）を用（・た。
この株はサト” ５− （Ｓａｄｌｅｒ）も％ １９８
０に記載されており１ａＣ工ｑ とＹ＋遺伝子を染色体
上にもつものである。Ｅ、Ｃｏ１１ Ｒａ７９１はコネ
チカット州ニューヘヴンのエール医科大学Ｌｃｏｌｉ
）エネテイツクセンターより恵与されたものを用いた
。
０に記載されており１ａＣ工ｑ とＹ＋遺伝子を染色体
上にもつものである。Ｅ、Ｃｏ１１ Ｒａ７９１はコネ
チカット州ニューヘヴンのエール医科大学Ｌｃｏｌｉ
）エネテイツクセンターより恵与されたものを用いた
。
その遺伝子型はＰニエＴ）４０００（ＩＥ二Ｉ（１）、
」二Ｚ １）４００８（ｌａｃ Ｌ８）、λ−，ＩＮ
（ｒｒｎＤ−ｒｒｎ ＢＥ）１、（Ｒ，Ｂ、ブＬ／７
ト” （Ｂｒｅｎｔ ）、Ｍ、ブタシー７ （Ｐｔａｓ
ｈｎｅ）１９８１）である。Ｅ、ｃｏｌｉ （ＪＭ１
０３）は、Ｐ！プロモーターフラグメントとＴ７ Ｇ
ｅｎｅ １の間の介在領域をシーケンスするためにＭ１
３のクローニングに用いた。これはメシング（Ｍｅ ｓ
ｅ ｉ ｎｇ）、１９７９により記述されており、そ
の遺伝子型はΔ（ｌａｃ、 ｐｒｏ）、ｔｈｉ−，５ｔ
ｒＡ、ｅｎｄＡ、５ｂｃＢ１５ 。
」二Ｚ １）４００８（ｌａｃ Ｌ８）、λ−，ＩＮ
（ｒｒｎＤ−ｒｒｎ ＢＥ）１、（Ｒ，Ｂ、ブＬ／７
ト” （Ｂｒｅｎｔ ）、Ｍ、ブタシー７ （Ｐｔａｓ
ｈｎｅ）１９８１）である。Ｅ、ｃｏｌｉ （ＪＭ１
０３）は、Ｐ！プロモーターフラグメントとＴ７ Ｇ
ｅｎｅ １の間の介在領域をシーケンスするためにＭ１
３のクローニングに用いた。これはメシング（Ｍｅ ｓ
ｅ ｉ ｎｇ）、１９７９により記述されており、そ
の遺伝子型はΔ（ｌａｃ、 ｐｒｏ）、ｔｈｉ−，５ｔ
ｒＡ、ｅｎｄＡ、５ｂｃＢ１５ 。
１ａｃ、Ｉ’ｌ、ｌａｃ Ｚ Ｍ２Ｓである。
培養培地
２Ｏ−１０−５ＴＹＥ培地および寒天培地を一貫して用
い休１１あたり２０ｇ バクトートリプトン、１１
バクト酵母エキス、５ ｆｉ ＮａＣＡ） 、適当な
抗生物質を選択に用いた（例えば、アンピシリン７５μ
９／ｒｔｔ１１テトラサイクリン塩酸塩２０μＪ／ｍｅ
）。＃主物質はすべてシグマ社のものを用（・た。
い休１１あたり２０ｇ バクトートリプトン、１１
バクト酵母エキス、５ ｆｉ ＮａＣＡ） 、適当な
抗生物質を選択に用いた（例えば、アンピシリン７５μ
９／ｒｔｔ１１テトラサイクリン塩酸塩２０μＪ／ｍｅ
）。＃主物質はすべてシグマ社のものを用（・た。
Ｔ７フアージＤＮＡの調製
Ｔ７バクテリオフアージを７ Ｑ、 ｌ Ｔｉ Ｏ−
ター中で３ＱＫｒｐｍで一夜遠心する点を除いて、本質
的にはマニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉ日）ら、１９８２
％がバクテリオファージラムダに対して記載して（・る
方法を用いて野生株Ｔ７バクテリオフアージを得、Ｔ７
ＤＮＡを単離精製した。塩化セシウムの濃度はファージ
懸濁液１ ｒｔｔｌ！当りｏ、ｓＢであった。
ター中で３ＱＫｒｐｍで一夜遠心する点を除いて、本質
的にはマニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉ日）ら、１９８２
％がバクテリオファージラムダに対して記載して（・る
方法を用いて野生株Ｔ７バクテリオフアージを得、Ｔ７
ＤＮＡを単離精製した。塩化セシウムの濃度はファージ
懸濁液１ ｒｔｔｌ！当りｏ、ｓＢであった。
プラスミビベクターおよび他の遺伝子要素多くのクロー
二／グベクターが用いられた。それらはすなわちｐＢＲ
３２２（ストクリツフエ（Ｓｎｔｃｌｉｆｆｅ）、１９
７９ ） ； ｐＡｃＹｃ１８４（チャン（Ｃｈａｎｇ
） およびコーｘ ７ （Ｃｏｈｅｎ）、１９７８
Ｊ ； Ｉ）ＫＧ−２である。
二／グベクターが用いられた。それらはすなわちｐＢＲ
３２２（ストクリツフエ（Ｓｎｔｃｌｉｆｆｅ）、１９
７９ ） ； ｐＡｃＹｃ１８４（チャン（Ｃｈａｎｇ
） およびコーｘ ７ （Ｃｏｈｅｎ）、１９７８
Ｊ ； Ｉ）ＫＧ−２である。
ｐＭＴｔｔｓ （カリフォルニア、パロオート（Ｐａ
ｌＯＡ１ｔｏ入ＤＮＡＸ研究所のＨ，ハング（Ｈｕａｎ
ｇ）とに、′ア（Ｍｏｏｒｅ） により供給された〕は
、ＥｃｏＲ工制限部位の１塩基対よりはじまる６６塩基
対ポＩＪ １７ンカーを含むｐＢＲ３２２の誘導体であ
る。その２２７５塩基対の全ＤＮＡ配列が知られている
。
ｌＯＡ１ｔｏ入ＤＮＡＸ研究所のＨ，ハング（Ｈｕａｎ
ｇ）とに、′ア（Ｍｏｏｒｅ） により供給された〕は
、ＥｃｏＲ工制限部位の１塩基対よりはじまる６６塩基
対ポＩＪ １７ンカーを含むｐＢＲ３２２の誘導体であ
る。その２２７５塩基対の全ＤＮＡ配列が知られている
。
ｐＫＧ−２はシエリング社のに、ゲバイｙ（Ｇｅｗａｉ
ｎ）ニヨリ造成すレタモノテ、ｐＢＲ３２２とＰＶＵ２
０８に由来する雑種プラスミドである〔ハカート（Ｈａ
ｋｋａａｒｔ）ら、１９８１ ）。各シラスミド由来の
ＰｓｔＩ／ＡｖａＩフラグメントを、ｐＶＵ２０ｓ
プラスミドがアンピシリン耐性遺伝子の３′末端Ｃ０ｐ
ｔ８開始点を供与するようライゲーションした。
ｎ）ニヨリ造成すレタモノテ、ｐＢＲ３２２とＰＶＵ２
０８に由来する雑種プラスミドである〔ハカート（Ｈａ
ｋｋａａｒｔ）ら、１９８１ ）。各シラスミド由来の
ＰｓｔＩ／ＡｖａＩフラグメントを、ｐＶＵ２０ｓ
プラスミドがアンピシリン耐性遺伝子の３′末端Ｃ０ｐ
ｔ８開始点を供与するようライゲーションした。
アンピシリン耐性遺伝子の５′位と完全なテトラサイク
リン耐性遺伝子はｐＢＲ３２２フラグメントによって供
与される。
リン耐性遺伝子はｐＢＲ３２２フラグメントによって供
与される。
と！プロモーター（ｌａｃ ｐりは最初バックマン（Ｂ
ａｃｋｍａｎ）ら、１９７６年により紹介されたもので
、本来はｐＫＢ２５２に由来する。Ｔ７Ｇｅｎｅｌのア
ミノ酸末端位はｐＴ７−１３ より単離した〔スター
ル（Ｓｔａｈｌ）およびチン（Ｚｉｎｎ） 、１９８１
．ｌｌ。
ａｃｋｍａｎ）ら、１９７６年により紹介されたもので
、本来はｐＫＢ２５２に由来する。Ｔ７Ｇｅｎｅｌのア
ミノ酸末端位はｐＴ７−１３ より単離した〔スター
ル（Ｓｔａｈｌ）およびチン（Ｚｉｎｎ） 、１９８１
．ｌｌ。
これはＳ、スタール（Ｓｔａｈｌ）より恵与されたもの
である。使用したネズミα−２インターフェロン配列は
サラ（Ｓｈａｗ）ら、１９８３年により単離され、特徴
づけられたものである。使用したネズミインターロイキ
ンー３遺伝子はヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）ら、１９８４年
により単離され特徴づけられた配置列であった。
である。使用したネズミα−２インターフェロン配列は
サラ（Ｓｈａｗ）ら、１９８３年により単離され、特徴
づけられたものである。使用したネズミインターロイキ
ンー３遺伝子はヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）ら、１９８４年
により単離され特徴づけられた配置列であった。
Ｔ７プロモーター制御下でのヒトα−２インク−７エロ
ンをコート８するヌクレオチビ配列を含むＥ、ｃｏ’ｌ
ｉ Ｄ １２１０組換え体が、以下の方法でヒトα−２
インターフエロン合成に対してテストされた。組換え体
を、１００μｉ／ｍｅアンピシリンおよび２０μｇ／ｍ
ｌ テトラサイクリン塩酸塩を含む２０−１０−、Ｓ寒
天プレートにストリークし、３０℃で一晩培養した。翌
朝、２０−１０−５培地の細胞懸濁液５ ｒｎｌをプレ
ートスクラッピングにより作った。えられた細胞）跡ｌ
蜀液をただちに２５０ゴ三角フラスコ中、３０μｇ〆ａ
アンピアリン、２０μｇ／ｌｎｅテトラサイクリンを含
む２０−１０−５培地５０ｍ１に稀釈した。フラスコを
ニュープランスウイツクミクロザーンウォーターバスシ
ェーカー（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ｍｉｃｒｏｔ
ｈｅｒｍ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈｓｈａｋｅｒ ）にて
３７℃で振盪した。細胞の濁度をクレソトーサ−ｖ −
：／ ｙ （Ｋｌｅｔｔ−８ｏｍｍｅｒＢｏｎ）比色計
を用（・て波長５００ ｎｍ（グリーンフィルター）で
測定し、その濃度が約クレット２００に達したとき、開
始時（０時間）のサンプルを分取した。このとき工ＰＴ
Ｇを最終濃度５ｍＭになるよう加えた。並行して対照実
験をＩＰＴＧ無添加の条件で行った。
ンをコート８するヌクレオチビ配列を含むＥ、ｃｏ’ｌ
ｉ Ｄ １２１０組換え体が、以下の方法でヒトα−２
インターフエロン合成に対してテストされた。組換え体
を、１００μｉ／ｍｅアンピシリンおよび２０μｇ／ｍ
ｌ テトラサイクリン塩酸塩を含む２０−１０−、Ｓ寒
天プレートにストリークし、３０℃で一晩培養した。翌
朝、２０−１０−５培地の細胞懸濁液５ ｒｎｌをプレ
ートスクラッピングにより作った。えられた細胞）跡ｌ
蜀液をただちに２５０ゴ三角フラスコ中、３０μｇ〆ａ
アンピアリン、２０μｇ／ｌｎｅテトラサイクリンを含
む２０−１０−５培地５０ｍ１に稀釈した。フラスコを
ニュープランスウイツクミクロザーンウォーターバスシ
ェーカー（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ｍｉｃｒｏｔ
ｈｅｒｍ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈｓｈａｋｅｒ ）にて
３７℃で振盪した。細胞の濁度をクレソトーサ−ｖ −
：／ ｙ （Ｋｌｅｔｔ−８ｏｍｍｅｒＢｏｎ）比色計
を用（・て波長５００ ｎｍ（グリーンフィルター）で
測定し、その濃度が約クレット２００に達したとき、開
始時（０時間）のサンプルを分取した。このとき工ＰＴ
Ｇを最終濃度５ｍＭになるよう加えた。並行して対照実
験をＩＰＴＧ無添加の条件で行った。
双方のフラスコより１時間ごとにｉｎサンプルを３本採
取し、インターフェロン分析および細胞濃度を調べた。
取し、インターフェロン分析および細胞濃度を調べた。
シイグルプラスミドシステムは以下のようにしてα−２
インターフエロン生産についてテストした。Ｅ、ｃｏｌ
ｉ Ｄ１２１０およびＥ、ｃｏｌｉ ＲＢ７９１ をそ
れぞれ別にｐＲＲＢ２０ＩＦ−２３組みかえ体で形質転
換させ、それぞれＩＰＴＧの誘導下でα−２インターフ
エロン生産をテストしてみた。細胞は１００μｇ／扉ｇ
アンピシリンを含む２０−１０−５寒天プレートで一
晩成長させた。増殖１８時間後、細胞の５ｄ懸濁液をプ
レートスクラッピングにより得、これを７５μｆｊ／ｒ
ｒｔｌアンピシリンを含む新鮮な２０−１０−５培地で
、３００ ｒｐｍでニュープランスウイツクＧ−５２０
−タリーシエーカ − （Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃ
ｋ Ｇ−５２ｒｏｔａｒｙ ５ｈａｋｅｒ）で３０
℃でクレットＯ０Ｄ、が２００になるまで振盪した。こ
のとき、５０ａｌを２５０ｍｇ三角フラスコに移し、ニ
ュープランスウイツクミクロザーンウォーターバスシェ
ーカーで３７℃で培養した。
インターフエロン生産についてテストした。Ｅ、ｃｏｌ
ｉ Ｄ１２１０およびＥ、ｃｏｌｉ ＲＢ７９１ をそ
れぞれ別にｐＲＲＢ２０ＩＦ−２３組みかえ体で形質転
換させ、それぞれＩＰＴＧの誘導下でα−２インターフ
エロン生産をテストしてみた。細胞は１００μｇ／扉ｇ
アンピシリンを含む２０−１０−５寒天プレートで一
晩成長させた。増殖１８時間後、細胞の５ｄ懸濁液をプ
レートスクラッピングにより得、これを７５μｆｊ／ｒ
ｒｔｌアンピシリンを含む新鮮な２０−１０−５培地で
、３００ ｒｐｍでニュープランスウイツクＧ−５２０
−タリーシエーカ − （Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃ
ｋ Ｇ−５２ｒｏｔａｒｙ ５ｈａｋｅｒ）で３０
℃でクレットＯ０Ｄ、が２００になるまで振盪した。こ
のとき、５０ａｌを２５０ｍｇ三角フラスコに移し、ニ
ュープランスウイツクミクロザーンウォーターバスシェ
ーカーで３７℃で培養した。
開始時（０時間）サンプルを取り、５ ｍＭ 工ＰＴ
Ｇを適当なフラスコに添加した。フラスコは２５０ｒｐ
ｍで振とうさせ、誘導憐６時間までの２時間毎に１ ｍ
ｌサンプルを各３本採取し、再び連続的に一晩培養を行
なった（誘導後約２０時間）。
Ｇを適当なフラスコに添加した。フラスコは２５０ｒｐ
ｍで振とうさせ、誘導憐６時間までの２時間毎に１ ｍ
ｌサンプルを各３本採取し、再び連続的に一晩培養を行
なった（誘導後約２０時間）。
培養物１ ｍｌをピはットで取り１．５ ｍｌエノイン
トゝルチューブに移し、このサンプルをプリンクマン遠
心機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）で遠心
する。上滑を流し去り、細胞の沈殿を再び０．２ ｍ／
の溶菌緩衝液（５０ｍＭ Ｈｏｐｅｓ、３ｏｍＭ Ｎａ
Ｃ４１％５ＤＳ１％β−メルカプトエタノール、５Ｍ尿
素；ｐＨ７，ｏ）Ｋ懸濁する。懸濁液を９０℃で１分間
加熱し、もとの容量まで冷却生理食塩水のリン酸緩衝液
（ＰＢＳ） でうすめる。サンプルを攪拌し、プリン
クマン遠心機で１分間遠心する。０．１ ｒｒｔ１分取
して希釈し１次の分析用にした。
トゝルチューブに移し、このサンプルをプリンクマン遠
心機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）で遠心
する。上滑を流し去り、細胞の沈殿を再び０．２ ｍ／
の溶菌緩衝液（５０ｍＭ Ｈｏｐｅｓ、３ｏｍＭ Ｎａ
Ｃ４１％５ＤＳ１％β−メルカプトエタノール、５Ｍ尿
素；ｐＨ７，ｏ）Ｋ懸濁する。懸濁液を９０℃で１分間
加熱し、もとの容量まで冷却生理食塩水のリン酸緩衝液
（ＰＢＳ） でうすめる。サンプルを攪拌し、プリン
クマン遠心機で１分間遠心する。０．１ ｒｒｔ１分取
して希釈し１次の分析用にした。
α−２インターフエロン蛋白は、本質的にはファミリエ
ツテイ（Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ）ら、１９８１年、の記
述にあるように、Ｎ工Ｈ／ＷＨＯ天然白血球インターフ
ェロンスタンダー）’６９／１９をｉ準として、ＥＭＣ
ウィルスとヒト表皮細胞（ＦＳ−７０）を用いた細胞変
性効果／阻害により、抗ウィルス活性を少なくともｌＸ
ｌ０ ユニット／〜もつものとして特徴づけられてい
る。
ツテイ（Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ）ら、１９８１年、の記
述にあるように、Ｎ工Ｈ／ＷＨＯ天然白血球インターフ
ェロンスタンダー）’６９／１９をｉ準として、ＥＭＣ
ウィルスとヒト表皮細胞（ＦＳ−７０）を用いた細胞変
性効果／阻害により、抗ウィルス活性を少なくともｌＸ
ｌ０ ユニット／〜もつものとして特徴づけられてい
る。
Ｅｘｏ■を除いたすべての酵素およびリングはマサチュ
ーセッツビバ’Ｊ −（Ｂθｖｅｒｌｙ） の法人ニ
ューイングランドバイオラボより購入した。
ーセッツビバ’Ｊ −（Ｂθｖｅｒｌｙ） の法人ニ
ューイングランドバイオラボより購入した。
ＥＸＯ■酵素は、メリーランドロックパイル（Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ）の法人ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）リサ
ーチラボラトリーズより購入した。反応は本質的には製
品のカタログの特記に従って行った。
ｖｉｌｌｅ）の法人ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）リサ
ーチラボラトリーズより購入した。反応は本質的には製
品のカタログの特記に従って行った。
電気泳動およびＤＮＡ単離技術
アガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲル
電気泳動の手法は本質的にはマニアナイスら、１９８２
年に従って行った。アガロースまたはポリアクリルアミ
ドゲルからのＤＮＡフラグメントの単離および回収は、
概してＨ２Ｏ。
電気泳動の手法は本質的にはマニアナイスら、１９８２
年に従って行った。アガロースまたはポリアクリルアミ
ドゲルからのＤＮＡフラグメントの単離および回収は、
概してＨ２Ｏ。
スミス、１．９８０年に従（・実行した。
大ｔおよび小量（小規模〕のプラスミビ調製本研究に一
貫して用いられた大量プラスミド単離の調製法は特にマ
ニアナイスら、１９８２年に記述されているアルカＩＪ
−３ＤＳ溶菌法である。多くのクローンもまた本質的に
は、マニアナイスら、１９８２年に記述されているアル
カＩＪ−８ＤＳ溶菌法に従ってスクリーニングを行った
。ただし例外として、使用した細胞は一般的には１０ｗ
Ｌｌオーバーナイト培養したものを用いた。
貫して用いられた大量プラスミド単離の調製法は特にマ
ニアナイスら、１９８２年に記述されているアルカＩＪ
−３ＤＳ溶菌法である。多くのクローンもまた本質的に
は、マニアナイスら、１９８２年に記述されているアル
カＩＪ−８ＤＳ溶菌法に従ってスクリーニングを行った
。ただし例外として、使用した細胞は一般的には１０ｗ
Ｌｌオーバーナイト培養したものを用いた。
形質転換法
Ｅ、ｃｏｌｉの形質転換法は本質的にダガード（Ｄａｇ
ｅｒｔ）およびエールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）、１９
７９年により記載されている手法で行った。
ｅｒｔ）およびエールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）、１９
７９年により記載されている手法で行った。
ｐＲＲＢ２０のブロモ、−ター領域の配列はくベリー
（Ｂｅｖｅｌｙ） Ｍａのニューイングランドゝバイオ
ラボのＭ１３クローニングおよびＤＮＡ塩基配列決定シ
ステムにより決められた。該システムはメシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）とヴイエア（Ｖｉ ｅ ｉ ｒａ ）、１
９８２年が開発したクローニングベクターおよびサンガ
ーら、１９７７年が記載した配列決定法を使用するもの
である。
（Ｂｅｖｅｌｙ） Ｍａのニューイングランドゝバイオ
ラボのＭ１３クローニングおよびＤＮＡ塩基配列決定シ
ステムにより決められた。該システムはメシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）とヴイエア（Ｖｉ ｅ ｉ ｒａ ）、１
９８２年が開発したクローニングベクターおよびサンガ
ーら、１９７７年が記載した配列決定法を使用するもの
である。
Ｔ７ゲノム上の制限酵素認識部位およびプロモーターと
遺伝子の位置は、ダン（Ｄｕｎｎ）とスタブイア−（Ｓ
ｔｕｄｉｅｒ）、１９８３年により発表された配列を用
（・て決定した。この雑文の位置は、上述の著者の習慣
に従い塩基対（ｂ、ｐ、 ）数で決められている。ｐＢ
Ｒ３２２の制限酵素認識部位の位置および塩基対数はマ
ニアナイスら、１９８２年に記された配列により定義さ
れている。
遺伝子の位置は、ダン（Ｄｕｎｎ）とスタブイア−（Ｓ
ｔｕｄｉｅｒ）、１９８３年により発表された配列を用
（・て決定した。この雑文の位置は、上述の著者の習慣
に従い塩基対（ｂ、ｐ、 ）数で決められている。ｐＢ
Ｒ３２２の制限酵素認識部位の位置および塩基対数はマ
ニアナイスら、１９８２年に記された配列により定義さ
れている。
ネズミインターフェロンの分析
ネズミインターフェロンの標品生産および分析手順は、
ヒトα−２インターフエノン分析に用いた対照はヒトα
−１インターフエロンだった。
ヒトα−２インターフエノン分析に用いた対照はヒトα
−１インターフエロンだった。
ＳＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動はしメリ
ー（Ｌａｅｍｍｌｉ）、１９７０年に従って行った。
ー（Ｌａｅｍｍｌｉ）、１９７０年に従って行った。
ランニングゲルは１５％アクリルアミドゝおよび６．６
チスタソキングゲルである。試料は、その全部がランニ
ングゲルに入るまで２０ ｍＡ定電流で流した以後、電
流を３５ｍＡ に上げ１こ。
チスタソキングゲルである。試料は、その全部がランニ
ングゲルに入るまで２０ ｍＡ定電流で流した以後、電
流を３５ｍＡ に上げ１こ。
結果
Ｔ７Ｇａｎｅ Ｉ （Ｔ ７ ＲＮＡ４す） ラ−
ゼ） のりｏ−＝７７Ｔ７ＲＮＡ ポリメラーゼ遺伝子
はＴ７ゲノムの３１７１塩基対で始まり、５８２ｏ塩基
対で終わる。全遺伝子（工、各々別個にクローンした２
つの７２グメントから組立てた。この遺伝子のカルボキ
シ末端をＴ７ゲノムＤＮＡから以下のようにして直接ク
ローンした。Ｔ７ゲノムをＭ２ＯＩで分解し、８３１１
塩基対のフラグメントをアガロースゲル電気泳動により
単離した。このフラグメントを引き続きＮｃ：ｔ Ｉで
分解した。Ｎｃｉ Ｉ部位は２６６ｏ塩基対と７５８９
塩基対にあり、４９２９塩基対のフラグメントをアガロ
ースゲル電気泳動で単離した。このフラグメントをさら
にＨａθ■で単離した。Ｔ７ゲノムの４７４４塩基対か
ら５８８０塩基対の間に存在し且つＴ７ＲＮＡ＋ｌＪメ
ラーゼ１．ｌＡプロモーターを含む１１３６塩基対のフ
ラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離した。
ゼ） のりｏ−＝７７Ｔ７ＲＮＡ ポリメラーゼ遺伝子
はＴ７ゲノムの３１７１塩基対で始まり、５８２ｏ塩基
対で終わる。全遺伝子（工、各々別個にクローンした２
つの７２グメントから組立てた。この遺伝子のカルボキ
シ末端をＴ７ゲノムＤＮＡから以下のようにして直接ク
ローンした。Ｔ７ゲノムをＭ２ＯＩで分解し、８３１１
塩基対のフラグメントをアガロースゲル電気泳動により
単離した。このフラグメントを引き続きＮｃ：ｔ Ｉで
分解した。Ｎｃｉ Ｉ部位は２６６ｏ塩基対と７５８９
塩基対にあり、４９２９塩基対のフラグメントをアガロ
ースゲル電気泳動で単離した。このフラグメントをさら
にＨａθ■で単離した。Ｔ７ゲノムの４７４４塩基対か
ら５８８０塩基対の間に存在し且つＴ７ＲＮＡ＋ｌＪメ
ラーゼ１．ｌＡプロモーターを含む１１３６塩基対のフ
ラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離した。
ｐＲＲ１９の造成： ＰＢＲ３２２をＢａｍ Ｈ工で切
ってその部位をＤＮＡポリメジーゼエ大フラグメント（
クレノーフラグメント）でフィル・イン（補填）し１こ
。Ｔ７フラグメント°イ平滑末端の１１３６塩基対ｔ
Ｂａｍ Ｈ工処理／補填／平滑末端処理したプラスミド
ゝｐＢＲ３２２由来のフラグメントに２イゲーシヨンし
、該ライゲーションフラグメントをＥ．ｃｏｌｉ ２９
４に形質転換した。補填したＢａｍ ＨＩ部位とＨａθ
■部位の組会せはＢａｍ Ｈ工部位を再び作す、これは
、１１３６塩基対フラグメントの存在するクローンをス
クリーニングするマークとして用いられる。こうしてｐ
ＲＲ１９を単離した（第１図）。その方向は、Ｉ）ＢＲ
３２２プラスミビのＨａｓ■部位近傍に関して、１１３
６塩基対フラグメントの読み取る末端中に存在する非対
称なＨｐａ １部位の距離を調べることによって演縛し
た。ｐＲＲ−１Ｔ７−３９ の造成：Ｔ７Ｇｅｎｅｌ配
列をコードするアミノ酸末端はｐＴ７−１３より得ろこ
とができ、これを、双方のフラグメントに共通に存在す
るＫｐｎ １部位を利用することにより、ｐＲＲ１Ｑ中
に含まれたカルボキシ末端をコードする配列に納会した
。この部位はＴ７ゲノムの５６１４塩基対に位置する。
ってその部位をＤＮＡポリメジーゼエ大フラグメント（
クレノーフラグメント）でフィル・イン（補填）し１こ
。Ｔ７フラグメント°イ平滑末端の１１３６塩基対ｔ
Ｂａｍ Ｈ工処理／補填／平滑末端処理したプラスミド
ゝｐＢＲ３２２由来のフラグメントに２イゲーシヨンし
、該ライゲーションフラグメントをＥ．ｃｏｌｉ ２９
４に形質転換した。補填したＢａｍ ＨＩ部位とＨａθ
■部位の組会せはＢａｍ Ｈ工部位を再び作す、これは
、１１３６塩基対フラグメントの存在するクローンをス
クリーニングするマークとして用いられる。こうしてｐ
ＲＲ１９を単離した（第１図）。その方向は、Ｉ）ＢＲ
３２２プラスミビのＨａｓ■部位近傍に関して、１１３
６塩基対フラグメントの読み取る末端中に存在する非対
称なＨｐａ １部位の距離を調べることによって演縛し
た。ｐＲＲ−１Ｔ７−３９ の造成：Ｔ７Ｇｅｎｅｌ配
列をコードするアミノ酸末端はｐＴ７−１３より得ろこ
とができ、これを、双方のフラグメントに共通に存在す
るＫｐｎ １部位を利用することにより、ｐＲＲ１Ｑ中
に含まれたカルボキシ末端をコードする配列に納会した
。この部位はＴ７ゲノムの５６１４塩基対に位置する。
ｐＲＲ１９をＫｐｎ ■およびＰｖｕ ［［で分解した
。複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を含む大き
なフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離し
た。ｐＴ７−１３ をＰｓｔ、 ｌで分解し、クレノー
酵素によって平滑末端にしたものを、 Ｋｐｎ １で分
解した。Ｔ７Ｇｅｎｅｌを含むフラグメントアガロース
ゲル電気泳動により単離し、前述の如く準備したｐＲＲ
１９ベクターにライゲーションしｒこ。
。複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を含む大き
なフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離し
た。ｐＴ７−１３ をＰｓｔ、 ｌで分解し、クレノー
酵素によって平滑末端にしたものを、 Ｋｐｎ １で分
解した。Ｔ７Ｇｅｎｅｌを含むフラグメントアガロース
ゲル電気泳動により単離し、前述の如く準備したｐＲＲ
１９ベクターにライゲーションしｒこ。
該ライゲーションしたフラグメントをＥ、ｃｏｌｔ２９
４に形質転換した。プラスミ）”ＤＮＡをＫｐｎ■およ
びＨｐａ ｌで分解することにより、クローンをスクリ
ーンした。プラスミドｐＲＲ−ＩＴ７−３９（第２図）
はこのスクリーニングによって得たものである。このプ
ラスミドゝ中に含まれるＴ７ＤＮＡ ＆！Ｔ７ゲ／ム１
７）３１１７塩基対から５８８０塩基対まで及ぶ。
４に形質転換した。プラスミ）”ＤＮＡをＫｐｎ■およ
びＨｐａ ｌで分解することにより、クローンをスクリ
ーンした。プラスミドｐＲＲ−ＩＴ７−３９（第２図）
はこのスクリーニングによって得たものである。このプ
ラスミドゝ中に含まれるＴ７ＤＮＡ ＆！Ｔ７ゲ／ム１
７）３１１７塩基対から５８８０塩基対まで及ぶ。
ｌａｃプロモーター（ｌａｃ ｐリシステム用いたｌａ
ｃ ｐｏ配列はＵｖ５誘導体である。存在するオリジナ
ルプロモーターフラグメントは２０３塩基対Ｈａｅ１フ
ラグメントとして雑文ｌに載っている。本発明の造成に
用いられた配列はＥｃｏ ＲＩおよびＰｖｕ Ｉｆ部位
をもつひとまとまりの１２５塩基対フラグメントである
。それは以下のようにして造成された： ｐＫＢ２５２
をＥｃｏ ＲＩで分解し、フラグメントを１０％−４０
チグリセロ一ル濃度勾配で、５Ｗ２７０−ターで２４Ｋ
ｒｐｍ、２４時間遠心した。小さなフラグメントを
多くのグラジェントを集めることにより回収し、さらに
Ａｌｕ ｌで分解した。ｐＪ３Ｒ３２２を１ｉ：ｃｏ
ＲＩおよびＰｖｕ ｆＪで切断し、複製開始点およびア
ンピシリン耐性遺伝子を含む大きなフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動により単離した。
ｃ ｐｏ配列はＵｖ５誘導体である。存在するオリジナ
ルプロモーターフラグメントは２０３塩基対Ｈａｅ１フ
ラグメントとして雑文ｌに載っている。本発明の造成に
用いられた配列はＥｃｏ ＲＩおよびＰｖｕ Ｉｆ部位
をもつひとまとまりの１２５塩基対フラグメントである
。それは以下のようにして造成された： ｐＫＢ２５２
をＥｃｏ ＲＩで分解し、フラグメントを１０％−４０
チグリセロ一ル濃度勾配で、５Ｗ２７０−ターで２４Ｋ
ｒｐｍ、２４時間遠心した。小さなフラグメントを
多くのグラジェントを集めることにより回収し、さらに
Ａｌｕ ｌで分解した。ｐＪ３Ｒ３２２を１ｉ：ｃｏ
ＲＩおよびＰｖｕ ｆＪで切断し、複製開始点およびア
ンピシリン耐性遺伝子を含む大きなフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動により単離した。
回収し？、＝ｐＢＲ３２２ＤＮＡを次にＡｌｕ １分解
した小さなりＮＡ フラグメントとライゲーションし
、そのライゲーション混合物をＥ、ｃｏｌｉ ２９４に
形質転換して、アンピシリンおよび５−ブロモ−４−ク
ロ：ｌ−３−インド９リルーβ−Ｄ−ガラクトシド９を
含む２０−１０−５寒天プレート上にまいた。
した小さなりＮＡ フラグメントとライゲーションし
、そのライゲーション混合物をＥ、ｃｏｌｉ ２９４に
形質転換して、アンピシリンおよび５−ブロモ−４−ク
ロ：ｌ−３−インド９リルーβ−Ｄ−ガラクトシド９を
含む２０−１０−５寒天プレート上にまいた。
スクリーニングしたクローンのうち１つが１２５塩基対
フラグメントをもっていた。クローンした１２５塩基対
フラグメントのヌクレオチド８配列は以下のように決め
られた： ＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ
ＧＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧ ＣＡＣ
ＣＣαＪＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴ１２５塩基対フラグメ
ントを、１）ＢＲ３２２から造成しｆ、ｐ８０４−ＲＩ
のＥｃｏ ＲＩ／Ｐｖｕ ■領域にクローンした（第３
図）。この図において、本来のｐＢＲ３２２のＥｃｏ
ＲＩ部位を補填して再びライゲーション（Ｘｍｎ １部
をつくった）し、Ｅｃｏ Ｒニリンｊ妥補填したＮａｅ
１部位に挿入した。１２５塩基対’ｌａｃ ｐｏ フ
ラグメントの挿入後、得られたプラスミド８をｐ ８０
４−ＲＩ １ａｃとした（第３図下）。
フラグメントをもっていた。クローンした１２５塩基対
フラグメントのヌクレオチド８配列は以下のように決め
られた： ＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ
ＧＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧ ＣＡＣ
ＣＣαＪＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴ１２５塩基対フラグメ
ントを、１）ＢＲ３２２から造成しｆ、ｐ８０４−ＲＩ
のＥｃｏ ＲＩ／Ｐｖｕ ■領域にクローンした（第３
図）。この図において、本来のｐＢＲ３２２のＥｃｏ
ＲＩ部位を補填して再びライゲーション（Ｘｍｎ １部
をつくった）し、Ｅｃｏ Ｒニリンｊ妥補填したＮａｅ
１部位に挿入した。１２５塩基対’ｌａｃ ｐｏ フ
ラグメントの挿入後、得られたプラスミド８をｐ ８０
４−ＲＩ １ａｃとした（第３図下）。
ｌａｃ ｐｏ制御下のＴ７Ｇｅｎｅｌのクローニング（
第４図参照） ｐＲＲ−ＩＴ７−３９をＴｔｈ１１１■で分解して、切
断部位を補填し、プラスミド９をさらにＰｓｔ Ｉで分
解した。Ｔ７遺伝子フラグメントをアガロースゲル電気
泳動により単離した。ｐ８０４−ＲＩ ｌａｃをＰｖ
ｕ ■およびＰｅｔ ｌで分解した。ｌａｃ ｐｏおよ
び複製開始点を含むフラグメントをアガロースゲル電気
泳動により回収して、単離したｐＲＲ−ＩＴ７−３９
’ｒ７ Ｇｅｎｅ １フラグメントにライゲーション
した。このＤＮＡをＪｃｏｌｉ ＤＩ ２１０に形質転
換した。スクリーニングを行ったクローンからｐＲＲ−
ＩＴ７Ｌ−３が単離された（第４図下）。
第４図参照） ｐＲＲ−ＩＴ７−３９をＴｔｈ１１１■で分解して、切
断部位を補填し、プラスミド９をさらにＰｓｔ Ｉで分
解した。Ｔ７遺伝子フラグメントをアガロースゲル電気
泳動により単離した。ｐ８０４−ＲＩ ｌａｃをＰｖ
ｕ ■およびＰｅｔ ｌで分解した。ｌａｃ ｐｏおよ
び複製開始点を含むフラグメントをアガロースゲル電気
泳動により回収して、単離したｐＲＲ−ＩＴ７−３９
’ｒ７ Ｇｅｎｅ １フラグメントにライゲーション
した。このＤＮＡをＪｃｏｌｉ ＤＩ ２１０に形質転
換した。スクリーニングを行ったクローンからｐＲＲ−
ＩＴ７Ｌ−３が単離された（第４図下）。
ｐＲＲ−ＩＴ７Ｌ−３をもつＪｃｏｌｉ Ｄ１２１０細
胞はインプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）存在下で２０−１０−５寒天には生育しない。これ
は’ｒ７ Ｇｅｎｅ ｌ生産物がＥ、 ｃｏｌｉ細胞
を阻害することを示唆している。これは、ｌａｃ ｐｏ
制御下でＴ７ Ｇｅｎｅ ｌをもつ細胞を含む肉汁培
地に工ＰＴＧを／１０える実験で確かめられた。３７°
で対数増殖期の細胞をＩＰＴＧで誘導すると、徐々に成
長が止まり、死滅期に到った。
胞はインプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）存在下で２０−１０−５寒天には生育しない。これ
は’ｒ７ Ｇｅｎｅ ｌ生産物がＥ、 ｃｏｌｉ細胞
を阻害することを示唆している。これは、ｌａｃ ｐｏ
制御下でＴ７ Ｇｅｎｅ ｌをもつ細胞を含む肉汁培
地に工ＰＴＧを／１０える実験で確かめられた。３７°
で対数増殖期の細胞をＩＰＴＧで誘導すると、徐々に成
長が止まり、死滅期に到った。
死滅期の開始は４２℃で更に明瞭になった。ＩＰＴＧ（
２ｍＭ）を含む寒天プレートを引き続き、１ａＣｐＯ制
御下でのＴ７Ｇｅｎｅｌにおける組みかえ体造成の最初
のスクリーニングに用いた。
２ｍＭ）を含む寒天プレートを引き続き、１ａＣｐＯ制
御下でのＴ７Ｇｅｎｅｌにおける組みかえ体造成の最初
のスクリーニングに用いた。
Ｔ７Ｇｅｎｅ２のクローニング
Ｔ７Ｇｅｎｅ２はＴ７ゲノムの８８９８塩基対から９０
９０塩基対に位置する。この蛋白の機能は宿主ＲＮＡ＋
＋？＋Ｊメラーゼを失活させることである。７５７９塩
基対から１０３０９塩基対に及んでＴ７Ｇｅｎｅ２を含
むＴ７ゲノムの最大のＨａθｍフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動によって単離した。単離したＤＮＡを次
にさらにＨｌ ｎｃ■で分解した。８７６５塩基対と９
２７７塩基対に存在するＨｌｎｃ ｎ制御部位はＴ７
Ｇｅｎｅ２を含む。この５１２塩基対のフラグメント
をアガロースゲル電気泳動により単離しｒこ。
９０塩基対に位置する。この蛋白の機能は宿主ＲＮＡ＋
＋？＋Ｊメラーゼを失活させることである。７５７９塩
基対から１０３０９塩基対に及んでＴ７Ｇｅｎｅ２を含
むＴ７ゲノムの最大のＨａθｍフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動によって単離した。単離したＤＮＡを次
にさらにＨｌ ｎｃ■で分解した。８７６５塩基対と９
２７７塩基対に存在するＨｌｎｃ ｎ制御部位はＴ７
Ｇｅｎｅ２を含む。この５１２塩基対のフラグメント
をアガロースゲル電気泳動により単離しｒこ。
クローニングベクターはｐＢＲ３２２より調製した。該
プラスミドをＰｖｕ ［とＡｖａ ｌで分解し、開始点
を含む大きなフラグメントをアガロースゲル電気泳動に
より単離した。接着末端の５１２塩基対のＴ７フラグメ
ントＤＮＡをｐＢＲ３２２の接着末端をもつＰｖｕ ［
部位にライゲーションした。
プラスミドをＰｖｕ ［とＡｖａ ｌで分解し、開始点
を含む大きなフラグメントをアガロースゲル電気泳動に
より単離した。接着末端の５１２塩基対のＴ７フラグメ
ントＤＮＡをｐＢＲ３２２の接着末端をもつＰｖｕ ［
部位にライゲーションした。
このフラグメントのＡｖａ Ｉ末端は単一鎖の４塩基が
突出しているためそのまま残る（第５図）。ライゲーシ
ョンを６５℃で１０分加熱することにより止め、ＤＮＡ
を２容のエタノールで沈殿させた後、回収した。沈殿な
ＴＥ緩衝液に溶かし、次に溶かしたＤＮＡをＮｒｕ ｌ
で分解した（ｐＢＲ３２２中を特異的な部位で切断する
几この酵素はやはり接着末端として残る。制限酵素処理
したＤＮＡをアガロースゲル上で流した。適当な直鎖状
の大きさの範囲のバンドを切り出して単離した。これら
の直鎖状ＤＮＡフラグメントな、平滑末端どうしのライ
ゲーションによりそれぞれ再環化し、次にＥ、ｃｏｌｉ
２９４に形質転換した。各々形質転換したクローンを
Ｋｐｎ ｌによるプラスミド″’ＤＮＡ切断によりスク
リーニングした。この酵素により５１２塩基対フラグメ
ント領域内の特異的な部位で切断が起こる（Ｔ７ゲノム
の９１９０塩基対）。更に研究することによりこれら形
質転換のうちの１つが第６図に示す方向の５１２塩基対
のＤＮＡ フラグメントを含むクローンであることが判
明し、このシラスミドｆｐＲＲ−２Ｔ７−３５と命名し
た。
突出しているためそのまま残る（第５図）。ライゲーシ
ョンを６５℃で１０分加熱することにより止め、ＤＮＡ
を２容のエタノールで沈殿させた後、回収した。沈殿な
ＴＥ緩衝液に溶かし、次に溶かしたＤＮＡをＮｒｕ ｌ
で分解した（ｐＢＲ３２２中を特異的な部位で切断する
几この酵素はやはり接着末端として残る。制限酵素処理
したＤＮＡをアガロースゲル上で流した。適当な直鎖状
の大きさの範囲のバンドを切り出して単離した。これら
の直鎖状ＤＮＡフラグメントな、平滑末端どうしのライ
ゲーションによりそれぞれ再環化し、次にＥ、ｃｏｌｉ
２９４に形質転換した。各々形質転換したクローンを
Ｋｐｎ ｌによるプラスミド″’ＤＮＡ切断によりスク
リーニングした。この酵素により５１２塩基対フラグメ
ント領域内の特異的な部位で切断が起こる（Ｔ７ゲノム
の９１９０塩基対）。更に研究することによりこれら形
質転換のうちの１つが第６図に示す方向の５１２塩基対
のＤＮＡ フラグメントを含むクローンであることが判
明し、このシラスミドｆｐＲＲ−２Ｔ７−３５と命名し
た。
遺伝子２とＴ７Ｇｅｎｅｌを給仕させる前にこのシラス
ミドゝかも不要なりＮＡを除去した。この不要なりＮＡ
はＣ１ａ １部位とＴ７ Ｋｐｎ １部位の間のｐＢＲ
３２ｚ ＤＮＡであり、これを以下のようにして除去
しＴこ。すなわち、ｐＲＲ−２Ｔ７−３５をＣＩＩＬ
ＩおよびＫｐｎ ｌで分解し、大きなフラグメントを単
離した（第７図）。このＤＮＡフラグメントをクレノー
酵素で処理した。この反応により、Ｃ１ａ■部位は補填
され、３′側が突き出たＫｐｎ【部位は平滑末端になっ
た。２つの平滑末端をさらにライゲーションし、プラス
ミ）’ ＤＮＡ ｆ Ｅ、ｃｏｌｉ２９４に形質転換し
た。ＤＮＡを酵素Ｈａｅ ■で分解してクローンなスク
リーニングした。これらクローンよりｐＲＲ−ＩＢ−２
Ｔ７ が単離した（第７図）。
ミドゝかも不要なりＮＡを除去した。この不要なりＮＡ
はＣ１ａ １部位とＴ７ Ｋｐｎ １部位の間のｐＢＲ
３２ｚ ＤＮＡであり、これを以下のようにして除去
しＴこ。すなわち、ｐＲＲ−２Ｔ７−３５をＣＩＩＬ
ＩおよびＫｐｎ ｌで分解し、大きなフラグメントを単
離した（第７図）。このＤＮＡフラグメントをクレノー
酵素で処理した。この反応により、Ｃ１ａ■部位は補填
され、３′側が突き出たＫｐｎ【部位は平滑末端になっ
た。２つの平滑末端をさらにライゲーションし、プラス
ミ）’ ＤＮＡ ｆ Ｅ、ｃｏｌｉ２９４に形質転換し
た。ＤＮＡを酵素Ｈａｅ ■で分解してクローンなスク
リーニングした。これらクローンよりｐＲＲ−ＩＢ−２
Ｔ７ が単離した（第７図）。
Ｔ ７ Ｇｅｎｅ ２をＴ７ Ｇｅｎｅ １系に移
すために、Ｂａｍ ＨＩニリンカをｐＲＲ−ＩＢ−２Ｔ
７ のＮａｅ １部位に挿入した。これは以下のように
して行った。
すために、Ｂａｍ ＨＩニリンカをｐＲＲ−ＩＢ−２Ｔ
７ のＮａｅ １部位に挿入した。これは以下のように
して行った。
すなわち、プラスミドをＮｄｅ ｌで分解後、その制限
部位をクレノー酵素で補填した。補填した部位をウシ腸
管アルカリホスファタゼ（Ｃ工ＡＰ）で処理した。５′
リン酸化され１こＢａｎ Ｈニリンカーを平滑末端に
ライゲーションし、このＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ２９４に
形質転換した。クローンをプラスミドＤＮＡ をＢａｎ
ＨＩで分解することによりスクリーニングした。１）
ＲＲ−９Ｂ−２Ｔ７を単離し、次のＴ７Ｇｅｎｅ２の実
験に用いた（第８図）。
部位をクレノー酵素で補填した。補填した部位をウシ腸
管アルカリホスファタゼ（Ｃ工ＡＰ）で処理した。５′
リン酸化され１こＢａｎ Ｈニリンカーを平滑末端に
ライゲーションし、このＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ２９４に
形質転換した。クローンをプラスミドＤＮＡ をＢａｎ
ＨＩで分解することによりスクリーニングした。１）
ＲＲ−９Ｂ−２Ｔ７を単離し、次のＴ７Ｇｅｎｅ２の実
験に用いた（第８図）。
Ｔ７Ｇｅｎｅｌおよび２、そしてｌａｃプロモーターを
集め、以下の手順でｐＡＣＹｏ １８４にクローンし
た（第９および１０図）。ｐ８０４−Ｒ工ｌａｃをＰｖ
ｕ ＩＩおよびＢａｎ ＨＩで分解した。１ａｃｐＯを
含むフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離
した。ｐＲＲ−ＩＴ７−３９χＴｔｈ１１１１により分
解し、その制限部位をクレノー反応で補填した。Ｂａｍ
ＨＩをＴ７Ｇｅｎｅｌを含むフラグメントの除去に用
い１こ。アガロースゲル電気泳動による単離および上述
の如く準備しｒ、、＝ｐ８０４−Ｒ工１ａＣベクターに
ライゲーションした後、えられたプラスミド９をＥ、ｃ
ｏｌｉ Ｄ１２１０ に形質転換した。
集め、以下の手順でｐＡＣＹｏ １８４にクローンし
た（第９および１０図）。ｐ８０４−Ｒ工ｌａｃをＰｖ
ｕ ＩＩおよびＢａｎ ＨＩで分解した。１ａｃｐＯを
含むフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離
した。ｐＲＲ−ＩＴ７−３９χＴｔｈ１１１１により分
解し、その制限部位をクレノー反応で補填した。Ｂａｍ
ＨＩをＴ７Ｇｅｎｅｌを含むフラグメントの除去に用
い１こ。アガロースゲル電気泳動による単離および上述
の如く準備しｒ、、＝ｐ８０４−Ｒ工１ａＣベクターに
ライゲーションした後、えられたプラスミド９をＥ、ｃ
ｏｌｉ Ｄ１２１０ に形質転換した。
ＩＰＴＧ含有寒天プレート上で対照プレートに比較して
成長しないものを探すことによってクローンをまずスク
リーニングし１こ。これらクローンよりｐＲＲ−ｔＴ７
シニ５を単離した（第９図甲〕。
成長しないものを探すことによってクローンをまずスク
リーニングし１こ。これらクローンよりｐＲＲ−ｔＴ７
シニ５を単離した（第９図甲〕。
ｐＲＲ−ＩＴ７１ａｃ ５およびｐＲＲ−９Ｂ−２Ｔ７
をＰｅｔ。
をＰｅｔ。
１およびＢａｍ ＨＩで分解しｆコ。’ｌ’７Ｇｅｎｅ
ｌおよび２を含むフラグメントをアガロースゲル電気泳
動により単離し、−緒にライゲーションさせて、Ｅ
ｃｏｌｉＤ１２１０ に形質転換させた。プラスミドゝ
ＤＮＡのＥｃｏ ＲＩ分解によってクローンをスクリー
ニングした。このスクリーニングより、 ｐＲＲ−ＩＴ
７ Ｇ２ １ａｃ ７が単離された（第９図下）。
ｌおよび２を含むフラグメントをアガロースゲル電気泳
動により単離し、−緒にライゲーションさせて、Ｅ
ｃｏｌｉＤ１２１０ に形質転換させた。プラスミドゝ
ＤＮＡのＥｃｏ ＲＩ分解によってクローンをスクリー
ニングした。このスクリーニングより、 ｐＲＲ−ＩＴ
７ Ｇ２ １ａｃ ７が単離された（第９図下）。
ｌａ（！ ｐｏおよびＴ７Ｇｅｎｅｌおよび２を含むＥ
ｃｏ ＲＩ フラグメント乞ｐＲＲ−Ｉｒ２Ｏ３１ａｃ
７から分解し、ｐＡＣＹＣ１８４のＥｃｏ Ｒ工部位
にクローンした。えられたシラスミドをＥ、ｃｏｌｉ
Ｄ１２１０に形質転換させた。このとき、ｐＡＣＹＣｌ
８４テトラサイクリン耐性マーカーを選択に用いた。
ｃｏ ＲＩ フラグメント乞ｐＲＲ−Ｉｒ２Ｏ３１ａｃ
７から分解し、ｐＡＣＹＣ１８４のＥｃｏ Ｒ工部位
にクローンした。えられたシラスミドをＥ、ｃｏｌｉ
Ｄ１２１０に形質転換させた。このとき、ｐＡＣＹＣｌ
８４テトラサイクリン耐性マーカーを選択に用いた。
そのうちの１つのプラスミド９をｐＡＣ−Ｉｒ２Ｏ３−
７８とした（第１０図）。
７８とした（第１０図）。
Ｔ ７ Ｇｅｎｅ ｌ Ｏプロモーターのクローニン
グＴ７ ＧｅｎθｌＯプロモーターは、少なくとも２
つの遺伝子の合成を制御する強力なプロモーターである
。それらは遺伝子１０Ａおよび１０Ｂであり両方ともＴ
７バクテリオフアージ頭部蛋白をコードする。このプロ
モーターはＥ、ｃｏｌｉ Ｔ７フアージ系においてＴ７
ＲＮＡ ｙｆリメラーゼによってのみにより認識され
る。プロモーターはＴ７ゲノムの２２９０３塩基対に位
置する。この配列は２つのＮｃｉ ■部位によりまとめ
て切り出される（２１８３９塩基対と２３１９２塩基対
）。
グＴ７ ＧｅｎθｌＯプロモーターは、少なくとも２
つの遺伝子の合成を制御する強力なプロモーターである
。それらは遺伝子１０Ａおよび１０Ｂであり両方ともＴ
７バクテリオフアージ頭部蛋白をコードする。このプロ
モーターはＥ、ｃｏｌｉ Ｔ７フアージ系においてＴ７
ＲＮＡ ｙｆリメラーゼによってのみにより認識され
る。プロモーターはＴ７ゲノムの２２９０３塩基対に位
置する。この配列は２つのＮｃｉ ■部位によりまとめ
て切り出される（２１８３９塩基対と２３１９２塩基対
）。
Ｎａ１ｌ酵素をＴ７ゲノムの分解に用いたところ、プロ
モーターを含む１３５３塩基対のフラグメントが得られ
た。アガロースゲル電気泳動による単離後、フラグメン
トをさらにＨ１ｎｃ■ とＮｄｅ■で分解してＴゲノム
の２２６２２塩基対および２２９６４塩基対を切断して
えられる３４２塩基対のフラグメントを得た。Ｎｄｅ
１部位はｇθｎθ１０Ａの２２９６６塩基対のＡＴＧ開
始開始コン８ンむ。この３４２塩基対のフラグメントを
ポリアクリルアミド８ゲル電気泳動により単離し精製し
た後、Ｅｃｏ Ｒ工およびＮｄｅ Ｉで分解しｆこｐＢ
Ｒ３２２Ｋクローンした。Ｅｃｏ ＲＩ部位は、Ｎｄｅ
１反応する前にクレノーフラグメントで補２２９２６
塩基対のＡＴＧコドンの間のＴ７の３４２塩基対のフラ
グメント内に特異的なＸｂａ １部位があることＫより
、 Ｘｂａ ｌにより少量を分解することによってまず
クローンなスクリーニングした。このスクリーニングに
より、ｐＲＲ−Ｔφ１゜−１８が単離された（第１１図
）。
モーターを含む１３５３塩基対のフラグメントが得られ
た。アガロースゲル電気泳動による単離後、フラグメン
トをさらにＨ１ｎｃ■ とＮｄｅ■で分解してＴゲノム
の２２６２２塩基対および２２９６４塩基対を切断して
えられる３４２塩基対のフラグメントを得た。Ｎｄｅ
１部位はｇθｎθ１０Ａの２２９６６塩基対のＡＴＧ開
始開始コン８ンむ。この３４２塩基対のフラグメントを
ポリアクリルアミド８ゲル電気泳動により単離し精製し
た後、Ｅｃｏ Ｒ工およびＮｄｅ Ｉで分解しｆこｐＢ
Ｒ３２２Ｋクローンした。Ｅｃｏ ＲＩ部位は、Ｎｄｅ
１反応する前にクレノーフラグメントで補２２９２６
塩基対のＡＴＧコドンの間のＴ７の３４２塩基対のフラ
グメント内に特異的なＸｂａ １部位があることＫより
、 Ｘｂａ ｌにより少量を分解することによってまず
クローンなスクリーニングした。このスクリーニングに
より、ｐＲＲ−Ｔφ１゜−１８が単離された（第１１図
）。
完全な発現系をテストするため、α−２インターフ屯ロ
ン遺伝子（α−２ＩＦ’Ｎ）を選んだ。Ｔ７Ｇｅｎｅｌ
Ｏプｏ−ｖ−一ターをｐＢＴＩＦ−１３Ｋクローンした
。該プラスミドはＢａｎ Ｈ工／Ｐｖｕ １部位にα−
２ＩＦ’遺伝子をクローンしｒ、＝ｐＢＲ３２２誘導体
である。これは、このプラスミド１のＥｃｏ ＲＩ部位
とＢａｎ ＨＩ部位の間に位置するトリプトファンプロ
モーターの制御下にある。第１２図はクローニングの手
順および集めたフラグメントが図示されている。ｐＲＲ
−Ｔ７φ１０−１８をＮａｅ Ｉで切断し、その部位を
クレノーフラグメントで補填してさらにＰｓｔ ■で分
解を行い、プロモーターを含むフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動で単離した。
ン遺伝子（α−２ＩＦ’Ｎ）を選んだ。Ｔ７Ｇｅｎｅｌ
Ｏプｏ−ｖ−一ターをｐＢＴＩＦ−１３Ｋクローンした
。該プラスミドはＢａｎ Ｈ工／Ｐｖｕ １部位にα−
２ＩＦ’遺伝子をクローンしｒ、＝ｐＢＲ３２２誘導体
である。これは、このプラスミド１のＥｃｏ ＲＩ部位
とＢａｎ ＨＩ部位の間に位置するトリプトファンプロ
モーターの制御下にある。第１２図はクローニングの手
順および集めたフラグメントが図示されている。ｐＲＲ
−Ｔ７φ１０−１８をＮａｅ Ｉで切断し、その部位を
クレノーフラグメントで補填してさらにＰｓｔ ■で分
解を行い、プロモーターを含むフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動で単離した。
ｐＢＴＩＦ−１３をＢａｎ Ｈ工で分解シ、ソノ部位上
ＥＸＯ■を用いて平滑末端にしてアガロースゲル電気泳
動によりα−２ＩＦ’遺伝子を含むフラグメントを単離
した。プロモーターおよびＩＦ遺伝子をライゲーション
し、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０に形質転換した。’ｒ７
Ｇｅｎｅ １０プ（ｆｆモーターとα−２工Ｆ遺伝
子を接合することによって得られた特異的なＸｂａ Ｉ
／Ｂｇｌ ＩＩｌフラグメントスクリーニングすること
により、 ｐＲＲ−、、Ｔφ１０−工Ｆが単離された（
第１２図）。
ＥＸＯ■を用いて平滑末端にしてアガロースゲル電気泳
動によりα−２ＩＦ’遺伝子を含むフラグメントを単離
した。プロモーターおよびＩＦ遺伝子をライゲーション
し、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０に形質転換した。’ｒ７
Ｇｅｎｅ １０プ（ｆｆモーターとα−２工Ｆ遺伝
子を接合することによって得られた特異的なＸｂａ Ｉ
／Ｂｇｌ ＩＩｌフラグメントスクリーニングすること
により、 ｐＲＲ−、、Ｔφ１０−工Ｆが単離された（
第１２図）。
Ｔ７φｌ０ＩＦ フラグメントのｐＡＣＹＣ１８４へ
のクローニング Ｔ７ Ｇｅｎｅ ｌ Ｏプロモーターおよびα−２工Ｆ
遺伝子を含むフラグメントな以下の手順に従ってｐＡＣ
ＹＣ−１８４にクローニングした（第１３図）。
のクローニング Ｔ７ Ｇｅｎｅ ｌ Ｏプロモーターおよびα−２工Ｆ
遺伝子を含むフラグメントな以下の手順に従ってｐＡＣ
ＹＣ−１８４にクローニングした（第１３図）。
このフラグメントを、ｐＲＲ−Ｔ７φ１０工ＦのｐＢＲ
３２２の部分に存在する２つのＲｓａ ■部位により切
断されたものを集めた（もともとはｐＢＲ３２２の２２
８２塩基対から３８４７塩基対に位置する）。
３２２の部分に存在する２つのＲｓａ ■部位により切
断されたものを集めた（もともとはｐＢＲ３２２の２２
８２塩基対から３８４７塩基対に位置する）。
Ｒｓａ ｌで切断するとｐＲＲ−Ｔ７φＩＱ−工Ｆ’は
長さ約１８８０塩基対の平滑末端フラグメントとなる。
長さ約１８８０塩基対の平滑末端フラグメントとなる。
ｐＡＣＹＣ−１８４をＥｃｏ Ｒ工で分解し、クレノー
反応によってその部位を補填し、さらに末端なラン腸管
アルカリホスファターゼで処理した。得られた生成物を
上記単離したＲｓａ （フラグメントに２イゲーシヨン
し、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０に形質転換した。
反応によってその部位を補填し、さらに末端なラン腸管
アルカリホスファターゼで処理した。得られた生成物を
上記単離したＲｓａ （フラグメントに２イゲーシヨン
し、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０に形質転換した。
クローンをＸｂａ Ｉ酵素による制限反応の分析でスク
リーニングした。ｐＡＣＹＣ−１８４はＸｂａ ｌ制限
酵素認識部位を１カ所持っており、Ｒｓａ ■フラグメ
ントのＴ７プロモーター領域中にも１カ所しか存在しな
いので、このスクリーニングを用いると２つのバンドが
見られた。ｐＡＣ−φｌ０ＩＦ’−２を他のクローンと
共に単離した。
リーニングした。ｐＡＣＹＣ−１８４はＸｂａ ｌ制限
酵素認識部位を１カ所持っており、Ｒｓａ ■フラグメ
ントのＴ７プロモーター領域中にも１カ所しか存在しな
いので、このスクリーニングを用いると２つのバンドが
見られた。ｐＡＣ−φｌ０ＩＦ’−２を他のクローンと
共に単離した。
平滑末端のライゲーションをｐＡＣ−φＩＯ工Ｆ−２の
構築に用いたことにより、 Ｒｓａ ｌフラグメントの
方向が２通り可能である。スクリーニングによりいくつ
かのシラスミ白ま一方向を向き、他のプラスミドは他の
方向だった。それゆえ、ｐＡＣ−φ１０工Ｆ−２の方向
ｉ１％Ｘｂａ ｌおよびＢａｍ Ｈ１乞用いる制限酵素
分析を実行することにより決定した。
構築に用いたことにより、 Ｒｓａ ｌフラグメントの
方向が２通り可能である。スクリーニングによりいくつ
かのシラスミ白ま一方向を向き、他のプラスミドは他の
方向だった。それゆえ、ｐＡＣ−φ１０工Ｆ−２の方向
ｉ１％Ｘｂａ ｌおよびＢａｍ Ｈ１乞用いる制限酵素
分析を実行することにより決定した。
Ｔ７−φ１０工Ｆ フラグメントは１文献７に示される
地図に従って時計回りに向いている（第１３図参照）。
地図に従って時計回りに向いている（第１３図参照）。
Ｔ ｖ ａ ＋）メラーゼの発現の分析後（α−２イン
ターフエロンの生成により測定したン、発現の改良−ｉ
ｐＡｃＩＴ７Ｇ２−７８のＥｃｏ Ｒ工’ｒ７ Ｇｅ
ｎｅ １と２のフラグメントを酵素Ｂａ１３１で処理す
ることによって行った（第１４図）。ｐＴ７−１３由来
のクローンされたＴ７ ＤＮＡからのｌａｃ ｐｏ
要素を分離しｒ、＝ｐＢＲ３２２ＤＮＡ を、Ｂａｌ
３１反応で調整することにより、相当層を除去した。そ
の結果。
ターフエロンの生成により測定したン、発現の改良−ｉ
ｐＡｃＩＴ７Ｇ２−７８のＥｃｏ Ｒ工’ｒ７ Ｇｅ
ｎｅ １と２のフラグメントを酵素Ｂａ１３１で処理す
ることによって行った（第１４図）。ｐＴ７−１３由来
のクローンされたＴ７ ＤＮＡからのｌａｃ ｐｏ
要素を分離しｒ、＝ｐＢＲ３２２ＤＮＡ を、Ｂａｌ
３１反応で調整することにより、相当層を除去した。そ
の結果。
３０分後に約４００塩基対のＤＮＡ フラグメントの両
端を除去した。試料を５分ごとに取り、この方法でフラ
グメントの両分を作った。ＤＮＡ精製の後、フラグメン
トｕＢａｍＨＩで分解した。
端を除去した。試料を５分ごとに取り、この方法でフラ
グメントの両分を作った。ＤＮＡ精製の後、フラグメン
トｕＢａｍＨＩで分解した。
ｐ８０４−ＲＩ ｌａｃ ｔｌ Ｐｖｕ■およびＢａｍ
ＨＩで分解することによってクローニング（フタ−を
得た。長さの異なる平滑末端化したフラグメントの全画
分をｌａｃプロモーターと納会した。ライゲーションし
た画分？＜Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄ１２１０に形質転換した。
ＨＩで分解することによってクローニング（フタ−を
得た。長さの異なる平滑末端化したフラグメントの全画
分をｌａｃプロモーターと納会した。ライゲーションし
た画分？＜Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄ１２１０に形質転換した。
Ｘｍｎ ｌおよびＥｃｏ ＲＩの分解によってクローン
なスクリーニングした。Ｘｍｎ ｌ制限酵素認識部位は
Ｔ７ ｆ［Ａ 、ｔ’？リメラーゼのＡ ＴＧの後の
２８塩基対の位置に存在する。それゆえ、ｌａｃ ｐｏ
のＢａ１３１分画のライゲーションにより得、られたＥ
ｃｏ Ｒ工／Ｘ闘Ｉフラグメントは、 Ｂａｌ ３１酵
素による 分解のため様々な鎖長になっている。５３０
塩基対から２６０塩基対にわたるフラグメントの長さに
よりクローンを分類した。クローンはスクリーニングの
回数に従ってデザインされたｐＲＲＢである。
なスクリーニングした。Ｘｍｎ ｌ制限酵素認識部位は
Ｔ７ ｆ［Ａ 、ｔ’？リメラーゼのＡ ＴＧの後の
２８塩基対の位置に存在する。それゆえ、ｌａｃ ｐｏ
のＢａ１３１分画のライゲーションにより得、られたＥ
ｃｏ Ｒ工／Ｘ闘Ｉフラグメントは、 Ｂａｌ ３１酵
素による 分解のため様々な鎖長になっている。５３０
塩基対から２６０塩基対にわたるフラグメントの長さに
よりクローンを分類した。クローンはスクリーニングの
回数に従ってデザインされたｐＲＲＢである。
異なる鎖長を有するＥｃｏ ＲＩ／Ｘｍｎ Ｉフラグメ
ントの１２のクローンをｐＡＣ−φｉｏ工Ｆ（第１３図
）と共に形質転換し、工ＰＴＧ誘導下でのα−２インタ
ーフエロン生産を調べた。表１にみられる結果は、ｐＲ
ＲＢ２Ｑ ｇもつ株による、ＩＰＴＧ により誘導可能
なα−２インターフエロンの生産を示す。誘導のない培
養ではインターフェロン活性の顕著な増大はみられない
が、工ＰＴＧで誘導される培養では６時間後にインター
フェロン活性が顕著に増大した。Ｂａ１３１分解によっ
て除去されるヌクレオチドの数を決定するために、ｌａ
ｃ ｐｏ領領域おけるＥｃｏ Ｒ工部位からＴ７ｙｔ？
リメラーゼ遺伝子のＡＴＧ ’開始コビン下流２８塩基
対に位置す７５Ｘｍｒｓ １部位に至るヌクレオチビ配
列を表わすＥｃｏ ＲＩ／Ｘｍｎ Ｉフラグメントの塩
基配列を決定した。ｐＢＲ３２２ＤＮＡ に介在する２
２１９塩基対から２１９６塩基をＢａ１３１ により
除去することによってこれを決定した。それゆえｐＲＲ
Ｂ２０造成におけるＴ７Ｄ、ＮＡ 由来の、二部、プロ
モーターを分離したｐＢＲ３２２の配列は、ｐＢＲ３２
２配列の２１９７塩基対から２０６７塩基対に相当する
。
ントの１２のクローンをｐＡＣ−φｉｏ工Ｆ（第１３図
）と共に形質転換し、工ＰＴＧ誘導下でのα−２インタ
ーフエロン生産を調べた。表１にみられる結果は、ｐＲ
ＲＢ２Ｑ ｇもつ株による、ＩＰＴＧ により誘導可能
なα−２インターフエロンの生産を示す。誘導のない培
養ではインターフェロン活性の顕著な増大はみられない
が、工ＰＴＧで誘導される培養では６時間後にインター
フェロン活性が顕著に増大した。Ｂａ１３１分解によっ
て除去されるヌクレオチドの数を決定するために、ｌａ
ｃ ｐｏ領領域おけるＥｃｏ Ｒ工部位からＴ７ｙｔ？
リメラーゼ遺伝子のＡＴＧ ’開始コビン下流２８塩基
対に位置す７５Ｘｍｒｓ １部位に至るヌクレオチビ配
列を表わすＥｃｏ ＲＩ／Ｘｍｎ Ｉフラグメントの塩
基配列を決定した。ｐＢＲ３２２ＤＮＡ に介在する２
２１９塩基対から２１９６塩基をＢａ１３１ により
除去することによってこれを決定した。それゆえｐＲＲ
Ｂ２０造成におけるＴ７Ｄ、ＮＡ 由来の、二部、プロ
モーターを分離したｐＢＲ３２２の配列は、ｐＢＲ３２
２配列の２１９７塩基対から２０６７塩基対に相当する
。
ｐＲＲＢ２０ Ｙ Ｈｉｎａ ｌで分解し、その部位を
クレノー酵素で補填した。ＤＮＡ をエタノール沈殿し
、適当なバッファーに再懸濁して、ウシ腸管アルカリホ
スファターゼで処理した。得られたＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動により単離した。ｐＲＲ−’ｒ７φ１０−
ＩＦ ｆ Ｒｓａ ｌで分解し、Ｔ７遺伝子１０プロ
モーターとα−２インターフェロンヲ含むフラグメント
をアガロースゲル電気泳動により単離した。このフラグ
メントな、上記の如く調装したｐＲＲＢ ２０ シラ
スミドとライゲーションし、Ｅ、ｃｏｌｉＤ１２１０
に形質転換した。クローンしたプラスミド”ＤＮＡ標品
”＜Ｘｍｎ ■により分解してスクリーニングした。１
回目のスクリーニング後、クローンなＴ７プロモーター
中の特異的な部位をＸｂａ ｌで分解しまたＴ７ Ｒ
ＮＡ 、ｙ＋）メラーゼ遺伝子中の特異的な部位なＮ
ａｅ ｌで分解することにより造成を確かめ、方向を決
定した。この研究より、株ｐＲＲＢ２０ＩＦ’−２３を
原形（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）として選択した。
クレノー酵素で補填した。ＤＮＡ をエタノール沈殿し
、適当なバッファーに再懸濁して、ウシ腸管アルカリホ
スファターゼで処理した。得られたＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動により単離した。ｐＲＲ−’ｒ７φ１０−
ＩＦ ｆ Ｒｓａ ｌで分解し、Ｔ７遺伝子１０プロ
モーターとα−２インターフェロンヲ含むフラグメント
をアガロースゲル電気泳動により単離した。このフラグ
メントな、上記の如く調装したｐＲＲＢ ２０ シラ
スミドとライゲーションし、Ｅ、ｃｏｌｉＤ１２１０
に形質転換した。クローンしたプラスミド”ＤＮＡ標品
”＜Ｘｍｎ ■により分解してスクリーニングした。１
回目のスクリーニング後、クローンなＴ７プロモーター
中の特異的な部位をＸｂａ ｌで分解しまたＴ７ Ｒ
ＮＡ 、ｙ＋）メラーゼ遺伝子中の特異的な部位なＮ
ａｅ ｌで分解することにより造成を確かめ、方向を決
定した。この研究より、株ｐＲＲＢ２０ＩＦ’−２３を
原形（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）として選択した。
系の試験
ｐＲＲＢ−２０工Ｆ−２３馨Ｅ、ｃｏｘｉ ＲＢ７９１
およびＥ、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０ Ｋ形質転換した。両
方の株とも染色体上にｌａｃ工ｑ工具変異つ。誘導実験
を実験方法の項のシングルプラスミビシステムについて
記載した方法に従って行った。細胞ｔ３０℃でＭ胞濃度
クレット２００まで増殖させ、次に工ＰＴＧ最藉濃度５
ｍＭ で誘導した。このとき、培養温度を３７℃に上
昇させ残る実験を行った。１ｍｇの試料を３本、２時お
きに取り一晩の連続培養の後に最後のサンプルを採取し
た（誘導後、約π時間）。
およびＥ、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０ Ｋ形質転換した。両
方の株とも染色体上にｌａｃ工ｑ工具変異つ。誘導実験
を実験方法の項のシングルプラスミビシステムについて
記載した方法に従って行った。細胞ｔ３０℃でＭ胞濃度
クレット２００まで増殖させ、次に工ＰＴＧ最藉濃度５
ｍＭ で誘導した。このとき、培養温度を３７℃に上
昇させ残る実験を行った。１ｍｇの試料を３本、２時お
きに取り一晩の連続培養の後に最後のサンプルを採取し
た（誘導後、約π時間）。
表２は各法に対する実験の典型的な結果を示す。
結果は、ＩＰＴＧで誘導された細胞中でα−２インター
フエロンが徐々に蓄積することを示す。
フエロンが徐々に蓄積することを示す。
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０宿主沫で３８倍、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ ＲＢ７９１宿主株で３０倍もの違いがあった。
ｉ ＲＢ７９１宿主株で３０倍もの違いがあった。
シングルプラスミドゝシステムの融通性および種々の納
会と遺伝子の方向性におレナろ種々の要素の有用性がｐ
ＲＲＢ２０ｃクローンの造成により示され１こ。
会と遺伝子の方向性におレナろ種々の要素の有用性がｐ
ＲＲＢ２０ｃクローンの造成により示され１こ。
第１６図は、１）ＲＲＢ２０ンＩＦ’−２３とｐＫＧ−
２そして雑種ｃＱｐｔ８クローーングベクターがどのよ
うにして酵素Ａｈａ ｉｌおよび次いでＥｃｏ ＲＩに
より切断されるかを示しｋものである。ｐＲＲＢ２０工
Ｆ−２３より、ｌａｃ ｐｏおよびＴ７ Ｇｏｎｅ
１発現系を含むＤＮＡ フラグメンドナアガロースゲル
電気泳動により単離し、ｐＫＧ−２より複製開始点およ
びテトラサイクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ フラグメ
ント乞アガロースゲル電気泳動によって単離しｒこ。適
当なり Ｎ Ａ フラグメントをライゲーションしてＥ
、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０にライゲーション混合物と共に
形質転換し１こ後、クローンを単離し、酵素Ｂａｍ Ｈ
ＴでプラスミドＤＮＡを分解することによりクローンの
スクリーニングを行った。相関しｙ、ｚＥ、ｃｏ１１Ｄ
１２１０／ｐＲＲＢ２ Ｑｃはさらに、Ａｈａ Ｉ［ｌ
、ＡｖａＩ−Ｅｃｏ ＲＩ 、Ｋｐ工 によりその特
性が調べられた（第１６図）。
２そして雑種ｃＱｐｔ８クローーングベクターがどのよ
うにして酵素Ａｈａ ｉｌおよび次いでＥｃｏ ＲＩに
より切断されるかを示しｋものである。ｐＲＲＢ２０工
Ｆ−２３より、ｌａｃ ｐｏおよびＴ７ Ｇｏｎｅ
１発現系を含むＤＮＡ フラグメンドナアガロースゲル
電気泳動により単離し、ｐＫＧ−２より複製開始点およ
びテトラサイクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ フラグメ
ント乞アガロースゲル電気泳動によって単離しｒこ。適
当なり Ｎ Ａ フラグメントをライゲーションしてＥ
、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０にライゲーション混合物と共に
形質転換し１こ後、クローンを単離し、酵素Ｂａｍ Ｈ
ＴでプラスミドＤＮＡを分解することによりクローンの
スクリーニングを行った。相関しｙ、ｚＥ、ｃｏ１１Ｄ
１２１０／ｐＲＲＢ２ Ｑｃはさらに、Ａｈａ Ｉ［ｌ
、ＡｖａＩ−Ｅｃｏ ＲＩ 、Ｋｐ工 によりその特
性が調べられた（第１６図）。
Ｔ７φ１０ の異種遺伝子を含む平滑末端のＤＮＡフ
ラグメントは、単一のＡｈａ ｌ制限部位（平滑末端の
制限竹片〕にクローンすることができ、その結果、５′
から３′への読みとり方向が２つの任意の方向性を有す
るクローン乞得ろる可能性がある。これン示すため、ｐ
ＲＲ２０１Ｆ’−２３をＡｈａ ｌ［で切断し、Ｔ７遺
伝子１０プロモーターおよびα−２インターフェロン遺
伝子乞含むフラグメントをアガロースゲル電気泳動によ
り単離した。ｐＲＲＢ２０ＣをＡｈａ ［１で分１゜ 解し、ウシ腸管アルカリホスファターゼ処理した。Ｔ７
プロモーターおよびインターフェロン遺伝子を含むフラ
グメントをｐＲＲＢ２０Ｃベクターにライゲーションし
、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０ に形質転換した。スク
リーニングしたクローンより、各方向性を有する数種の
クローン、すなわち、ｌ１１７Ｇｅｎｅ転写の５′から
３′への方向と同じあるいは反対の方向性乞有するクロ
ーンが単離された。その方向はＡｖａ ｌ／Ａａｔ Ｉ
Ｉ制限フラグメントの大きさにより同定した。各々の方
向性を有する２つのクローンをフラスコで培養し、Ｔ７
−ＲＮＡポリメラーゼによるα−２インターフエロンの
生産を示すためＩＰＴＧで誘導した。クローンｐＲＲＢ
２０ＣＩＰ−２は、ｌａｃ ｐｏおよびＴ７ Ｇｅｎｅ
１配列と５′から３′への読み取り方向が同じ方向
性ケ有するＴ７ Ｇｅｎｅ １０およびα−２−ＩＦ’
Ｎ遺伝子配列をもつ。クローンｐＲＲＢ ２０ＣＩＦ’
−１１は方向性が互いに逆な２つの遺伝子を有している
（第１６図）。これら２つの培養物の誘導の手順は、最
初の温度を３０℃から３７℃に変えた以外はｐＲＲ２０
工Ｆ−２３クローンで用いた場合と同じである。温度７
ＩＰＴＧによる誘導時に４２℃で１時間おき、以後３
７°に戻して培養した。これば、プラスミド８のコピー
数が極めて多いためにプラスミドの複製開始点（第１６
図）が、温度上昇で細胞が致死的な、温度感受性ｃｏｐ
−変異〔ハークカート（Ｈａａｋｋａａｒｔ）ら〕だか
らである。表３の結果にみもれる通り、このプラスミド
の系はいずれの方向にも誘導可能である。ｐＲＲ２０ｃ
ＩＦ−２中−のプロモーターがすべて５′から３７方向
であるという事実は、このシングルプラスミドシステム
における誘導性あるいは安定性に影響しない。
ラグメントは、単一のＡｈａ ｌ制限部位（平滑末端の
制限竹片〕にクローンすることができ、その結果、５′
から３′への読みとり方向が２つの任意の方向性を有す
るクローン乞得ろる可能性がある。これン示すため、ｐ
ＲＲ２０１Ｆ’−２３をＡｈａ ｌ［で切断し、Ｔ７遺
伝子１０プロモーターおよびα−２インターフェロン遺
伝子乞含むフラグメントをアガロースゲル電気泳動によ
り単離した。ｐＲＲＢ２０ＣをＡｈａ ［１で分１゜ 解し、ウシ腸管アルカリホスファターゼ処理した。Ｔ７
プロモーターおよびインターフェロン遺伝子を含むフラ
グメントをｐＲＲＢ２０Ｃベクターにライゲーションし
、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０ に形質転換した。スク
リーニングしたクローンより、各方向性を有する数種の
クローン、すなわち、ｌ１１７Ｇｅｎｅ転写の５′から
３′への方向と同じあるいは反対の方向性乞有するクロ
ーンが単離された。その方向はＡｖａ ｌ／Ａａｔ Ｉ
Ｉ制限フラグメントの大きさにより同定した。各々の方
向性を有する２つのクローンをフラスコで培養し、Ｔ７
−ＲＮＡポリメラーゼによるα−２インターフエロンの
生産を示すためＩＰＴＧで誘導した。クローンｐＲＲＢ
２０ＣＩＰ−２は、ｌａｃ ｐｏおよびＴ７ Ｇｅｎｅ
１配列と５′から３′への読み取り方向が同じ方向
性ケ有するＴ７ Ｇｅｎｅ １０およびα−２−ＩＦ’
Ｎ遺伝子配列をもつ。クローンｐＲＲＢ ２０ＣＩＦ’
−１１は方向性が互いに逆な２つの遺伝子を有している
（第１６図）。これら２つの培養物の誘導の手順は、最
初の温度を３０℃から３７℃に変えた以外はｐＲＲ２０
工Ｆ−２３クローンで用いた場合と同じである。温度７
ＩＰＴＧによる誘導時に４２℃で１時間おき、以後３
７°に戻して培養した。これば、プラスミド８のコピー
数が極めて多いためにプラスミドの複製開始点（第１６
図）が、温度上昇で細胞が致死的な、温度感受性ｃｏｐ
−変異〔ハークカート（Ｈａａｋｋａａｒｔ）ら〕だか
らである。表３の結果にみもれる通り、このプラスミド
の系はいずれの方向にも誘導可能である。ｐＲＲ２０ｃ
ＩＦ−２中−のプロモーターがすべて５′から３７方向
であるという事実は、このシングルプラスミドシステム
における誘導性あるいは安定性に影響しない。
Ｅ ｃｏｌｌ ＲＮＡ 、＋？！Ｊ メラーセＩｃ
ヨル％ｘ写ｆ）Ｈ始はりファンピシンに対し極めて感受
性が高い。
ヨル％ｘ写ｆ）Ｈ始はりファンピシンに対し極めて感受
性が高い。
しかしながら、その構造および性質が異なるＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼは、リファンピシン存在下でも、Ｔ７プ
ロモーターからの転写を開始させることができる。シラ
スミドｐＲＲＢ２０工Ｆ−２３を含むＥ、ｃｏｌ−ｉ
Ｄ１２１０株を３０℃で細胞濃度がクレット２００にな
るまで成長させ、最終濃度２ｍＭのＩＰＴＧで誘導した
。このとき培養温度を３７℃に上昇させ残る実験を行っ
た。リファンピシン（１００μ９７ｍ１り ｔｆ：ＩＰ
ＴＧで誘導した。１，５、５．６時間後に添加した。１
ｒｕｇ試料３本を１．５時間ごとに分取し、ＩＦＮ活
性を調べた。第１７図はこの実験の結果を示すものであ
る。リファンピシンを誘導時に添加し１こ場合、インタ
ーフェロンの生産は見られなかつ１こ。しかしながらリ
ファンピシンを５．６時間後に加えた場合、連続的に高
いレベルでＩＦＮ 合成がみられた。リファンピシン添
加後の工Ｆ’Ｎ生産の絶対的なレベルの違いはＴ７
ＲＮＡポリメラーゼの濃度が誘導後食なくとも６時間後
で徐々に増大することを示している。
ポリメラーゼは、リファンピシン存在下でも、Ｔ７プ
ロモーターからの転写を開始させることができる。シラ
スミドｐＲＲＢ２０工Ｆ−２３を含むＥ、ｃｏｌ−ｉ
Ｄ１２１０株を３０℃で細胞濃度がクレット２００にな
るまで成長させ、最終濃度２ｍＭのＩＰＴＧで誘導した
。このとき培養温度を３７℃に上昇させ残る実験を行っ
た。リファンピシン（１００μ９７ｍ１り ｔｆ：ＩＰ
ＴＧで誘導した。１，５、５．６時間後に添加した。１
ｒｕｇ試料３本を１．５時間ごとに分取し、ＩＦＮ活
性を調べた。第１７図はこの実験の結果を示すものであ
る。リファンピシンを誘導時に添加し１こ場合、インタ
ーフェロンの生産は見られなかつ１こ。しかしながらリ
ファンピシンを５．６時間後に加えた場合、連続的に高
いレベルでＩＦＮ 合成がみられた。リファンピシン添
加後の工Ｆ’Ｎ生産の絶対的なレベルの違いはＴ７
ＲＮＡポリメラーゼの濃度が誘導後食なくとも６時間後
で徐々に増大することを示している。
これらの条件下で、これらの細胞はα−２インターフエ
ロンのみを生産する。とい５のは、リファンピシンは、
Ｅ ｃｏｌｉ ＲＮＡ ポリメラーゼ依存的なすべ
ての転写を阻害するからである。結局、これら細胞内で
転写される唯一のｍＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
により方向づけもれたものである。リファンピシンはｓ
通常、 Ｔ ７ Ｇｅｎｅ ２の作用を模倣する。
ロンのみを生産する。とい５のは、リファンピシンは、
Ｅ ｃｏｌｉ ＲＮＡ ポリメラーゼ依存的なすべ
ての転写を阻害するからである。結局、これら細胞内で
転写される唯一のｍＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
により方向づけもれたものである。リファンピシンはｓ
通常、 Ｔ ７ Ｇｅｎｅ ２の作用を模倣する。
Ｔ７ ０θｎθ２０そういった系へのとりこみは本質的
には同じ結果を与える。
には同じ結果を与える。
Ｇｅｎｅ ２によってコート９された蛋白にＥ、ｃｏｌ
ｉＲＮＡ、１′？リメラーゼが結合するとこれを不活性
化し、全ての宿主転写乞停止させる。しかしながら、Ｇ
ｅｎｅ ２蛋白に非感受性なＴ７ ＲＮＡ ｔｄリメ
ラーゼは、宿主の機能が消耗するまで転写を続けつるも
のである。この系は従って、高濃度で異質なポリハプチ
ト９を生産する能力を持っている。
ｉＲＮＡ、１′？リメラーゼが結合するとこれを不活性
化し、全ての宿主転写乞停止させる。しかしながら、Ｇ
ｅｎｅ ２蛋白に非感受性なＴ７ ＲＮＡ ｔｄリメ
ラーゼは、宿主の機能が消耗するまで転写を続けつるも
のである。この系は従って、高濃度で異質なポリハプチ
ト９を生産する能力を持っている。
フタ−の造成
Ｔ７ Ｇｅｎｅ ｌ Ｏプロモーター近傍の異種遺伝
子のクローニングを容易にするため、プロモーターをｐ
ＭＴｔｌｓにクローンした。その結果、このプラスミド
のポリリンカーＤＮＡ／＋；Ｔ７プロモーターの直接下
流に位置した。ｐＭＴＩｔｓ（Ｈ，ハング（Ｈｕａｎｇ
）、Ｋ、Ａ−ア（Ｍｏｏｒｅ）、ＤＮＡＸ Ｒｃｓ。
子のクローニングを容易にするため、プロモーターをｐ
ＭＴｔｌｓにクローンした。その結果、このプラスミド
のポリリンカーＤＮＡ／＋；Ｔ７プロモーターの直接下
流に位置した。ｐＭＴＩｔｓ（Ｈ，ハング（Ｈｕａｎｇ
）、Ｋ、Ａ−ア（Ｍｏｏｒｅ）、ＤＮＡＸ Ｒｃｓ。
工ｎｓｔ、、私信〕は一般的なりローニングばフタ−で
あり、以下の制限酵素の認識配列をもつ。それらはすな
わち、Ｅｃｏ ＲＩ、 Ｓｍａ ｌ 、 Ｂａｎ Ｈ
Ｉ。
あり、以下の制限酵素の認識配列をもつ。それらはすな
わち、Ｅｃｏ ＲＩ、 Ｓｍａ ｌ 、 Ｂａｎ Ｈ
Ｉ。
Ｓａｌ ｌ、Ｐｓｔ Ｉ、 Ｂｇｌ １１、Ｘｂ
ａ ｌそしてＨｉｎｄ ［１である。ｐＲＲＴ ７φ１
０−１８（第１７図）をＮａｅ １で分解した。この部
位をクレノー反応で補填し、直鎖状ＤＮＡ Ｖアガロー
ス電気泳動により単離した。この単離しＬ直鎖ＤＮＡ
−ｔさらに酵素Ｐｖｕ ■で分解し、 ’ｒ７ Ｇｅ
ｎｅ １０プロモーターとアンピシリン耐性遺伝子の部
分的な配列を含むフラグメントケアガロ−スゲルミ気泳
動により単離した。
ａ ｌそしてＨｉｎｄ ［１である。ｐＲＲＴ ７φ１
０−１８（第１７図）をＮａｅ １で分解した。この部
位をクレノー反応で補填し、直鎖状ＤＮＡ Ｖアガロー
ス電気泳動により単離した。この単離しＬ直鎖ＤＮＡ
−ｔさらに酵素Ｐｖｕ ■で分解し、 ’ｒ７ Ｇｅ
ｎｅ １０プロモーターとアンピシリン耐性遺伝子の部
分的な配列を含むフラグメントケアガロ−スゲルミ気泳
動により単離した。
ｐＭＴｌｌｓ Ｙ Ｅｃｏ ＲＩで分解し、酵素Ｅｘｏ
■で処理して直鎖状にしたＤＮＡ ｉアガロースゲル電
気泳動により単離した。次にこのフラグメントンＰｖｕ
ｌで分解した。ポリリンカー配列を含む大きなフラグ
メントは複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子の３
′側を含む。これｔアガロースゲル電気泳動により単離
しＬ０次にこれら２つのフラグメント乞−緒にライゲー
ションし、 Ｅ、ｃｏｌｉ２９４に形質転換した。用い
た選択はアンピシリン耐性遺伝子の再生である。 −
゛ ゛−千井モ簀亨を千ｐＲＲＴ７φ１０−１８ Ｄ
ＮＡ に特異的な部位で切断するＸｍｎ ＩおよびｐＭ
ＴｌｌｓＤＮＡに特異的な部位で切断するＨｉｎｄ ｍ
でプラスミ）ＤＮＡ １分解することにより、スクリー
ニングを行った。このスクリーニングによりプラスミド
ｐＲＲＴ７φ１０−Ｘｕ２が得られた（第１８図）。
■で処理して直鎖状にしたＤＮＡ ｉアガロースゲル電
気泳動により単離した。次にこのフラグメントンＰｖｕ
ｌで分解した。ポリリンカー配列を含む大きなフラグ
メントは複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子の３
′側を含む。これｔアガロースゲル電気泳動により単離
しＬ０次にこれら２つのフラグメント乞−緒にライゲー
ションし、 Ｅ、ｃｏｌｉ２９４に形質転換した。用い
た選択はアンピシリン耐性遺伝子の再生である。 −
゛ ゛−千井モ簀亨を千ｐＲＲＴ７φ１０−１８ Ｄ
ＮＡ に特異的な部位で切断するＸｍｎ ＩおよびｐＭ
ＴｌｌｓＤＮＡに特異的な部位で切断するＨｉｎｄ ｍ
でプラスミ）ＤＮＡ １分解することにより、スクリー
ニングを行った。このスクリーニングによりプラスミド
ｐＲＲＴ７φ１０−Ｘｕ２が得られた（第１８図）。
子の発現
ネズミα−２インターフェロン遺伝子乞標準的な方法、
例えばそれを含むプラスミドを分解することにより（シ
ョー（Ｓｈａｗ）ら、１９８３）得た。
例えばそれを含むプラスミドを分解することにより（シ
ョー（Ｓｈａｗ）ら、１９８３）得た。
ｐＴＲＧ３０５−１ と称するプラスミド〔Ｒ，グリ
ーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）、シェリング社〕
を酵素Ａｖａ １とＥｃｏ ＲＩで分解し、クレノー
反応によって得り。
ーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）、シェリング社〕
を酵素Ａｖａ １とＥｃｏ ＲＩで分解し、クレノー
反応によって得り。
ネズミα−２インターフェロン遺伝子領域を含むＤＮＡ
７．−約１５５０塩基対のフラグメントとしてアガロ
ースゲル電気泳動により単離した。ｐＲＲＴ７φ−Ｘｕ
２をＳｍａ Ｉで分解し、ウシ腸管アルカリホスファタ
ーゼ処理した。直鎖状ＤＮＡ乞アガロースゲル電気泳動
によって単離した。マウスα−２インター７エロ／を含
むＤＮＡ フラグメントをこのＤＮＡ とライゲーショ
ンし、Ｂ、ｃｏｌｉ ２９４に形質転換した。クローン
したプラスミドＤＮＡｙ酵素ＢｇＩＵで分解することに
よりスクリーニングした。アガロースゲル電気泳動で観
察される７ラグメ／トの大きさより、ネズミα−２イン
ターフェロン遺伝子および’ｒ７ Ｇｅｎｅ １０プ
ロモーターに関する遺伝子の方向性乞確認し１こ。ｐＲ
ＲＴ７φ１〇−Ｍ（１２）−１ をこうして同定した（
第１９図）。
７．−約１５５０塩基対のフラグメントとしてアガロ
ースゲル電気泳動により単離した。ｐＲＲＴ７φ−Ｘｕ
２をＳｍａ Ｉで分解し、ウシ腸管アルカリホスファタ
ーゼ処理した。直鎖状ＤＮＡ乞アガロースゲル電気泳動
によって単離した。マウスα−２インター７エロ／を含
むＤＮＡ フラグメントをこのＤＮＡ とライゲーショ
ンし、Ｂ、ｃｏｌｉ ２９４に形質転換した。クローン
したプラスミドＤＮＡｙ酵素ＢｇＩＵで分解することに
よりスクリーニングした。アガロースゲル電気泳動で観
察される７ラグメ／トの大きさより、ネズミα−２イン
ターフェロン遺伝子および’ｒ７ Ｇｅｎｅ １０プ
ロモーターに関する遺伝子の方向性乞確認し１こ。ｐＲ
ＲＴ７φ１〇−Ｍ（１２）−１ をこうして同定した（
第１９図）。
ｐＲＲＢ２０ トｐＲＲＴφ１０−２−１ を酵素Ｃ１
ａ ｌおよびＨｉｎｄ ｉｌｌで分解した。ｐＲＲＢ２
ｏ をさらにウシｍ管アルカリホスファターゼ処理した
。適当な長さのフラグメントな次にアガロースゲルで単
離し、得られたＤＮＡ −ｉライゲーションして１１．
ｃｏｌｉＤ１２１０ に形質転換しｒこ。クローン７（
Ｃｘａｌ およびＨｉｎｄ ［１で分解することによ
りスクリーニングし、１７００塩基対のフラグメントを
生じるクローンを以後の実験に用いるため選択した。ネ
ズミα−２インターフェロン遺伝子の発現試験用に選ば
れたクローンはｐＲＲＢ−２０Ｍ工Ｆ−２１５ と命名
しｙ、＝（第２１図）。工ＰＴＧの誘導下、このクロー
ンはネズミα−２インターフェロンを約６００００ユニ
ツト／ ｒｒｔｌｌで生産した。
ａ ｌおよびＨｉｎｄ ｉｌｌで分解した。ｐＲＲＢ２
ｏ をさらにウシｍ管アルカリホスファターゼ処理した
。適当な長さのフラグメントな次にアガロースゲルで単
離し、得られたＤＮＡ −ｉライゲーションして１１．
ｃｏｌｉＤ１２１０ に形質転換しｒこ。クローン７（
Ｃｘａｌ およびＨｉｎｄ ［１で分解することによ
りスクリーニングし、１７００塩基対のフラグメントを
生じるクローンを以後の実験に用いるため選択した。ネ
ズミα−２インターフェロン遺伝子の発現試験用に選ば
れたクローンはｐＲＲＢ−２０Ｍ工Ｆ−２１５ と命名
しｙ、＝（第２１図）。工ＰＴＧの誘導下、このクロー
ンはネズミα−２インターフェロンを約６００００ユニ
ツト／ ｒｒｔｌｌで生産した。
２、Ｔ７φ１０制御下でのネズミエＬ−３遺伝子のクロ
ーニング ネズミインターロイキ：ｙ−３（ＩＬ−３）遺伝子は標
準的な方法により〔ヨコタ（Ｙｏｚｋｏｔａ）ら、１９
８４）単離でき、次いでネズミα−２１Ｆ’Ｎ遺伝子の
手順と本質的には同じ様にして、ｐＲＲＢ２０にクロー
ンした。我々ば、ｐＴＲＰ−Ｃ１ｌ と称するプラス
ミド實Ｇ、ツラウスキ（Ｚｕｒａｗｓｋｉ）により恵与
、ＤＮＡＸ研究所、パロオート（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）
、カリフォルニア３ｆＣ１ａＩで分解し、その部位をク
レノー酵素で埋め、さらにＨｉｎａ ［１制限酵素で分
解することによってネズミエＬ−３遺伝子を含む４７０
塩基対の７ラグメ／トを得た。該ネズミエＬ−３遺伝子
を含むフラグメントな次いであらかじめＳｍａ Ｉおよ
びＨｉｎａ ＩＩＩで切断しておいたｐＲＲφ１０−Ｘ
Ｕ２ ＶＣりＣ”−ンＬｒ、：。Ｔ７ ＤＮＡ 断
片中に切断部位を有するＣｘａ Ｉおよび工Ｌ−３ＤＮ
Ａフラグメントの３′末端に位置するＮｃｏ ■によっ
て分解することによってクローンをスクリーニングした
。このスクリーニングより、ｐＲＲφ１０−工Ｌ−３１
が単離され、その特性が調べられた（第２０図）、Ｔ７
Ｇｅｎｅブｏ モー ターオＪ：びＩＬ−３ＤＮＡ
ｔ、、（含むフラグメントを次に、上述したネズミα
−２インターフェロン遺伝子に用いたのと同じ方法で（
各プラスミドのＣ１ａ ｉ／Ｈｉｎａ ［１切断を結合
し、アガロースゲル電気泳動で適当な直鎖ＤＮＡを単離
し、ｐＲＲＢ２０ ＜フタ−にＴ７φ１０−工Ｌ−３遺
伝子フラグメントをライゲーションしてこれ乞Ｅ、ｃｏ
ｌｉ Ｄ １２１０ 形質転換することにより）、ｐＲ
ＲＢｚｏｖｃクローンした。制限酵素Ｎｃｏ ＩとＢａ
ｍ ＨＩでゲラスミ）’ＤＮＡを分解することによって
単離したクローン乞スクリーニングした。ｐＲＲ２０Ｉ
Ｌ−３３を含むクローンをこのスクリーニングから単離
した（第２１図）。発現ばこのクローンの誘導しγこ培
養物を溶菌させ、その生成物７ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミド９ゲルで分析することにより確認した。ネズミＩＬ
−３の分子量に相当するバンドが観察された。
ーニング ネズミインターロイキ：ｙ−３（ＩＬ−３）遺伝子は標
準的な方法により〔ヨコタ（Ｙｏｚｋｏｔａ）ら、１９
８４）単離でき、次いでネズミα−２１Ｆ’Ｎ遺伝子の
手順と本質的には同じ様にして、ｐＲＲＢ２０にクロー
ンした。我々ば、ｐＴＲＰ−Ｃ１ｌ と称するプラス
ミド實Ｇ、ツラウスキ（Ｚｕｒａｗｓｋｉ）により恵与
、ＤＮＡＸ研究所、パロオート（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）
、カリフォルニア３ｆＣ１ａＩで分解し、その部位をク
レノー酵素で埋め、さらにＨｉｎａ ［１制限酵素で分
解することによってネズミエＬ−３遺伝子を含む４７０
塩基対の７ラグメ／トを得た。該ネズミエＬ−３遺伝子
を含むフラグメントな次いであらかじめＳｍａ Ｉおよ
びＨｉｎａ ＩＩＩで切断しておいたｐＲＲφ１０−Ｘ
Ｕ２ ＶＣりＣ”−ンＬｒ、：。Ｔ７ ＤＮＡ 断
片中に切断部位を有するＣｘａ Ｉおよび工Ｌ−３ＤＮ
Ａフラグメントの３′末端に位置するＮｃｏ ■によっ
て分解することによってクローンをスクリーニングした
。このスクリーニングより、ｐＲＲφ１０−工Ｌ−３１
が単離され、その特性が調べられた（第２０図）、Ｔ７
Ｇｅｎｅブｏ モー ターオＪ：びＩＬ−３ＤＮＡ
ｔ、、（含むフラグメントを次に、上述したネズミα
−２インターフェロン遺伝子に用いたのと同じ方法で（
各プラスミドのＣ１ａ ｉ／Ｈｉｎａ ［１切断を結合
し、アガロースゲル電気泳動で適当な直鎖ＤＮＡを単離
し、ｐＲＲＢ２０ ＜フタ−にＴ７φ１０−工Ｌ−３遺
伝子フラグメントをライゲーションしてこれ乞Ｅ、ｃｏ
ｌｉ Ｄ １２１０ 形質転換することにより）、ｐＲ
ＲＢｚｏｖｃクローンした。制限酵素Ｎｃｏ ＩとＢａ
ｍ ＨＩでゲラスミ）’ＤＮＡを分解することによって
単離したクローン乞スクリーニングした。ｐＲＲ２０Ｉ
Ｌ−３３を含むクローンをこのスクリーニングから単離
した（第２１図）。発現ばこのクローンの誘導しγこ培
養物を溶菌させ、その生成物７ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミド９ゲルで分析することにより確認した。ネズミＩＬ
−３の分子量に相当するバンドが観察された。
表 １
０ ６．６ ８．３
１ ２３．６ ５．０
２ ２９．６ ５．７
３ ４２．１ ７．７
４ ５８．５ ２．７
５ ６９．６ １．８
６ ７２．７ １．８
※ ３つの試料の平均値
※※ 工ＰＴＧを終濃度５ｍＭで添加
表２
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０ ０ ４０．０ ４０．
０２ ３２．０ ２２．０ ４ １２９．０ １６．０ ６ ２２２．２ １３．０ ２０ ５７８．３ １５．４ Ｅ、ｃｏｌｉ ＲＢ７９１ ０ ２５．０ ２５．
０２ ８０．０ ２３．８ ４ １０５．８ １８．９ ６ ３７０．４ １７．３ ２０ ２１３．３ ６．８ ※ ３つの試料の平均 表３ ｐｉ（ＲＢ２０ＣＩＦ−２０５，６５，６１１４，２１
０，７ ２３５，７１７，２ ４２ｇ８．６ ４１．０ ６ ２９７．６ ８３．３ ２０ ２４０．０ ４．２ ｐＲＲＢ２Ｑｃ工Ｆ’−１１０３，４３，４１３４Ｂ
２８．６ ２ ５７Ｌ１ ５２．６− ４ １４７．４ ９０．０ ６ ４４８．０ １２３．０ ２０ ２９０．９ ７８．６ 以下の記述は、上述した材料および実験方法の項目で示
した文献に関する。
０２ ３２．０ ２２．０ ４ １２９．０ １６．０ ６ ２２２．２ １３．０ ２０ ５７８．３ １５．４ Ｅ、ｃｏｌｉ ＲＢ７９１ ０ ２５．０ ２５．
０２ ８０．０ ２３．８ ４ １０５．８ １８．９ ６ ３７０．４ １７．３ ２０ ２１３．３ ６．８ ※ ３つの試料の平均 表３ ｐｉ（ＲＢ２０ＣＩＦ−２０５，６５，６１１４，２１
０，７ ２３５，７１７，２ ４２ｇ８．６ ４１．０ ６ ２９７．６ ８３．３ ２０ ２４０．０ ４．２ ｐＲＲＢ２Ｑｃ工Ｆ’−１１０３，４３，４１３４Ｂ
２８．６ ２ ５７Ｌ１ ５２．６− ４ １４７．４ ９０．０ ６ ４４８．０ １２３．０ ２０ ２９０．９ ７８．６ 以下の記述は、上述した材料および実験方法の項目で示
した文献に関する。
１、バック？ ｙ （Ｂａｃｋｍａｎ）、Ｋ、Ｍ、ブタ
シーン（ＰｔａｓｈｎりおよびＷ、ギルバート（Ｇｉｌ
ｂｅｒｔ）、１９７６年。バクテリオファージラムダの
Ｃ１遺伝子なもつプラスミドの造成、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ７３゜４１７４−４１７８゜ ２、 ポリバー（Ｂｏｌｌｖａｒ）、Ｆ’、、に、バッ
ク７ン（Ｂａｃｋｍａｎ）、１９７９年。クローニング
ベクターとしてのエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ＣＯＩ工）のプラスミド、イン（工ｎ）つ（
Ｗｕ）、 Ｒ，メンツビ オズエンザイモロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｓ ｏｆ Ｅｎｒｙｍｏｌｏｇｙ） ６８ ：
２４５−２６７゜ ３、 ブｖ ７ ト’ （Ｂｒｅｎｔ）、Ｒｏ、Ｍ、シ
タシー７ （Ｐｔａｓｈｎｅ入１９８１年、１θＸＡ遺
伝子産物の活性機作、Ｐｒｏｃ。
シーン（ＰｔａｓｈｎりおよびＷ、ギルバート（Ｇｉｌ
ｂｅｒｔ）、１９７６年。バクテリオファージラムダの
Ｃ１遺伝子なもつプラスミドの造成、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ７３゜４１７４−４１７８゜ ２、 ポリバー（Ｂｏｌｌｖａｒ）、Ｆ’、、に、バッ
ク７ン（Ｂａｃｋｍａｎ）、１９７９年。クローニング
ベクターとしてのエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ＣＯＩ工）のプラスミド、イン（工ｎ）つ（
Ｗｕ）、 Ｒ，メンツビ オズエンザイモロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｓ ｏｆ Ｅｎｒｙｍｏｌｏｇｙ） ６８ ：
２４５−２６７゜ ３、 ブｖ ７ ト’ （Ｂｒｅｎｔ）、Ｒｏ、Ｍ、シ
タシー７ （Ｐｔａｓｈｎｅ入１９８１年、１θＸＡ遺
伝子産物の活性機作、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ７８ ： ／％７ｐｐ
４２０４−２０８゜４、チャンク（Ｃｈａｇ）、Ａ、Ｃ
，Ｙ、、Ｓ、Ｎ、 コーｘン（Ｃｏｈｅｎ）、１９７８
年。Ｐ１５Ａクリプテイックミニプラスミド由来の増幅
可能な多コピーＤＮＡ クローニングベクターの造成お
よびその性質、Ｊ、Ｂａｃｔｅｎｏｌ。
４２０４−２０８゜４、チャンク（Ｃｈａｇ）、Ａ、Ｃ
，Ｙ、、Ｓ、Ｎ、 コーｘン（Ｃｏｈｅｎ）、１９７８
年。Ｐ１５Ａクリプテイックミニプラスミド由来の増幅
可能な多コピーＤＮＡ クローニングベクターの造成お
よびその性質、Ｊ、Ｂａｃｔｅｎｏｌ。
１３４：１１４１゜
５、 ダガート（Ｄａｇｅｒｔ）、Ｍ、、Ｓ、Ｄ、’ｘ
−ルリツヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）％１９７９年。塩化カル
シウム内での長期培養がＥｓｃｈｅｉｎｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ細胞の受容能が増大する。Ｇｅｎｅ ６ ：２３−
２８゜６、 ダｙ （Ｄｕｎｎ）、ＩＴ、Ｊ、、Ｆ、Ｘ
タデイア−（Ｓｔｕｄｉｅｒ）、１９８３年。バクテリ
オファージＴ７の完全なヌクレオチド９配列およびＴ７
遺伝子要素の位置。
−ルリツヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）％１９７９年。塩化カル
シウム内での長期培養がＥｓｃｈｅｉｎｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ細胞の受容能が増大する。Ｇｅｎｅ ６ ：２３−
２８゜６、 ダｙ （Ｄｕｎｎ）、ＩＴ、Ｊ、、Ｆ、Ｘ
タデイア−（Ｓｔｕｄｉｅｒ）、１９８３年。バクテリ
オファージＴ７の完全なヌクレオチド９配列およびＴ７
遺伝子要素の位置。
Ｊ、Ｍｏ’１．Ｂｉｏｌ、 １６６：４７７−５３５゜
７、 ファミレツテイ（Ｆａｍｉｌｌθｔｔｉ入フィリ
ップ（Ｐｈｔｌｌｔｐ） ｃ、、サラ（Ｓａｒａ） ル
ーベンスタイン（Ｐａｂｅｎｓｔｅｉｎ）、シト’ニー
（Ｓｙｄｎｅｙ）、ベスト力（Ｐｅｓｔ、ｋａ）、１
９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ。
７、 ファミレツテイ（Ｆａｍｉｌｌθｔｔｉ入フィリ
ップ（Ｐｈｔｌｌｔｐ） ｃ、、サラ（Ｓａｒａ） ル
ーベンスタイン（Ｐａｂｅｎｓｔｅｉｎ）、シト’ニー
（Ｓｙｄｎｅｙ）、ベスト力（Ｐｅｓｔ、ｋａ）、１
９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ。
７８：３８７−３９４、 アカデミツクブレス社。
８、マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ入Ｔ、、Ｅ、Ｆ、
７リツシユＣＦ’ｒｉｔｓｃｈ入Ｊ、サンブロック（Ｓ
ａｍｂｒｏｃｋ）、１９８２年。モレキュラークローニ
ン、／： 実Ｍｔ、コールドスプリングハーバ−研究所
。
７リツシユＣＦ’ｒｉｔｓｃｈ入Ｊ、サンブロック（Ｓ
ａｍｂｒｏｃｋ）、１９８２年。モレキュラークローニ
ン、／： 実Ｍｔ、コールドスプリングハーバ−研究所
。
９、 メシング（Ｍｅｓｓｊｎｇ）、：ｆ、、；Ｊ、ビ
エイラ（ｖｉｅｉｒａ）１９８２年。２本鎖を分解した
制限フラグメントのいずれの鎖かを選択する際に役立つ
一対のＭ１３ベクター。Ｇｅｎｅ １９．２６９−２７
６゜１０、 サトリー（Ｓａｄｌｅｒ入、Ｔ、、Ｒ，
Ｍ、テクレンズルグ（Ｔｅｃｋｂｅｎｂｎｒｇ）１．Ｔ
、Ｌ、ペッツ（Ｂｅｔｚ）、１９８０年。合成ラクトー
スオはレートの多くのコピーが縦列したプラスミドＧｅ
ｎｅ８：２７９−３００゜Ｌｌ、ｆンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ）、ｐ、、Ｓ、ニラフレ／（Ｎｉｃｋｌｅｎ）Ａ、Ｒ
，カールソ７ （Ｃｏｕｌｓｏｎ）、１９７７年＠ 一
本領を停止させろ阻害剤を用い７．ＤＮＡ塩基配列決定
Ｐｒｏａ Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、
、 Ｖｏｌ ７４．１１６１２、ｐｐ５４６３−５４
６７゜１２、スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｈ，Ｏ，，１９８
０年、′ゲルからのＤＮＡの回収−Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
エイラ（ｖｉｅｉｒａ）１９８２年。２本鎖を分解した
制限フラグメントのいずれの鎖かを選択する際に役立つ
一対のＭ１３ベクター。Ｇｅｎｅ １９．２６９−２７
６゜１０、 サトリー（Ｓａｄｌｅｒ入、Ｔ、、Ｒ，
Ｍ、テクレンズルグ（Ｔｅｃｋｂｅｎｂｎｒｇ）１．Ｔ
、Ｌ、ペッツ（Ｂｅｔｚ）、１９８０年。合成ラクトー
スオはレートの多くのコピーが縦列したプラスミドＧｅ
ｎｅ８：２７９−３００゜Ｌｌ、ｆンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ）、ｐ、、Ｓ、ニラフレ／（Ｎｉｃｋｌｅｎ）Ａ、Ｒ
，カールソ７ （Ｃｏｕｌｓｏｎ）、１９７７年＠ 一
本領を停止させろ阻害剤を用い７．ＤＮＡ塩基配列決定
Ｐｒｏａ Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、
、 Ｖｏｌ ７４．１１６１２、ｐｐ５４６３−５４
６７゜１２、スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｈ，Ｏ，，１９８
０年、′ゲルからのＤＮＡの回収−Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
’Ｖｏｌ ６立、Ｐａｒｔ工、グロスマント” （Ｇ
ｒｏｓｓｖｒａｎｄ）、Ｌ、、に、モ／ｌ／ダベ（Ｍｏ
ｌｄａｖｅ） ＠、アカデミツクプレス、ニューヨーク
、３７１−３８０゜ １３、 スタール（Ｓｔａｈｌ ）、Ｓ、 、に、ツ
イン（Ｚｉｎｎ）、１９８１年、バクテリオファージＴ
７ ＲＮＡ ポリメラーゼのクローンした遺伝子の塩
基配列、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 ２４ ： ４８１−
４８５゜１４、ストリッツ工（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）１
．Ｔ、Ｇ、 １９．７８ＤＮＡ 配列より区分した
ｐＢＲ３２２制限地図。
ｒｏｓｓｖｒａｎｄ）、Ｌ、、に、モ／ｌ／ダベ（Ｍｏ
ｌｄａｖｅ） ＠、アカデミツクプレス、ニューヨーク
、３７１−３８０゜ １３、 スタール（Ｓｔａｈｌ ）、Ｓ、 、に、ツ
イン（Ｚｉｎｎ）、１９８１年、バクテリオファージＴ
７ ＲＮＡ ポリメラーゼのクローンした遺伝子の塩
基配列、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 ２４ ： ４８１−
４８５゜１４、ストリッツ工（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）１
．Ｔ、Ｇ、 １９．７８ＤＮＡ 配列より区分した
ｐＢＲ３２２制限地図。
４３１６塩基対の長さの正確なりＮＡサイズマーカーＮ
ｖｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、５：２７２１０１
５、ハカールト（Ｈａｋｋａａｒｔ ）、Ｍ、Ｊ、Ｊ、
、Ｅ、ベルトカンプ（Ｖｅｌｔｋａｎｐ）、Ｈ，Ｊ、、
Ｔ、ナイカンプ（Ｎｙｋａｎｐ）細菌宿主■を溶菌させ
る際に関与するプラスミドＣｌ０ＤＦ −１３によりコ
ードされた７′ロチインＨ０Ｇｅｎｅ Ｈ産物の合成の
機能および調節Ｍｏ１．Ｇｅｎ。
ｖｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、５：２７２１０１
５、ハカールト（Ｈａｋｋａａｒｔ ）、Ｍ、Ｊ、Ｊ、
、Ｅ、ベルトカンプ（Ｖｅｌｔｋａｎｐ）、Ｈ，Ｊ、、
Ｔ、ナイカンプ（Ｎｙｋａｎｐ）細菌宿主■を溶菌させ
る際に関与するプラスミドＣｌ０ＤＦ −１３によりコ
ードされた７′ロチインＨ０Ｇｅｎｅ Ｈ産物の合成の
機能および調節Ｍｏ１．Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ、１８３（１９８１）３２６−３３２゜１６
、 Ｌ／Ａ リ（Ｌａｅｍｍｌｌ）、Ｕ、Ｕ、１９７０
年、バクテリオファージＴ４頭部会合時の構造蛋白の分
解Ｎａｔｕｒｅ ２２７ ：６８０−６８５゜１７、
ショー（Ｓｈｏｗ）、プレイ（Ｇｒａｙ）Ｄ、 、Ｗ
、ボール（Ｂａｌｌ入Ｈ，タイ／） （Ｔａｉｒａ）％
Ｎ 、７７ター（Ｍａｍｔｅｒ）、Ｐ、レンギｘル（Ｌ
ｅｒｇｙｅｌ）、Ｃ，ワイス？ ン（Ｗｅ ｉ ｓ ｓ
ｍａｎｎ１９８３年、クローンしたネズミＩＦ’Ｎ−α
遺伝子の構造および発現Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｐｅ５ｅａｒｃｈ Ｍｏ１１１：５５５−５７３゜ １８、ヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）、Ｔ、、Ｆ”、リー（Ｌ
ｅｅ）、Ｄ、 ｖニック（Ｒｅｎｎｉｃｋ入Ｃ，ホール
（Ｈａｌｌ）、Ｎ、プレイ（Ａｒａｉ）、 １９８４年
、サル細胞中での肥満細胞成長因子活性発現をするマウ
スｃＤＮＡクローンの単離およびその性質、ＰＮＡＳ、
８１：１０７０−１０７４゜
、 Ｌ／Ａ リ（Ｌａｅｍｍｌｌ）、Ｕ、Ｕ、１９７０
年、バクテリオファージＴ４頭部会合時の構造蛋白の分
解Ｎａｔｕｒｅ ２２７ ：６８０−６８５゜１７、
ショー（Ｓｈｏｗ）、プレイ（Ｇｒａｙ）Ｄ、 、Ｗ
、ボール（Ｂａｌｌ入Ｈ，タイ／） （Ｔａｉｒａ）％
Ｎ 、７７ター（Ｍａｍｔｅｒ）、Ｐ、レンギｘル（Ｌ
ｅｒｇｙｅｌ）、Ｃ，ワイス？ ン（Ｗｅ ｉ ｓ ｓ
ｍａｎｎ１９８３年、クローンしたネズミＩＦ’Ｎ−α
遺伝子の構造および発現Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｐｅ５ｅａｒｃｈ Ｍｏ１１１：５５５−５７３゜ １８、ヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）、Ｔ、、Ｆ”、リー（Ｌ
ｅｅ）、Ｄ、 ｖニック（Ｒｅｎｎｉｃｋ入Ｃ，ホール
（Ｈａｌｌ）、Ｎ、プレイ（Ａｒａｉ）、 １９８４年
、サル細胞中での肥満細胞成長因子活性発現をするマウ
スｃＤＮＡクローンの単離およびその性質、ＰＮＡＳ、
８１：１０７０−１０７４゜
ｉ１図は、カルボキシ末端の配列をコードするクローン
した１１３６塩基対の’ｒ７ ＤＮＡ フラグメント
ン含むｐＲＲ１９の構造タボす。 第２図は、’ｒ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ遺伝子のコ
ーディング配列すべてとＴ ７１． Ｉ Ａプロモータ
ー配列を含むｐＲＲ−ＩＴ７−３９ の構造な示す。 第３図に工、ｌａｃプロモーター配列をクローンするま
での各ステラフの概要な示す。ここでは、２つの制限酵
素認識部位が変っている。Ｅｃｏ ＲＩ部位は補填され
、次いでライゲーションによってＸｍｎ ■部位が付け
られｐ８０４−１ができた。引きつづいて、ｐ８０４−
１ において％Ｎｄｅ １部位は補填されＥｃｏ Ｒ工
＋）ンカー配列が該部位に接続されて［０４−ＲＩを作
った。次いでＥｃｏＲＴ７ Ｐｖ ｕ■フラグメントと
して存在するｌａｃプロモーター配列がｐ８０４−ＲＩ
にクローンされた。えられたプラスミ）”ｐ８０４−Ｒ
Ｉ１．ａｃが図に示され、時計方向と反対の方向性を有
する三プロモーター配列をもつ。 第４図は、ト且ブロモーターオにレータ−配列の制御下
にあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミ
ドの造成を示す。 第５図は、Ｔ７ Ｇθｎ２配列乞コードする５１２塩基
対フラグメントｕｐＢＲ３２２にクローンしたときの各
段階の手順な示したものである。 ｇ６図はｐＲＲ−２Ｔ７−３５ の構造を示したもので
ある。クローンしたフラグメントは、マーカーとしてＫ
ｐｎ ｌ制限酵素乞用いて同定し、方向を決定した。 第７図は、Ｃ１ａ ｌ／Ｋｐｎ Ｉフラグメント乞切
り出すことによっていかにしてｐＲＲ−２Ｔ７−３５の
大きさを縮少し、ｐＲＲ−ｔＢ−２Ｔ７ を作ったかを
示す。 第８図は、（・かにしてｐＲＲ−ＩＢ−２Ｔ７ のＮｄ
ｅ１部位をＢａｍＨ工部位に変えたう・を示す。 第９図は、いかにしてＴ７ Ｇｅｎｅ ２ ’ａ’Ｔ
７Ｇｅｎｅ １とタンデムにクローンしたかを示す図
である。Ｔ ７ Ｇｏｎｅ Ｉ Ｙ Ｉ）８０４−Ｒ工
１ａＣのＰｖｕ ｌｌ領域に再度クローンし、ライゲー
ションによってｐＲＲ−ＩＴ７ １ａｃ ５を造成した
。ｐＲＲＩＴ７ １ａｃ５とｐｌＴ７Ｌ３ （第５図
）の唯一の相異点は、ｐｌＴ７Ｌ−３がＥｃｏ Ｒ工部
位をもつのに対し。 ｐＲＲ−ＩＴ７ １ａｃ ５はＸｍｎ ｉ ｉｌｌ限部
位をもつことであるｏＴ７Ｇｅｎｅ２はＰｓｔＩ；’Ｂ
ａｍ ＨＴ７ラグメントとしてｐＲＲ−、ｌＴ７ に
クローンされｐＲＲ−ＩＴ７ Ｇ２１ａｃ７が得られた
。Ｔ７Ｇｅｎｅ１および２の配夕１ｊは制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩにより単離することができる。 第１０図はｐＡＣ−ＩＴ７Ｇ２−７８の構造２示してい
る。これは、ｐＲＲ−Ｉ Ｔ７Ｇ２ １ａｃ ７ 由
来のＴ７ Ｇｅｎｅ １および２のＥｃｏ Ｒ工制限フ
ラグメント乞、ｐＡＣＹＣ１８４のＥｃｏ Ｒｌ制限部
位にクローンすることにより得られている。 第１１図はＴ７ ０θｎｅｌｏプロモーターをクローン
し、再びＮｄｅ ｌ制限部位乞作った工程な示す。Ｔ７
ゲノムＤＮＡ −Ｑ出発物質として一連の制限酵素で分
解して、Ｔ ７Ｇｅｎｅ １０プロモーターを含む３４
０塩基対のフラグメントを得た。これ７ｐＢＲ３２２由
来のフラグメントにクローンした。単離され１こシラス
ミｌ−”ＰＲＲ−Ｔ７φ１０−１８は、’ｒ７ ＲＮＡ
４リメラーゼ存在下でＴ７プロモーターによって直接
発現されるような部位に、任意の遺伝子をクローンしり
ろよう、 Ｎｄｅ １部位で開裂させることができろ。 第１２図は、いかにしてＴ７ Ｇｅｎｅ １０プロモ
ーターなα−２インターフエロン遺伝子の上流にクロー
ンしたかを示したものである。ここに示されにプラスミ
ド”ｐＲＲ−Ｔ７φＩＱ−ＩＦ’は、Ｔ７Ｇｅｎｅ ｌ
Ｏプロモーターの制御下にある ’ｒ７ ＲＮ４ポリ
メラーゼによってα−２インターフエロン遺伝子が発現
できる。 第１３図はいかにしてｐＲＲ−Ｔ７φＩＱ−工Ｆ’がＲ
ｓａ ｌで分解され、平滑末端フラグメントとしてｐＡ
ＣＹｏ １８４にクローンしたかを示す図である。 ｐＡＣ−φｌ０ＩＦ−２は同一、細胞内でｐＢＲ３２２
と適合性のｐＡＣＹＣｒｓ４−＜フタ−中にある 異種
遺伝子の発現を司るＴ７フロモーターより成る。 第１４図は、ｐＡＣ−ＩＴ７Ｇ２−７８のＴ７遺伝子Ｅ
ｃｏ ＲＩ フラグメントをＢａ１３１で分解すること
によっていかに多くのクローンが生じるかを示す図であ
る。該酵素は１ａｃ７０モーター領域を介して、該プロ
モーターとＴ７Ｇｅｎｅｌコーディング領域の開始点の
間に弁在するｐＨＲ３２２１）ＮＡに分解することが認
められている。次いでＥａｍ Ｈ王で分解することによ
り各極長さのフラグメントを生じ１こ、これらのフラグ
メントはｐ８０４−Ｒ工山二ンＰｖａ ｆｌ／Ｂａｍ
Ｈ工で分解して得られるフラグメントに挿入することに
よって完全なｌａｃプロモーターの近傍にクローンした
。多くのクローン乞単離した。これらのうちの１つであ
るｐｌ（Ｒ２Ｑ は２プラスミドゝ系に使用され、第１
４図に示されている。 第１５図はシングルプラスミドゝシステムの概略７示す
図である。Ｔ７Ｇｅｎθ１０フロモーター／α−２イン
タ一フエロン腹台体を含む平滑末端のＲｓａ ■フラグ
メントン、あらかじめ平滑末端にしておいｙ、、ｐＲＲ
Ｂ２０のＨｌｎｄ ［１部位にクローンした。 １：１ＲＲＢ２０ＩＦ’−２３を単離しＴ７シングルブ
ラスミト９系に含まれる遺伝子およびプロモーターの方
向を図示した。 第１６図ばｐＲＲＢ２０工Ｆ−２０およびｐＫＧ−２由
来のプラスミドゝｐＲＲＢ２０Ｃの造成ヲ示したもので
ある。Ａｈｄ ］ｌ ／ Ｅｃｏ Ｒｌ制限部位のフラ
グメントが各々のプラスミドから単離された。ｐＲＲＢ
２０ＩＦ’−２３はＴ７ Ｇｅｒｌｅｌを与え、ｐＫＧ
−２由来のフラグメントは、テトラサイクリン耐性遺伝
子およびｃａｐｔ８オリジンを含む。この図では、 ｐ
ＲＲＢ２０ＩＦ−２３由来のＴ７φ１０−α工Ｆ’Ｎ
フラグメントが如何にしてＡｈａ ｌ制限部位にクロ
ーンされたかも示されている。用いられたフラグメント
はＡｈａ ［１制限フラグメントであり、２つのＡｈａ
■部位がＤＮＡの挿入により再生している。ｐＲＲＢ
２０ＣＩＦ−２は単離された組みかえ体でありＴ７Ｇｅ
ｎｅ １およびＴ ７ Ｇｅｎｅ １０プロモーター
−ＩＦ’Ｎ複合体の読み取り方向は同じで５′から３′
への方向である。 第１７図は、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０／ｐＲＲＢ １
０ Ｉ Ｆ −２３が生産するインターフェロンに対す
るリファンピシンの影響を示したグラフである。Ｉ Ｐ
ＴＧは開始時２ｍＭ の濃度で加えられ、細胞ば３７
℃で培養された。リファンピシン（１００μ／！／Ｒ１
）を矢印で示したところで添加し１こ（すなわち、１．
５．５．６時間後）。 グラフの印は以下のこと乞示す。○：す７アンピシンヲ
加える前のインターフェロンレベル；×：１．５時間後
にリファンピシン２加えて培養した際の工ＦＮレベル；
・：・５時間後にリファンピシンを加えた除のＸＦＮ
レベル；■：６時間後にリファンピシンｙｉ 加工ｒｓ
ときのＩＦ”Ｎ レベル。 第１８図は、’ｌ’７Ｇｅｎｅｌｏプロモーターを含む
フラグメントＹｐＭＴ１１Ｓ にクローニングすること
により、いかにしてｐ ＲＲＴ ７φ１０−Ｘｕ２が造
成されたかを示す。プロモーターにはポリリンカーの特
異的な制限部位がフロモーターの読み取り方向に対して
３′となるよう位置させた。 第１９図は、ネズミα−２ＩＦ’Ｎ遺伝子の挿入断片を
ｐＲＲＴφ１０−Ｘｕ ２のＳｍａ １部位に入れるこ
とによりｐＲＲＴＭφ１０−Ｍ（１２）−１を造成した
ことを示す。ネズミのα−２ＩＦＮ遺伝子は制限酵素Ａ
ｖａ ｌ、 Ｅｃｏ Ｒ工でｐＴＲＧ３０５−１ よ
り切り出しｆこ。クレノー反応により末端ン平滑末端に
し、フラグメン）−１ｐＲＲＴφ１０−Ｘｕ２の平滑末
端であるＳｍａ ｌ制限部位にクローンした。 第２０図はネズミインターロイキン３ （ＩＬ−３）を
どのようにしてｐＲＲＴ７φ１０−Ｘｕ２ にクローン
したかな示す。ＩＬ−３を含むｐＴＲＰ−Ｃ１１％を制
限酵素Ｃ１ａ ｉで分解し、その部位をクレノー酵素で
補填した。ＩＬ−３遺伝子は、Ｈｉｎｄ ［１によりフ
ラスミビより切り出し、アガロースゲル電気泳動で単τ
離した。ｐＲＲＴ７φ１０−Ｘｕ２はＳｍａ ｉそして
Ｈｉｎｄ ｍで分解して調製した。次いでＩＬ−３遺伝
子なこのベクターに入れ、ｐＲＲＴ７φ１０−工Ｌ−３
１を得ることができた。 第２１図はｐＲＲＢｚｏ−Ｍｌｌ−Ｆ’−ｚｔ５および
ｐＲＲＢ３０ＩＬ−３３の造成な示すものである。各々
の場合とも、Ｔ７φ１０ Ｙ含むＤＮＡ フラグメ
ントとネズミの遺伝子を、Ｃ１ａＩおよびＨｌｎｄ ｍ
で分解することによりベクターから切り出しｆこ。ｐＲ
ＲＢ２０は同様に、 Ｃ１ａ ＩおよびＨｉｎｄ ｍで
分解し、ウシ腸管アルカリホスファターゼで処理した。 その後、Ｔ７φｌＯとネズミ遺伝子の７ラグメ／トをラ
イゲーションシｒ、、：結果、クローンしたツラスミビ
ｐＲＲＢ２０−ＭＩＦ−２１５およびｐＲＲＢ２０工Ｌ
−３３を肖ることができた。 （外５名） 第４図 とＣｏＩ＋１１ ＃Ｊ、５図 Ｎｏｖ＋
Ｎｄｅｌ第７図 第８図 第１７図 ＩＰＴＧ １１７１１後の経時（時間）第１８図 第１９図 第２ｏ図 暮１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、４ 識別記号 庁内
整理番号り発 明 者 サトワント・カウル・ ア
メリカ合衆国ニューナルラ −ルド
ウエル、ナタリリ発 明 者 マイケル・ジョセフ
・ アメリカ合衆国ニューライアン
ルフオード、ハイ・クライブ ３４ シャーシー州０７００６．ウェスト・コー・ドライブ
２６
した１１３６塩基対の’ｒ７ ＤＮＡ フラグメント
ン含むｐＲＲ１９の構造タボす。 第２図は、’ｒ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ遺伝子のコ
ーディング配列すべてとＴ ７１． Ｉ Ａプロモータ
ー配列を含むｐＲＲ−ＩＴ７−３９ の構造な示す。 第３図に工、ｌａｃプロモーター配列をクローンするま
での各ステラフの概要な示す。ここでは、２つの制限酵
素認識部位が変っている。Ｅｃｏ ＲＩ部位は補填され
、次いでライゲーションによってＸｍｎ ■部位が付け
られｐ８０４−１ができた。引きつづいて、ｐ８０４−
１ において％Ｎｄｅ １部位は補填されＥｃｏ Ｒ工
＋）ンカー配列が該部位に接続されて［０４−ＲＩを作
った。次いでＥｃｏＲＴ７ Ｐｖ ｕ■フラグメントと
して存在するｌａｃプロモーター配列がｐ８０４−ＲＩ
にクローンされた。えられたプラスミ）”ｐ８０４−Ｒ
Ｉ１．ａｃが図に示され、時計方向と反対の方向性を有
する三プロモーター配列をもつ。 第４図は、ト且ブロモーターオにレータ−配列の制御下
にあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミ
ドの造成を示す。 第５図は、Ｔ７ Ｇθｎ２配列乞コードする５１２塩基
対フラグメントｕｐＢＲ３２２にクローンしたときの各
段階の手順な示したものである。 ｇ６図はｐＲＲ−２Ｔ７−３５ の構造を示したもので
ある。クローンしたフラグメントは、マーカーとしてＫ
ｐｎ ｌ制限酵素乞用いて同定し、方向を決定した。 第７図は、Ｃ１ａ ｌ／Ｋｐｎ Ｉフラグメント乞切
り出すことによっていかにしてｐＲＲ−２Ｔ７−３５の
大きさを縮少し、ｐＲＲ−ｔＢ−２Ｔ７ を作ったかを
示す。 第８図は、（・かにしてｐＲＲ−ＩＢ−２Ｔ７ のＮｄ
ｅ１部位をＢａｍＨ工部位に変えたう・を示す。 第９図は、いかにしてＴ７ Ｇｅｎｅ ２ ’ａ’Ｔ
７Ｇｅｎｅ １とタンデムにクローンしたかを示す図
である。Ｔ ７ Ｇｏｎｅ Ｉ Ｙ Ｉ）８０４−Ｒ工
１ａＣのＰｖｕ ｌｌ領域に再度クローンし、ライゲー
ションによってｐＲＲ−ＩＴ７ １ａｃ ５を造成した
。ｐＲＲＩＴ７ １ａｃ５とｐｌＴ７Ｌ３ （第５図
）の唯一の相異点は、ｐｌＴ７Ｌ−３がＥｃｏ Ｒ工部
位をもつのに対し。 ｐＲＲ−ＩＴ７ １ａｃ ５はＸｍｎ ｉ ｉｌｌ限部
位をもつことであるｏＴ７Ｇｅｎｅ２はＰｓｔＩ；’Ｂ
ａｍ ＨＴ７ラグメントとしてｐＲＲ−、ｌＴ７ に
クローンされｐＲＲ−ＩＴ７ Ｇ２１ａｃ７が得られた
。Ｔ７Ｇｅｎｅ１および２の配夕１ｊは制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩにより単離することができる。 第１０図はｐＡＣ−ＩＴ７Ｇ２−７８の構造２示してい
る。これは、ｐＲＲ−Ｉ Ｔ７Ｇ２ １ａｃ ７ 由
来のＴ７ Ｇｅｎｅ １および２のＥｃｏ Ｒ工制限フ
ラグメント乞、ｐＡＣＹＣ１８４のＥｃｏ Ｒｌ制限部
位にクローンすることにより得られている。 第１１図はＴ７ ０θｎｅｌｏプロモーターをクローン
し、再びＮｄｅ ｌ制限部位乞作った工程な示す。Ｔ７
ゲノムＤＮＡ −Ｑ出発物質として一連の制限酵素で分
解して、Ｔ ７Ｇｅｎｅ １０プロモーターを含む３４
０塩基対のフラグメントを得た。これ７ｐＢＲ３２２由
来のフラグメントにクローンした。単離され１こシラス
ミｌ−”ＰＲＲ−Ｔ７φ１０−１８は、’ｒ７ ＲＮＡ
４リメラーゼ存在下でＴ７プロモーターによって直接
発現されるような部位に、任意の遺伝子をクローンしり
ろよう、 Ｎｄｅ １部位で開裂させることができろ。 第１２図は、いかにしてＴ７ Ｇｅｎｅ １０プロモ
ーターなα−２インターフエロン遺伝子の上流にクロー
ンしたかを示したものである。ここに示されにプラスミ
ド”ｐＲＲ−Ｔ７φＩＱ−ＩＦ’は、Ｔ７Ｇｅｎｅ ｌ
Ｏプロモーターの制御下にある ’ｒ７ ＲＮ４ポリ
メラーゼによってα−２インターフエロン遺伝子が発現
できる。 第１３図はいかにしてｐＲＲ−Ｔ７φＩＱ−工Ｆ’がＲ
ｓａ ｌで分解され、平滑末端フラグメントとしてｐＡ
ＣＹｏ １８４にクローンしたかを示す図である。 ｐＡＣ−φｌ０ＩＦ−２は同一、細胞内でｐＢＲ３２２
と適合性のｐＡＣＹＣｒｓ４−＜フタ−中にある 異種
遺伝子の発現を司るＴ７フロモーターより成る。 第１４図は、ｐＡＣ−ＩＴ７Ｇ２−７８のＴ７遺伝子Ｅ
ｃｏ ＲＩ フラグメントをＢａ１３１で分解すること
によっていかに多くのクローンが生じるかを示す図であ
る。該酵素は１ａｃ７０モーター領域を介して、該プロ
モーターとＴ７Ｇｅｎｅｌコーディング領域の開始点の
間に弁在するｐＨＲ３２２１）ＮＡに分解することが認
められている。次いでＥａｍ Ｈ王で分解することによ
り各極長さのフラグメントを生じ１こ、これらのフラグ
メントはｐ８０４−Ｒ工山二ンＰｖａ ｆｌ／Ｂａｍ
Ｈ工で分解して得られるフラグメントに挿入することに
よって完全なｌａｃプロモーターの近傍にクローンした
。多くのクローン乞単離した。これらのうちの１つであ
るｐｌ（Ｒ２Ｑ は２プラスミドゝ系に使用され、第１
４図に示されている。 第１５図はシングルプラスミドゝシステムの概略７示す
図である。Ｔ７Ｇｅｎθ１０フロモーター／α−２イン
タ一フエロン腹台体を含む平滑末端のＲｓａ ■フラグ
メントン、あらかじめ平滑末端にしておいｙ、、ｐＲＲ
Ｂ２０のＨｌｎｄ ［１部位にクローンした。 １：１ＲＲＢ２０ＩＦ’−２３を単離しＴ７シングルブ
ラスミト９系に含まれる遺伝子およびプロモーターの方
向を図示した。 第１６図ばｐＲＲＢ２０工Ｆ−２０およびｐＫＧ−２由
来のプラスミドゝｐＲＲＢ２０Ｃの造成ヲ示したもので
ある。Ａｈｄ ］ｌ ／ Ｅｃｏ Ｒｌ制限部位のフラ
グメントが各々のプラスミドから単離された。ｐＲＲＢ
２０ＩＦ’−２３はＴ７ Ｇｅｒｌｅｌを与え、ｐＫＧ
−２由来のフラグメントは、テトラサイクリン耐性遺伝
子およびｃａｐｔ８オリジンを含む。この図では、 ｐ
ＲＲＢ２０ＩＦ−２３由来のＴ７φ１０−α工Ｆ’Ｎ
フラグメントが如何にしてＡｈａ ｌ制限部位にクロ
ーンされたかも示されている。用いられたフラグメント
はＡｈａ ［１制限フラグメントであり、２つのＡｈａ
■部位がＤＮＡの挿入により再生している。ｐＲＲＢ
２０ＣＩＦ−２は単離された組みかえ体でありＴ７Ｇｅ
ｎｅ １およびＴ ７ Ｇｅｎｅ １０プロモーター
−ＩＦ’Ｎ複合体の読み取り方向は同じで５′から３′
への方向である。 第１７図は、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄ１２１０／ｐＲＲＢ １
０ Ｉ Ｆ −２３が生産するインターフェロンに対す
るリファンピシンの影響を示したグラフである。Ｉ Ｐ
ＴＧは開始時２ｍＭ の濃度で加えられ、細胞ば３７
℃で培養された。リファンピシン（１００μ／！／Ｒ１
）を矢印で示したところで添加し１こ（すなわち、１．
５．５．６時間後）。 グラフの印は以下のこと乞示す。○：す７アンピシンヲ
加える前のインターフェロンレベル；×：１．５時間後
にリファンピシン２加えて培養した際の工ＦＮレベル；
・：・５時間後にリファンピシンを加えた除のＸＦＮ
レベル；■：６時間後にリファンピシンｙｉ 加工ｒｓ
ときのＩＦ”Ｎ レベル。 第１８図は、’ｌ’７Ｇｅｎｅｌｏプロモーターを含む
フラグメントＹｐＭＴ１１Ｓ にクローニングすること
により、いかにしてｐ ＲＲＴ ７φ１０−Ｘｕ２が造
成されたかを示す。プロモーターにはポリリンカーの特
異的な制限部位がフロモーターの読み取り方向に対して
３′となるよう位置させた。 第１９図は、ネズミα−２ＩＦ’Ｎ遺伝子の挿入断片を
ｐＲＲＴφ１０−Ｘｕ ２のＳｍａ １部位に入れるこ
とによりｐＲＲＴＭφ１０−Ｍ（１２）−１を造成した
ことを示す。ネズミのα−２ＩＦＮ遺伝子は制限酵素Ａ
ｖａ ｌ、 Ｅｃｏ Ｒ工でｐＴＲＧ３０５−１ よ
り切り出しｆこ。クレノー反応により末端ン平滑末端に
し、フラグメン）−１ｐＲＲＴφ１０−Ｘｕ２の平滑末
端であるＳｍａ ｌ制限部位にクローンした。 第２０図はネズミインターロイキン３ （ＩＬ−３）を
どのようにしてｐＲＲＴ７φ１０−Ｘｕ２ にクローン
したかな示す。ＩＬ−３を含むｐＴＲＰ−Ｃ１１％を制
限酵素Ｃ１ａ ｉで分解し、その部位をクレノー酵素で
補填した。ＩＬ−３遺伝子は、Ｈｉｎｄ ［１によりフ
ラスミビより切り出し、アガロースゲル電気泳動で単τ
離した。ｐＲＲＴ７φ１０−Ｘｕ２はＳｍａ ｉそして
Ｈｉｎｄ ｍで分解して調製した。次いでＩＬ−３遺伝
子なこのベクターに入れ、ｐＲＲＴ７φ１０−工Ｌ−３
１を得ることができた。 第２１図はｐＲＲＢｚｏ−Ｍｌｌ−Ｆ’−ｚｔ５および
ｐＲＲＢ３０ＩＬ−３３の造成な示すものである。各々
の場合とも、Ｔ７φ１０ Ｙ含むＤＮＡ フラグメ
ントとネズミの遺伝子を、Ｃ１ａＩおよびＨｌｎｄ ｍ
で分解することによりベクターから切り出しｆこ。ｐＲ
ＲＢ２０は同様に、 Ｃ１ａ ＩおよびＨｉｎｄ ｍで
分解し、ウシ腸管アルカリホスファターゼで処理した。 その後、Ｔ７φｌＯとネズミ遺伝子の７ラグメ／トをラ
イゲーションシｒ、、：結果、クローンしたツラスミビ
ｐＲＲＢ２０−ＭＩＦ−２１５およびｐＲＲＢ２０工Ｌ
−３３を肖ることができた。 （外５名） 第４図 とＣｏＩ＋１１ ＃Ｊ、５図 Ｎｏｖ＋
Ｎｄｅｌ第７図 第８図 第１７図 ＩＰＴＧ １１７１１後の経時（時間）第１８図 第１９図 第２ｏ図 暮１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、４ 識別記号 庁内
整理番号り発 明 者 サトワント・カウル・ ア
メリカ合衆国ニューナルラ −ルド
ウエル、ナタリリ発 明 者 マイケル・ジョセフ
・ アメリカ合衆国ニューライアン
ルフオード、ハイ・クライブ ３４ シャーシー州０７００６．ウェスト・コー・ドライブ
２６
Claims (19)
- （１）バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子の上流に位置し且つ該遺伝子と同じ転写方向にある誘
導可能な適合性プロモーター領域を有する組換えプラス
ミドベクターを含み、さらに異種ポリペプチドを特定す
る構造ＤＮＡ配列の上流に位置し且つ該ＤＮＡ配列と同
じ転写方向にあるバクテリオファージＴ７プロモーター
領域を含む宿主細胞であつて、該Ｔ７プロモーター領域
と該構造ＤＮＡ配列とが上記組換えプラスミドベクター
上にあるか、あるいは第二の組換えプラスミドベクター
上にある該宿主細胞を、異種ポリペプチドの発現に適す
る条件下で培養することから成る、適切な宿主内で異種
ポリペプチドを生産する方法。 - （２）ａ）バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子の上流にあり且つ該遺伝子と同じ転写方向にある
誘導可能な適合性プロモーター領域を有している第１の
組換えプラスミドベクター；および ｂ）異種ポリペプチドを特定する構造ＤＮＡ配列の上流
にあり且つ該遺伝子と同じ転写方向にあるバクテリオフ
ァージＴ７プロモーター領域を有している第２の組換え
プラスミドベクター；の各々の１またはそれ以上のコピ
ーを含む宿主細胞を、異種ポリペプチドの発現に好まし
い適切な条件下に培養することからなる適切な宿主中で
異種ポリペプチドを生産する方法。 - （３）組換えプラスミドベクターの１つまたはそれ以上
のコピーを含む宿主細胞を、異種ポリペプチドの発現に
好ましい条件下に培養することからなる適切な宿主中で
異種ポリペプチドを製造する方法であつて、該ベクター
は ａ）バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子
の上流にあり且つ該遺伝子と同じ転写方向にある、適合
性のある誘導可能なプロモータ領域；および ｂ）異種ポリペプチドをコードする構造ＤＮＡ配列の上
流にあり且つ該配列と同じ転写方向にあるバクテリオフ
ァージＴ７プロモーター領域；を有している上記方法。 - （４）上記バクテリオファージＴ７プロモーター領域が
、組換えプラスミドベクター中でバクテリオファージＴ
７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を転写するのに必要な方向
と反対の方向性を有する特許請求の範囲第３項記載の方
法。 - （５）上記宿主が細菌である特許請求の範囲第１項〜第
４項のいずれか１項に記載の方法。 - （６）上記宿主がＥ．ｃｏｌｉである特許請求の範囲第
５項記載の方法。 - （７）所望するポリペプチドを特定する構造ＤＮＡ配列
と結合し、且つ該配列と同じ転写方向にあるバクテリオ
ファージＴ７プロモーター領域を有するＤＮＡフラグメ
ント。 - （８）上記ＤＮＡフラグメントが、宿主細菌細胞を形質
転換するのに適する組換えプラスミドベクター中に含ま
れている特許請求の範囲第７項記載のＤＮＡフラグメン
ト。 - （９）ａ）バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子と結合し、且つ該遺伝子と同じ転写方向にある誘
導可能なプロモーター領域；およびｂ）所望するポリペ
プチドを特定する構造ＤＮＡ配列の上流にあり且つ該配
列と同じ転写方向にあるバクテリオファージＴ７プロモ
ーター領域；を有しているＤＮＡフラグメント。 - （１０）細菌宿主細胞の形質転換に適している組換えプ
ラスミドベクター中に含まれている特許請求の範囲第９
項記載のＤＮＡフラグメント。 - （１１）上記バクテリオファージＴ７プロモーター領域
が、組換えプラスミドベクター中でバクテリオファージ
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を転写するのに必要な方
向と反対の方向性を有する特許請求の範囲第１０項記載
のＤＮＡフラグメント。 - （１２）上記バクテリオファージＴ７プロモーター領域
が、組換えプラスミドベクター中でバクテリオファージ
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を転写するのに必要な方
向と同じ方向性を有する特許請求の範囲第１０項記載の
ＤＮＡフラグメント。 - （１３）所望するポリペプチドを特定する構造ＤＮＡ配
列と結合し、且つ該配列と同じ転写方向にあるバクテリ
オファージＴ７プロモーター領域を有している組換えプ
ラスミドベクターの少なくとも１つのコピーを有してい
る形質転換された宿主細胞。 - （１４）細菌である特許請求の範囲第１３項記載の宿主
細胞。 - （１５）バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺
伝子と結合し且つ該遺伝子と同じ転写方向にある誘導可
能なプロモーター領域を有している第２の組換えプラス
ミドベクターの少なくとも１つのコピーを更に含む特許
請求の範囲第１３項または第１４項に記載の形質転換さ
れた宿主細胞。 - （１６）ａ）バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子の上流にあり且つ該遺伝子と同じ転写方向にあ
る誘導可能な適合性プロモーター領域；および ｂ）所望するポリペプチドを特定する構造ＤＮＡ配列の
上流にあり且つ該配列と同じ転写方向にあるバクテリオ
ファージＴ７プロモーター領域；を有している組換えプ
ラスミドベクターの少なくとも１つのコピーを有する形
質転換された宿主。 - （１７）細菌である特許請求の範囲第１６項記載の宿主
。 - （１８）組換えプラスミドベクター中に存在する上記バ
クテリオファージＴ７プロモーター領域が、同じく該ベ
クター中に存在するバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリ
メラーゼ遺伝子を転写するのに必要な方向と反対の方向
性を有する特許請求の範囲第１６項または第１７項記載
の形質転換された宿主。 - （１９）バクテリオファージＴ７プロモーター領域およ
び、そのすぐ下流に所望するポリペプチドを特定する構
造ＤＮＡ配列の挿入のための少なくとも１つの制限酵素
認識部位を有する組換えプラスミドベクター。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66099984A | 1984-10-15 | 1984-10-15 | |
| US660999 | 1984-10-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61100197A true JPS61100197A (ja) | 1986-05-19 |
Family
ID=24651777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60228563A Pending JPS61100197A (ja) | 1984-10-15 | 1985-10-14 | バクテリオフアージｔ７のプロモーターおよび遺伝子配列を利用する新規発現系 |
Country Status (2)
| Country | Link |
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63289A (ja) * | 1986-03-27 | 1988-01-05 | モンサント カンパニ− | バクテリアにおける新規リボゾ−ム結合部位を用いたタンパク生産の増強 |
| JPH04506302A (ja) * | 1989-10-19 | 1992-11-05 | シェリング・コーポレーション | バクテリオファージｔ７プロモーター及び遺伝子配列を用いる新規な発現系 |
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Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5693489A (en) * | 1984-03-30 | 1997-12-02 | Associated Universities, Inc. | Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase |
| US5232840A (en) * | 1986-03-27 | 1993-08-03 | Monsanto Company | Enhanced protein production in bacteria by employing a novel ribosome binding site |
| US5266474A (en) * | 1987-06-24 | 1993-11-30 | Genentech, Inc. | Balanced inducible transcription system |
| CA1340506C (en) * | 1987-11-24 | 1999-04-20 | Nicholas H. Carbonetti | Production of gonorrheal pi proteins and vaccines |
| EP0406738A3 (en) * | 1989-07-03 | 1991-08-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production of acidic fgf protein |
| JPH0343088A (ja) * | 1989-09-29 | 1991-02-25 | Takeda Chem Ind Ltd | ａＦＧＦ蛋白質の製造法 |
| CA2070989A1 (en) * | 1989-12-19 | 1991-06-20 | Kazuaki Kitano | Production of human basic fgf mutein |
| FR2666813A1 (fr) * | 1990-09-18 | 1992-03-20 | Rhone Poulenc Sante | Procede microbiologique de preparation de l'apolipoproteine aiv humaine ou de derives de celle-ci. |
| ATE125299T1 (de) * | 1990-09-28 | 1995-08-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Synthetisches gen für menschliches parathyroidhormon. |
| GB2278358B (en) | 1992-02-27 | 1995-07-26 | Lynxvale Ltd | Heterologous gene expression in Lactococcus,and the expression products therefrom |
| FR2714062B1 (fr) * | 1993-12-22 | 1996-02-16 | Bio Merieux | Promoteur modifié pour ARN polymérase, sa préparation et ses applications. |
| CA2140081C (en) * | 1994-01-13 | 2008-04-01 | Dean L. Engelhardt | Process, construct and conjugate for producing multiple nucleic acid copies |
| US6986985B1 (en) | 1994-01-13 | 2006-01-17 | Enzo Life Sciences, Inc. | Process for producing multiple nucleic acid copies in vivo using a protein-nucleic acid construct |
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| US5807702A (en) * | 1995-02-27 | 1998-09-15 | Abbott Laboratories | Method for expressing phosphorylated recombinant human β-casein in a bacterial system |
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| CA2213734A1 (en) * | 1995-02-27 | 1996-09-06 | Abbott Laboratories | A plasmid for expressing modified recombinant proteins in a bacterial system |
| US5830690A (en) * | 1995-12-29 | 1998-11-03 | Council Of Scientific & Indus. Res. & Dept. Of Biotech. | Process for producing polypeptides |
| FR2782094B1 (fr) * | 1998-08-07 | 2002-03-01 | Centre Nat Rech Scient | Souches mutantes de e. coli et leur utilisation pour la production de polypeptides recombinants |
| US20030166282A1 (en) | 2002-02-01 | 2003-09-04 | David Brown | High potency siRNAS for reducing the expression of target genes |
| US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
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| WO2005087932A2 (en) * | 2003-10-03 | 2005-09-22 | Promega Corporation | Vectors for directional cloning |
| US20060142228A1 (en) | 2004-12-23 | 2006-06-29 | Ambion, Inc. | Methods and compositions concerning siRNA's as mediators of RNA interference |
-
1985
- 1985-10-11 EP EP85307299A patent/EP0178863A1/en not_active Withdrawn
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63289A (ja) * | 1986-03-27 | 1988-01-05 | モンサント カンパニ− | バクテリアにおける新規リボゾ−ム結合部位を用いたタンパク生産の増強 |
| JP2769541B2 (ja) * | 1987-06-24 | 1998-06-25 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | 平衡型構成誘導性転写系 |
| JPH04506302A (ja) * | 1989-10-19 | 1992-11-05 | シェリング・コーポレーション | バクテリオファージｔ７プロモーター及び遺伝子配列を用いる新規な発現系 |
| JP2011083296A (ja) * | 2003-10-03 | 2011-04-28 | Promega Corp | 方向性クローニング用ベクター |
| US9018014B2 (en) | 2003-10-03 | 2015-04-28 | Promega Corporation | Vectors for directional cloning |
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| US9469857B2 (en) | 2003-10-03 | 2016-10-18 | Promega Corporation | Vectors for directional cloning |
| JP2018514231A (ja) * | 2015-04-30 | 2018-06-07 | エンゲネス・ビオテヒ・ゲーエムベーハーＥｎｇｅｎｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｇｍｂｈ | 増殖とタンパク質生成との分離 |
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