JPS6072874A - ２，１，３−ベンゾオキサジアゾ−ルの新規誘導体 - Google Patents
２，１，３−ベンゾオキサジアゾ−ルの新規誘導体Info
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- JPS6072874A JPS6072874A JP58178313A JP17831383A JPS6072874A JP S6072874 A JPS6072874 A JP S6072874A JP 58178313 A JP58178313 A JP 58178313A JP 17831383 A JP17831383 A JP 17831383A JP S6072874 A JPS6072874 A JP S6072874A
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- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
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- C07D271/12—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
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- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、アミンおよび／又はチオールの検出Ｏ定量の
際に発螢光剤として用いることのできる２゜１、３−ベ
ンゾオキサジアゾールの新規誘導体に関する。
際に発螢光剤として用いることのできる２゜１、３−ベ
ンゾオキサジアゾールの新規誘導体に関する。
チオールを検出・定量する際の発螢光試薬としては、従
来よりＮ置換マレイミド〔町田等Ｏｈｅｍ。
来よりＮ置換マレイミド〔町田等Ｏｈｅｍ。
Ｐｈａｒｍ、 Ｂｕｌｌ、 （Ｔｏｋｙｏ）２５ 、１
６７８（１９７７） 、や奈良等Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏ１
．Ｏｈｅｍ、４２，７９３（１９７８） ） ＃ダンシ
ルアシリジン［：Ｆａｈｅｙ Ｒ，Ｏ，等Ａｎａ１．
Ｂｉｏｅｈｅｍ。
６７８（１９７７） 、や奈良等Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏ１
．Ｏｈｅｍ、４２，７９３（１９７８） ） ＃ダンシ
ルアシリジン［：Ｆａｈｅｙ Ｒ，Ｏ，等Ａｎａ１．
Ｂｉｏｅｈｅｍ。
１０７．１（１９８０））、ビメイン（Ｌａｎｋｍｙｒ
Ｅ、Ｐ。等Ｊ、Ｏｈｒｏｍａｌｏｇｒ、 ２２２．２
４９ （１９８１） ）およびアンモニウム７−りｐロ
ー２．１．３−ベンゾオキサジアゾール−４−スルフォ
ネート（以下ｒ Ｓ Ｂ Ｄ ”’ ｏｎ」と略す）
ＣＡｎｄｒｅｗａ、 Ｊ、 Ｌ。等Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ 。
Ｅ、Ｐ。等Ｊ、Ｏｈｒｏｍａｌｏｇｒ、 ２２２．２
４９ （１９８１） ）およびアンモニウム７−りｐロ
ー２．１．３−ベンゾオキサジアゾール−４−スルフォ
ネート（以下ｒ Ｓ Ｂ Ｄ ”’ ｏｎ」と略す）
ＣＡｎｄｒｅｗａ、 Ｊ、 Ｌ。等Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ 。
２１４．３８６（１９８２））などが知られている。
これ等のうち、５ＢＤ−Ｏｊ！は水に対する溶解性が優
れていること、チオール基との複合体の安定性が良好で
あること、等の点で他の発螢光試薬に比べ、タンパク質
中のチオールの検出・定量など生物学的な応用性が広い
旨述べられている［：Ａｎｄ−ｒｅｗｓ Ｊ、 Ｌ、等
Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ２
１４９３８６ （１９８２））。
れていること、チオール基との複合体の安定性が良好で
あること、等の点で他の発螢光試薬に比べ、タンパク質
中のチオールの検出・定量など生物学的な応用性が広い
旨述べられている［：Ａｎｄ−ｒｅｗｓ Ｊ、 Ｌ、等
Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ２
１４９３８６ （１９８２））。
しかしながら、５ＢＤ−０４！のチオールに対する反応
性は、低く、本発明者が検討したところによると、アル
カリ性水溶液（ｐＨＩ Ｏ）中、４０℃で１時間、さら
に室温で２４時間反応させてもチオールとの反応率はわ
ずかに数％でしかなく、従って低濃度のチオールの定量
に用いることができなかった〇 一方、アミンを検出・定量する際に用いられる発螢光試
薬としては、７−り四ロー４−二Ｆロー２、１．３−ベ
ンゾオキサジアゾール（以下ｒＮＢＤ−ＯＡＪと略す）
［Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、 １０８．１５５（１９６８
）〕、［Ａｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、５３．２９０（１
９７３））や７−フルオロ−４−ニトロ−２，１，３−
ベンゾオキサジアゾール〔特開昭５７−７６４５５号〕
等が知られている。
性は、低く、本発明者が検討したところによると、アル
カリ性水溶液（ｐＨＩ Ｏ）中、４０℃で１時間、さら
に室温で２４時間反応させてもチオールとの反応率はわ
ずかに数％でしかなく、従って低濃度のチオールの定量
に用いることができなかった〇 一方、アミンを検出・定量する際に用いられる発螢光試
薬としては、７−り四ロー４−二Ｆロー２、１．３−ベ
ンゾオキサジアゾール（以下ｒＮＢＤ−ＯＡＪと略す）
［Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、 １０８．１５５（１９６８
）〕、［Ａｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、５３．２９０（１
９７３））や７−フルオロ−４−ニトロ−２，１，３−
ベンゾオキサジアゾール〔特開昭５７−７６４５５号〕
等が知られている。
しかしながら一つの発螢光剤でアミンとチオールの両方
に対し反応性を有し、アミンおよび／又はチオールの検
出・定量に使用し得る化合物は知られていない。
に対し反応性を有し、アミンおよび／又はチオールの検
出・定量に使用し得る化合物は知られていない。
本発明者はアミンおよびチオールの両方に対し選択的に
反応性の高い化合物を得るべく、合成ならびにスクリー
ニングを重ねる中で、７−フルオ０−２．１．３−ベン
ゾオキサジアゾールの４位にスルホニル基を介しである
種の置換基を導入した新規な化合物が、アミンおよびチ
オールの両方に対し極めて高い反応性を示すことを見出
し、本発明を完成した。
反応性の高い化合物を得るべく、合成ならびにスクリー
ニングを重ねる中で、７−フルオ０−２．１．３−ベン
ゾオキサジアゾールの４位にスルホニル基を介しである
種の置換基を導入した新規な化合物が、アミンおよびチ
オールの両方に対し極めて高い反応性を示すことを見出
し、本発明を完成した。
すなわち本発明は式、
「
たは炭素数１〜３のアルキル基）、−０−Ｒ３（但しＲ
３はフェニルまたはベンジル）、または塩素原子である
。〕 で表わされる２、 ｌ、 ３−ベンゾオキサジアゾール
の新規誘導体である。
３はフェニルまたはベンジル）、または塩素原子である
。〕 で表わされる２、 ｌ、 ３−ベンゾオキサジアゾール
の新規誘導体である。
３一
本発明の化合物は文献未載の新規化合物であり、例えば
下記の反応式に沿って７−フルオロ−２，１゜３−ベン
ゾオキサジアゾールとクロロスルホン酸を反応させるこ
とにより、前記式においてＲが塩素である場合に該当す
る新規な化合物７−フルオロ−４Ｊ−りｐルスルホニル
−２，１，３−ベンゾオキサジアゾールが得られ、更に
当該化合物のクロル前記定義に同じ）または−〇−Ｒ３
（但しＲ３は前記定量に同じ）である基と置換すること
によって、同じく本発明の化合物である７−フルオロ−
２，１，３−ベンゾオキサジアゾールの誘導体を得るこ
とが４− 〔反応式〕 上記反応に於いて、反応−■に使用しうる溶媒としては
テトラヒドロ７ラン、ジエチルエーテル。
下記の反応式に沿って７−フルオロ−２，１゜３−ベン
ゾオキサジアゾールとクロロスルホン酸を反応させるこ
とにより、前記式においてＲが塩素である場合に該当す
る新規な化合物７−フルオロ−４Ｊ−りｐルスルホニル
−２，１，３−ベンゾオキサジアゾールが得られ、更に
当該化合物のクロル前記定義に同じ）または−〇−Ｒ３
（但しＲ３は前記定量に同じ）である基と置換すること
によって、同じく本発明の化合物である７−フルオロ−
２，１，３−ベンゾオキサジアゾールの誘導体を得るこ
とが４− 〔反応式〕 上記反応に於いて、反応−■に使用しうる溶媒としては
テトラヒドロ７ラン、ジエチルエーテル。
アセトニトリル、ジオキサン、りｐＯホルム、ジクｐル
メタン、ジクロルエタン、酢酸エチル等の不活性有機溶
媒が挙げられる。また反応−■において使用しうる溶媒
としては、ベンゼン、トルエン、ビリシン。エーテル、
クロロホルム、酢酸エチル等の不活性有機溶媒が挙げら
れる。上記反応（反応−■および反応−■）は通常０℃
〜１１０℃の範囲内で行なうことができるが、好ましく
は５０℃〜６０℃である。反応に要する時間は、反応温
度１反応に供せられる化合物、溶媒等によって異なるが
、反応−■２反応−■共、通常は３０分〜４８時間、好
ましくは１〜２４時間の範囲で適宜選択される。
メタン、ジクロルエタン、酢酸エチル等の不活性有機溶
媒が挙げられる。また反応−■において使用しうる溶媒
としては、ベンゼン、トルエン、ビリシン。エーテル、
クロロホルム、酢酸エチル等の不活性有機溶媒が挙げら
れる。上記反応（反応−■および反応−■）は通常０℃
〜１１０℃の範囲内で行なうことができるが、好ましく
は５０℃〜６０℃である。反応に要する時間は、反応温
度１反応に供せられる化合物、溶媒等によって異なるが
、反応−■２反応−■共、通常は３０分〜４８時間、好
ましくは１〜２４時間の範囲で適宜選択される。
反応混合物からの目的物の単離・精製は常法に従って容
易に行なうことができる。例えば、ジクｐルメタン、り
四ロホルム、酢酸エチルのごとき有機溶媒による抽出、
或は活性炭素、シリカゲル。
易に行なうことができる。例えば、ジクｐルメタン、り
四ロホルム、酢酸エチルのごとき有機溶媒による抽出、
或は活性炭素、シリカゲル。
イオン交換樹脂、デキストラン架橋重合体９スチレン若
しくはアクリル酸エステルの多孔質重合体等を用いた各
種のクロマトグラフィーを適用して行なうことができる
。
しくはアクリル酸エステルの多孔質重合体等を用いた各
種のクロマトグラフィーを適用して行なうことができる
。
出発物質の７−フルオロ−２，１，３−ベンゾオキサジ
アゾールは既知化合物であり、例えばＮｕｎｎ。
アゾールは既知化合物であり、例えばＮｕｎｎ。
等の方法［Ｊ、Ｏｈｅｍ、５ｏｃ（ｃ）１４３３．１９
７０）に従って製造することができる。
７０）に従って製造することができる。
本発明の化合物は、それ自身では螢光を示さないか、あ
るいは極くわずか示す程度であるが、チオールおよび／
又はアミンに対し選択的に反応結合したのち顕著な螢光
を示すことから、その螢光強度を測定することにより検
体中のチオールおよび／又はアミンを検出・定置するこ
とができる。
るいは極くわずか示す程度であるが、チオールおよび／
又はアミンに対し選択的に反応結合したのち顕著な螢光
を示すことから、その螢光強度を測定することにより検
体中のチオールおよび／又はアミンを検出・定置するこ
とができる。
本発明の化合物を発螢光剤として含有する組成物を用い
てチオールおよび／又はアミンを定量する際、良好な反
応性を期待するための好ましい条件は、「■本発明の化
合物とチオールおよび／又はアミンとの反応をアルカリ
性、好ましくは−８〜１０で行なわせる。■この際の反
応温度は２０℃以上、好ましくは３０〜７０℃、反応時
間は１分〜６０分、好ましくは５分〜１５分である。■
反応中の−１を維持するためには緩衝液を用いることが
望ましく、例えばホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、炭
酸緩衝液等が用いられる。中でも特にホウ酸緩衝液がよ
い。■チオール又はアミンと結合して得られた螢光誘導
体を励起させ、生じた螢光強度を測定するための励起波
長および螢光波長は、本発明の化合物がチオールと結合
した螢光誘導体である場合は、励起波長が３６０〜４１
０％ｍ、好ましくは３７０〜４００謁であり、螢光波長
は４８０〜５３０ｓｓｗ好ましくは４９０〜５２０ｓｍ
で７− ある。またアミンと結合した螢光誘導体である場合は、
励起波長が４３０〜ｂ ４４０〜４７０ ｓｓＦあり、螢光波長が５３０〜５８
０語集、好ましくは５４０〜５７０ ｓｍの範囲からそ
れぞれ選択できる。」等である。
てチオールおよび／又はアミンを定量する際、良好な反
応性を期待するための好ましい条件は、「■本発明の化
合物とチオールおよび／又はアミンとの反応をアルカリ
性、好ましくは−８〜１０で行なわせる。■この際の反
応温度は２０℃以上、好ましくは３０〜７０℃、反応時
間は１分〜６０分、好ましくは５分〜１５分である。■
反応中の−１を維持するためには緩衝液を用いることが
望ましく、例えばホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、炭
酸緩衝液等が用いられる。中でも特にホウ酸緩衝液がよ
い。■チオール又はアミンと結合して得られた螢光誘導
体を励起させ、生じた螢光強度を測定するための励起波
長および螢光波長は、本発明の化合物がチオールと結合
した螢光誘導体である場合は、励起波長が３６０〜４１
０％ｍ、好ましくは３７０〜４００謁であり、螢光波長
は４８０〜５３０ｓｓｗ好ましくは４９０〜５２０ｓｍ
で７− ある。またアミンと結合した螢光誘導体である場合は、
励起波長が４３０〜ｂ ４４０〜４７０ ｓｓＦあり、螢光波長が５３０〜５８
０語集、好ましくは５４０〜５７０ ｓｍの範囲からそ
れぞれ選択できる。」等である。
本発明の化合物は多くの特徴を有するが、列記すると次
の如くである。
の如くである。
（１）チオールとアミンの両方に対し選択的に反応し、
かつ反応性が高いので、両者を同時に、かつ高感度に検
出・定量が可能な発螢光試薬として用いられる。
かつ反応性が高いので、両者を同時に、かつ高感度に検
出・定量が可能な発螢光試薬として用いられる。
（２）発螢光試薬として用いる場合、盲検値が低いので
良好な測定感度が期待できる。
良好な測定感度が期待できる。
（３）チオールとアルカリ性条件下で反応させたのち、
反応液の…を２付近にすることにより、螢光強度を増加
させることができる。
反応液の…を２付近にすることにより、螢光強度を増加
させることができる。
（４）溶液状態での安定性が高く、室温で一週間以上も
安定である。
安定である。
（５）チオールとの誘導体およびアミンとの誘導体は安
定性が高く、−が９．５の条件下では冷蔵庫８− 中で一週間以上も安定である。
定性が高く、−が９．５の条件下では冷蔵庫８− 中で一週間以上も安定である。
本発明の化合物は前述の特性から微量のチオールおよび
／又はアミンの螢光定量分析に応用できるばかりでなく
、広く生体組織試料を対象とし顕微鏡の視野内でチオー
ルおよび／又はアミンを検出するような組織学的検査、
チオールおよび／又はアミンを含有する蛋白質、ペプチ
ドの定量、酵素中のチオールおよび／又はアミンの機能
の研究、膜、細胞１組織等の生体中のチオールおよび／
又はアミンの検出とこれら生体構成部分の構造と機能の
関係についての検討、種々の分泌液その硬ｉ床試料中の
チオールおよび／又はアミンの定量を基礎とした代謝、
臨床分析それらの自動化の基礎等、生化学、生理学およ
び基礎、臨床にわたる医学的研究に非常に広範囲の応用
が可能である。
／又はアミンの螢光定量分析に応用できるばかりでなく
、広く生体組織試料を対象とし顕微鏡の視野内でチオー
ルおよび／又はアミンを検出するような組織学的検査、
チオールおよび／又はアミンを含有する蛋白質、ペプチ
ドの定量、酵素中のチオールおよび／又はアミンの機能
の研究、膜、細胞１組織等の生体中のチオールおよび／
又はアミンの検出とこれら生体構成部分の構造と機能の
関係についての検討、種々の分泌液その硬ｉ床試料中の
チオールおよび／又はアミンの定量を基礎とした代謝、
臨床分析それらの自動化の基礎等、生化学、生理学およ
び基礎、臨床にわたる医学的研究に非常に広範囲の応用
が可能である。
本願発明の化合物の中から７−フルオ０−４−スル７ア
モイル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（以下ｒ
８ Ｂ Ｄ −８０２ＮＨ２Ｊと略す）と７−フルオ
ロ−４−フェノキシスルホニル−２，１，３−ベンゾオ
キサジアゾール（以下ｒｓ Ｂ Ｄ −ｓｏ３甜序！代
表側として取り上げ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システィンお
よびＬ−プロリンを用いてチオールおよびアミンとの反
応性を以下の参考例の如く検討した。
モイル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（以下ｒ
８ Ｂ Ｄ −８０２ＮＨ２Ｊと略す）と７−フルオ
ロ−４−フェノキシスルホニル−２，１，３−ベンゾオ
キサジアゾール（以下ｒｓ Ｂ Ｄ −ｓｏ３甜序！代
表側として取り上げ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システィンお
よびＬ−プロリンを用いてチオールおよびアミンとの反
応性を以下の参考例の如く検討した。
〔参考例−１〕
Ｎ −７セｆ／ｌｚ−Ｌ −システィンを５ＢＤ−８Ｏ
３ｐｈおよび８ Ｂ Ｄ −ＳＯ２ＮＨ２とそれぞれ反
応させた後の溶液のｐＨと螢光強度との関係を検討した
。
３ｐｈおよび８ Ｂ Ｄ −ＳＯ２ＮＨ２とそれぞれ反
応させた後の溶液のｐＨと螢光強度との関係を検討した
。
（Ａ） Ｓ Ｂ Ｄ −５Ｏ３ｐｈ ２．９■をアセト
ニトリルに溶解し、全量を１．０ ｆｆ１ｌｌとした。
ニトリルに溶解し、全量を１．０ ｆｆ１ｌｌとした。
（Ｂ） ８ Ｂ Ｄ −５Ｏ２ＮＨ２２，２ｖＩｇをア
セトニトリルに溶解し、全量を１． Ｏｔｔｔｌとした
。
セトニトリルに溶解し、全量を１． Ｏｔｔｔｌとした
。
Ｎ−アセチル−Ｌ−システィン１６．３■を１ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸２Ｎａ（以下ｒＥＤＴＡＪとする）
水溶液に溶かし、全量を１００ｉＪとした。
レンジアミン四酢酸２Ｎａ（以下ｒＥＤＴＡＪとする）
水溶液に溶かし、全量を１００ｉＪとした。
次いでこれより１１１ｅを分取し、１ｗＭＢＤＴＡを含
む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ（＝ ８．０ ）で全社
を１゜友ｊとした。
む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ（＝ ８．０ ）で全社
を１゜友ｊとした。
■上記の如くして作製した■の被検サンプルを０゜１１
− ５−ずつ２回分取し、一方には■−（Ａ）の試液を、ま
た他方には■−■）の試液をそれぞれ０．５１ずつ加え
て６０℃で３０分間反応させた。次いでこれらの反応液
より各０．１−ずつを分取し、それぞれにｐ）Ｉ緩衝域
の異なった０、 ０５ Ｍ濃度の適当な綬衝液を加えて
全社をそれぞれ１１〃ｅとした後、螢光強度を測定した
。また同様にして検体ブランクの螢光強度を測定した。
− ５−ずつ２回分取し、一方には■−（Ａ）の試液を、ま
た他方には■−■）の試液をそれぞれ０．５１ずつ加え
て６０℃で３０分間反応させた。次いでこれらの反応液
より各０．１−ずつを分取し、それぞれにｐ）Ｉ緩衝域
の異なった０、 ０５ Ｍ濃度の適当な綬衝液を加えて
全社をそれぞれ１１〃ｅとした後、螢光強度を測定した
。また同様にして検体ブランクの螢光強度を測定した。
この結果を表−■に示した。
反応終了後、溶液のｐＨを下げることにより高い螢光強
度を得られることがこの表から明らかである。
度を得られることがこの表から明らかである。
表−■
〔参考例−２〕
発Ｗ光試液とＮ−アセチル−Ｌ−システィンとの反応性
を検討した。
を検討した。
■発螢光試液の作製
（Ａ）ＳＢＤ−８Ｏ３ｐｈ ２．ｌ１％ｌを全量が１０
ｄになるようにアセトニトリルに俗解した。
ｄになるようにアセトニトリルに俗解した。
（Ｂ） ８ Ｂ Ｄ−ＳＯ２ＮＨ２２，２■を全量が１
０ｙＩＬｌになるようにアセトニトリルに溶解した。
０ｙＩＬｌになるようにアセトニトリルに溶解した。
■被検サンプルの作製
Ｎ−アセチル−Ｌ−システィン１６．３ｗｇを１ｍＭＥ
ＤＴ人水溶液で全量が１００−になるように溶解した。
ＤＴ人水溶液で全量が１００−になるように溶解した。
次いでこれから各１１ずつを分取し、一方には１ｍＭ
Ｅ Ｄ Ｔ Ａを含むｐＨｓ、 ０の０．１ Ｍはう酸
緩衝液を加え、他方には…９．５の同緩衝液を加えてそ
れぞれ全量を１００−とした（前者を「サンプル−ＩＪ
、後者を「サンプル−■」とする）。
Ｅ Ｄ Ｔ Ａを含むｐＨｓ、 ０の０．１ Ｍはう酸
緩衝液を加え、他方には…９．５の同緩衝液を加えてそ
れぞれ全量を１００−とした（前者を「サンプル−ＩＪ
、後者を「サンプル−■」とする）。
■、上記■の如くして作製したサンプル−■およびサン
プル−■を１１！１１ずつ分取したものにそれぞれ■の
発螢光試液１１！ｌ加えたものを６０’Ｃで５分〜３０
分の間で予め設定した時間インキユベートした後、反応
液の−を０． Ｉ Ｎ塩酸で２．０に調整してから螢光
強度を測定した。この結果を第１図に示した。
プル−■を１１！１１ずつ分取したものにそれぞれ■の
発螢光試液１１！ｌ加えたものを６０’Ｃで５分〜３０
分の間で予め設定した時間インキユベートした後、反応
液の−を０． Ｉ Ｎ塩酸で２．０に調整してから螢光
強度を測定した。この結果を第１図に示した。
Ｓ Ｂ Ｄ −５ｏ３ｐｈ、 ８ Ｂ Ｄ −ＳＯ２Ｎ
Ｈ２とも反応時の−が８．０の場合は２０〜３０分で反
応が最大に達した。また反応時の−１が９．５の場合は
５〜１５分で反応が最大に達した。また両者とも反応が
最大に達した後はほぼ一定の螢光強度を示した。
Ｈ２とも反応時の−が８．０の場合は２０〜３０分で反
応が最大に達した。また反応時の−１が９．５の場合は
５〜１５分で反応が最大に達した。また両者とも反応が
最大に達した後はほぼ一定の螢光強度を示した。
〔参考例−３〕
発螢光試薬とＬ−プロリンとの反応性を横側した。
■発螢光試液の作製
（Ａ） ８［）−５ｏ３ｐｈ ２．９１１１９を全量が
Ｎｏｄになるようにアセトニトリルに溶解した。
Ｎｏｄになるようにアセトニトリルに溶解した。
（Ｂ） ５ＢＤ−８０２ＮＨ２２，２ａｐを全量が１０
ｔｎｌになるようにアセトニトリルに溶解した。
ｔｎｌになるようにアセトニトリルに溶解した。
（ＯＮ Ｂ Ｄ−Ｏｎ （公知化合物）２．０■を全量
が１０１１Ｉｌになるようにアセトニトリルに溶解した
。
が１０１１Ｉｌになるようにアセトニトリルに溶解した
。
■被検サンプルの作製
Ｌ−プロリン１１．５■を１００ｍｅの水に溶解した。
次いで１ｄを分取し、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐｌ（−
８，０）で全量を１００１とした。
８，０）で全量を１００１とした。
■、前記■の如くして作製した被検サンプル１．０πｌ
に■の発螢光試液１．０ ｍｌを加え、６０℃で５〜６
０分間の間で予め設定した時間インキュベートしたのち
、０．ＩＮ塩酸０．４ ｒｔｌを加えてから螢光強度を
測定した。その結果を第２図に示した。図中Ｎｅｔ螢光
強度は各発螢光試薬とも６０℃で６０分間反応させたと
きの螢光強度を１００としたときの相対値である。
に■の発螢光試液１．０ ｍｌを加え、６０℃で５〜６
０分間の間で予め設定した時間インキュベートしたのち
、０．ＩＮ塩酸０．４ ｒｔｌを加えてから螢光強度を
測定した。その結果を第２図に示した。図中Ｎｅｔ螢光
強度は各発螢光試薬とも６０℃で６０分間反応させたと
きの螢光強度を１００としたときの相対値である。
この図から本発明の化合物のアミンに対する反応性は、
従来公知のＮ Ｂ Ｄ−Ｏｆに比し同等またはそれ以上
であることがわかる。
従来公知のＮ Ｂ Ｄ−Ｏｆに比し同等またはそれ以上
であることがわかる。
次に実施例によって本発明を説明する。
実施例１゜
７−フルオロ−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール３
． Ｏｆを１０ｍＪのクロロホルムに溶解させたのち、
０℃にてクロロスルホン酸１１． Ｏｒｘｌ！を滴下ｔ
。
． Ｏｆを１０ｍＪのクロロホルムに溶解させたのち、
０℃にてクロロスルホン酸１１． Ｏｒｘｌ！を滴下ｔ
。
た。室温で１時間反応させ、さらに２時間還流した。次
いで反応液を２００１の氷水中に移したのち手早くクロ
ロホルムで抽出した。抽出液を水洗、硫酸マグネシウム
で乾燥後濾過し、Ｆ液を減圧濃縮した。残渣を採りクロ
ロホルムを移動相とするシリカゲルカラムクロマトグラ
フィー（２副ｘ６０譚）に付し、５ｗｌずつ７ラクシｌ
ンした。それぞれの７ラクシヨンを薄層クロマトグラフ
ィー（シー１５− リカゲル、りｐロホルム）にて精査し、Ｒｆ値が約０．
５０の７ラクシヨンを集め減圧濃縮し融点６４〜６６℃
の淡褐色針状結晶４．Ｏｆを得た。
いで反応液を２００１の氷水中に移したのち手早くクロ
ロホルムで抽出した。抽出液を水洗、硫酸マグネシウム
で乾燥後濾過し、Ｆ液を減圧濃縮した。残渣を採りクロ
ロホルムを移動相とするシリカゲルカラムクロマトグラ
フィー（２副ｘ６０譚）に付し、５ｗｌずつ７ラクシｌ
ンした。それぞれの７ラクシヨンを薄層クロマトグラフ
ィー（シー１５− リカゲル、りｐロホルム）にて精査し、Ｒｆ値が約０．
５０の７ラクシヨンを集め減圧濃縮し融点６４〜６６℃
の淡褐色針状結晶４．Ｏｆを得た。
元素分析値 ０６Ｈ２Ｎ２０３０１’ＳとしてＯＨＮ
理論値（財） ３０．４６ ０．８５ １１．８４実測
値（１） ３０．４８ ０．６１ １１．７０実施例２
゜ 実施例１で得た化合物１ｆをとり、これに水冷下２８％
アンモニア水１ｄを滴下した。０℃で１時間反応させた
後、水５０ｄを加えた。濾過によって不溶物を除去した
後、Ｆ液を減圧濃縮した。
値（１） ３０．４８ ０．６１ １１．７０実施例２
゜ 実施例１で得た化合物１ｆをとり、これに水冷下２８％
アンモニア水１ｄを滴下した。０℃で１時間反応させた
後、水５０ｄを加えた。濾過によって不溶物を除去した
後、Ｆ液を減圧濃縮した。
残渣をクロロホルム−アセトニトリル（容積比１：１）
を移動相とするシリカゲルカラムク鴛マドグラフィー（
２ｃｍ Ｘ ６０ ａｘ ）に付し２ｄずつフラクショ
ンした。それぞれの７ラクシヨンを薄層クロマトグラフ
ィー〔シリカゲル、りＥ２９ホルム−アセトニトリル（
容積比１：１））にて精査し、１６− Ｒｆ値が０．７５付近のフラクションを集め減圧濃縮し
、得られた物質をベンゼン−ヘキサン（容積比２：１）
から再結晶して融点１４５〜１４７℃の白色板状結晶０
．４ｆを得た。
を移動相とするシリカゲルカラムク鴛マドグラフィー（
２ｃｍ Ｘ ６０ ａｘ ）に付し２ｄずつフラクショ
ンした。それぞれの７ラクシヨンを薄層クロマトグラフ
ィー〔シリカゲル、りＥ２９ホルム−アセトニトリル（
容積比１：１））にて精査し、１６− Ｒｆ値が０．７５付近のフラクションを集め減圧濃縮し
、得られた物質をベンゼン−ヘキサン（容積比２：１）
から再結晶して融点１４５〜１４７℃の白色板状結晶０
．４ｆを得た。
元素分析値 ０＠Ｈ４Ｎ３０３ＦＳとして０ ）（Ｎ
理論値（２） ３３．１８ １．８６ １９．３５実測
値（至） ３３．１１ １．８２ １９．２７実施例３
６ 合成 実施例１で得た化合物１．０■にジメチルアミンの４０
％水滴液を水冷下部下し、０℃で３０分間反応させた。
値（至） ３３．１１ １．８２ １９．２７実施例３
６ 合成 実施例１で得た化合物１．０■にジメチルアミンの４０
％水滴液を水冷下部下し、０℃で３０分間反応させた。
次いでＩＮ塩酸１ ’００ ｗｇを加え、エチルエーテ
ルで抽出、水洗の後エチルエーテル層を採り、硫酸マグ
ネシウムで乾燥、濾過しだ後Ｆ液を減圧濃縮して残渣を
得た。この残渣をりｐロホルムを移動相とするシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（２ｃｍＸ６０国）に付し
、２耐ずつ７ラクションした。それぞれの７ラクシヨン
を薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、りｐロホルム
）にて精査し、 Ｒｆ値が０．４１付近のフラクション
を集め減圧濃縮した。残渣をπ−ヘキサンで洗滌後、ヘ
キサン−ベンゼン（容積比９５：５）より再結晶し、融
点１６１〜１６２℃の黄色針状晶０．３ｆを得た。
ルで抽出、水洗の後エチルエーテル層を採り、硫酸マグ
ネシウムで乾燥、濾過しだ後Ｆ液を減圧濃縮して残渣を
得た。この残渣をりｐロホルムを移動相とするシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（２ｃｍＸ６０国）に付し
、２耐ずつ７ラクションした。それぞれの７ラクシヨン
を薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、りｐロホルム
）にて精査し、 Ｒｆ値が０．４１付近のフラクション
を集め減圧濃縮した。残渣をπ−ヘキサンで洗滌後、ヘ
キサン−ベンゼン（容積比９５：５）より再結晶し、融
点１６１〜１６２℃の黄色針状晶０．３ｆを得た。
元素分析値 ０＠ＨＢＮ３０３Ｆ８としてＯＨＮ
理論値（至） ３９．１８ ３．２９ １７．１３実測
値（至） ３９．３７ ３．２３ １７．２９実施例４
゜ 実施例１で得た化合物１．Ｏｆとフェノール１ｆヲヘン
ゼン５ ｍｌに溶解した。次いでこれにベンゼン５１ｉ
Ｌｌとピリジン１１１Ｉ！との混合溶液を水冷上滴下し
たのち、室温で４時間反応させた。１０％塩酸水溶液５
０ｍ１にこの反応液を水冷上滴下したのち、ベンゼンで
抽出、水洗、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した
。残渣をクロロホルムを移動相とするシリカゲルカラム
クロマトグラフィー（２釧×６０α）に付し、２ｗｒｌ
ずつフックシ１ンした。
値（至） ３９．３７ ３．２３ １７．２９実施例４
゜ 実施例１で得た化合物１．Ｏｆとフェノール１ｆヲヘン
ゼン５ ｍｌに溶解した。次いでこれにベンゼン５１ｉ
Ｌｌとピリジン１１１Ｉ！との混合溶液を水冷上滴下し
たのち、室温で４時間反応させた。１０％塩酸水溶液５
０ｍ１にこの反応液を水冷上滴下したのち、ベンゼンで
抽出、水洗、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した
。残渣をクロロホルムを移動相とするシリカゲルカラム
クロマトグラフィー（２釧×６０α）に付し、２ｗｒｌ
ずつフックシ１ンした。
それぞれの７ラクシヨンを薄層クロマトグラフィー（シ
リカゲル、クロロホルム）にて精査し、 Ｒｆ値が０．
７３付近の７ラクシヨンを集め減圧濃縮後、２−ヘキサ
ンより再結晶して融点１２０〜１２１℃の白色針状晶０
．４１を得た。
リカゲル、クロロホルム）にて精査し、 Ｒｆ値が０．
７３付近の７ラクシヨンを集め減圧濃縮後、２−ヘキサ
ンより再結晶して融点１２０〜１２１℃の白色針状晶０
．４１を得た。
元素分析値 ０１２Ｈ７Ｎ２０４ＦＳとしてＯＨＮ
理論値（財） ４８．９８ ２．４０ ９．５２実測ｉ
１（至） ４９．１７ ２．３８ ９．４７実施例５゜ 実施例１で得た化合物１グとベンジルアルコール１ ｍ
ｌをベンゼン５ ｔｔｔｌに溶解した。次いでこれにピ
リジン１ ｗｅとベンゼン５−の混合溶液を滴下したの
ち室温で１時間反応させた。反応後１０％塩酸水溶液５
０ｄにこの反応液を滴下したのちクロ１９− ロホルムで抽出、水洗、硫酸マグネシウムで乾燥後、減
圧濃縮した。残渣をベンゼンを移動相とするシリカゲル
カラムクロマトグラフィー（２ｃｔｎ×６０ ａｎ ）
に付し、２１ずつフラクションした。それぞれの７ラク
シヨンを薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、りｐロ
ホルム）にて精査し、Ｒｆ値が０．７１付近の７ラクシ
ヨンを集め、減圧濃縮後、３−ヘキサン−ベンゼン（容
積比９５：５）より再結晶し、融点１６０〜１６１℃の
白色板状晶０．４２を得た。
１（至） ４９．１７ ２．３８ ９．４７実施例５゜ 実施例１で得た化合物１グとベンジルアルコール１ ｍ
ｌをベンゼン５ ｔｔｔｌに溶解した。次いでこれにピ
リジン１ ｗｅとベンゼン５−の混合溶液を滴下したの
ち室温で１時間反応させた。反応後１０％塩酸水溶液５
０ｄにこの反応液を滴下したのちクロ１９− ロホルムで抽出、水洗、硫酸マグネシウムで乾燥後、減
圧濃縮した。残渣をベンゼンを移動相とするシリカゲル
カラムクロマトグラフィー（２ｃｔｎ×６０ ａｎ ）
に付し、２１ずつフラクションした。それぞれの７ラク
シヨンを薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、りｐロ
ホルム）にて精査し、Ｒｆ値が０．７１付近の７ラクシ
ヨンを集め、減圧濃縮後、３−ヘキサン−ベンゼン（容
積比９５：５）より再結晶し、融点１６０〜１６１℃の
白色板状晶０．４２を得た。
元素分析値 ０１３Ｈ９Ｎ２０４ＦＳとしてＯＨＮ
理論値（至） ５０．６５ ２．９４ ９．０９実測値
（至） ５０．６４ ２．９３ ９．２２・（１１ ２０−
（至） ５０．６４ ２．９３ ９．２２・（１１ ２０−
第１図は本発明の化合物の一つである５ＢＤ−８Ｏ３ｐ
ｈおよび１９ Ｂ Ｄ −８０２ＮＨ２を発螢光剤とし
て、各々Ｎ−アセチル−Ｌ−システィンと反応させたと
きの反応時間と螢光強度の関係を示すグラフである。図
中０−０は発螢光剤が５ＢＤ−８０３ｐｈであり、反応
時の…を８．０とした場合である。以下同様に△−Δは
８ＢＤ−５Ｏ２Ｉ／ＮＨ２，ｐＨ千８．０、・−・は８
Ｂ Ｄ −８０３ｐｈ ＃ Ｐ”＝ ９．５、ムーム
は８ Ｂ Ｄ −８０２ＮＨ２。 ｐＨ＝ ９．５である。 第２図は本発明の化合物の一つである５ＢＤ−８０３ｐ
ｈと８ Ｂ Ｄ−ＳＯ２ＮＨ２を、また従来公知のＮＢ
Ｄ −Ｏｎをそれぞれ発螢光剤として、Ｌ−プロリン
と反応させたときの反応時間と強光強度の関係を示すグ
ラフである。図中・−・はＮＢＤ−ＯＡｌ、０−〇は８
Ｂ Ｄ−５ｏ３ｐｈ、 △−Ａは５ＢＤ−８Ｏ２ＮＨ
２の場合をそれぞれ示す。 弔 １ 図 １０ ２０ ３０（■ 第２図 一’０ ６０ （分）
ｈおよび１９ Ｂ Ｄ −８０２ＮＨ２を発螢光剤とし
て、各々Ｎ−アセチル−Ｌ−システィンと反応させたと
きの反応時間と螢光強度の関係を示すグラフである。図
中０−０は発螢光剤が５ＢＤ−８０３ｐｈであり、反応
時の…を８．０とした場合である。以下同様に△−Δは
８ＢＤ−５Ｏ２Ｉ／ＮＨ２，ｐＨ千８．０、・−・は８
Ｂ Ｄ −８０３ｐｈ ＃ Ｐ”＝ ９．５、ムーム
は８ Ｂ Ｄ −８０２ＮＨ２。 ｐＨ＝ ９．５である。 第２図は本発明の化合物の一つである５ＢＤ−８０３ｐ
ｈと８ Ｂ Ｄ−ＳＯ２ＮＨ２を、また従来公知のＮＢ
Ｄ −Ｏｎをそれぞれ発螢光剤として、Ｌ−プロリン
と反応させたときの反応時間と強光強度の関係を示すグ
ラフである。図中・−・はＮＢＤ−ＯＡｌ、０−〇は８
Ｂ Ｄ−５ｏ３ｐｈ、 △−Ａは５ＢＤ−８Ｏ２ＮＨ
２の場合をそれぞれ示す。 弔 １ 図 １０ ２０ ３０（■ 第２図 一’０ ６０ （分）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 式） たは炭素数１〜３のアルキル基）、ＯＲ３（但しＲ３４
１フエニルまたはベンジル）または塩素原子である。〕
で表わされる２、 １．３−ベンゾオキサシア
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58178313A JPS6072874A (ja) | 1983-09-28 | 1983-09-28 | ２，１，３−ベンゾオキサジアゾ−ルの新規誘導体 |
| US06/729,203 US4769467A (en) | 1983-09-28 | 1985-05-01 | Fluorogenic 2,1,3-benzoxadiazoles and fluorometric amine/thiol assays therewith |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58178313A JPS6072874A (ja) | 1983-09-28 | 1983-09-28 | ２，１，３−ベンゾオキサジアゾ−ルの新規誘導体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6072874A true JPS6072874A (ja) | 1985-04-24 |
| JPH0452270B2 JPH0452270B2 (ja) | 1992-08-21 |
Family
ID=16046290
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58178313A Granted JPS6072874A (ja) | 1983-09-28 | 1983-09-28 | ２，１，３−ベンゾオキサジアゾ−ルの新規誘導体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4769467A (ja) |
| JP (1) | JPS6072874A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4769467A (en) * | 1983-09-28 | 1988-09-06 | Oread Laboratories, Inc. | Fluorogenic 2,1,3-benzoxadiazoles and fluorometric amine/thiol assays therewith |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5989840A (en) * | 1997-05-29 | 1999-11-23 | Americare International Diagnostics, Inc. | Estimation of active infection by heliobacter pylori |
| IN188837B (ja) * | 1998-05-22 | 2002-11-09 | Torrent Pharmaceuticals Ltd | |
| CN100425599C (zh) * | 2005-12-31 | 2008-10-15 | 清华大学 | 一种有机电致发光材料及其应用 |
| EP2574193A4 (en) | 2009-12-30 | 2013-12-25 | Oregon State | DETECTION OF A THIOL |
| EP3003145A4 (en) * | 2013-05-30 | 2017-01-25 | Alt Bioscience, Llc. | Apparatus for simultaneous detection of amines and thiols |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU431166A1 (ru) * | 1972-03-29 | 1974-06-05 | Ф. С. Михайлицын | Способ получения сульфонов или сульфонамидов аминобенз-2,1,3-тиадиазола |
| JPS5951270A (ja) * | 1982-09-17 | 1984-03-24 | Kazuhiro Imai | ２−オキサベンゾ−１，３−ジアゾ−ル誘導体およびそれを含むチオ−ル測定用組成物 |
| JPS6072874A (ja) * | 1983-09-28 | 1985-04-24 | Kazuhiro Imai | ２，１，３−ベンゾオキサジアゾ−ルの新規誘導体 |
-
1983
- 1983-09-28 JP JP58178313A patent/JPS6072874A/ja active Granted
-
1985
- 1985-05-01 US US06/729,203 patent/US4769467A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4769467A (en) * | 1983-09-28 | 1988-09-06 | Oread Laboratories, Inc. | Fluorogenic 2,1,3-benzoxadiazoles and fluorometric amine/thiol assays therewith |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4769467A (en) | 1988-09-06 |
| JPH0452270B2 (ja) | 1992-08-21 |
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