JPS6066992A - インタ−フエロン様ポリペプチド，対応遺伝子，対応プラスミド組換体，形質転換した細胞およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不発ＱＪＪは、ヒト−α−インターフェロン（以下、ｈ
ＩＦＮ−αと略記することがある）および遺伝子二［学
的方法によるｈＩＦＮ−αの製造に関する。さらに具体
的には、本発明は、ｈｌＦＮ−α構造遺伝子、対応プラ
スミド組換体および形質転換した細胞をも包含するもの
である。

ヒト−α−インターフェロンは１９５７年１ｓａａｃｓ
およびＬｉｎｄｆＩｎｍａｎｎによりヒト白血球よりき
わめて粗な沈殿物として発見された分子量約２万のタン
ノック質である（　Ｐｒｏｃ、　Ｒｏｙ、Ｓｏｃ、　Ｂ
１．１４７．　２５８〜２６７（１９５７））。この物
質は、一般にウィルス感染した細胞において抗ウィルス
作用をもつクン／ｅり質の合成を誘導するものとして捉
えられている。

インタ−７千口ノ（以下、ｌＦＮと記すこともある）は
、α型以外にも、βｊ６よびｒ型などの物質の存在も知
られており、その由来、抽出精製法および生理活性等は
種々研究されているところである（例えば「蛋白質核Ｍ
酵素Ｊ別冊Ｎ２５、インターフェロン研究の進歩−１２
、（１９８１）参照）。これらのうち、ｈＩＦＮ−αは
現在までに最も広範囲に研究されかつ臨床用に用いられ
てきた物質であり、１９７３年に骨肉腫の転移を抑制し
たとい５龜告（Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ
５ｔ、　、５１．７：（３（１９７３）　以来、抗腫瘍
剤として臨床用に応用の可能性が太きいとして注目を浴
びている。現在、ｈＩＦＮ−αは少なくとも１】柿類あ
るとされ、その構成アミノ酸の数は１６５ないし１６６
である。また、その他の性状についても種々文献がある
（例えば、化学の領域、Ｖｏｌ、３７、克６　（１９８
３）を参照されたい）。

ところで、近年、遺伝子工学の飛躍的な発展に伴なって
、大腸菌等に異種のタンパク質を産生させることが可能
となっており、インターフェロンの産生て関しても既に
種々提案されているところである（ｈＩＦＮ−αに関し
ては、例えば、特開昭５７−７９８９７号ζ同５７−１
５８７９６号、同５８−４７９８号、同５８−４１８４
９号、同５８−６０９９８号および同５８−８８３９９
号各公報等がある）。

発明の概要 要旨 本発明は、新規なｈＩＦＮ−αの構造遺伝子を発見した
こと、そしてこの遺伝子の組込みか可能なベクターを作
製できること、グラスミ１組換体による適当宿主細胞の
形質転換および形質転換体の培養によるＩＦＮ−αの産
生および回収が可能であること、ならびにｈＩＦＮ−α
が抗ウィルス活性を有すること、を確認してなされたも
のである。

従って、本発明によるインターフェロン様ポリペゾチド
は下記のアミノ酸配列式で表わされるポリペプチドから
なること、を特徴とするものである。

Ｃｙａ　−Ａｓ　ｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒ　ｏ−Ｇ　ｌ　ｎ−
Ｔｈ　ｒ−１１ｉ　ｓ　−８ｅ　ｒ−Ｌｅ　ｕ−に　１
ｙ−ＡｌＩｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−１１
ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ＝Ｇ］ｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ
−Ａｒｇ−１１ｅ−８ｅｒ−１１ｉｓ−Ｐｈｅ−８ｅｒ
−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−
Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ
−１１ｅ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｈ４ｓ−Ｇｌｕ−
Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｇｌ　ｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｌ−Ａｓ
ｐ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ａｌ　ａ−Ｔｒｐ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｉ　１ｅ−Ｃ１ｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
−Ｇｌｎ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−ＴＩＩｒ−Ｇｌ　
ｎ−Ｇ１　ｔ＋−Ｖａ　Ｉ−ＧＩｙ−Ｖａ　ｌ−Ｇ１　
ｕ−Ｃ；Ｉｕ−１１ｅ　−Ａｌ　ａ−Ｌｅｕ　−Ｍｅ　
ｔ−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ａｓ　ｐ−８ｅ　ｒ−Ｉ　ｌ
　ｅ−Ｌｅｕ−Ａｌ　ａ−Ｖａ　Ｉ　−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｐｈｃ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅ　ｕ　−Ｍｅ　ｔ−Ｇｌ　ｙ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙ　ｒ−８ｅ　ｒ−Ｐｒ　ｏ−Ｃｙ
ｓ−Ａｌ　ａ　−１”ｒｐ−Ｇｌ　ｕ　−Ｖａ　１−Ｖ
ａ　ｌ−Ａｒｇ−Ａｌ　ａ−Ｇ　Ｉ　ｕ　−ｒ　ｌ　ｅ
　−Ｍｅ　ｔ−Ａｒ＊−８ｅｒ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｐｈ
ｅ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｚ−Ｌｙｓ　＝Ａｓｐ
また本発明によるインターフェロン様ポリペプチド（そ
のアミノ酸配列式は前記の通りである）の製造法は、下
記の工程からなること、を特徴とするものである。

（１）上記アミノ酸配列式で表わされるインターフェロ
ン様ポリペプチドの構造遺伝子を含む遺伝子を用意する
こと。

（２）予定した宿主細胞内で増殖可能なプラスミドにこ
の遺伝子を組み込んで、この細胞内で増殖可能なプラス
ミドａ換体をつくること。

（３）このシラスミドによって、宿主細胞を形質転換さ
せること。

（４）得られる形質転換体を培養し、産生されたインタ
ーフェロン様ポリペプチドを回収すること。

上記において、予定した荷主細胞内で増殖可Ｈしなシラ
スミドは、トリットファンオペロンの発現系およびλフ
ァー、り由来のＰＲ−ＰＬゾロモークーを有する発現系
を利用できるものが代表的であり、両発現系の由来およ
び形質転閃において使用する宿主菌の代表的なものは、
ニジエリギア（Ｅｓｃｈ−ｅｒｌｃｈｉａ　）　属に属
する大腸菌である。

本発明は、また、インターフェロン様ポリペプチド（そ
のアミノ酸配列式は前記の通りである）を表現する構造
遺伝子を含む二本鎖ポリデオキシリｉヌクレオチド、そ
の構造遺伝子を含むシラスミＰ組換体およびそのシラス
ミド組換体によって形質転換されたエシェリキア（Ｆｓ
ｃｈｅｒｌｃｈｉａ　）に属する該ポリペブチＦ産生曲
をも包含するものである。

効果 本発明によれば、新しいＩＦＮ−αが提供される。

従って、本発明によるＩＦＮ−αは、従来のＩＦＮ−α
がそうであったように、ＩＦＮ−αとしての生理活性を
有していて、抗肺瘍剤をはじめ医薬品としての応用が考
えられるだけでなく、新規なボリベゾテ１であるため従
来のＴＦＮ−αとはい（らか）（なった生理活性が期待
できよう。

また、本発明の方法忙よるＩＦＮ−αの産生効率は、従
来法（（よるものと同等あるいはそれ以上である。

なお、副次的なことであるが、本発明において利用され
ているＩＦＮ−αを産生するヒト白血球より直接目的と
する構造Ａ′を伝子なとり出すという技術は、免投グロ
ブリンに代表されるように、発現の際に組換えやυ′ア
レン、ジメントを起こすような遺伝子のクローニングに
は非常に有効となる。また、本発明に利用されているリ
ンカ−およびプラスミドペククーは、本発明に係るＩＦ
Ｎ−α以外の物デ１の発現を行なうに際し有力な手段と
なるであろう。すなわち、本発明による方法は、遺伝子
工学的手法をもって生合成したいわゆる直接発現法（Ｎ
ａｔｕｒｅ、　２８１．５４４（１９７９）　）によっ
て始めから大腸ｉ＆ｊ蛋白質由来のアミノ酸配列を含ま
ない目的イ１ｆ白質を産生させるという最も有力１．ｃ
手段の一つの方法の応用・地回を拡大できることを示唆
するものに他ならない□ 究明の具体的説明 ｈＩＦＮ−α 本発明におけるヒト−α−インターフェロンは、下記の
アミノ酸配列式で示されるポリペプチドである。

Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｎ−Ｔｈ　ｒ
−１（ｉ　５−８ｅ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−４１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−１１ｅ
−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−
Ｌｙ＋＋−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−ＰＩ＋ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌ　ｕ−Ｖａ　
１．−Ｐｈｅ　−Ａｓ　ｐ−Ｇｌｙ−Ａｓ　ｎ−Ｇ１　
ｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌ
ａ−Ｉ　１ｅ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−田５−Ｇｌ　
ｕ−Ｍｅ　ｔ、−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔ
’ｈｅ−Ａ＊ｎ−Ｌａｕ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｐ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａイｒｐ
−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ！Ｉ
ｐ−Ｌ）ｒｓ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔ　１　ｅ−Ｇｌ　ｕ
−１，ｚｅｕ−Ｐｈ　ｅ−ＧＩｎ−ｆ”ｙｌｎ−Ｌｅｕ
−Ａｇｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Δｌａ−Ｃｙｓ−
Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖ
ａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｍｅ
ｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−３ｅｒ−１１ｅ−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒ　ｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈ　
ｅ　−Ｇ　Ｉｎ−Ａｒｇ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−八ｌｌＬ−Ｔｒｐ−
Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１
１ｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−８ｅ　ｒ−Ｐｂｅ−３ｅ　ｒ−
ＰＩ）ｅ−８ｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−Ａ　ｓ　ｎ−Ｌｅ　ｕ
−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ上式中、Ｃｙｓ等は、いうまでもな
く、システィン等のアミノ酸を示す当業界で承認されて
いる記号である。

このポリペプチドは、従来報告されたｈＩＦＮ−αと比
較して、アミノ酸残基の配列番号−ｅ３４（Ｔｙｒ）、
４２（ｖａｌ）、５６（Ａｌａ）、５７（Ｐｈｅ）、１
０１（Ｔｈｒ）、１０９（Ｉｌｅ）、１１０（Ａｌａ）
および１３３（Ｇｌｙ）にお（・て異なって（・る。

なお、従来報告されたｈＩＦＮ−αのアミノ酸配夕１１
＆土、日本臨床、第４０巻、第８号、第８６貞（１９８
２４Ｆ）に記載されたものによった。この文献には、た
とえば、ＩＦＮ−α１と同りおよびＩＦＮ−α２と同Ａ
のように、１ケの遺伝子のポリフォルリズムの可能１つ
：が示されている。

このように、本発明のｈＩＦＮ−αは、従来報告された
ものとアミノ酸残基が８個異なって（・る。これらのア
ミノ酸は、従来報告されたインターフェロンのアミノ酸
配列の中で殆ど１１′ｆｆｉ換σ）みらね、１．【（・
位置にある。従って、本発明のα−Ｉ　Ｆ　Ｎ　；１’
ｉ、’　（云子（ｉ対立遺伝子あるいは、！？リフオル
リズムとレマ考えカ（１く、新しい遺伝子であるといえ
る。

本発明の新規ヒト−α−インターフェロンｉ′ｉ、従来
のヒト−α−インターフェロンと同様、同等の生理活性
、たとえば抗ウィルス活性、を有するので、それ自身で
ＩＦＮ−α様生理活性ポリペブチＦとして使用すること
ができることは前記したところである。

ｈＩＦＮ−αの製造 本発明によるｈｌＦＮ−αは、」−記アミノ酸配列式で
表わされるインターフェロン様ポリペプチドの構造遺伝
子を含む遺伝子を用意し、予定した宿主細胞内で増殖可
能なシラスミドにこの遺伝子を組込んで、この細胞内で
増殖可能なプラスミド組換体をつくること、このプラス
ミドによって、宿主細胞を形質転換させること、および
得られる形質転換体を培養し、産生されたインターフェ
ロン様ポリペプチドを回収すること、からなる方法によ
って製造することができる。

構造遺伝子が新規な塩基配列を持つものであり、従って
生成ポリペプチドが新規なアミノ酸配列のものであるこ
と、を除けば、これらの単位工程およびその結合による
目的ポリペプチドの製造は、分子生物学の分野において
既に公知のものである。

１）構造遺伝子 ＩＦＮ−αを製造するための構造遺伝子（ま、天然物よ
り単離するか、目的の遺伝子が作る蛋白質力ｔある程度
えもれて部分的にでもアミノ酸配列カー夛乏まれば、そ
れをもとに化学脅威してもよ（・。

天然物より単離する場合は、ｌｉ　）白血球より所１（
ｒＦＮに対するメツセンジャーＲＮＡを抽出精製し、こ
れをもとに単一鎖の相補的ＤＮＡを生成させ、これを二
本鎖ＤＮＡにし、このＤＮＡを適当／ｊクローン化のた
めのベクターにおける適当な部位に組込み、このベクタ
ーを用い作製された組換えＤＮＡ分子により適当な宿主
を形質転換するか、ある（・（′！、メツセンジャーＲ
ＮＡ　−＋　ＤＮＡという工程の代わりに、白血球より
直接ゲノムＤＮＡを調製し、これを１Ｊ性戸；４ｊ７ｔ
　′Ｍｊ（１勾配遠心法によりＤＮＡ　ｌｆｆ１片”　
太ｔ　サ−Ｃ：　分ｎ１ｔｉしてＩＦＮ−α構造遺伝子
を含むＤＮＡ画分を得て、以１）ｒトは上記に従うとい
う方法も′Ａｂる。

実験操作のｆｆ易さ、ＩＦＮ構造遺伝子取得σ）　４Ｍ
実性の点等から考慮して、本発明者らの白血球力・ら直
接ゲノムＤＮＡを調製する方法が好まい゛。そσ）一実
施態様は、Ｐｒｏｃ、Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ、、　５５
Ｂ％　４６４（１９７９）を考慮にしてヒト白血球より
ゲノムＤＮＡを調製し、これを中性蔗糖密度勾配遠心法
によりＤＮＡ断片の大きさで分画したのち、ＩＦＮ−α
の構造遺伝子を含む画分を集め、この両分をクローニン
グして形質転換株を得て、この株よりＩＦＮ遺伝子を含
むシラスミドを調製したのち、ＩＦＮ構造遺伝子を切り
出して、以降の組換え操作に用いる、ということからな
る。

前記アミノ酸配列式で表わされるインターフェロン様ぼ
りペゾチドは力ｒ親物質であり、従ってこのポリペプチ
ドを表現する構造遺伝子を含む二本鎖ポリデオキシリボ
ヌクレオチドも新規物質である。

この二本鎖ポリデオキシリ前ヌクレオチ１の具体例は、
前記アミノ酸配列式で表わされるインターフェロン様ポ
リペプチドを表現する構造遺伝子が下記の塩基配列のも
のである。

Ｃｙ、？　Ａｓｐ　Ｌｅｒｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ
　Ｉｒ１ｓ　、５ｅｒ　ｌ−ｕ　ＧｌｙＡ’ｓｎ　Ａｒ
、ｑ　Ａｒ、ｑ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｉｌ　ｔ　Ｌ’ｔｕ
　１．ｓ＋ｒ、　Ａｌａ　ＧｌｎＡＡＴ−Ａ（１−Ａ（
１−ＧＣＣ−Ｔ丁Ｇ−Ａ’ｒＡ−ＣＴＣ−ＣＴＧ−ＧＣ
Ａ−ＣＡＡ−Ｔ１’Ａ−ＴＣＣ−’Ｉ’ＣＣ−ＣＧＧ−
ＡＡＣ−ＴＡＴ−ＧＡＧ−ＧＡＣ−ＣＧＴ−ＧＴＴ＝Ａ
ｆａｔ　Ｇｌｙ　Ｉｒｑ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　ｆｌｉｔ　
Ｐｈｒ　、５ｅｒ　Ｃｙｚ　１．ｅｕＡＴＧ−ＧＧＡ−
ＡＧＡ−ＡＴＣ−ＴＣＴ−ＣＡＴ−ＴＴＣ−ＴＣＣ−Ｔ
ＧＧ−Ｃ’ｒＧ−ＴＡＣ−ＣＣＴ−ＴＣＴ−’ｌ’ＡＧ
−ＡＧＡ−ＧＴＡ−ＡＡＧ−ＡＧＧ−ＡＣＣ−ＣＡＣ−
Ｌｙｚ　／ｆｓｐ　Ａｒｑ　Ｔｙｒ　ｌｈｐ　／’Ａ　
−Ｇｌｙ　／’〕ｌｅ　Ｐｒｎ　ＧｌｎＡＡＧ−ＧＡＣ
−ＡＧＡ−’ｌ’ＡＴ−ＧＡ’ｌ’−’ｒｌ”ｃ−にＧ
Ａ−’］Ｖｌ’Ｃ−ＣＣＣ−ＣＡに−Ｔ’ｌ’Ｃ−Ｃ’
ｒＧ−’ｌ’ｃ　ｒ−ＡＴＡ−Ｃ’ｒＡ−Ａ　Ａ（；　
−ＣＣＩ’−ＡＡＧ　−ＧＧに−ＧＴＣニーにｌｕ　Ｖ
ｅｉｌ　ｌ’Ａｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉｒｎ、Ｇｌｎ　
Ｐｈｔ　Ｇｌｎ　１．ｙ、ｔＧＡＧＧＧＴＧ−ＴＴＴ−
ＧＡＴ−ＧＧ（ニーＡＡＣ−ＣＡＧ−Ｔ’ｒＣ−ＣＡＧ
−ＡＡＧ−ＣＴＣ−ＣＡＣ−ＡＡＡ−ＣＴＡ−ＣＣＧ−
ＴｒＧ−Ｇ’１１Ｃ−ＡＡＧ−Ｇ’ｒＣ−’Ｉ”ＦＣ−
Ａ１．ａ　に〕ｎ　Ｉｌａ　Ｉｌａ　、Ｓｇｒ　Ａｌａ
　ＰＡｅ　Ｆｌｉｐ　Ｇｌｕ　Ａ（ａｔｌｌｇ　Ｇｌｎ
　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｎ　Ｌｅｕ、Ｐｈｅ　
Ｓｔｒ　ＴｈｒＡＴＣ−ＣＡＧ−ＣＡＧ−ＡＣＣ−’ｌ
ｌ’Ｔｃ−ＡＡＴ−ＣＴＣ−ＴＴＣ−ＡＧＣ−ＡＣＡ−
ＴＡＧ−ＧＴＣ−ＧＴＣ−ＴＧＧ−ＡＡＧ−ＴＴＡ−Ｇ
ＡＧ−ＡＡＧ−ＴＣＧ−ＴＧＴ−Ｌｙｚ　Ａｓｐ　Ｓｅ
ｒ　、５ａｒ　イｌａ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｇｌ
ｕ　ＴｈｒＡＡＧ−ＧＡＴ−ＴＣＡ−ＴＣＴ−ＧＣＴ−
ＧＣＴ−ＴＧＧ−ＧＡＴ−ＧＡＧ−ＡＣＣ−ＴＴＣ−Ｃ
’ｒＡ−ＡＧＴ−ＡＧＡ−ＣＧＡ−ＣＧＡ−ＡＣＣ−Ｃ
ＴＡ−ＣＴＣ−ＴＧＧ−１、ｔＩＡＬｐｕ　ｌｈｐ　１
．ｙｒ　Ｐｈｐ　Ｔｙｒ　Ｉｌｇ　Ｇｌｕｌ、ｅａ　Ｊ
’ＡｙＣＴＣ−ＣＴＡ−ＧＡＣ−ＡＡＡ−ＴＴＣ−ＴＡ
Ｃ−ＡＴＴ−ＧＡＡ−ＣＴＴ−ＴｒＣ−ＧＡＧ−ＧＡＴ
−ＣＴＧ−ＴＴＴ−ＡＡＧ−ＡＴＧ−ＴＡＡ−ＣＴＴ−
ＧＡＡ−ＡＡＧ−Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｊ、ｔｕ　Ｉｓｎ　
イｚｐ　Ｌｅａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＣｙＨ１）ａｌＣＡ
Ｇ−ＣＡＡ−ＣＴＧ−ＡＡＴ−ＧＡＣ−ＣＴＡ−ＧＡＡ
−ＧＣＣ−ＴＧＴ−ＧＴＧ−ＧＴＣ−ＧＴＴ−ＧＡＣ−
ＴＴＡ−ＣＴＧ−ＧＡＴ−ＣＴＴ−Ｃ（”、Ｇ−ＡＣＡ
−ＣＡＣ−７’Ａｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　にｌｙ
　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　ｌ１ａＬ’ｇｕ　
Ａｆｅｔ　Ａｚｎ　Ｇｌｕ　１．ｒｐ　Ｓｕｒ　Ｉｌ　
ａ　Ｌｅ＋１Ｉｌａ　ＶａｌＣＴＧ−ＡＴＧ−晶１’−
ＧＡＧ−ＧＡＣ−ＴＣＣ−ＡＴＣ−ＣＴＧ−ＧＣＴ’−
ＧＴＧ−ＧＡＣ−ＴＡＣ−ＴＴＡ−ＣＴＣ−ＣＴＧ−Ａ
ＧＧ−ＴＡＧ−ＧＡＣ−ＣＧＡ−ＣＡＣ−Ａｒ、ｑ　１
．ｙｒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｇ　Ｇｌｎ、　Ｉｒｇ　Ｉｌｅ　
Ｐｒｏ　Ｌｅａ　ＴｙｒＡＧＧ−ＡＡＡ−ＴＡＣ−ＴＴ
Ｔ−ＣＡＡ−ＡＧＡ−ＡＴＣ−ＡＣＴ−ＣＴＴ−ＴＡＴ
−ＴＣＣ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−ＡＡＡ−ＧＴＴ−ＴＣＩ’
−’ｒＡＧ−’Ｉ’ＧＡ−ＧＡＡ−ＡＴＡ−Ｌａｕ　Ａ
ｆｔｔ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌ、ｙｔ　Ｔｙｒ　Ｓｔｒ　
Ｐｒｏ　（、’ｙｚ　ＡｌａＣＴＧ−ＡＴＧ−＜石Ｇ−
ＡＡＧ−Ａ／μｍＴＡＣ−ＡＧＣ−ＣＣＴ−ＴＧＴ−Ｇ
ＣＣ−ＧＡＣ−１’Ａｃ　−ＣＣＣ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−
ＡＴＧ−ＴＣＧ−ＧＧＡ−ＡＣＡ−ＣＧに−７°ｒｐ　
Ｇｌｕ　Ｖｒｒｌ　Ｖａｔ　Ａｒｇ　Ａｌａ　’Ｇｌｕ
ｔ　Ｉｌａ　Ａｆｅｔ　イｒｑＴＧＧ−ＧＡＧ−ＧＴＴ
−Ｇ’ｌ’Ｃ−ＡＧＡ−ＧＣＡ−ＧＡＡ−Ａｉ”Ｃ−八
’ｌ’Ｇ−ＡＧＡ−ＡＣＣ−ＣＴＣ−ＣＡＡ−ＣＡＧ−
ＴＣＴ−ＣＧ’ｒ−ＣＴＴ−’ｌ”八Ｇ−ＴＡＣ−ＴＣ
Ｔ−５ｅｒ　ＰＡｔ　、５ａｒ　Ｐｌｈｅ　、Ｓｔｒ　
Ｔｈｒ　Ｉｔｎ　Ｌｔｕ　Ｇｌｎ　ＬｙｅＧｌｙ　Ｌａ
ｗ　Ｉｒ、ｑ　Ａｒ、ｑ　１．ｙｓ　Ａｒｇ２）ベクタ
ーの作製 本発明に用いるベクターとしては、大腸菌内で増殖可能
なさまざまなプラスミドを用いることが可能である。本
発明では、トリプトファンオペロンを有するプラスミド
ベクターを構築したり（すなわち、トリプトファンオペ
ロンのクローニング用部位の直後にＩＦＨの構造遺伝子
にメチオニンをコードする開始コドンをつけた遺伝子を
挿入して、大腸菌由来のアミノ酸配列を含まない蛋白質
として発現させる方法（直接発現法：　Ｎａｔｕｒｅｓ
　２）見、５４４〜５４Ｂ（１９７９））に用いる）、
ファージλｐｌｎｃ　５（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎ
ｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１７０．１６１〜１６９
（１９７９））およびｐＢＲ３２２（Ｇｅｎｅ、　２．
９５（１９７７）　）各々から必要な部分をとり出しく
これらはいずれもＤＮＡ配列が公知なので自ら必要な部
分は決まってくる）、大腸菌内で増殖可能なプラスミド
とするためこれら断片を適宜改変して単一のシラスミＦ
′イクターを構鳴して用いるのが適当である。なお、本
発明で上記のトリプトファンプロモーター、ファー・ジ
λｐｌａｃ　５およびｐＢＲ３２２を用いたのは、何れ
も遺伝子組換えの分野においてよく知られているからで
ある。例えば、ファージλｐｌａｃ　５から必要プより
ＮＡ部分を得るにはλｐｌａｃ　５浴臨菌であるところ
のＥ、　ｃｏｌｉ　ＰＩ（１５１２から公知の方法（別
冊、［蛋白質・核酸・酵素」、核酸実験法、下、ｐ１９
（１９７３）　）　により得ることができる。また、ｐ
ＢＲ３２２は、大腸菌由来のプラスミドとして知られて
いて最も入手しやすいものの一つであること、全塩基配
列が決定されていること、アンぎシリン抵抗性（Ａｐｒ
）およびテトラサイクリン抵抗性（Ｔｃｒ）の標識遺伝
子を持っていること、等の理由によるものである。

３）プラスミド組換体 （１）造成 外来性遺伝子が発現するようにしくまれたベクターの適
当な位置に前述のインターフェロン構造遺伝子を組込む
ことより、プラスミド組換体が造成される。組込操作そ
のものは、分子生物学の分野で公知の常法に従って行な
うことができる。具体的な方法については、後記の実験
例を参照されたい。

なお、前記アミノ酸配列式で表わされるインターフェロ
ン様号ソリベゾテｒを表現づ−る構造遺伝子は新規物質
であり、従ってこの構造遺伝子を含むプラスミド組換体
も新規物質である。

（２）　リンカ− 所望の構造遺伝子をプラスミドに組込むに際してフレー
ムをあわせたり、所望の制限酵素切断片やりセソーム結
酋部位などを導入するため、甘酸した種々のリンカ−を
用いることば組換えＤＮＡ技術上の有力な手段である。

本発明の場合も種々リンカ−を用いているが（詳細は後
記実験例を参照されたい）、そのリンカ−の造成は、十
−鎖のそれぞれについて、これをいくつかのフラグメン
トに分けたものを化学的に合成し、ついで各フラグメン
トな結合する任意の方法によって達成される。

フラグメントの合成法としては、ジエステル法（５ｃｉ
ｅｎｃｅＸ２０３．６１４（１９７６））、トリエステ
ル法（５ｃｉｅｎｃｅ　、里、１０５６（１９７７）　
）、固相法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　＆５ｅａｒ
ｃｈ　、　８．５４９１　（１９８０）’）、液相法、
あるいは酵素を用いる方法（Ｊ、　１ｉｏｎ、Ｃｈｅｍ
、。

止り、２０１４（１９６６））等があるが、甘酸時間、
収率、精製などの点から、同相法でトリエステル法によ
るものが好ましい。

（３）方向性の判定 プラスミドに組込まれたＩＦＮ−α遺伝子の方向性の判
定は、構造遺伝子内に含まれる特定の部位を認識する酵
素でその部位を切断し、構造遺伝子外の特定の位置に別
の酵素で切断を入れ、得られた断片のサイズを分析する
ことにより行なうことができる。

４）形質転換 （１）宿主菌 宿主菌は、上記造成プラスミド組換体がその菌体中で増
殖できるものであり、かつその微生物の遺伝的性質が詳
細に解明されているものであることが望ましい。

本発明のインターフェロン構造遺伝子を組込んだプラス
ミド組換え体（例えばｐｌＦ　１１２）を用いて形質転
換させる宿主菌の一具体例は、エシェリキア・コリに属
する太腸繭株Ｋ　１２　Ｃ６００である。

このに１２Ｃ６００は、グラム陰性桿菌で、胞子を作ら
ず、通性嫌気性等の大腸菌属の一般属性を有する他、Ｆ
因子を含まず、サプレッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺
伝子組換えに関与するヌクレアーゼをコードするｒｅｃ
ＢＣ遺伝子に欠陥を有する。栄養要求性としては、アミ
ノ酸のトレオニンとロイシンをその最小培地上での増殖
に必要とするものである。

（２）形質転換 形質転換操作そのものは、分子生物学の分野で公知の常
法（例えばクシュナー法（ＧｅｎｅｎｔｉｃＴ＋；ｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ、　１９７８．１７（１９７８））に
従って行なうことができる。具体的な方法については、
後記の実験例を参照されたい。

（３）形質転換体 形質転換操作によって形質転換された株は、組換え体シ
ラスミドの移入によって作り出された組換え体ＤＮＡの
マーカー（薬剤耐性、栄養要求性等）を指標にして選択
できる。形質転換体の一具体例としては、大腸菌Ｋ　１
．２　Ｃ６００をｐＩＦ　１０１（後記）によって形質
転換させて得た形質転換体に１２Ｃ６００（ｐＩＦ　１
０１）がアル。コノ形ａ転換体は、宿主菌Ｋ］２Ｃ６０
０と下記の性質において異なる菌株である。

Ａｍｒ、　Ｔｃｒ（ただし温度感受性）従って、この性
質を指標として形質転換体をスフ＆択することができる
。

なお、前記のアミノ酸配列式で表わされるインターフェ
ロン様ポリペゾテドの構造遺伝子は新規物質であり、従
って、この構造遺伝子を組込んだ、予定した化生細胞内
で増殖可能な、プラスミド組換体によって形質転換され
たエシェリキアＡｔＪｉに属する該ＩリペプチＰ産生菌
も新規な菌である。

５）ヒト−α−インターフェロンの産生以上のよ’Ｉｎ
＋、て得た形質転換体を常法に従って培養ずれば、目的
とするｈＩＦＮ−αが産生される。

具体的な方法については後記実験例を参照された＋１）
。

なお、本発明のｈＩＦＮ−αは、形俤転換株に移入され
た組換え体ＤＮＡに挿入された遺伝子について１ｕ１［
限酵素地図の作製および塩基配列の決定を行なって、従
来のＩＦＮとの間の塩基配列の相違を確認した。

制限酵素地図作成は、形質転換株から組換え体ＤＮＡを
採取し、ＤＮＡを切り出し、ついで制限酸素を用いて行
なった（　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ（
！Ｉ、、　ＵＳＡ％豆、３９６１（１９７５）　、生化
学実験動床（日本生化学会編）（東京化学同人）２巻、
核飯の化学ＩＩ、４３１（１９７５）等を参照されたし
）。また、塩基配列決定法としてはマキサム−ギルバー
ト法（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、　ＵＳＡ％　７６．
５６０（１９７７）　ｒ蛋白質核酸・酵素」、箆、１８
２（１９７８）参照）で行なった。

６）ＩＦＮの活性測定 活性測定は、ＩＦＮ培養液から４＋田もの方法（Ｎａｔ
ｕｒｅ　Ｘ２８４．３１６−３２０（１９８０））に従
ってＳ−１００両分を調製し、この両分を抗ウイルス活
性測定用の試料液として、培養している細胞に加え、一
定時間作用さ４たのち、適当なライ−へを感染させて、
このウィルスの増殖の程度を定１１［する任意の方法に
よって行なうことができる。

本発明の揚台は、細胞変性効果（ｃｐｇ　：　Ｃｙｔｏ
ｐａ−ｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　）、すなわち
ウィルスが細胞に感染して榴弾ｔすると細胞が破壊され
る現象なＩＦＮが抑える度合を測定することによって、
抗ウィルス活性を調べた（詳細は後記実験例を参照され
たい）。

７）　ＩＦＨの検出 検出は、組換体プラスミドにコードされる蛋白錘を分子
量（大きさ）によって同定する、大腸Ｕ、＋のミニセル
産生変異株を用いる方法（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅ
ｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１８６．１９３−２０３（
１９８２））で行なった。なお、ミニセル産生変異株と
は、細胞***の際に大腸菌のＤＮＡは複製包含されない
が、プラスミｒをはじめ蛋白合成に必要な細胞物質はす
べて含んでいる小さな細胞を産生ずる株をいう。本発明
の場合は、ミニセル産生変異株として、Ｅ、ｃｏｌｔ　
Ｊａｎ　１１９６株（上記へりｏｌｅｃｕｌａｒ　（’
ｒｅｒ＋０ｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉ−ｃ３）を用いた。な
お、実験操作の詳細は上記文献および後記実験例を参照
されたい。

実　験　例 実施例１ ｈＩＦＮ−αの調製 インターフェロン遺伝子の調製は、ヒト白血球細胞を用
いて以下の手順に従って行なった。

１）ゲノムＤＮＡの調製 人の白血球細胞（５Ｘ　１０９ｃｅｌｌ　）をＰＢＳ　
−０，１％ノニデット■Ｐ−４０（ＰＢＳはリン酸緩衝
液（ｐＨ７，５）　、１００　ｍＭ塩塩化ナトリウム混
成液こと、ノニデットは非イオン性界面活性剤である）
１００ｍｌ　に懸ｌ蜀したの゛ら、テフロンホモジナイ
ザーでホモジナイズする。ついで、遠心分離（３０００
ｒｐｍ、５分）を行なつ−Ｃ沈殿（核両分）を得て、こ
れを１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液ｐＨ７，５，１ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸塩（以下ＥＤＴＡと記す）、１％Ｓ
ＤＳの混合液２００ｍ１　に＃解してゲノムＤＮＡの溶
出を行ない、さらＫもう一度この混合溶液２００　ｍｌ
　を加えて加分撹拌したのち、フェノール混合液（フェ
ノール：クロロホルム：イソアミル７　ルコール＝５０
：　５０　：　１　）を加えて遠心（１１０００ｒｐ　
、　］（１１分を行なう。このとき、溶液は２層に分離
するが、そのうち上清をとる。このフェノール混合液に
よるゲノム１）ＮＡ抽出操作を４回（り返し、これら上
清をまとめたものにエーテルを加工、残留していたフェ
ノールを除去したのち、エタノール沈殿を行なってＤＮ
Ａを回収した。このＤＮＡを水にｆｆ５　ｉ’ｌｌ　し
て、次の操作に用いた。

２）中性蔗糖密度勾配遠心法（ＩＣよるＤＮＡ画分の外
見 先に調製ｌまたゲノムＤＮＡを、中性１）：“糖密度勾
配遠心法（Ｐｒｏｃ、　Ｎ１１ｔ１．Ａｃｎｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ　％　７４．５３６３（１９７７）参照）
によってＤＮＡの大きさで分画した。

ずなわち、ゲノムＤＮＡ　’７５１１　ｇを１００　ｍ
Ｍ　）リス１７．ｈ酸緩雨液（ｐＨ７，５）、７　ｍＭ
　ＭｇＣｌ２．５０　ｍＭＮａＣＩ混合液に溶解し、　
これに制限酵素Ｆ、ｃｏ　Ｒ１（３７５単位／７５μｌ
）を添加して３７℃で一夜反応を行なった。ついで、日
立ＤＧＦ−Ｕ密度勾配フラクショネーターで５〜２０％
直線蔗糖密度勾配を作ったのち、日立ＲＰＳ２７０−タ
ーで遠心分離（２４０００ｒｐｍ、４０時間）して、３
０個の自分に分別した。これら各々の両分は、その一部
をとってアガロースゲル電気泳動を行なって、ＤＮＡ断
片の長さを確認したのち、ｉ、ｏｏｏ〜２．０００塩基
対（以下塩基対はｂｐと記す）に相当する画分な一つに
とりまとめた。ついで、この両分を透析したのち、エタ
ノール沈殿を行なってＤＮＡ画分を得て、これを８０μ
ｌの水に溶解して、次のクローニングに使用した。

３）インターフェロン遺伝子のクローニング２）で調製
したＩＦＮ遺伝子を含むＤＮＡ断片は制限Ｇ 酵素Ｆ：ｃｏ　ＮＪによる切断端（−一）を有すＴＴＡ
Ａ るりで、クローニングに使用するベクターとしてｐＢＲ
３２８（微工研菌寄第７１８４号）を用（・た。なお、
ｐＢＲ３２８はアンピシリン耐４９ｇ　（Ａｍｐｒ）、
クロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ　）、テトラサイク
リン耐性（Ｔｃｒ）であるところ、制限酵素Ｆ、ｃｏ　
Ｒ１認識部位はＣｍ’の構造遺伝子中にあって本発明で
はこの部位をクローニング部位としているので、ＩＦＮ
遺伝子を含むＤＮＡが挿入されていれば、形質転換体は
クロラムフェニコール感受性（Ｃｍ’　）　トなる。

クローニングに際して、ベクター（ｐＢｔｔ　３２８）
同志あるいはそれ自体の結合を防ぐため、ｐ１３Ｒ３２
８をＥｃｏ　ＲＩ　消化したのちさらに太腸酌アルカリ
性ボスファターゼ（以下ＢＡＰと記す）処理をして、Ｅ
ｃｏＲＩ切断端の５′−末端リン酸基を除去した。

この処ｉｌ］！済みｐＢｌ　３２８１層ｇと２）で調製
したＤＮＡ画分３μｇをＥｃｏ　ＲＩ消化したものとを
、６６ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、６　、６
　ｍＭ　ＭｇＣ１２，１０ｍＭ　ＤＴＴ　、　５０　ｔ
ｔＭ　ＡＴＰ　、　Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造１５単
位）の混合液４０μｍ中、１４℃で一夜反応させた。つ
いで、この反応混液を用いて大腸菌χ１７７６株の形質
転換をクシュナーの方法（Ｇｅｎｅｎ−ｔｉｃ　Ｆｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ１９７８．１７（１９７８））に従っ
て行なった。ずなわち、ルリア（Ｔ、ｕｒｌａ　）培地
Ｋ　１００　ｐｇ／ｍｌ　ジアミノピメリン酸（以下Ｄ
ＡＰ　）　、チミ、ジン（１（）μｇ／ｍｌ）およびテ
トラサイクリン１（）８ｇ７ｍ　ｌを添加したものを用
い、寒天上にニトロセルロースフィルターを敷いて３７
℃で一夜培養することにより形質転換を行なった。なお
、この操作と同様にして、保存用プレートも作製した。

４）　コロニーハイブリダイゼーションによる一次スク
リーニング 形質転換を行なった太腸閉からＩＦＮ遺伝子が挿入され
た菌をスクリーニングするため、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　７２．３
９６］（１９７５）およびＮｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ旦、１５（１９８１）に基づいてコロ
ニーハイブリダイゼーションを下記の手順に従って行な
った。

（１１ＤＮＡの固定 ニトロ七に１−ス上のコロニーをスペクチノマイシン（
６層ｇ／ｍｌ）含有プレート」二に移して３７℃で４時
間培養することによりプラスミドを増殖させたのち、フ
ィルターをはがし、これを０．５Ｎ水酸化ナトリウム水
溶液上に浮かしてコロニーを溶菌しかつＤＮＡを変性（
５〜１０分室温で放置）させる。フィルターを取り出し
、水分を除去したのち０．５　Ｎ水酸化ナトリウム水溶
液中で洗浄し、さらに０，５Ｒ，！）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）に移すことにより中和洗浄する。

このフィルターを新しいトリス塩酸緩衝液（ｐＴ（７，
５）に移し、室温で１ｏ分間振盪後、１．５Ｍ塩化ナト
リウムを含む０．５Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
に移して洗浄したのち、さらに２×ｓｓｃ　（Ｉ　ＳＳ
Ｃは０．０１５　Ｍクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩
化ナトリウム、ｐＨ７，２）浴液に移して洗印する。洗
浄操作終了後、フィルターの水分を除去し、真空オープ
ン中、（資）℃／２時間／１気圧で処理することにより
、ＤＮＡをフィルターに同定した。

（２）プローブの合成 Ｃ＋）をＴ４ポリヌクＶオチドキナーゼ（２０単位）の
存在下で３７℃で１時間反応させることにより行なった
。ラベルされた３２Ｐ−プローブは１７Ｘ］、０７ｅｐ
ｍあり、比活性は２３　Ｘ　１１０６ｃｐ　／　ｐ　ｍ
ｏｌであつブこ。

コロニーハイブリダイゼーションには、このプローブが
８　Ｘ　１１０５ｃｐ／ｍｌ　反応液の放射活性になる
ようにして使用した。

（３）ハイブリダゼーション （２）で合成した放射性２ベルを施したプローブを用い
℃、ハイブリダイゼーショ／を行なった。なお、ハイブ
リダイゼーションはプレハイゾリダイゼーションを６　
Ｘ　ＮＥＴ　（Ｉ　ＮＥＴは０．１５塩化すｉ・リウム
、０．０１５　Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ＴＩＨ７，５）
、０．００１　Ｍ　ＥＤＴＡ　）、５×デンハート（１
デンハートは０．０２　％ノイコール、０．０２％ポリ
ビニルピロリドン、０．０２％ＢＳＡ　（牛血清アルブ
ミン））、０．５　％　ＳＤＳ、　１０％硫酸デキスト
ランに１５０１１ｇ／ｍｌの大腸菌ＤＮＡおよびＲＮＡ
　にゎらはともに大腸菌を超音波処理し、エタノール沈
殿で得たもの）を〃１」えて３７℃で一夜行なったのち
、プローブ（８ＸＨ１５ｅｐｍ／ｍｌ）を加え、３７℃
で一夜反応させることより行なった。反応終了後、フィ
ルターを６×ＳＳＣで洗浄したのち、オートラジオグラ
フィーを行なった。その結果約５０，０００のコロニー
から８個のキャンディデートを得て、これを保存用プレ
ートから回収した。

５）サザーンのハイブリダイゼーションによる二次スク
リーニング ８個のキャンディデートからプラスミドをとり出しくこ
のプラスミドをｐｃＩＦ　００１〜００８とした）、Ｅ
ｃｏ　ＲＩ消化後、垂直型アガロースゲル電気法＋１＜
ＩＪを行なって、ＤＮＡを分画した。次いで、これらの
ＤＮＡ断片をアルカリ浴液（０，４Ｍ　ＮａＯＨ、０，
８ｈりＮａＣ１’）　に浸漬してＤＮＡを変性させ、０
．５Ｍ）リス塩酸緩４１ｔｊｆｆＫ　（ｐＨ７，６）、
１．５　Ｍ　ＮａＣ１で中和後、ゲルにニトロセルロー
スフィルターを密着させて＾均ｎｌＦ液（６ＸＳＳＣ）
で変性ＤＮＡをフィルターに移した（　Ｊ、　ｋ’ｌｏ
ｌ、　Ｈｌｏｌ、　９８．５０３（１９７５））。

以下のハイブリダイゼーションは４）の操作に準じ、プ
レハイブリダイぜ一ジョン、Ｐ−プローブ（Ｉ　Ｘ　１
１０６ｃｐ／ｍｌ）を添加してハイブリダイゼーション
を行なったのちフィルターを洗浄し、オートラジオグラ
フィーを行なった。その結果、オートラジオダラムで最
も濃いスポットを有するものｐＣＩＦ　００７を得た。

そしてこのシラスミＦからＩＦＮ遺伝子を含む２０００
　ｂｐのＤＮＡ断片を＃糖密度勾配遠心によって回収し
た。ついで、プローブに用いたヌクレオチド配列と同じ
（あるいはそれに相補的な）配列のｐｃＴＦ　００７よ
り取り出した２０００　ｂｐの断片中の位置およびその
配列を確認するため、２０００　ｂｐをＨｉｎｆ　Ｉお
よびＰｓｔ　ｒ消化したのち、２．５％アガロースゲル
電気泳動を行なって分画し、これらについてサザーンの
ハイブリダイゼーションを行なって、最も強くノ・イブ
リダイズする２００　ｂｐのＤＮＡ断片を得て、マキサ
ム・ギルバート法によってヌクレオチド配列を決定した
。

その結果、プローブのヌクレオチド配列と全（同じ（あ
るいはそれに相補的な）配列の存在を確認した。すなわ
ち、このｐｃＩＦ　００７挿入断片が白血球型インター
フェロン遺伝子であることが示唆された。

確認 （１）制限酵素地図の作成 ＩＦＮ遺伝子を含有するＤＮＡ断片（２０００ｂ、ｐ　
）の制限酵素地図の作成を以下の制限酵素イ群および口
ｆ＋ｆを用いて行なった。

（イ）　６ｂｐを認識するもの ｌ３ａｌ　ｌ、　ＩｌａｍＨＩ、Ｂｇｌ　Ｉ、　ＢｇＩ
　ＩＩ、　Ｃ１ａ　１Ｈｐａ　ｌ　５Ｋｐｎ　Ｉ　５Ｈ
ｉｎｄ　ｍ、　Ｈｌｎｃ　ＩＩ、　Ｍｌｕ　ＩＰｖｕ　
Ｉ、　Ｐｖｕ　ＩＩ　、Ｓｍａ　Ｉ、Ｓｓｔ　Ｉ、Ｓｓ
ｔ　Ｉ（ロ）　４ｂｐまたは５ｂｐを認識するものＨ４
ｎｆ　ｌ　％　Ａｌｕ　Ｉ、Ｈａｅ　Ｉｌｌ、Ｓａｕ　
３ＡＩ、Ｆｏｋ　ｌ５ａｕ　９６１．　Ｄｄｅ　ｌ、Ｒ
ａａ　Ｌ、　Ｆｕｎ　４ＨＩ　、　Ｂｓｔ　Ｎｌなお、
ここで用いた制限酵素の反応糸作は、使用説明用に従っ
てトリス塩ｌ！２緩４１ｉ７液（ｐＨは：ｉＭ宜調節）
、ＭｇＣ１、ＫＣＩ　、　ＮａＣ１等を適宜組み合わせ
たものである。

その結果、第九図に示したような制限酵素地図を得た。

矢印（↓）が制限酵素認識部位を示し、Ｓはシグナル配
列、Ｇは構造遺伝子を示す。

（２）　塩基配列の確認 ｐＣＩＦ　００７より取り出した２０００　ｂｐの塩基
配列の確認は、マキサム・ギルバート法（文献前記）に
従って行なった。その結果、第１図に示されるような結
果を得た。図中、上から１０段目の１←で始まるＴＧＴ
から同工６段ＧＡＴ→１で終わる部分が本発明のｈＩＦ
Ｎ−αの構造遺伝子である（図中ではＧで示す）。また
、ＩＦＮ−αの構造遺伝子最後のＧＡ’ｌ’の次のトリ
プレットコｌ″ンＴＧＡ上の★は終止コドンを示ず。図
中のＳはシグナル配列を示す。

アンダーラインは制ｉ’ａ　６Ｗ素の認１１ｔ’ｌｆ！
配列を示し、その下のＲｓａ　Ｉ等は制限酵素を示す。

ＩＦＮ構造遺伝子の構築 ＩＦＮ遺伝子を大腸菌内で発現させるため、以下の手順
に従ってＩＦＮ構造遺伝子の構築を行なった。

１）　ＩＦＮ構造遺伝子の切り出し ｐＣＩＦ　００７を制限ｊｌＡ　Ｘ　Ｅｃｏ　ＲＩ消化
し、ＩＦＮ遺伝子を含む２０００　ｂｐのＤＮＡ断片を
中性Ｗ糖密度勾配遠心法で回収した。これをさらにＤｄ
ｅ　ＩおよびＲｓａ　Ｉで消化し、アガロースゲル電気
泳動で８００ｂｐ　のＤＮＡ断片を回収した。このＤＮ
Ａ断片は、ＩＦＮ構造遺伝子の最初の数個のアミノ酸を
欠いたものである（第１図参照）。

２）リンカ−の接続 切り出した構造遺伝子の５′−末端側は、欠失部分を補
足し、さらに開始コドン（ＭｅｔをコードするＡＴＧ　
）および■：ｃｏ　ＲＩ切断部位とのフレーム合わぜの
ための配列を有するリン〃−（このリンカ−を本発明で
は便宜的にＭｅｔ　ＩＪンカーとした）を結合し、３′
−末端１１りには制限酵素Ｓｍａ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ　
−８ａｕ　Ｉ認識部位を有するリンカ−（以下Ｓｍａ　
Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｓｍａ　Ｉリンカ−とする）をつ
ないで、第９図に示すようなＩ　ＦＮ　４；ｑ造遺伝子
を構築し、アガロースゲル電気泳動で回収したのち、後
述のＩＦＮ発現発現イータ−結した。

ベクターの作製 Ｉ　ＦＮ　＠造遺伝子を組込んで大腸菌内で発現させる
ため、以下の操作に従ってベクターを作製した。

１）λファージのプロモーター導入 ｐＢＲ３２２（Ｇｅｎｅ　２．９５（１９７７））　３
　ｔｔｇを、１０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
）、７ｍＭＭｇＣ１２，１００ｍＭ　ＮａＣ１混合液５
μｍ中で制限酵素ＢａｍＩ（Ｉ　（１０単位）およびＦ
；ｃｏ　ＲＩ　（１０単位）を用る３７℃／２時間の反
応に付したのち、アガロースゲル電気泳動で大きい方の
ＤＮＡ断片を回収した。

一方、７アージλｐｌａｃ　５　（１０ｔｔｇ）をＢａ
ｍ　ＩＩおよびＥｃｏＲＩ消化して、７１．３〜８１．
０　ｑｂの範囲のＤＮＡ断片を回収した（ここで用いる
係は、λｐｌａｃ　５の遺伝子中における位置を示す）
。ついで、これらの操作で得られた二つのＤＮＡ断片を
５０ｍＭ　）　’）ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）、１０
ｍＭＭｇＣ１２，２０ｍＭ　ＤＴＴ　。

および１　ｍＭ　ＡＴＰの混合液（余計（ト）μｌ）に
溶ｊｖＩ：　Ｌ、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼ（５単位）を用
いて１４℃で一夜反応を行なった。ついで、この反応混
合液を用い、大腸菌株χ１７７６の形質転換をクシュナ
ーの方法（Ｇｅｎａｎｔｉｃ　Ｆ＞ｇｉｎｅｅｒｌｎｇ
、　１９７Ｂ、１７（１９７８））に従かつてＰ−１物
理的封じ込め設備内で行なった（組換えＤＮＡ実験指針
）。ついで、形質転換株の選択を２０　／Ｚ　ｇ／　ｍ
　１　アンピシリン含有Ｌ−プレート（１チトリゾトン
、０．５　ｑ６イースト抽出物、０．５％ＮａＣ１、１
，５％アガー）十で行なったのち、得られた形ｌｑ転換
株よりプラスミドを調製し、数種の制限酵素を用いて解
析したところ、このプラスミドはｐＦＩＲ３２２のＢｎ
ｍ　ＨＩ　−ｅｃｏ　ＲＩ　＋ＩＪｉ片およびλｐｌａ
ｃ　５の７１．：う〜ＳＩ、Ｏ％部分が結合したもので
あった（このシラスミドは、ｐＦＭ　１０１と命名）。

ついで、ｐＦＭｌｏｌをＢｇＩ　ＩＩ消化してλｐｌａ
ｃ　５由来（１）　７３．４−８０．３％部分ン除去し
たｐＦＭ　１０２を調製した（以上第２図参ｌ（す。

ｐＦＭ　１０２をＢｇｌ　ＩＩおよびＢａｍ　ＨＩで消
化したのち、アガロースゲル眠気泳動で小さい方の断片
な回収しく以下ｊｐに［回収１とはアガロースゲル′「
ＩＩ気泳動を行なってＤＮＡ−「月を回収すること化；
ｔｆｃ味する）、これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理（
以下このＴ４１）ＮＡポリメラーゼ処理を行なったとい
うことは制限酵菜切断端を枯涜末端から鈍感末端に改変
することを意味する）した。ついでこの１すを片とｐＨ
８］　（ｐＢＲ３２２’！”　Ｅｃｏ　ＴｔＩ　−Ｈｌ
ｎｄ　ｍ消化して回収した大きい断片とＨｐａ　Ｉおよ
び５ａｒｉ＋Ｉの認識部位を有するリンカ−とを連結し
たプラスミド）をＨｐａ　Ｉ消化したものとを、６６ｍ
Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、６．６　ｍＭ　
ＭｇＣｌ２、］（ｌ　ｍＭ　ＤＴＴ　。

５０　ｔＭ　ＡＴＰの混合溶液（全量４０μｌ）中でＴ
４ＤＮＡリガーゼ（５単位）を用いる１４℃／−夜の反
応（以下このリガーゼを用いる反応は単に「結合」と記
す）に付したのち、先と同様の方法で形質転換を行ない
、スクリーニングして、ｐＦＭ　１０３を調製した（第
３図）。なお、以下に用いる「ｐＦＭ×××を調製した
」という語句は、Ｔ４ＤＮＡ　！Ｊガーゼによる結合反
応を行なったのち、この反応混合液を用いて宿主菌の形
質転換を行ない、形質転換株を選択したのち、制限酵素
を用いて分析を行なって各断片が正しく連結されたかど
うかの確認を行なったという一連の操作を含むものとす
る。

ｐＦＭ　１０３をＨｐａ　Ｉ　−Ｂａｍ　Ｈ１消化して
小さい方の断片を回収し、ｐＦＭ　１０１をＨｐａＩ　
−ＢａｍＨＩ消化して大きい方の断片を回収して、両断
片を結合させて、ｐＦＭ　１０７を調製した（第４図）
。ついで、ｐＦＭ　１０７をＥｃｏ　ＲＩ消化後、Ｔ、
ＤＮＡ　ポリメラーゼ処理し、再び結合させることによ
って、ｐＦＭｌ（）７中のｍｃｏ　ＲＩ　認識部位が除
去されたものであるｐＦＭ’ｉｏａを調製した。

ｐＦＲ（１０８をＢｇｌ　ＩＩ消化することよりλｐｌ
ａｃ　５山来の断片（７８，８〜８０．３％部位）を除
去し、さらにプロモーター領域ＰＲＯ１１を含む断片が
もう一つのプロモーター領域ＰＬＯＬと同じ向きにクロ
ーンしたｐＦＭｌｌｏを調製した（第５図）。

ついで、Ｉ）ＦＭ　１１０をＰｓｔ　Ｉ　消化して不要
部分（Ｐｓｔ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ部分）を除去したのち
回収した大きい１つ１片と、ｐＢＲ３２２をＥｃｏ　Ｒ
Ｉ消化し、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ処理したのちさら
にＰｓｔＩ消化して回収した小さい断片とを下記の二段
階で結合させた。すなわち、第一段階ばＰｓｔ　Ｉ切断
端同志の結合を行ない、第二段階として残りの結合させ
るべき断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理後結合させる
ことによってｐＦＭｌｌｌを調製した（第５図）。

ｐＦＭｌｌｌ　は同一方向に二つのプロモーター領域ｐ
、ｏＲおよびＰＬＯ化有しているが、これらのプロモー
ターはりプレクサー（図中のＣＩ）が温度感受性である
ため温度を調節することによりプロモーター活性が制御
できるようにしたものである（例えば加℃→４２℃にす
ることよりプロモーターは活性化される）。

２）リンカ−の導入 （１）　リンカ−の設計 プラスミドへＩＦＮ構造遺伝子を組込むに際して、第６
図および第９図で示されるようなリンカ−を設計した。

すなわち、第６図では、ＩＦＮ以外の遺伝子の発現を諌
止するための終止コドンの導入（図中の５ＴＯＰ　）、
さらに翻訳が開始されるためのリポソーム結合部位（Ｓ
Ｄ配列）、ｉｌｉ！Ｉ限酪素Ｘｈｕ　Ｉ　Ｘ！ｌｐａ　
Ｔ、Ｅｃｏ　ＴＨおよびＳｍａ　Ｉ　認識部位（切断部
位は第５図中のａ　＝　ｄに対応）を設けた。

また、第９図のリンカ−の設計は１′］ｉＪ記したとこ
ろである。

（２）合成 リンカ−の合成は、第６図について説明すれば、下記の
通りである。先ず、Ｆ’ＮＩ〜ＦＮ４の各フラグメント
を合成し、ついでＦＮ２およびＦＮ３のフラグメントの
５′−末端をリン酸化したものとＦＮＩおよびＦＮ２と
を結合して目的とするリンカ−を合成した（以下これを
５ＴＯＰ−８Ｄ　リンカ−とする）。すなわちＦＮ２お
よびＦＮ３各々１００　ｐｍｏｌ　（０，０１Ａ２６０
　）をａｌｍＭ　）リス塙酸緩価液（ｐＨ７，５）、１
０　ｍＭ　ＭｇＣ１２，１（ｌ　ｍＭ　ＤＴＴ、　０，
５　ｍＭ　ＡＴＰの混合液中（余情５０μｌ）、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（８単位）に加えて３７℃／１
時間（リン酸化）の反応を行なった。ついで、９０℃で
２分間処理することにより反応を止めたのち、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（９００単位）、ＦＮＩおよびＦ’Ｎ　２を
加えて１４“°Ｃで一夜反応を行なって調製した。

３）発現ベクターの作製 （１）　ｐＦＭ　１１２の調製 ｐＦＭｌｌｌをＩ（ｐａ　Ｉ　−Ｓｍａ　ｒ　消化し、
回収した大きい断片と５ＴＯＰ−３Ｄ　リンカ−とを結
合して、ｐＦ’Ｍ　１１２　を―製した（第７図）。な
お、このプラスミＦにリンカ−が正しく仲人されたかど
うかの確認は、宿主ｉ°１からプラスミドを調製したの
ち、・マキサム・ギル、？−ト法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　＋’：ｒ＋ｙ；ｙｍｏｌｏｇｙ色、Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄ　Ｐａｒｔ　Ｔ　４９９〜５６０（１９８０
）Ａｃａｄｅｍｉｃ　ＰｒｅｓｌＩ　刊）Ｋ従って塩基
配列を確認することより行ない、正しく挿入されている
ことが確認できた（第８図Ａ）。

ｆ２）　ｐＦＭ　１１３の作製 ｐＦＭｎｉをＢｇｌ　！　−Ｓｍａ　Ｉ　消化し、大き
い断片と、小さい断片とを別々に回収した。ついで、小
さい断片をｌ”ｌａｅ　ｍ消化し、ＰＬＯＬ領域を含む
２５０ｂｐの断片とさきはどの大きい断片および５ＴＯ
Ｐ−８Ｄリンカ−とを結合して、ｐＦＭ１１３を調製し
た（第７図）。これらの結合が正しく行なわれたかどう
かの確認は、上記と同様に行なった（第８図Ｂ）。

ところで、ｐＦＭ１１２とｐＦＭ１１３との相違点は、
Ｎ遺伝子の一部を有するかどうかである。このＮ遺伝子
は、ラムダゲノムのｔ終止点で、ｒｈｏ−依存性（ある
棟では非依存性）の転写終止を妨げることによって正の
転写調節ン行なう蛋白質で、いわゆるアンチターミネー
タ−である。

３）　ＩＦＮ構造遺伝子の導入 ｐＦＭ　１１２およびｐＦＭ１１３に上記で構築したＩ
ＦＮ構造遺伝子を有する断片を挿入した。ずなわち、ｐ
ＦＭｉ１２の場合はＥｃｏ　ＲＩ　−：”ｍｕ　Ｉ消化
したのち回収した大きい断片とＩＦＮ構造遺伝子を有す
る断片とを結合させて、発現ベクタープラスミｒｐＩＦ
　１０１を調製した（第１（）図）。

同様Ｋ　ｐＩＦ　２０２もｆＡ製した（第１０図）。

ＩＦＮ遺伝子のｐＩＦ　１０１、ｐｌＦ　２０２での発
現 ＩＦＮ遺伝子を挿入したプラスミド組換体を含む太ｊ拗
闇を培養することによって、ＩＦＮを発現させ、ついで
抗ウィルス活性を測定した。

ｌ）菌の培養および誘発 プラスミド組換体ｐＩＦ　１０１を含む大腸繭ＫＩ２Ｃ
６００（ｐＩＦ　１０１　）を２５０　ｍｌのルリア培
地で、；幻℃で０Ｄ６ｏｏが０．２５−０．３まで培養
したのら、４５℃の水浴中で５分間保温してｔｔｌをか
け、さらに・１２℃で２時間蛋盪培う寮を行なった。

ｐＩｌｉ　２０２についても同様に行なった。

２）抗ウィルス活性の測定 抗ウィルス活性は、Ｓ−１００画分を調製して、この両
分を用いて測定した。

（１）　Ｓ−１００画分の調製 菌を培養後、遠心（７０００ｒｐｍ、　１．０分）して
集画し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＪ（７，０）で洗浄
したのちリゾチーム（最終濃度０．５　ｍｇ／ｍｌ　）
処理を水浴上でＩ分間性なった。ついで、超音波処理を
クゼタｌＮ５ＯＮＡＴＯＲＭＯＤＥＬ　２００Ｍを用い
て２００Ｗテ１５分間行ナッタノち、遠心（１０ｋｒｐ
ｍ　、　２０分）を行なって、上清を得℃、さらに超遠
心（２４ｋｒｐｍｓ１時間）な行なって上清両分を得て
、これを８−１００画分とした。

（２）抗ウィルス活性の測定 活性の測定は成４＋（「インターフェロン」、中外医学
双書刊、１９８０　）に従って行なった。すなわち、試
験管内にＦＬ細胞（ヒト羊膜由来の株化細胞）を単層に
培養し、培養液を捨て、培養液で適当に希釈したインタ
ーフェロン液（Ｓ−１００画分）を加えたのち、これを
−夜培養し、インターフエロン液を捨てる。ついで、適
当な量の水泡性１コ内炎ウィルスを試験管に入れる。４
８時間後、各試験管について細胞変性効果（以下ＣＰＥ
　）が起っているかどうかを判定した。判定結果より、
ＣＰＥを５０　％に抑えられているインターフェロン液
の希釈濃度をインターフェロン単位とした。その結果を
下表に示した。なお、ｐＩＦ　１０１およびｐＩＦ２０
２の対照としてｐＦＭ１１２およびｐＦＭ１１３も同様
の操作を行なって、活性を測定した。

実施例２ ＩＦＮ発現ベクターとして、トリプトファンを有するプ
ラスミドを作製した。

ＩＦＮ発現ベクターの作製 トリプトファンゾロモーターを有するプラスミドｐｏｃ
’ｒ　３　をもとにして、ＩＦＮ発現Ｒクターを作製し
た（　ｐＯｃＴ　３はｐＨＲ３２２のＥｃｏ　ＲＩ部位
にトリプトファンプロモーターを有する５００　ｂｐの
ＤＮＡ　断片をＥｃｏＲＩリンカ−を用いて挿入し作製
されたものである）。

発現ベクターの作製は、ｐｏｃ’ｒ　３をＥｃｏ　ＲＩ
消化して大、小二つの断片を回収し、各々をＴ４ＤＮＡ
　、１？　＋）メラーゼ処理したのち、この二つの断片
を結合し、プロモーターがテトラサイクリン向きのプラ
スミドｐｏｃ’ｒ　’２△Ｅと、アンピシリン向きのシ
ラスミドｐｏｃ’ｒ　３△Ｅとを得た（第１１図）。

１）　ｐ’ｒｓ　２０２の作製 ｐｏｃ’ｒ△３Ｅ　ヲＰｓｔ　Ｉ　消化し、この切断部
位にＰｓ’ｔ　Ｉ　−Ｓｍａ　Ｉ　−Ｐｓｔ、　Ｉリン
カ−ＧＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡ　（合成法は実施例１（
ＡＣＧＴＣＧＧＧＣＣＣＧ 参照））を挿入して、ｐＴ’ｓ　２０１を調製した（第
１２図）。ついで、ｐ’ｒｓ　２０１をＳｍａ　Ｉで消
化したのち、５ＴＯＰ−８Ｄリンカ−（実施例１参照）
を挿入し、古（訳の方向にこのリンカ−が正しく挿入さ
れたプラスミドｐ’ｒｓ　２０２ン＾Ｉ吊製した。

２）　ＩＦＮ遺伝子の挿入 ｐ’ｒｓ　２０２を’Ｆ’；ｃｏ　ＲＩ　−Ｓｍｎ　Ｉ
消化したものにＩＦＮ遺伝子（ｐＩＦ　２０２をＦ；ｃ
ｏ　ＲＩ　−Ｓｍｎ　Ｉ消化して切り出してきたもの）
を挿入したのち、ＩＦＮ遺伝子が正しく挿入されている
かどうかのチェックを制限酵素を用いて行なった。その
結果、正しく挿入された株を３株（ｐｌＦ　３０１、ｐ
ｌＦ　３０２、ｐＩＦ　３０３　）得た（第１４図）。

ＩＦＮ遺伝子のｐＩＦ　３０１．３０２．３０３での発
現 ｐＩＦ　３０１．３０２および３０３　を用いてのＩＦ
Ｎの発現は、Ｍ９−カザミノ酸培地（２５０ｍｌ　）中
、３７℃で０Ｄ６ｏｏが約０，３になるまで培養したの
ら、インＰ−ルアクリル酸（１０ｍｇ／ｉｎｌのエタノ
ール浴液、最終濃度加μｇ／１ｎｌ）で誘尋をかけ、さ
らに３７℃で２時間振盪培養をすることにより行１Ｌつ
た。

また、抗ウィルス活、性の測定は実施例１と同様に５−
ｔｏｏ画分を調製して行なった。そのときの結果を下表
に示す。

実施例３ ＩＦＮ発現ベクターの作製 発現ベクターとしてｐＩＦ　４０１を作製した。すなわ
ち、ｐＩＦ　２０２をＳｍａ　Ｉ　−Ｘｈａ　Ｉ消化し
てＩＦＮ遺伝子を回収し、この断片を７４ＤＮＡ＆リメ
ラーゼ処理した。ついでｐ’ｒｓ　１０１をＳｍａ　Ｉ
消化し、これにＩＦＮ：ｉｌ’ｆ伝子を挿入してｐＩＦ
　４０１を調製した（第１５図）。

ｐＩＦ　４０１の発現 ＩＦＮの発現は、Ｌ９−カザミノ酸培地で、−１３７℃
で０Ｄ６ｏｏが約１０になるまで培養し、イｙ　Ｆ′″
−ルアクリル酸（最終濃度８μｇ７蚕ｌ）で誘導をかけ
、さらに３７°゛Ｃで１時間振盪培養することによって
行なった。抗ウィルス活性は、実施例１と同様に１０ｍ
１の培地から集菌し、５０ｍＭナトリウムリン酸緩１ｎ
９液（ｐＨ７，０）で洗浄後、リゾチーム（最終濃度０
．５μｇ／ｍ１’）処理し、凍結・融ｉ１１’＃によっ
て菌を破壊したのち、その融解液を超遠心しく　２４　
ｋｒｐｍ７１時間）、’ｉ４９られた一ヒ清を用いて両
足した。

その結果を下表に示す。

実施例４ プラスミドｐＩＦ　５０３の作製 ＩＦＮ−αを発現させるため転写の調節領域であるアテ
ニュエー゛ターを含むリーダー領域を除去し、トリシト
ファンプロモーター（以下Ｔｒｐ　Ｐと記す）部分だけ
を有するプラスミドｐＩＦ　５０３（第１４図）を作製
した。

まず、ｐｏｃ’ｒ　（前記）をＥｃｏ　ＲＩ消化してＴ
ｒｐ　Ｐおよびリーダー領域を含むＤＮＡ断片を切゛り
出し、さらにリーダー領域を除去した。すなわち、第１
６図に従って説明すれば、切り出したＤＮＡ断片（■）
をＨｐａ　Ｉ消化によりａとｂとに切断する（■）。ａ
をさらにＴａｑ　Ｉ消化してＣとｄとに切断し、リーダ
ー領域を含むＣは粱てる（■）。次いで、ｐＢＲ３２２
中Ｆ、ｃｏ　ＲＩ　−Ｃ１ａ　Ｉ　部分を除去したもの
と断片すおよびｄとを結合して、ｐ’ｒｓ　００１を得
た。

次にｐＴＳ　００１をＩｉ：ｃｏ　ＲＩ　’、肖化し、
さらにＴ４ポリメラーゼ処理を行なったのち再び結合さ
せることにより、Ｆ；ｃｏ　ＲＩ　認識部位を欠失させ
たｐＴＳ００２を得た。

一方、ｐｒＦ２０２　（上記）をＸｈａ　Ｉ　−Ｓｍａ
　Ｉ消化してＩＦＮ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を得て
、これをＴ４ポリメラーゼ処理したものと、ｐＴｓＯＯ
２をＣ１ａ　Ｉで処理後、Ｔ４ポリメラーぜ処理を行な
ったものとを結合させて、ｐＩＦ　５０３を得た。

ＩＦＮ遺伝子の発現 ＩＦＮ遺伝子の発現は上記実施例２と同様に行フｃつた
。その結果を下表に示した。

実施例５ ＩＦＮの検出 ＩＦＨの検出は、ミニセルｋｒ生変異株■・ｒ、　Ｃｏ
目Ｋｍｌ１９６を用いて行なった。すなわち、ｐＩＦｌ
ｏｌ、２０２．３０１および４０１でＫｍ　１１９６の
形Ｒ転゛換をノルガードらの方法（（ｋｎｅ、３．２７
９−２９２（１９７８））　に従って行ない、ついでこ
の形質転換株を培養したのち、細胞の大きさによって（
中性蔗糖密度勾配遠心法）ミニセルを分離濃縮した（　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ　、　８６．１９３−２０３（１９８２））。この操
作で得られたｐＩＦ　１０１とｐＩＦ２０２谷々をもつ
ミニセルを１）ａｖＩＳ−１９アミノ酸（メチオニンを
除（）培地で予め４２℃で１２分培養し、ついで２１）
μＣ１５５Ｓ−メチオニンを加えて４２°０で加分振盪
培養したのち、またｐＩＦ　３０１および４０１はＩ）
ａｖｉｓ　−１８アミノ酸（メチオニンとトリシトファ
ンを除く）培地にインドールアクリル酸（２ｆ）μｇ、
／ｍｌ　）を飽加して各々を予め３７℃で１２分培養し
たのら、加μＣ１５５Ｓ−メチオニンを加えて３７℃で
２（）分振盪培養したのち、各々を５０μＭナトリウム
アジド（１００μｇ／ｍｌ）を含む培地で洗浄後、遠心
しく　１０　’ｋｒｐｍ　／か分）、可溶化緩衝液（Ｎ
ａｔｕｒｅ、　２２７．６８０−６８５　（１９７０）
）　Ｋ１１ｄ濁させたのち、３分間煮沸した。ついで、
１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なったのち
、フルオログラフィーを行なって、組換体プラスミドに
コ−ドされた蛋白質を検出した。そのときの結果を第１
７〜１９図に示した。第１７図は、ｐＩＦ　１０１およ
び２０２についての結果である。Ａが温１ｉ　３（Ｊ　
℃のときの結果であり、Ｂが温度４２℃（シラスミドに
訪導をかけた）ときの結果である。ＡおよびＢのまん中
はマーカーを示しており、そのバンドの横の数字は分子
量である。Ｂの石噛の矢印（←）はＩＦＮと思われるバ
ンドであって、分子ｉ１８，５００である。このパンＦ
は、ＢのｐＩＦ　１０１および２０２のみに見られるも
のである。なお、ｐＦＭ　１１２およびｐｒＭｉ＋３は
対照として示したものである。

第１８〜１９図はｐＩＦ　３０１および４０１の結果で
あり、ｐ’ｒｓ　２０２．１０１および００１　は対照
である。

いずれも矢印（←）がＩＦＮと思われるパンＦである。

図中の→・および−は、インドールアクリル酸添加の有
無を示している。

本発明に関連して、下記の微生物が通曲省工業技術院微
生物工業技術研究Ｈｔ　（微工研）に、昭和お年８月２
日に、受託されている。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ］２Ｃ６００（ｐＢＲ３２８）　７
１８４Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＩＦ　３０
１）　７１８５Ｅ、　ｃｏｌｔ　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＩ
Ｆ　５０３）７１８６Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＫＩ２Ｃ６００
（ｐＩＦ　４０１）　７１８７Ｅ、　ｃｏｌｔ　Ｋ］２
Ｃ６００（ｐＩＦ　２０２）　’　７１８８Ｅ、　ｃｏ
ｌｉ　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＯｃＴ　３）　７１８９３　
ｃｏｌｉ　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＩＦ　１０１）　７１９
０＊　受託番号は、微工研酌寄番号を示す。

これらの微生物の菌学的性Ｔえは、導入されたプラスミ
ドによるものを除けは公知の親画Ｅ、　ｃｏｌ　ｌＫ１
２Ｃ６００のそれと同じであるが、その一部は明細書中
に記載されていると共に寄託に際して彼工研に提出した
書面に記載されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、白血球より調製した２０００　ｂｐのゲノム
ＤＮＡの塩基配列を示す。 第２図は、２１Ｍ１ｏ２　調製のフローチャートである
。 第３図は、ｐＦＭ　１０３　調製のフローチャートであ
る。 第４図は、ｐＦＭ　１０７　調製のフローチャートであ
。る。 第５図は、ｐＦＭ　１１１　調製のフローチャートであ
る。 第６図は、５ＴＯＰ−３Ｄ　リンカ−の配列を示す。 第７図は、ｐＦＭ　１１２および１１３關製のフローチ
ャートである。 第８図は、ｐＦＭ　１１２および１１３　の遺伝子地図
である。 第９図は、Ｍｅ　ｔリンカーオｄよびＳｍａ　Ｉ　−Ｘ
ｈｏ　Ｉ−Ｓｍａ　Ｉ　１，１ツカ−の塩基配列および
結合部位を示したもの・である。 第１０図は、ｐＩＦ　１０１および２０”２　Ｈ１４Ｊ
ｓｌ！のフローチャートである。 １Ｂ１１図は、ｐｏｃ’ｒ　２へＩｉ〕および３／＼ｆ
Ｉ】調製のフローチーソートである。 第１２図（佳、ｐＴ８２０１　Ｘ製のフローチャートで
ある。 第１３図は、ｐ’ｒｓ　２０２　調製の７０−チャート
である。 第１４図は、ＰＩＦ　３０１　調製のフローチャートで
ある。 第１５図は、ｐｌＦ　４０１　Ｈ製のフローチャートで
ある。 第１６図は、ｐ’ｒｓ　００１　調製のフローチャート
である。 第１７〜１９図は、フルオログラフィーの結果のトレー
スである。 第２０図は、実施例１で得られたＩＦＮ遺伝子含有ＤＮ
Ａ断片（２，０００ｂｐ）の制限酵素地図である。 Ｓ・・シグナル配列 Ｇ・・・構造遺伝子 出願人代理人　猪　股　清 鳥７図 ＴＣｇ号導十 泡８図 尾９又 ＧＴＡＣＡＣＡＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＴ范１０図 帛１１図 鬼１２図 毘１４図 Ｔｒｐ　Ｐ ′ミ、 尾１５図 帛１６図 第１７図 Ａ　Ｂ 第１８図 第１９図 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号［相］発
　明　者　鈴　木　正　則　広島県高田和究所内 ：甲田町下甲立１６２４　湧永製薬株式会社中央研手続
補正書（方式） 昭和５９年２月ニア　Ｅ＋ 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５８年　特　許　願　第１７５７４２号法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 湧水製薬株式会社 昭和５９年１月１１目 （発送日　昭和５９年　１　月　３１１コラ６、補正の
対象

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記のアミノ酸配列式で表わされるボリペゾチ１か
   らなることを特徴とする、インターフェロン様ポリ被ゾ
   チド。 Ｃｙｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−１
   （ｉ　ｓ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−
   Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ
   ｌａ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ４１ｅ−８ｅｒ
   −Ｈｌｓ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
   Ａｓｐ−ＡｒＨ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐ
   ｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓ
   ｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｑ
   −Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−１１ｅ−８ｅｒ−Ａ５−８
   ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｒ　１ｅ−Ｇｌｎ−
   ’Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
   ８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−８ｅｒ−Ａ
   ｌａ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ７Ｔｈｒ−Ｌｅ
   ｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−１１ｅ
   −Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
   Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｖ
   ａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａ
   ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ
   −ＡＩＩｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−８ｅｒ−１１ｅ−Ｌｅｕ
   −Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＬｙｌＩ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ
   −Ｇｌ　ｎ−Ａｒｇ−４１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ
   −Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−
   ３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｖ
   ａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｍｅ
   ｔ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−３ｅｒ
   −Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙａ−ノ酸配列
   式で表わされるインターフェロン様ポリペプチドの製造
   法。 アミノ酸配列式 ％式％ Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔ
   ｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉ　ｎ（；ｌ　ｎ
   −Ｌｅｕ−Ａｓ　ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌ
   　ｎ−Ｃｙｓ−Ｖａ　ｌ　−Ｔｂｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−
   Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａ
   ｌａ−Ｌｅｕ−Ｍｅ　ｔ−Ａｓｎ−Ｇ１　ｕ−Ａ８ｐ−
   ８ａ　ｒ−１］　］ｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖｉ　Ｉ−Ａ
   ｒｇ−ＬｙｌＩ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉ
   ｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＧＩ
   ｙ−ＬｙｌＩ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｙ
   ｓ−ＡＩ　！Ｉ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａ］−Ａ
   ｒｇ−Ａｌａ−ＧＩｕ−ＩＩｅＪ４ｅｔ−ＡｒＦＣ−Ｓ
   ｅｒ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａ！
   ！ｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒ
   ｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ工程 （１）上ｉｌ己アミノ酸配列式で表わされるインターフ
   ェロン様ポリペプチドの構造遺伝子を含む遺伝子を用意
   すること。 （２）予定した宿主細胞内で増殖可能なシラスミドにこ
   の３ｙｔ伝子を組込んで、この細胞１内で増殖可能なプ
   ラスミド組換体をつくること。 （３）このシラスミドによって、宿主イ（１１胞を形質
   転換させること。 （４）得られる形Ｊ）■転換体を培：４すし、産生され
   たイア１−７エロン様ポリペプチドを回収すること。 ３、予定した宿主細胞内で増殖可能なプラスミｒがトリ
   ゾトファンオ被ロンの発現系を利用できるものである、
   特許請求の範囲第２項記載の製造法。 ４、予定した宿主細胞内で増殖可能なシラスミドがラム
   ダファージの初期発現系（ＰＲ−ＰＬ）を利用できるも
   のである。特許請求の範囲第２項記載の製造法。 ５、宿主細胞がエシェリキア（Ｅ９ｈｅｒｉｃｈｉａ　
   ）属罠６、下記のアミノ酸配列式で表わされるインター
   フェロン様ポリペプチドを表現する構造遺伝子を含む、
   二本鎖ポリデオキシリゼヌクレオチド。 Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−川
   ５−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓ　ｎ−Ａｒ　ｇ−Ａ
   ｒｇ−Ａｌ　ａ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅ　ｕ−
   Ａ　］　ｎ−Ｇ１　ｎ　−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−１
   １ｅ−８ｅｒ−Ｈｉａ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌａ
   ｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ
   −Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ
   −Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−
   Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−１１ｅ−８
   ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−ＩＩ
   ｅ−Ｇｉｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
   −Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｎｐ−３ｅｒ−
   ８ｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔ
   ｈｒ−Ｌｃｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｙ
   ｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１
   　ｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓ　ｐ−Ｌｅ　ｕ−Ｇｌ　ｕ
   −Ａ　ｌ　ａ−Ｃｙｓ−Ｖａ　Ｉ−Ｔｈｒ−ＧＩＨ−Ｇ
   ］ｔ＋−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｃ÷Ｉｕ−
   １１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｍｅ　ｔ−Ａ　５ｎ−Ｇｌ　
   ｕ−Ａｓ　ｐ−８ｅ　ｒ−１］　ｅ−Ｌｅ　ｏ−Ａｌ　
   ａ−Ｖａ　ｌ　−Ａｒ　Ｆ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈ　ｅ
   　−Ｇ　１　ｎ−Ａ　ｒ　ｇ−ｒ　ｌ　ｅ−Ｐｒ　ｏ−
   Ｌｅ　１１−Ｔｙｒ−Ｌｃｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
   −Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−
   Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｖｎｌ−Ｖｉｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇ
   ｌｕ−１１ｅ−八４ｅｔ−Ａｒｇ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−３
   ｅｒ−１）ｈｅ−３ｅｔ−’Ｉ’ｈｒ−Ａｓｎ−ｂｅｕ
   −ＧＩｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−へｒＨ−Ａｒｇ−
   Ｔ、＋ｙｓ−へｓｐ７、構造遺伝子が下記の塩基配列の
   ものである、特許請求の範囲第６項記載の二本釦ポリデ
   オキシリゼヌクレオチ１゜ Ｃｙｘ　Ａｓｐ　Ｌｅｆｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　７’Ａ、
   ｒ　ｌ１ｉｒ　Ｓｅｒ　１．ｔｕ　ＧｌｙＴＧＴ−ＧＡ
   Ｔ−ＣＴＧ−ＣＣＴ−ＣＡＣ−ＡＣＴ−ＣＡＣ−ＡＧＣ
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   ＡＧ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−Ａ、ＧＴ−ＴＧＴ−ＴＴＧ−Ａ
   ＡＣ−ＧＴＴ−ＴＴＴ−Ｇｌｙ　Ｌｐｒｔ　Ｉｒ、ｑ　
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   ＧＧ−ＡＡＧ−ＧＡＴＣＣＴ−ＡＡＴ−ＴＣＴ”ＴＣＣ
   −ＴＴＣ−ＣＴＡ８、下記のアミノ酸配列式で表わされ
   るインターフェロン様ポリペプチドを表現する構造遺伝
   子を倉む、プラスミド組換体。 Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ｈ
   ｆ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
   −Ａｌ　ａ−Ｌｅｕ（Ｉｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌ　ａ
   −Ｇｌｎ−閘ｅｔ−Ｇｌｙ−ＡｒＦｒ−１１ｅ−８ｅｒ
   −Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
   Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＡＳｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐ
   ｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｎ−Ｇｌｕ−Ｖａ　Ｉ−Ｐｈｅ−
   Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｎ−
   Ｌｙｓ　−Ａｌａ−ＧＩｎ−Ａｌａ−１１ｅ−８ｅｒ−
   Ａｌａ−Ｐｈｅ−）＋ｉｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−１］　ｅ
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   Ａｓ　ｎ−Ｌｅ　ｕ−Ｐｈ　ｒ＋−８ｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒ
   −Ｌｙｓ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｓｅｒ−Δ１ａ−Ａｌａ−
   Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ
   ｓ　ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｙｒ−１］　］ｅ−Ｇｌ
   ｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＧＩｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＡＩＩ
   ｎ−Ａｓｐ−Ｌｒ＋ｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｖａ
   ｌ−１’ｈｒ−Ｇｌ　ｒ＋−Ｇｌ　ｕ−Ｖａ　］　−Ｇ
   ｌ　ｙ−Ｖａ　］−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ　＋＋−１１ｅ−Ａ
   ｌ　ｅ−Ｌｅｕ−Ｍｏｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−８
   ｅｒ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙ
   ｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｎ−Ａｒｇ−Ｉ　ｌ　ｅ−
   Ｐｒｏ−Ｌａ　ｕ−Ｔｙ　ｒ−Ｌｅ　ｕ−Ｍｅ　ｔ−Ｇ
   ｌ　ｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−８ｅ　ｒ−Ｐｒｏ−
   Ｃｙｓ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａ
   ｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｍｅｔ−Ａｒ
   ｇ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｔｂｒ
   −Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
   Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡＳｐ９、下記のアミノ酸配
   列式で表わされるインターフェロン様ポリペプチドの構
   造遺伝子を組み込んだ、予定した宿主細胞内で増殖可能
   な、グラスミ１組換体によって形質転換されたものであ
   ることを特徴とするエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｌ−ｃ
   ｈｌａ）属に属する該ポリペプチド産生菌。 Ｃｙａ−ＡＩＩｐ−Ｌ＠ｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−
   ＨｉＩ！−Ｆｉｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓ　ｎ−Ａｒ
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   ｕ−Ｌｅａ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｇｌ　ｎ−ｌＸｅ　ｔ−Ｇ　
   Ｉｙ−Ａｒｇ−Ｉ　ｌ　ｅ−８ｅ　ｒ−、Ｈｌ　５−Ｐ
   ｈｅ−８ｅ　ｒ−Ｃ：ｖ　５−Ｌｅｕ−Ｌｙ　ｓ−ＡＳ
   ｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｈ　ｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈ
   ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　］　］ｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−
   ＡｓｐＧｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙ
   ｓ−八Ｉａ−Ｇｌｎ−Ａｌｎ−１１ｅ−８ｅｔ−Ａｌａ
   −Ｐｈｃ−ｆ（ｉｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｉ　Ｉｅ−Ｇｌ
   ｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
   −３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−８ｅｒ−６ｅｒ−
   Ａｌａ−Ａｌｎ−Ｔｒｐ−ＡＳｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌ
   （＋　ｕ−Ｌｅ　ｕ−Ａｓ　ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ　−’
   ｒｙ　ｒ−’ｒ　Ｉ　ｅ　−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｌｅ　ｕ−Ｐ
   ｈ　ｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＡＩＩｎ−Ａｓｐ−
   Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇ
   ｌｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
   ｕ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａ＋＋ｎ−Ｇｌ
   ｕ−Ａｓｐ−８ｅｒ４１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−
   Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｒｇ−
   Ｔ　ｌ　ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅ　ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅ
   ｔ−ＧＩｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｐｒｏ
   −Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−ＧＪ　ｕ−ＶａＩ−ＶＦＩ
   　ｌ−Ａｔ　ＦＣ−Ａ　Ｉ　１ｌ−Ｇｌ　ｏ−Ｔ　］　
   ｅ−Ｍｅ　ｔ−Ａｒｇ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−８ｅｒ＝Ｐｈ
   ｅ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−へｑｎ−Ｌｅｕ付ｎ−ｔ、ｙＲ−
   Ｇｌｙ−１，、ｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ
   ハλ該ポリペゾチド産生繭がエシェリキア・コリ（Ｅｓ
   ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）である、特許請求の
   範囲第９与）１１己載の産生菌。