JPS6058074A - Plasmid and transformation of bacillus brevis using it - Google Patents
Plasmid and transformation of bacillus brevis using itInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はプラスミドおよびそれを用いてバチルス・プレ
ビスを形質転換する方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a plasmid and a method for transforming Bacillus plevis using the same.
バチルス・プレビス(Bacillusbrevig
)は表層蛋白質を細胞外に多量に蓄積し、またプロテア
ーゼ活性が少ない。Bacillus brevig
) accumulates large amounts of surface proteins outside the cells and has little protease activity.
な性質に着目し、本菌は組換えDNAの受容菌として好
適なものであると考えた。Based on these characteristics, we considered this bacterium to be suitable as a recipient bacterium for recombinant DNA.
しかるに、これまでにバチルス・プレビスにおいてはコ
ピー数の多いプラスミドは見出されていない。このよう
な事情のため、バチルス・ブレjビスのDNA受容菌と
し沓ぐれた性質は利用されていなかった〇
そこで、バチルス−プレビス細胞内でよく増殖できるプ
ラスミドベクターの開発が強く要望されている。However, no plasmid with a high copy number has been found in Bacillus plevis so far. Due to these circumstances, the outstanding properties of Bacillus brejvis as a DNA recipient bacterium have not been utilized.Therefore, there is a strong demand for the development of plasmid vectors that can proliferate well within Bacillus brevis cells.
本発明者らは、スタフィロコッカス・アウレウス由来の
プラスミドであってバチルス・ズブチリスを宿主とする
ベクターとして広く使用されているpUB 110 (
Gryawan、 T、 J、 、 8.0onten
te tmdD。The present inventors developed pUB 110 (
Gryawan, T. J., 8.0 onten.
te tmdD.
Dubnan (19ys) J、Eacteriol
、 154.318−529 )に注目し、このプラス
ミドベクターpUB i 10を用いてバチルス・プレ
ビスを形質転換したところ、pUl 110はバチルス
。プレビス細胞内で極めてよく増殖することならびに該
プラスミドpUB 110バチルス・プレビスを形質転
換せしめたところ、この外来遺伝子の情報を効率よく発
現することを見出した。Dubnan (19ys) J, Acteriol
, 154.318-529), and when this plasmid vector pUB i 10 was used to transform Bacillus plevis, pUl 110 was transformed into Bacillus. It was found that the plasmid pUB 110 proliferated extremely well in Bacillus plevis cells, and that the information of this foreign gene was efficiently expressed when the plasmid pUB 110 was transformed.
本発明は第1にプラスミドpUB j 10のドライブ
ユニット領域を少なくとも有するプラスミドであってバ
チルス・プレビスの細胞内に含まれているプラスミドを
提供するものであシ、第2にバチルス・プレビスの細胞
内にプラスミドpUB 110のドライブユニット領域
を少なくとも有するプラスミドを導入することを特徴と
するバチルス・プレビスの形質転換方法を提供するもの
である。The present invention firstly provides a plasmid that has at least the drive unit region of plasmid pUB j 10 and is contained in Bacillus plevis cells, and secondly, it provides a plasmid that is contained in Bacillus plevis cells. The present invention provides a method for transforming Bacillus plevis, which is characterized by introducing a plasmid having at least the drive unit region of plasmid pUB110.
ここで、ドライブユニット領域とはori領域と同餞で
あシ、宿主細胞内でプラスミドが増殖しつる機能を司る
DNA領域を意味する。本発明のプラスミドpUB 1
10のドライブユニット領域を少なくとも有するプラス
ミドとしてドライブユニット領域のほかに薬剤耐性など
の宿主細胞内に導入されたときに、その宿主を形質転換
して当該プラスミドが導入されていない宿主と区別出来
るよう圧するための、いわゆるマーカー遺伝子が含まれ
ているものを用いることが望ましい。さらに、プロモー
ター配列を入れておくこともでき、そのほか発現させる
べき蛋白質をコードする遺伝子、蛋白質を細胞外に分泌
せしめるに必要なりIIAなどが挿入されていてもよい
。すなわち、これらマーカー遺伝子、プロモーター配列
、外来遺伝子および/または蛋白質分泌のためのDNA
が挿入されているプラスミドのいずれも本発明における
プラスミドに含まれるものである。Here, the drive unit region is the same as the ori region, and refers to a DNA region that controls the function of plasmid propagation within a host cell. Plasmid of the invention pUB1
As a plasmid having at least 10 drive unit regions, in addition to the drive unit region, when introduced into a host cell such as drug resistance, it transforms the host and pressures the host so that it can be distinguished from a host in which the plasmid has not been introduced. It is desirable to use one that contains a so-called marker gene. Furthermore, a promoter sequence may be inserted, and in addition, a gene encoding a protein to be expressed, IIA, etc. necessary for secreting the protein to the outside of the cell may be inserted. That is, these marker genes, promoter sequences, foreign genes and/or DNA for protein secretion.
Any plasmid into which is inserted is included in the plasmids of the present invention.
本発明のpUB 110由来の新しいプラスミドは具体
的には次のようなものがある。すなわち、第1図に制限
酵素切断地図を示しだプラスミドplB−2はpUB
110とTIBB!+22を結合したものでアシ、大腸
菌(E、 coli )とバチルス・ プレビス(Ea
ail18brevis ) におけるシャトルベクタ
ーであり、いずれの細菌においてもコピー数が多いとい
う特色がある。図中、Amp’ はアンピシリン耐性、
Tarはテトラサイクリン耐性、 Nmrはネオマイシ
ン耐性を示す。第2図に、本発明の新しいプラスミドで
あるpKB−5およびpET −1の制限酵素切断地図
およびその造成経過を示す。pHT −1はpUBll
oと同様にバチルス・プレビスでコピー数の多いプラス
ミドであシ、ネオマイシン耐性遺伝子(Nmr)のほか
にエリスロマイシン耐性遺伝子(m−’ )を含んでい
る。さらに、pUB 110DNAに存在した制限酵素
切断部位以外にH1n4■によシ1個所切−断される部
位をもっている。また、pUBlloとα−アミラ)ゼ
な結合させて得たプラスミドpBAM−102の制限酵
素切断地図を第3図に示す。Specifically, the new plasmids derived from pUB110 of the present invention are as follows. That is, the restriction enzyme cleavage map is shown in Figure 1. Plasmid plB-2 is pUB
110 and TIBB! +22 is combined with Ashi, Escherichia coli (E, coli) and Bacillus plebis (Ea).
ail18brevis), and is characterized by a high copy number in all bacteria. In the figure, Amp' is ampicillin resistance;
Tar indicates tetracycline resistance, and Nmr indicates neomycin resistance. FIG. 2 shows the restriction enzyme cleavage maps of pKB-5 and pET-1, which are new plasmids of the present invention, and the progress of their construction. pHT-1 is pUBll
It is a plasmid with a large copy number in Bacillus plebis, similar to O, and contains an erythromycin resistance gene (m-') in addition to the neomycin resistance gene (Nmr). Furthermore, in addition to the restriction enzyme cleavage site present in pUB110 DNA, it has one site that is cleaved by H1n4. Furthermore, the restriction enzyme cleavage map of plasmid pBAM-102 obtained by ligating pUBllo with α-amylase is shown in FIG.
上記各プラスミドを導入した大腸菌およびノ(チルス・
プレビスはいずれも微工研に寄託されておシ、菌株名と
寄託番号は以下の通りである。E. coli and No.
All of the Plebis strains have been deposited with the Institute of Fine Technology, and the strain names and deposit numbers are as follows.
11!echeriahia coli HB101/
pH1B−2FICRMP−7227HB 101/醪
B−5FIl+RM P−7228B&cillus
brevis 47/pHT−1ア]IinM P−7
226147/pBAM−102’I!HRM P−7
’225どがある。また、プラスミドベクターの例とし
ては上記した4種類のプラスミドがある。11! echeriahia coli HB101/
pH1B-2FICRMP-7227HB 101/Momi B-5FIl+RM P-7228B&cillus
brevis 47/pHT-1a] IinM P-7
226147/pBAM-102'I! HRM P-7
'225 etc. Furthermore, examples of plasmid vectors include the four types of plasmids described above.
バチルス拳プレビスを形質転換する方法としては以下の
ような方法があるO
高滲透圧液(高張溶液とも云う。)に浮遊した細胞にリ
ゾチームを作用させて生じたプロトプラスト(細胞壁を
失なった裸の細胞)にポリエチレングリフールを用いて
プラスミドDNAを導入する方法や後述するように、ア
ルカリ性トリス塩酸緩衝液による処理で表層蛋白質を除
去した細胞(細胞壁の蛋白質のみを失なった細胞)にポ
リエチレングリコールを用いてプラスミドDNAを導入
する方法がある。The following methods are available for transforming Bacillus plebis. Protoplasts (naked cells that have lost their cell walls) are produced by the action of lysozyme on cells suspended in a high osmotic solution (also called a hypertonic solution). Using polyethylene glycol to introduce plasmid DNA into cells (cells) that have had surface proteins removed by treatment with alkaline Tris-HCl buffer (cells that have lost only cell wall proteins), as described later, There is a method of introducing plasmid DNA using
本発明のプラスミドを用いることによってノくチルス・
プレビスを容易に形質転換することができる。このバチ
ルス・プレビスは蛋白質を菌体外に多量に生産する能力
を有しておシ、しかもブpテアーゼ活性がないので、生
成した蛋白質が分解されない。したがって、動物、植物
および微生物山水/7−1纏桜手か釦込んだ渦を、その
遺伝子の有する遺伝情報は高い効率で発現され、かつ生
成した蛋白質は分解されず菌体外に分泌される。なお、
本発明のプラスミドを組込んで形質転換したバチルス・
プレビスの培養は通常のバチルス・プレビスの培養と同
じ方法で行なえばよい。By using the plasmid of the present invention, Noctilus
plebis can be easily transformed. This Bacillus plebis has the ability to produce a large amount of protein outside the bacterial body, and since it does not have buptease activity, the produced protein is not degraded. Therefore, the genetic information of the gene is expressed with high efficiency, and the produced protein is secreted outside the bacterial body without being degraded. . In addition,
Bacillus transformed with the plasmid of the present invention
Cultivation of Bacillus plevis may be carried out in the same manner as the usual cultivation of Bacillus plevis.
次に、本発明を実施例によシ説明する。Next, the present invention will be explained using examples.
実施例1
第2図に示したように、プラスミドpH079(Hoh
n、 B、and 0olline 、 :f、 (1
980) Gono 11.291−298)とプラス
ミドpUB 110 (Gryczan 、 T、 J
、。Example 1 As shown in FIG. 2, plasmid pH079 (Hoh
n, B, and 0olline, :f, (1
980) Gono 11.291-298) and plasmid pUB 110 (Gryczan, T, J
,.
S、 0ontente and D、 Dubnan
(197B ) J、 Baateriol。S, 0ontente and D, Dubnan
(197B) J, Baateriol.
V己、 31B−129)とをII!coPI部位で結
合したものをntn(I III 、 Ola Hで切
断し、これにHlndlll。Vself, 31B-129) and II! The one bound at the coPI site was cleaved with ntn(III, Ola H, and Hlndll.
CIILIで切断して得たプラスミドpHW 1 (H
orinouQhi 。Plasmid pHW 1 (H
orinouQhi.
S and B、 Weisblum (1982)
、T、 Bacteriol、150.804−814
)由来のエリスロマイシン耐性遺伝子を挿入することに
よってシャトルベクターpKE 5を得た。S and B, Weisblum (1982)
, T. Bacteriol, 150.804-814
Shuttle vector pKE5 was obtained by inserting the erythromycin resistance gene derived from A. ).
次いで、このプラスミドpHB 5から0.9KbのB
amHi断片を除去することによりプラスミドpHT−
1を得た。Then, from this plasmid pHB5, 0.9 Kb of B
By removing the amHi fragment, the plasmid pHT-
I got 1.
実施例2
プラスミドpBR322とプラスミドpUB110を用
い、実施例1と同様にしてこれらをKcoB 1部位で
結合することにより、第1図に示したプラスミドpFi
B 2を得た。Example 2 Plasmid pBR322 and plasmid pUB110 were ligated at the KcoB 1 site in the same manner as in Example 1 to create the plasmid pFi shown in FIG.
I got B2.
実施例5
(11好熱性α−アミラーゼ遺伝子の分離バチルス・ス
テアロザーモフィラス(B、 5tearo −the
rmophilus ) DY −5の好熱性α−アミ
ラーゼ遺伝子を含むプラスミドpH工501よシα−ア
ミラーゼ遺伝子を以下のようにして調製した。Example 5 (11 Isolation of thermophilic α-amylase gene) Bacillus stearothermophilus (B, 5tearo-the
The α-amylase gene of plasmid pH Engineering 501 containing the thermophilic α-amylase gene of DY-5 was prepared as follows.
プラスミドpH工5o1(%FM昭58−50148号
明細書参照)を制限酵素]jjaoB Iで部分的に加
水分解後、再びBarn Hlで部分的に加水分解し、
種々の長さのDNAを調製し、これをα−アミラーゼ遺
伝子として用いた。Plasmid pH engineering 5o1 (see %FM specification No. 58-50148) was partially hydrolyzed with restriction enzyme] jjaoB I, and then partially hydrolyzed again with Barn Hl,
DNAs of various lengths were prepared and used as the α-amylase gene.
(2) バチルス・ズプヂリスとバチルス・プレビス4
7への好熱性α−アミラーゼ遺伝子のクローニング
ベクター・プラスミドとしてpU13110を用いた。(2) Bacillus spudiris and Bacillus plebis 4
pU13110 was used as a cloning vector plasmid for the thermophilic α-amylase gene into 7.
まず、プラスミドpUB 100を制限酵素’EaoB
IおよびBamHIで切断し、5′末端のリン酸基をバ
クチリアル・アルカリ・ホスファターゼ処理により除去
し、線状プラスミドpUB 11 Gを調製した。First, plasmid pUB100 was added with restriction enzyme 'EaoB
A linear plasmid pUB 11 G was prepared by cutting with I and BamHI and removing the 5'-terminal phosphate group by bacterial alkaline phosphatase treatment.
前記好熱性アミラーゼDNAと線状プラスミドpUB
110を混合し、T4DIIAリガーゼで両DNAを連
結した。The thermophilic amylase DNA and linear plasmid pUB
110, and both DNAs were ligated using T4DIIA ligase.
連結したDNAを枯草菌(E、 5ubtilis )
I A 289(α−アミラーゼ陰性株)にOh=g
、 S、 and 0ohen 。The ligated DNA was transformed into Bacillus subtilis (E, 5ubtilis).
Oh=g for IA 289 (α-amylase negative strain)
, S., and 0ohen.
S、 )I、のプロトプラスト法(Mo1ea、 Qe
n、 Gono七、168゜111−115 (197
9)) で形質転換し、カナマイシン耐性によシ多数の
形質転換株を得た。これらの形質転換株を1%可溶性デ
ンプンと10μν盲カナマイシンを含むDifco A
ntibiotic medium 3プレート上にレ
プリカし、1夜培養後、ヨードデンプン反応によりコロ
ニーの周辺が無色になっているものを検索することによ
ってα−アミラーゼ生産株を選択した。第3図はα−ア
ミラーゼ遺伝子の入ったプラスミドpBAM −102
の制限酵素切断地図である。S, ) I, protoplast method (Mo1ea, Qe
n, Gono 7, 168゜111-115 (197
9)), and a large number of transformed strains resistant to kanamycin were obtained. These transformants were treated with Difco A containing 1% soluble starch and 10μν blind kanamycin.
After replicating on an ntibiotic medium 3 plate and culturing overnight, α-amylase producing strains were selected by searching for colonies whose surroundings were colorless by iodostarch reaction. Figure 3 shows plasmid pBAM-102 containing the α-amylase gene.
This is a restriction enzyme cleavage map of .
上記α−アミラーゼ遺伝子の入ったプラスミドを有する
枯草菌よりプラスミドをBirnboim 、 H。Birnboim, H. obtained a plasmid from Bacillus subtilis containing a plasmid containing the above α-amylase gene.
0、 and Doly 、 J、の方法(Nucls
ia Ac1ds Ees、、7 。0, and Doly, J.'s method (Nucls
ia Ac1ds Ees,,7.
151!l−1525(1979))により抽出し、セ
シウムク四ライドーエチジウムブロマイド超遠心分離法
でさらにプラスミドDNAを精製したのちバチルス・プ
レビス47菌の形質転換に使用した。151! 1-1525 (1979)), and the plasmid DNA was further purified by cesium tetralide ethidium bromide ultracentrifugation and used for transformation of Bacillus plebis 47.
まずはじめにアルカリ性トリス塩酸緩割液による処理に
よってバチルス・プレビスの表層蛋白質を除去し、残さ
れたペプチドグリカン層と細胞質膜によってのみ囲まれ
た細胞にポリエチレングリコールを用いてプラスミドD
NAを導入した。ずなわち、T、培地に前培養したバチ
ルス・プレビスの菌液を新しいT、培地5−に100分
の1希釈し、37℃で振とう培養を行ない、対数増殖後
期(0,D、 660 nm =1.9)に達したとき
、菌体を遠心(5000f、5分、室温)によって集め
、50mMのトリス塩酸緩衝液(pH7,5) 5m7
によシ洗浄した後、50mMのトリス塩酸緩衝液(pi
e、5 )にV濁し、57°Cで振とうした。60分
後、菌体を遠心(5000G、s分、室温)によって集
め、0.5m/のTP培地(0,955%KH,PO,
、0,426%Na2HPO4,0,5%肉エキス、1
%ポリペプトソ、0.2%F?母エキス、1%グルコー
ス)K懸濁した。これにプラスミドDNA溶液(10m
M)リス塩酸綬衝液、 pH7,5、1mM IeDT
A)とTP培地の1:1混合液100μtを加えて混合
した。次いで、直ちに40%ポリエチレングリコール溶
液(0,953%KH,PO,、0,426%Na2H
PO4、40%(w/v )ポリエチレングリコールp
xa6ooo)1.5mを加えて攪拌し、37℃で10
分分間上うし、た。しかる後、遠心(5000ji’、
5分、室温)によシ菌体を集め、20 mMMgo4を
添加したT、培地に懸濁した。37°Cで150分間振
聞損した後、形質転換体選択用の寒天培地(60μF!
−/Iのネオマイシンを含むT、培地プレート(ポリペ
プトン1%、肉エキス0.5%、 、 酵母エキス0.
2%、グルコース1%、ウラシル0.01%+ pH7
) )に0.1m/ずつ散布した。37℃で30時間培
養してネオマイシン耐性株を得た。これらの形質転換株
を1%可溶性デンプンと60 pf/−/memlネオ
マイシンむT、培地プレート上にレプリカし、1夜培養
後、ヨードデンプン反応によりコロニー周辺が無色にな
ったものを検索することによってα−アミラーゼ生産株
(バチルス・プレビス47/pBAM−102(712
11M P−7225) )を選択した。First, the surface proteins of Bacillus plevis were removed by treatment with an alkaline Tris-HCl solution, and plasmid D
Introduced NA. That is, the bacterial suspension of Bacillus plebis precultured in T medium was diluted to 1/100 in fresh T medium 5-, cultured with shaking at 37°C, and late logarithmic growth (0, D, 660 nm = 1.9), the bacterial cells were collected by centrifugation (5000f, 5 minutes, room temperature) and diluted with 5m7 of 50mM Tris-HCl buffer (pH 7.5).
After washing, 50mM Tris-HCl buffer (pi
e, 5) was suspended in V and shaken at 57°C. After 60 minutes, the bacterial cells were collected by centrifugation (5000G, s min, room temperature) and placed in 0.5 m/ml of TP medium (0,955% KH, PO,
, 0,426% Na2HPO4, 0,5% meat extract, 1
% Polypeptoso, 0.2% F? Mother extract, 1% glucose) K was suspended. Add plasmid DNA solution (10m
M) Liss hydrochloric acid solution, pH 7.5, 1mM IeDT
100 μt of a 1:1 mixture of A) and TP medium was added and mixed. Then, immediately add 40% polyethylene glycol solution (0,953% KH, PO, 0,426% NaH)
PO4, 40% (w/v) polyethylene glycol p
Add 1.5 m of xa6ooo), stir, and heat at 37°C for 10
I went up for a minute. After that, centrifugation (5000ji',
5 minutes at room temperature), the bacterial cells were collected and suspended in T medium supplemented with 20 mM Mgo4. After incubation at 37°C for 150 min, agar medium for transformant selection (60 μF!
-/I medium plate containing neomycin (polypeptone 1%, meat extract 0.5%, yeast extract 0.
2%, glucose 1%, uracil 0.01% + pH 7
) )) was sprayed at a rate of 0.1 m/each. A neomycin-resistant strain was obtained by culturing at 37°C for 30 hours. These transformants were replicated onto a T medium plate containing 1% soluble starch and 60 pf/-/meml neomycin, and after overnight culture, the colonies around them became colorless due to the iodostarch reaction. α-amylase producing strain (Bacillus plevis 47/pBAM-102 (712
11M P-7225)) was selected.
(3) α−アミラーゼの生産・圧
第3図に示すプラスミドを有する枯草菌々らびにバチル
ス・プレビス47菌を60μ¥/ mlネオマイシンま
たは10μfI/ v+lカナマイシンを含むT2液体
培地に接種し、37°Cで22時間培着[7、遠心分離
により培養濾液を調製して培養濾液中のα−アミラーゼ
活性を不破の方法(J、 Eiochθm、旦。(3) Production and pressure of α-amylase Bacillus subtilis and Bacillus plebis 47 bacteria carrying the plasmids shown in Figure 3 were inoculated into a T2 liquid medium containing 60μ¥/ml neomycin or 10μfI/v+l kanamycin, and incubated at 37°C. Culture filtrate for 22 hours at C [7. Culture filtrate was prepared by centrifugation and α-amylase activity in the culture filtrate was determined using a futuristic method (J, Eioch θm, Dan.
5B!S−605(1954))により40°Cで測定
した。5B! S-605 (1954)) at 40°C.
結果を第1表に示す。The results are shown in Table 1.
第1表
ノサ欣・フ1/白47菌 550 5600枯草菌およ
びバチルス・プレビス47菌で作られるα−アミラーゼ
はすべて菌体外に分泌され、耐熱性を示した。第1表に
示したように、α−アミラーゼ遺伝子を含む同じプラス
ミドの存在によってバチルス・プレビス47菌を宿主と
した場合には、枯草菌におけるよシも約10倍に及ぶ多
量のα−アミラーゼが生産された。Table 1 Nosakin Fu1/White 47 Bacteria 550 5600 All α-amylases produced by Bacillus subtilis and Bacillus plevis 47 were secreted outside the cells and showed heat resistance. As shown in Table 1, when Bacillus plevis 47 is used as a host due to the presence of the same plasmid containing the α-amylase gene, approximately 10 times as much α-amylase is produced as in Bacillus subtilis. produced.
第1図は本発明のプラスミドplB−2の制限酵素切断
地図、第2図は本発明のプラスミドpK13−3および
pHT −1の制限酵素切断地図およびこれらプラスミ
ドの造成経過を示すものである。第6図は本発明のプラ
スミドpBAM−102の制限酵素切断地図である。
特許出願人 鵜 高 重 三
第1図
手続補正書(自発)
昭和58年10月6 日
特許庁長官 若杉和夫 殿
1、 事件の表示
特願昭58−165066
2 発明の名称
プラスミドおよびそれを用いてバチルス・プレビスを形
質転換する方法
五 補正をする者
事件との関係 特許出願人
鵜高重三
4、代理人
〒104
東京都中央区京橋1丁目1番10号
5、 補正の対象
明細書の発明の詳細な説明の欄および図面& 補正の内
容
(1)明細書第2頁下から6行目の(’ Dubnan
J を「Dub部U」に訂正する。
(2) 同第7頁11行目の[D、 Dubnan J
を[D。
Dubnau Jに訂正する◎
(3) 同第7頁下から2行目のr 0.9 K?)
」 を[6,9Wb J に訂正する。
(4) 第1図〜第5図を別紙の通りに訂jEするO(
以上)
第1図FIG. 1 shows a restriction enzyme cleavage map of plasmid plB-2 of the present invention, and FIG. 2 shows a restriction enzyme cleavage map of plasmids pK13-3 and pHT-1 of the present invention and the construction progress of these plasmids. FIG. 6 is a restriction enzyme cleavage map of plasmid pBAM-102 of the present invention. Patent Applicant: U Taka Shige 3 Figure 1 Procedural Amendment (Voluntary) October 6, 1980 Commissioner of the Japan Patent Office Kazuo Wakasugi 1. Indication of Case Patent Application 165066/1982 2. Name of the Invention Plasmid and its Use Method for transforming Bacillus plebis 5 Relationship with the case of the person making the amendment Patent applicant Shigezo Udaka 4, Agent 1-1-10-5 Kyobashi, Chuo-ku, Tokyo 104 Invention of the specification subject to the amendment Detailed explanation column and contents of drawings & amendments (1) 6th line from the bottom of page 2 of the specification (' Dubnan
Correct J to "Dub part U". (2) Page 7, line 11 [D, Dubnan J
[D. Corrected by Dubnau J ◎ (3) r 0.9 K? on the second line from the bottom of page 7. )
” is corrected to [6,9Wb J. (4) Revise Figures 1 to 5 as shown in the attached sheet.
Above) Figure 1
Claims (1)
A域を少なくとも有し、バチルス・プレビスの細胞内に
含まれているプラスミド。 2 バチルス・プレビスの細胞内にプラスミドpUB
110のドライブユニット領域を少なくとも有するプラ
スミドを導入することを特徴とするバチルス0プレビス
の形質転換方法。[Claims] 1. Drive unit 9 of plasmid pUB 110
A plasmid that has at least the A region and is contained in Bacillus plevis cells. 2 Plasmid pUB in Bacillus plevis cells
A method for transforming Bacillus 0. plebis, which comprises introducing a plasmid having at least a 110 drive unit region.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58165066A JPS6058074A (en) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | Plasmid and transformation of bacillus brevis using it |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP58165066A JPS6058074A (en) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | Plasmid and transformation of bacillus brevis using it |
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Publication Number | Publication Date |
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JPS6058074A true JPS6058074A (en) | 1985-04-04 |
JPH0156756B2 JPH0156756B2 (en) | 1989-12-01 |
Family
ID=15805214
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58165066A Granted JPS6058074A (en) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | Plasmid and transformation of bacillus brevis using it |
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Country | Link |
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---|---|
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