JPS61212288A - Production of protein - Google Patents

Production of protein

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JPS61212288A
JPS61212288A JP60053433A JP5343385A JPS61212288A JP S61212288 A JPS61212288 A JP S61212288A JP 60053433 A JP60053433 A JP 60053433A JP 5343385 A JP5343385 A JP 5343385A JP S61212288 A JPS61212288 A JP S61212288A
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章 中山
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浩章 島田
Izumi Mita
三田　泉
Toshibumi Ozaki
俊文 尾崎
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Abstract

PURPOSE:A developing and secreting vector obtained by bonding specific two DNA base sequence to a phage plasmid replicable with a bacterium belonging to the genus Bacillus or its derivative, desired mold is secreted outside a mold and the protein is easily separated, and purified. CONSTITUTION:A developing and secreting vector obtained by bonding DNA base sequence participating in development of neutral protease gene outside a mold of a bacterium belonging to the genus Bacillus and DNA base sequence to code PRE-PRO structure of neutral protease to a phage plasmid replicable with a bacterium belonging to the genus Bacillus or its derivative. The DNA sequence is shown by the formula.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はバチルス属細菌を宿主菌とし遺伝子工学の手法
に依って所望の蛋白を該細菌の培養上清中に分泌生産さ
せる方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for secreting and producing a desired protein into the culture supernatant of Bacillus bacteria using genetic engineering techniques as a host bacterium.

本発明は特にバチルス属細菌で多量に分泌生産される菌
体外中性プロテアーゼの発現に関与するＤＮＡ塩基配列
と、該プロテアーゼのプレープロ構造をコードするＤＮ
Ａ塩基配列を有する発現・分泌ベクターに所望の蛋白の
遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を発現および分泌が可能と
なる様に連結して得た組換え体ＤＮＡを宿主菌として用
いるバチルス属細菌へ導入することによシ、所望の蛋白
を該細菌に分泌生産させる方法に関するものである。The present invention particularly relates to a DNA base sequence involved in the expression of an extracellular neutral protease secreted and produced in large amounts by Bacillus bacteria, and a DNA encoding the preprostructure of the protease.
A DNA base sequence containing the desired protein gene is linked to an expression/secretion vector having the A base sequence in a manner that enables expression and secretion, and the resulting recombinant DNA is introduced into a Bacillus bacterium to be used as a host bacterium. In particular, it relates to a method for secreting and producing a desired protein in the bacteria.

中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与するＤＮＡ塩基配
列としては、ＲＮＡポリメラーゼが認識し結合する領域
である−６５および一１０領域を含むプロモーター領域
、およびＲＮＡポリメラーゼによシ合成されたｍＲＮＡ
がリポソームと結合するためのリポソーム結合領域が重
要であることが知られている。そしてこれらの領域のＤ
ＮＡ塩基配列のみならず、これらの領域間のヌクレオチ
ド数、リポソーム結合領域から翻訳開始点までのヌクレ
オチド数もまた重要であることが知られている。The DNA base sequences involved in the expression of the neutral protease gene include the promoter region, which includes the -65 and -10 regions that are recognized and bound by RNA polymerase, and the mRNA synthesized by RNA polymerase.
It is known that the liposome binding region is important for binding to liposomes. and D in these areas
It is known that not only the NA base sequence but also the number of nucleotides between these regions and the number of nucleotides from the liposome binding region to the translation initiation site are important.

また発現の結果産生された中性プロテアーゼは菌体外に
分泌されるのに必要な領域としてシグナル構造と呼ばれ
るポリペプチドを有する。Furthermore, the neutral protease produced as a result of expression has a polypeptide called a signal structure as a region necessary for secretion outside the bacterial cell.

該ポリペプチドは成熟菌体外中性プロテアーゼのＮ末端
上流に存在し分泌の際に削除されるポリペプチドのＮ末
端側、即ちプロ中性プロテアーゼのＮ末端側に結合して
いるもので分泌の際の細胞膜通過に重要な役割を果すこ
とが知られている（Ｇ、ＢＩｏｂｅｌ　、Ｔ、Ｃｅ１ｌ
　Ｂｉｏｌ　　６７８３５（１９７５）　）。This polypeptide exists upstream of the N-terminus of the mature extracellular neutral protease and is bound to the N-terminus of the polypeptide that is deleted during secretion, that is, to the N-terminus of the pro-neutral protease, and is linked to the N-terminus of the pro-neutral protease. It is known that it plays an important role in cell membrane passage during cell membrane transport (G, BIobel, T, Ce1
Biol 67835 (1975)).

上に述べた様なシグナル構造とプロ構造はプレープロ構
造と呼ばれる単一のポリペプチドとして存在し、該部分
は分泌された成熟菌体外中性プロテアーゼには存在しな
いことから分泌の過程で順次切断されると考えられるが
、この切断の過程が中性プロテアーゼの効率のよい分泌
に関連していることは容易に理解し得るものである。従
って該プレープロ構造をコードするＤＮＡ塩基配列は発
現された中性プロテアーゼを分泌させるために重要な領
域であると云える。The signal structure and pro-structure described above exist as a single polypeptide called the pre-pro-structure, and since this part is not present in the secreted mature extracellular neutral protease, they are sequentially formed during the secretion process. It is easy to understand that this cleavage process is associated with efficient secretion of neutral proteases. Therefore, it can be said that the DNA base sequence encoding the pre-pro structure is an important region for secreting the expressed neutral protease.

以上のことから、中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与
するＤＮＡ塩基配列およびプレープロ構造をコードする
ＤＮＡ塩基配列を有する発現・分泌ベクターは、異種遺
伝子を発現させその結果産生された所望の蛋白を菌体外
に分泌させる上で重要な意味を有するものである。Based on the above, an expression/secretion vector having a DNA base sequence involved in the expression of a neutral protease gene and a DNA base sequence encoding a pre-pro structure can be used to express a heterologous gene and to inject the desired protein produced as a result into bacteria. This has an important meaning in secreting it outside the body.

近年の遺伝子工学の著しい発展によシ微生物を用いて異
種蛋白を製造することが可能となった。With the remarkable development of genetic engineering in recent years, it has become possible to produce heterologous proteins using microorganisms.

しかし通常宿主菌として用いられる大腸菌は菌体内に所
望の蛋白を蓄積するので該蛋白の産生量はそれに依って
限定される上に精製の際他の菌体内蛋白と所望の蛋白を
分離することが非常に困難であった。However, since Escherichia coli, which is usually used as a host bacterium, accumulates the desired protein within the bacterial body, the amount of protein produced is limited accordingly, and it is difficult to separate the desired protein from other intracellular proteins during purification. It was extremely difficult.

また精製された所望の蛋白中には大腸菌に由来する発熱
物質が混入することが多く、これらの点で大腸菌を宿主
とする遺伝子工学的な物質生産は実用化の観点から大き
な問題を内包するものであった。Furthermore, the purified desired protein is often contaminated with pyrogens derived from Escherichia coli, and in this respect, genetic engineering material production using Escherichia coli as a host poses major problems from the perspective of practical application. Met.

一方　バチルス属細菌は病原性を有さす永い間抗生物質
、菌体外酵素或は核酸系調味料等の菌体外分泌による製
造に用いられて来たことから、該細菌で使用可能な発現
・分泌ベクターを創製することは微生物による物質生産
の観点から大きな工業的意義を有するものである。On the other hand, Bacillus bacteria have long been pathogenic and have been used for the production of antibiotics, extracellular enzymes, and nucleic acid seasonings by extracellular secretion. The creation of vectors has great industrial significance from the viewpoint of substance production by microorganisms.

以下本発明の詳細な説明する。The present invention will be explained in detail below.

本発明の組換え体ＤＮＡの宿主菌として用いられるバチ
ルス属細菌としてはバチルス　ズブチリス、バチルス　
アミロリキファシエンス、バチルス　セレウス、バチル
ス　メガテリウム、バチルス　ステアロサーモフィルス
等如何なるものでも良いが遺伝学的によく研究されてい
るバチルスズブチリスが用いるのに容易である。Bacillus bacteria used as host bacteria for the recombinant DNA of the present invention include Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, and Bacillus subtilis.
Any species may be used, including Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, and Bacillus stearothermophilus, but Bacillus subtilis, which has been genetically well studied, is easy to use.

宿主菌の形質転換は如何なる方法でも良いがバチルス　
ズブチリスを宿主とした場合はプロトプラスト法（Ｓ、
Ｃｈａｎｇ、　Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ、　Ｍｏｌ　、Ｇｅ
ｎ、Ｇｅｎｅｔ。Any method may be used to transform the host bacteria, but Bacillus
When S. subtilis is used as a host, the protoplast method (S,
Chang, S.N., Cohen, Mol.Ge.
n, Genet.

１９７９、１６８．１１１　）およびコンピテント法（
ｃ、Ａｎａ−ｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｊ、５ｐｉ
ｚｉｚｅｎ、　Ｊ　、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　。1979, 168.111) and the competent method (
c, Ana-gnostopoulos, J, 5pi
Zizen, J., Bacteriol.

１９６１．８１，７４１　　）が有効な方法となる。1961.81, 741) is an effective method.

本発明における発現・分泌ベクターとは、バチルス属の
中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与するＤＮＡ塩基配
列および該中性プロテアーゼのプレープロ構造をコード
するＤＮＡ塩基配列とバチルス属で複製可能なファージ
またはプラスミド或はそれらの誘導体とを結合したもの
を指し、該発現・分泌ベクターに所望の蛋白をコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を結合することにより所
望の蛋白を菌体外に分泌生産させることが可能となるも
のである。The expression/secretion vector in the present invention refers to a DNA base sequence involved in the expression of a neutral protease gene of the genus Bacillus, a DNA base sequence encoding the preprostructure of the neutral protease, and a phage or plasmid capable of replicating in the genus Bacillus. or their derivatives, and by ligating a DNA base sequence containing a gene encoding the desired protein to the expression/secretion vector, it is possible to secrete and produce the desired protein outside the bacterial cell. This is the result.

即ち該発現・分泌ベクターに含まれる中性プロテアーゼ
のプレープロ構造をコードするＤＮＡ塩基配列の下流に
所望の蛋白の遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を結合し宿主
菌として用いるバチルス属細菌へ導入し、該細菌を形質
転換させて所望の蛋白をコードする遺伝子を宿主菌で発
現させその結果産生された所望の蛋白を菌体外に分泌さ
せることを可能とするものである。That is, a DNA base sequence containing the gene of the desired protein is ligated downstream of the DNA base sequence encoding the neutral protease pre-pro structure contained in the expression/secretion vector, and introduced into a Bacillus bacterium used as a host bacterium. It is possible to transform a bacterium, express a gene encoding a desired protein in the host bacterium, and secrete the resulting desired protein out of the bacterium.

かくして分泌された所望の蛋白を回収するには培養液か
ら菌体をｒ過または遠心によって除き、得られた上清か
ら通常の菌体外酵素等を精製する方法を応用することに
よってなされる。The desired protein secreted in this way can be recovered by removing the bacterial cells from the culture solution by r. filtration or centrifugation, and applying a conventional method for purifying extracellular enzymes, etc. from the resulting supernatant.

このことは大腸菌のように菌体内に所望の蛋白が蓄積さ
れる場合に比べ、精製の工程を大幅に簡略化出来、工業
的物質生産の観点から特段に有利な点となる。This greatly simplifies the purification process compared to cases such as Escherichia coli in which the desired protein is accumulated within the bacterial body, which is particularly advantageous from the viewpoint of industrial substance production.

発現・分泌ベクターを構成するプラスミド、７アージ或
はそれらの誘導体としては宿主として用いるバチルス属
細菌で複製可能なものであれば如何なるものでも使用可
能であるが、グラスミドとしては抗生物質耐性に関与す
る遺伝子を有するものが形質転換株を選択する際に便利
である。通常よく用いられるものとしてグラスミドとし
てはスタフィロコッカス由来のｐＵＢｌ　１０　、ｐＴ
Ｐ５　、ｐＵＣ１９４、ｐＫ１９４　、ｐｓＡＯ５０１
、ｐＢＤ６等を、又ファージとしてはφ１５、φ２９、
φ１０５、ρ１１等を挙げることが出来る。As the plasmid, 7age, or their derivatives constituting the expression/secretion vector, any plasmid that can be replicated in the Bacillus bacterium used as the host can be used, but as a grasmid, it is involved in antibiotic resistance. Those having the gene are convenient for selecting transformed strains. Grasmids commonly used include pUBl 10 derived from Staphylococcus, pT
P5, pUC194, pK194, psAO501
, pBD6, etc., and phages such as φ15, φ29,
Examples include φ105 and ρ11.

本発明における発現・分泌ベクターは前述した様に中性
プロテアーゼの発現に関与するＤＮＡ塩基配列を有し、
このＤＮＡ塩基配列によって所望の蛋白の遺伝子を発現
させ、また中性プロテアーゼのプレープロ構造をコード
するＤＮＡ塩基配列によって所望の蛋白のＮ−末端に中
性プロテアーゼのプレープロ構造と同一のポリペプチド
を附加するものである。The expression/secretion vector in the present invention has a DNA base sequence involved in the expression of neutral protease as described above,
This DNA base sequence allows expression of the gene for the desired protein, and the DNA base sequence encoding the neutral protease pre-pro structure is used to inject a polypeptide identical to the pre-pro structure of the neutral protease into the N-terminus of the desired protein. This is an addition.

該ポリペプチドの存在により所望の蛋白の宿主菌として
用いたバチルス属細菌の菌体外への分泌が可能となる。The presence of the polypeptide enables the secretion of the desired protein to the outside of the Bacillus bacterium used as the host bacterium.

従って発現・分泌ベクターでは発現に関与するＤＮＡ塩
基配列、プレープロ構造をコードするＤＮＡ塩基配列の
すぐ下流に所望の蛋白をコードする領域を含むＤＮＡ塩
基配列が結合されなければならない。Therefore, in the expression/secretion vector, a DNA base sequence containing a region encoding the desired protein must be ligated immediately downstream of the DNA base sequence involved in expression and the DNA base sequence encoding the preprostructure.

かかる結合は、中性プロテアーゼが分泌される際に最終
的に切断される成熟酵素Ｎ末端部分、即ちプロ構造の切
断点部分をコードするＤＮＡ塩基配列の該切断点近傍に
存在する制限エンドヌクレアーゼ切断部位を用いること
に依り達成される。Such a bond is caused by restriction endonuclease cleavage present near the cleavage point of the DNA base sequence encoding the N-terminal portion of the mature enzyme, that is, the cleavage point portion of the pro-structure, which is ultimately cleaved when the neutral protease is secreted. This is achieved by using parts.

特にバチルス　アミロリキファシエンスの菌体外中性プ
ロテアーゼ遺伝子の場合はプロ構造切断点近傍をコード
するＩ）ＨＡ塩基配列に制限エンドヌクレアーゼｓｐｈ
工の切断部位が存在するので該部位を用いて所望の蛋白
をコードする領域を含むＤＮＡ塩基配列を結合すること
が出来る。In particular, in the case of the extracellular neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens, the restriction endonuclease sph is applied to the I) HA nucleotide sequence encoding the vicinity of the pro-structure breakage point.
Since a natural cleavage site exists, this site can be used to join a DNA base sequence containing a region encoding a desired protein.

即ち、所望の蛋白をコードする領域を含むＤＮＡ塩基配
列を該Ｓｐｈ工切断部位に直接あるいはリンカ−等を用
いて間接に結合することによシ所望の蛋白を分泌させる
ために必要な組換え体ＤＮＡが構築できる。故にｓｐｈ
工切断部位に直接所望の蛋白をコードする領域を含むＤ
ＮＡ塩基配列を結合するのではなく、１カ所または数カ
所の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有するＤＮＡ塩
基配列を結合させ、該切断部位に所望の蛋白をコードす
る領域を含むＤＮＡ塩基配列を結合する型の発現・分泌
ベクターも当然本発明の範喘に入るものである。That is, by linking a DNA base sequence containing a region encoding a desired protein to the Sph engineering cleavage site either directly or indirectly using a linker or the like, a recombinant necessary for secreting the desired protein is produced. DNA can be constructed. Therefore sph
D containing a region encoding the desired protein directly at the cleavage site
Instead of binding an NA base sequence, a DNA base sequence having one or several restriction endonuclease cleavage sites is bound, and a DNA base sequence containing a region encoding the desired protein is bound to the cleavage site. Expression/secretion vectors also naturally fall within the scope of the present invention.

この様な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有するＤＮ
Ａ塩基配列として本発明者らは第１図に示す塩基配列を
含むものを構築したが、このものはプロ構造切断点近傍
のＳｐｈ工切断部位を該酵素で切断後、エキソヌクレア
ーゼ活性を有する酵素によシ突出末端を除去し平滑末端
にした後、第１図に示す塩基配列を含むＤＮＡ塩基配列
を結合したものである。DN with such a restriction endonuclease cleavage site
The present inventors constructed a nucleotide sequence A containing the nucleotide sequence shown in Figure 1, and after cutting the Sph engineering cleavage site near the pro-structure cleavage point with the enzyme, the A nucleotide sequence was converted into an enzyme having exonuclease activity. After removing the overhanging ends to make blunt ends, a DNA base sequence containing the base sequence shown in FIG. 1 was ligated.

このＤＮＡ塩基配列には制限エンドヌクレアーゼＳｍａ
工、ＢａｍＨＩの切断部位が存在するので、所望の蛋白
をコードする領域を含むＤＮＡ塩基配列を結合する際に
便利である（第２図）。Restriction endonuclease Sma
Since there is a cleavage site for BamHI and BamHI, it is convenient for joining a DNA base sequence containing a region encoding a desired protein (Figure 2).

更に本発明者らは第１図に示すＤＮＡ塩基配列の下流に
バチルス属細菌のα−アミラーゼ遺伝子（本来の分泌シ
グナルをコードするＤＮＡ塩基配列を削除したもの）を
含むＤＮＡ塩基配列が結合した形のＤＮＡ塩基配列を、
中性プロテアーゼ遺伝子のプロ構造切断点近傍の５ｐｈ
ｒ切断部位を前述の様に平滑末端にしたものに連結した
組換え体ＤＮＡを得た（第５図）。Furthermore, the present inventors have constructed a DNA base sequence in which a DNA base sequence containing the α-amylase gene of Bacillus bacteria (the DNA base sequence encoding the original secretion signal has been deleted) is linked downstream of the DNA base sequence shown in FIG. The DNA base sequence of
5ph near the pro-structure break point of the neutral protease gene
A recombinant DNA was obtained in which the r cleavage site was ligated to a blunt end as described above (Figure 5).

このものは中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与するＩ
）ＮＡ塩基配列およびプレープロ構造をコードするＤＮ
Ａ塩基配列のプロ構造の直ぐ下流に第１図に示すＤＮＡ
塩基配列と結合したα−アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
塩基配列が結合したものである。This is I, which is involved in the expression of the neutral protease gene.
) DN encoding the NA base sequence and prepro structure
Immediately downstream of the pro-structure of the A base sequence is the DNA shown in Figure 1.
DNA containing α-amylase gene combined with base sequence
It is a combination of base sequences.

この組換え体ＤＮＡをバチルス属細菌に導入することに
より中性プロテアーゼの発現に関与するＤＮＡ塩基配列
によってα−アミラーゼ遺伝子が発現され、中性プロテ
アーゼのプレープロ構造をＮ−末端上流に附加したプレ
ープロα−アミラーゼが菌体内に合成される。By introducing this recombinant DNA into a bacterium belonging to the genus Bacillus, the α-amylase gene is expressed by the DNA base sequence involved in the expression of neutral protease. Pro-α-amylase is synthesized within the bacterial body.

このものでは、プレープロ構造のはたらきにより発現物
質が菌体外へ分泌されるがその際にプレープロ構造は切
断され培地中には成熟形α−アミラーゼの形となって蓄
積する。即ちかかる組換え体ＤＮＡはα−アミラーゼを
所望とする蛋白と考えた場合には、該蛋白を製造する際
に用いうる組換え体ＤＮＡとなる訳である。そして、こ
のα−アミラーゼ遺伝子とプロ構造の切断点近傍の５ｐ
ｈＩ切断部位を平滑末端にしたものとの間には第１図に
示すＤＮＡ塩基配列が存在する。従って該ＤＮＡ塩基配
列中に存在するｓｍａ工およびＢａｍＨ工の切断部位を
利用して新たな所望の蛋白をコードする領域を含むＤＮ
Ａ塩基配列を結合することが出来る。In this product, the expressed substance is secreted out of the bacterial cell by the action of the pre-pro structure, but at this time the pre-pro structure is cleaved and accumulates in the medium in the form of mature α-amylase. That is, if such recombinant DNA is considered to be the desired protein, α-amylase, then it becomes a recombinant DNA that can be used in producing the protein. Then, 5p near the break point between this α-amylase gene and the pro-structure
The DNA base sequence shown in FIG. 1 exists between the hI cleavage site and the blunt end. Therefore, by utilizing the sma and BamH cleavage sites present in the DNA base sequence, a DNA containing a region encoding a new desired protein is generated.
A base sequence can be combined.

即ちこの組換え体ＤＮＡは発現・分泌ベクターとも云え
るものである。特にこの発現・分泌ベクターはベクター
のみの場合にはα−アミラーゼを宿主菌につくらせるが
、ひとたび所望の蛋白をコードする領域を含むＤＮＡ塩
基配列を前述したＳｍａ工或はＢａｍＨＩ切断部位に挿
入結合した場合には該ベクター中に存在するα−アミラ
ーゼの産生分泌は停止する。That is, this recombinant DNA can also be called an expression/secretion vector. In particular, this expression/secretion vector allows the host bacterium to produce α-amylase when only the vector is used, but once the DNA base sequence containing the region encoding the desired protein is inserted and ligated into the Sma engineering or BamHI cleavage site described above. In this case, production and secretion of α-amylase present in the vector is stopped.

このことは、目的とする所望の蛋白をコードする領域を
含むＤＮＡ塩基配列が発現・分泌ベクターに結合した組
換え体ＤＮＡを有する形質転換株を選択する上でその工
程を極めて簡略化できることになる。This greatly simplifies the process for selecting transformants that have recombinant DNA in which the DNA base sequence containing the region encoding the desired protein is linked to the expression/secretion vector. .

即ち、デンプン含有寒天培地上でヨードでんぷん反応に
よりハローを形成する菌は発現・分泌ベクターそのもの
を含んだものであるが、ハローを形成しなくなったもの
は発現・分泌ベクターに所望の蛋白をコードする領域を
含むＤＮＡ塩基配列が挿入結合したものであることを示
している。In other words, bacteria that form a halo on a starch-containing agar medium by iodostarch reaction contain the expression/secretion vector itself, whereas those that no longer form a halo encode the desired protein in the expression/secretion vector. This shows that the DNA base sequence containing the region is inserted and joined.

本発明者らは本発明の発現・分泌ベクターを用い種々の
所望の蛋白を菌体外に分泌蓄積させることに成功した。The present inventors have succeeded in secreting and accumulating various desired proteins outside of bacterial cells using the expression/secretion vector of the present invention.

このことは該発現・分泌ベクターを用いて枯草菌を宿主
として種々の蛋白、例えばインターフェロン、成長ホル
モン、インターロイキン、神経成長因子、カリクレイン
、プラスミノゲンアクチペーター或は工業用酵素を菌体
外に分泌生産させることが可能となったことを示すもの
で工業的微生物生産の観点から大きな意義を有するもの
である。This means that the expression/secretion vector can be used to secrete and produce various proteins such as interferon, growth hormone, interleukin, nerve growth factor, kallikrein, plasminogen activator, or industrial enzymes using Bacillus subtilis as a host. This is of great significance from the perspective of industrial microbial production.

以下具体例によって本発明を説明するが本発明はこれに
より何ら制限を受けるものではない。The present invention will be explained below with reference to specific examples, but the present invention is not limited thereto in any way.

実施例１．　発現・分泌ベクターの構築バチルス　アミ
口すキ７アシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子を含むプ
ラスミドｐＮＰ１５０をバチルス　　ズブチリスＭＴ−
０１５０（ＦＦＭ　ＢＰ−４２５）から常法に従い調製
した。該プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＳｐｈ工
で切断すると約５．４ｋｂの大フラグメントと約１ｋｂ
の小フラグメントが得られる。Example 1. Construction of expression/secretion vector Plasmid pNP150 containing the neutral protease gene of Bacillus subtilis MT-
0150 (FFM BP-425) according to a conventional method. When this plasmid is cut with restriction endonuclease Sph, a large fragment of about 5.4 kb and a large fragment of about 1 kb are obtained.
A small fragment of is obtained.

この大フラグメントを低融点アガロースゲル電気泳動法
によシ分離回収した。回収したＤＮＡは常法に従いカラ
ムクロマトグラフィーおよびフェノール抽出、エーテル
抽出、エタノール沈澱により精製した。This large fragment was separated and recovered by low melting point agarose gel electrophoresis. The recovered DNA was purified by column chromatography, phenol extraction, ether extraction, and ethanol precipitation according to conventional methods.

該精製Ｄ　Ｎ　Ａ　０．１μｆをＴ４リガーゼ５単位を
用いて結合し環状プラスミドとした。結合反応系の組成
は６６ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　、６．
６ｍＭ−ＭｇＣｌ　２．１０　ｍＭジチオスライトール
、　２ｍ１ｉＡＴＰである。反応は１５℃で３時間行な
った。0.1 μf of the purified DNA was ligated using 5 units of T4 ligase to form a circular plasmid. The composition of the binding reaction system is 66mM) Lis-HCl buffer (pH 7.5), 6.
6mM MgCl 2.10mM dithiothreitol, 2m1iATP. The reaction was carried out at 15°C for 3 hours.

この反応混液を用いてバチルス　ズプチリス１Ａ５１０
　（オハイオ大学バチルス　ストックセンター保存株）
をプロトプラスト法によシ形質転換しレアーゼを用いて
物理地図を作成した。Using this reaction mixture, Bacillus subtilis 1A510
(Ohio University Bacillus Stock Center stock)
was transformed by the protoplast method and a physical map was created using lyase.

その結果、得られたこのプラスミドｐｘｓ１ｓｏ　ハバ
チルスアミロリキ７アシェンスの中性プロテアーゼ遺伝
子の発現に関与するＤＮＡ塩基配列およびプレープロ構
造をコードするＤＮＡ塩基配列（特許請求の範囲第３項
に記載するＤＮＡ塩基配列）を有し、プロ構造の切断点
近傍のＤＮＡ塩基配列に存在する５ｐｈｘ切断部位から
下流の成熟菌体外中性プロテアーゼをコードするＤＮＡ
塩基配列が削除された形のプラスミドであることが確認
された。As a result, this plasmid pxs1so obtained contains a DNA base sequence involved in the expression of the neutral protease gene of Habacillus amyloriki 7 ashen and a DNA base sequence encoding the pre-pro structure (the DNA described in claim 3). DNA encoding a mature extracellular neutral protease downstream from the 5phx cleavage site, which is present in the DNA base sequence near the pro-structure cleavage point (base sequence)
It was confirmed that the plasmid had the base sequence deleted.

第２図に示す様に、本プラスミドは唯一のＳｐｈ工切断
部位を有し、該部位に直接或はリンカ−等を用いて間接
に所望の蛋白をコードする領域を含むＤＮＡ塩基配列を
コドンの読みとシのずれがおきない様に結合すれば所望
の蛋白を分泌生産する際に用いられる組換え体ＤＮＡが
容易に構築できる発現・分泌ベクターである。As shown in Figure 2, this plasmid has a unique Sph engineering cleavage site, and a DNA base sequence containing a region encoding a desired protein can be inserted into this site either directly or indirectly using a linker or the like. It is an expression/secretion vector that allows easy construction of recombinant DNA used for secretory production of a desired protein by ligating it so that no discrepancies occur.

て結合して第２図に示す発現・分泌ベクターｐｓＢ１５
０およびｐＢｓｌ　５０を構築した。The expression/secretion vector psB15 shown in FIG.
0 and pBsl 50 were constructed.

本発現・分泌ベクターは中性プロテアーゼのプロ構造切
断点をコードするＤＮＡ塩基配列の下流に第１図に示す
ＤＮＡ塩基配列が結合しておシ、該配列中には制限エン
ドヌクレアーゼＳｍａ　ＩおよびＢａｍＨＩの切断部位
が存在する。This expression/secretion vector has the DNA base sequence shown in Figure 1 linked downstream of the DNA base sequence encoding the pro-structure cleavage point of neutral protease, and contains the restriction endonucleases Sma I and BamHI. There are cleavage sites.

従って該切断部位のいずれかに所望の蛋白をコードする
領域を含むＤＮＡ塩基配列をコドンの読みとシのずれが
おきないように直接或はリンカ−等を用いて間接に結合
すれば所望の蛋白を分泌生産する際に用いられる組換え
体ＤＮＡが容易に構築できるものである。Therefore, if a DNA base sequence containing a region encoding a desired protein is linked to either of the cleavage sites directly or indirectly using a linker, etc., to avoid misalignment of the codon reading, the desired protein can be obtained. The recombinant DNA used for secretory production can be easily constructed.

以下にｐＥｓ１５０からのｐｓＢｌ　５０およびｐＢ８
１５０の造成に就いて述べる。psBl 50 and pB8 from pEs150 below
I would like to talk about the creation of 150.

１μｔのｐＥｓ１５０をｓｐｈ　Ｉを用いて常法に従い
切断開環した。得られた線状ｐＥ８１５０をフェノール
抽出、エーテル抽出およびエタノール沈澱に依って精製
した。このものを乾燥後３２μｔの蒸留水に溶解し１０
倍濃度のＴ４ポリメラーゼ緩衝液４μｔ１２ｍＭαＮＴ
Ｐ　２１１ｔおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製
）３単位を加えて５７℃でインキエベートした。1 μt of pEs150 was ring-opened using sph I according to a conventional method. The resulting linear pE8150 was purified by phenol extraction, ether extraction and ethanol precipitation. After drying, dissolve this in 32 μt of distilled water and
4μt 12mMαNT of double concentration T4 polymerase buffer
P211t and 3 units of T4 DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) were added and incubated at 57°C.

５０分後に１５０μｔのＤＮＡ緩衝液（１０ｍＭ）リス
−塩酸緩衝液ｐＨ８，０，１０ｍＭ　ＫＣＩ　、　０．
１ｍＭ　ＫＤＴＡ）を加えてフェノール抽出、エーテル
抽出、エタノール沈澱を行いＤＮＡを精製した。得られ
たＤＮＡは乾燥後５０μｔのトリス−塩酸緩衝液（５０
ｍ％、ｐＨ７，５）に溶解しうち１０μｔを以下の操作
に供した。After 50 minutes, 150 μt of DNA buffer (10 mM) Lis-HCl buffer pH 8, 0, 10 mM KCI, 0.
DNA was purified by adding 1mM KDTA) and performing phenol extraction, ether extraction, and ethanol precipitation. The obtained DNA was dried and then added to 50 μt of Tris-HCl buffer (50 μt).
%, pH 7.5) and 10 μt of the solution was subjected to the following operation.

即ち、このＤＮＡ１０μｔに別途合成法に依シ調製した
第１図に示すＤＮＡ塩基配列０．２μｔを加えＴ４リガ
ーゼによシ結合反応を行った。That is, 0.2 μt of the DNA base sequence shown in FIG. 1, which had been separately prepared by a synthetic method, was added to 10 μt of this DNA, and a ligation reaction was performed using T4 ligase.

反応系はＴ４　リガーゼ（宝酒造製）２０単位、６６ｍ
Ｍ）リス塩酸−緩衝液（ｐＨ７，５）、６．６ｍＭＭｇ
Ｃ１２，１０ｍＭジチオスライトール、２ｍＭ　ＡＴＰ
で、反応は４℃で２０時間行なった。The reaction system is 20 units of T4 ligase (manufactured by Takara Shuzo), 66 m
M) Lis-HCl-buffer (pH 7,5), 6.6mMMg
C12, 10mM dithiothreitol, 2mM ATP
The reaction was carried out at 4°C for 20 hours.

尚、反応液は全量で５０μｔとなるようにした。The total volume of the reaction solution was 50 μt.

かくして得られた反応液２０μｔを用い、バチルス　ズ
ブチリス　ｌＡ３１０をプロトプラスト法によシ形質転
換した。得られたカナマイシン耐性株からプラスミドを
調製し、常法に従い物理地図を作成した結果得られたプ
ラスミドはｓｐｈ工切断部位を有さす、Ｓｍａ工、Ｂａ
ｍＨＩの切断部位が各１か所存布するものであった。Bacillus subtilis lA310 was transformed by the protoplast method using 20 μt of the reaction solution thus obtained. A plasmid was prepared from the obtained kanamycin-resistant strain, and a physical map was created according to a conventional method.
There was one mHI cleavage site in each case.

このものは第１図に示すＤＮＡ塩基配列の挿入方向によ
９２種類あシそれぞれｐｓＢｌ　５０およびｐＢｓ１５
０と命名した。There are 92 types of this product, psBl 50 and pBs15, depending on the insertion direction of the DNA base sequence shown in Figure 1.
It was named 0.

実施例２　発現・分泌ベクターｐＫｓ１５０によるα−
アミラーゼの分泌生産 旬　発現および分泌に関与するＤＮＡ塩基配列を削除し
たα−アミラーゼ遺伝子の調製バチルスズブチリス由来
のαアミラーゼ遺伝子を含むプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　　
ｐＴＵＢ４　（Ｔａｋｅｉｃｈｊ　ｅｔａＪ　Ａｇｒｉ
ｃ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、４７１５９−１６１（１９Ｂ
！１））１０μ２を制限エンドヌクレアーゼＡｔｕＩ　
（宝酒造製）１０単位と制限エンドヌクレアーゼＫＣＯ
Ｒ工（宝酒造製）１０単位とを用いて３７℃で１時間反
応させた。Example 2 α- expression/secretion vector pKs150
Secretory production of amylase Preparation of α-amylase gene from which the DNA base sequence involved in expression and secretion has been deleted Plasmid DNA containing the α-amylase gene derived from Bacillus subtilis
pTUB4 (Takeichj etaJ Agri
c, Biol, chem, 47159-161 (19B
! 1)) 10μ2 restriction endonuclease AtuI
(Takara Shuzo) 10 units and restriction endonuclease KCO
The mixture was reacted with 10 units of R-Ko (manufactured by Takara Shuzo) at 37°C for 1 hour.

反応系の組成は１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
５）、１０ｍＭ　ＭｆＣｌＱ、１５０ｍＭ　Ｎａ１ｌで
ある。The composition of the reaction system was 10mM Tris-HCl buffer (pH 7,
5), 10mM MfClQ, 150mM Na1l.

反応の結果得られた遺伝子の発現およびその結果産生さ
れた蛋白の分泌に関与する領域を欠くσ−アミラーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片の前半部分（約４００塩基対）を
１．０チ低融点アガロース（ＢＲＬ、　Ｉｎｃ製）ゲル
電気泳動により分離し、該ＤＮＡをゲルより抽出した。The first half (approximately 400 base pairs) of the DNA fragment containing the σ-amylase gene, which lacks the region involved in the expression of the gene obtained as a result of the reaction and the secretion of the protein produced as a result, was added to 1.0 T low melting point agarose ( BRL, Inc.) was separated by gel electrophoresis, and the DNA was extracted from the gel.

該ＤＮＡはフェノール抽出およびクロロホルム抽出によ
シ精製した後エタノール沈殿を行って回収した。The DNA was purified by phenol extraction and chloroform extraction, and then recovered by ethanol precipitation.

該回収ＤＮＡを５０ｍ琶トＩＪスー塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）　１０μｔに溶解し、遺伝子の発現およびその結
果産生された蛋白の分泌に関与する領域を欠ぐα−アミ
ラーゼ遺伝子の前半部分のＤＮＡ断片（以後、断片Ａと
する）とした。The recovered DNA was diluted with 50mIJ-HCl buffer (pH 7).
, 5) was dissolved in 10 μt to obtain a DNA fragment of the first half of the α-amylase gene (hereinafter referred to as fragment A) lacking the region involved in gene expression and secretion of the protein produced as a result.

プラスミドｐＵｃ１５ＤＮＡ　（Ｐ　Ｌ−ファルマシア
・バイオケミカル製）を制限エンドヌクレアーゼＢｍａ
Ｘ　（宝酒造製）と制限エンドヌクレアーゼｚｃｏｕ工
（宝酒造製）で完全に切断し、大腸菌アルカリ性７オス
７アターゼ（宝酒造製）を用いて末端リン酸ニス≠ルを
加水分解したのち、Ｔ４リガーゼ（宝酒造製）を用いて
断片Ａと結合させた。Plasmid pUc15 DNA (PL-Pharmacia Biochemical) was digested with restriction endonuclease Bma.
X (manufactured by Takara Shuzo) and restriction endonuclease ZCOU (manufactured by Takara Shuzo) to complete cleavage, and the terminal phosphate varnish was hydrolyzed using E. coli alkaline 7 male 7 atase (manufactured by Takara Shuzo), followed by T4 ligase (Takara Shuzo). (manufactured by J.D.) and conjugated with fragment A.

ｐＵ０１３の切断は、ｐＵｃ！１　？）ＤＮＡ　５ｐｙ
　、Ｓｍａ工１０単位、ＫｃｏＲＩ　１０単位で３７℃
１時間反応を行うことにより実施した。反応系の組成は
、１’ＯｍＭ　）　ＩＪス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
１０ｍＭ　ＭｙＣＬｚ、１５０ｍＭＭａｓｔである。Cleavage of pU013 is pUc! 1? ) DNA 5py
, 10 units of Sma, 10 units of KcoRI at 37℃
This was carried out by conducting the reaction for 1 hour. The composition of the reaction system was 1'OmM) IJS hydrochloric acid buffer (pH 7.5),
10mM MyCLz, 150mMMast.

得られるｓｍａ工と１ｃｏＲ工で切断されたｐＨ（！１
３ＤＮＡヲ、フェノール抽出、エーテル抽出、エタノー
ル沈殿の操作によシ順次精製した。The pH (!1
3DNA, phenol extraction, ether extraction, and ethanol precipitation were sequentially purified.

得られたｐＵｏｌ　３ＤＮＡは、２０１１ｔの５０ｍＭ
−）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で溶解し、ベクター
ＤＮＡとした。The resulting pUol 3DNA was 50mM of 2011t.
-) Dissolved in Lis-HCl buffer (pH 7.5) to obtain vector DNA.

ベクターＤＮＡと断片Ａとの結合は、大腸菌Ｔ４リガー
ゼを用いて行った。反応系の組成は断片Ａ１０μｔ（前
記緩衝液）、ベクターＤＮＡ１０μｔ（前記緩衝液）、
大腸菌Ｔ、ＤＮＡＩＪガーゼ５単位６６ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）、６６ｍＭＭｒｇＣ１２１０ｍ
Ｍジチオスレイトール、２ｍＭ　ＡＴＰ（アデノシン三
リン酸）である。反応は、１５℃で２時間行った。The vector DNA and fragment A were ligated using E. coli T4 ligase. The composition of the reaction system was 10 μt of fragment A (the above buffer), 10 μt of vector DNA (the above buffer),
E. coli T, DNAIJ gauze 5 units 66mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 66mM MrgC1210m
M dithiothreitol, 2mM ATP (adenosine triphosphate). The reaction was carried out at 15°C for 2 hours.

反応の結果得られた組み換え体ＤＮＡを用い、大腸菌に
−１２（ＪＭｌｏｌ　）株（ＢＲＩ、Ｉｎｃ製）を宿主
として常法（Ｍａｎｄｅｌ　０Ｍ、ａｎｄ　Ａ、Ｈｉｇ
ａ　、　Ｊ　、Ｍｏｌ　。Using the recombinant DNA obtained as a result of the reaction, E. coli was incubated with -12 (JMlol) strain (manufactured by BRI, Inc.) in a conventional manner (Mandel 0M, and A, Hig.
a, J, Mol.

Ｂｉｏｌ　５３１５４（１９７０）　）に従い形質転換
を行った。Biol 53154 (1970)).

形質転換後、アンピシリンを最終濃度５０μｔ／ｌｄと
なるように加えたＴＢＡＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を用
いアンピシリン耐性株を選択した。After transformation, ampicillin-resistant strains were selected using TBAB medium (manufactured by Difco) to which ampicillin was added at a final concentration of 50 μt/ld.

得られたアンピシリン耐性株をベンアッセイ培地（Ｄｉ
ｆｃｏ社製）５０ｍｌを用いて３７℃１４時間培養後集
菌し、菌体からアルカリ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ。The obtained ampicillin-resistant strain was cultured in Venn assay medium (Di
After culturing at 37°C for 14 hours using 50 ml of FCO), the cells were collected using the alkaline method (Birnboim).

Ｈ，Ｃ，ｅｔ　ａｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓヱ１５１３　（１９７９）　）に従いプラスミドを
調製した。H, C, et al Nucleic Ac1ds R
A plasmid was prepared according to E.S.E. 1513 (1979)).

プラスミドｐＵ０１３と断片Ａの連結部位の塩基配列は
、第３図に示すものである。得られたプラスミドは、制
限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ　（！：　ＫｃｏＲＩ
で消化したところ、約４００塩基対と約２７００塩基゛
対のＤＮＡ断片が見出された。このことは、このプラス
ミドが、ｐ［ＴＯ１５のｓｍａｍ切工部位とＥＣＯＲ工
切断部位の間に約４００塩基対から成る断片Ａが挿入さ
れた組み換え体プラスミドであることを証明するものそ
ある。以後、この組み換え体プラスミ得た。The nucleotide sequence of the joining site between plasmid pU013 and fragment A is shown in FIG. The resulting plasmid was injected with the restriction endonuclease BamHI (!: KcoRI
Upon digestion, DNA fragments of approximately 400 base pairs and approximately 2,700 base pairs were found. This proves that this plasmid is a recombinant plasmid in which fragment A consisting of about 400 base pairs has been inserted between the smam cleavage site and the ECOR cleavage site of p[TO15. Thereafter, this recombinant plasmid was obtained.

この断片Ｂには遺伝子の発現およびその結果産生された
蛋白の分泌に関与する領域を欠くα−アミラーゼ遺伝子
の前半部分のＤＮＡ塩基配列全体を含むものである。This fragment B contains the entire DNA base sequence of the first half of the α-amylase gene, lacking the region involved in gene expression and secretion of the resulting protein.

次に、バチルス　ズブチリス由来のα−アミラで切断し
、約１３００塩基対から成るα−アミラーゼ遺伝子の後
半部分を有するＤＮＡ断片（以後、断片Ｃとする）を調
製した。Next, the DNA fragment was cleaved with α-amylase derived from Bacillus subtilis to prepare a DNA fragment (hereinafter referred to as fragment C) having the latter half of the α-amylase gene consisting of about 1300 base pairs.

さらに、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉ
ｎｃｌｌ　（宝酒造製）で分解して後大腸菌アルカリ性
フォスファターゼで処理したプラスミドｐＵ０１２ＤＮ
Ａ（ファルマシア社製）と断片Ｂと断片Ｃとを連結させ
た。Additionally, the restriction endonucleases BamHI and Hi
Plasmid pU012DN digested with ncll (manufactured by Takara Shuzo) and then treated with E. coli alkaline phosphatase
A (manufactured by Pharmacia), fragment B, and fragment C were ligated.

反応は、プラスミドｐＵｃ！１２　ＤＮＡ　５μ２を用
い、Ｈｉｎａｌｌ　１０単位ＢａｍＨ工１０単位で５７
℃１時間行った。次に、フェノール抽出、エタノール沈
殿を行った後、大腸菌アルカリ性フォスファターゼ（５
単位）、および最終濃度０．１　ｙＬとなるようトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を加えて６５℃２時間反応
させた。The reaction was performed using plasmid pUc! 12 Using DNA 5 μ2, Hinall 10 units BamH engineering 10 units is 57
℃ for 1 hour. Next, after phenol extraction and ethanol precipitation, E. coli alkaline phosphatase (5
Unit) and Tris-HCl buffer (pH 8,0) were added to give a final concentration of 0.1 yL, and the mixture was reacted at 65°C for 2 hours.

反応終了後、反応液はフェノール抽出、エーテル抽出、
エタノール沈殿を行いＤＮＡを回収した。After the reaction is complete, the reaction solution is subjected to phenol extraction, ether extraction,
DNA was recovered by ethanol precipitation.

そののち、２０μｔの５０ｍＭ　）　’）スー塩酸緩衝
液に再溶解した。Thereafter, it was redissolved in 20μt of 50mM)') HCl buffer.

かくして得られたｐＵＣ１２ＤＮＡ１μ２とトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解した断片Ｂ２μ２および
断片Ｃ２μｍを大腸菌Ｔ４　’）ガーゼ（宝酒造製）を
用いて前述と同様の方法を用いて結合した。1μ2 of the thus obtained pUC12 DNA, 2μ2 of fragment B and 2μm of fragment C dissolved in Tris-HCl buffer (pH 7.5) were combined using Escherichia coli T4' gauze (manufactured by Takara Shuzo) in the same manner as described above.

得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、大腸菌に−１２（
ＪＭｌ　０ｊ　）株を形質転換しアンピシリン耐性を示
す形質転換株を得た。得られたアンピシリン耐性株から
、アルカリ法に依り、プラスミドＤＮＡを調製した。Using the obtained recombinant DNA, -12(
JMl 0j ) strain was transformed to obtain a transformed strain exhibiting ampicillin resistance. Plasmid DNA was prepared from the obtained ampicillin-resistant strain by the alkaline method.

得られたプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＫ
ｃｏＲ工のみでまた制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ工
と制限エンドヌクレアーゼＢｉｎｄｌとで処理したとこ
ろ、ＥＣＯＲ工処理では１ケ所切断される約４５００塩
基対のＤＮＡ断片が、またＢａｍＨ工とＨｉｎｄＩ（宝
酒造製）とで処理した場合には、約１８００塩基対と約
２７００塩基対のＤＮＡ断片がそれぞれ確認された。The resulting plasmid DNA was treated with restriction endonuclease K.
When treated with coR alone and with restriction endonuclease BamH and restriction endonuclease Bindl, a DNA fragment of approximately 4500 base pairs was cleaved at one site in the ECOR treatment, but was also digested with BamH and HindI (Takara Shuzo). When treated, DNA fragments of about 1800 base pairs and about 2700 base pairs were respectively confirmed.

以上の結果を総合すると、ベクターとして用いたｐＵｃ
１２は約２７００塩基対であることから得られたプラス
ミド（以後、ｐＡＭ２９と略称する。）は、ｐＵＣ１２
のＢａｍＨ工切断部位とＨｉｎｄｌ切断部位との間に、
遺伝子の発現およびその結果産生された蛋白の分泌に関
与する領域を欠くα−アミラーゼ遺伝子が挿入された組
み換え体プラスミドであることが確認された。Combining the above results, pUc used as a vector
12 is approximately 2700 base pairs, the resulting plasmid (hereinafter abbreviated as pAM29) is pUC12.
Between the BamH cleavage site and the Hindl cleavage site,
It was confirmed that this was a recombinant plasmid into which an α-amylase gene was inserted, lacking the region involved in gene expression and secretion of the resulting protein.

このプラスミドｐＡＭ２９のα−アミラーゼ遺伝子を含
む領域とｐＵＣ！１２との連結部位は第４図に示すもの
である。ｐＡＭ２９プラスミドＤＮＡのα−アミラーゼ
遺伝子部分のアミノ末端よシ上流部分に、制限エンドヌ
クレアーゼＢａｍＨＩ、ｓｍａ工、ＳＳｔ工のそれぞれ
の切断部位が存在する。また、カルボキシル末端よシ下
流に、Ｈｉｎｄｌ　ＸＰｖｕ　■の切断部位がそれぞれ
存在するものである。The region containing the α-amylase gene of plasmid pAM29 and pUC! The connecting portion with 12 is shown in FIG. Cleavage sites for restriction endonucleases BamHI, SMA, and SSt are present in the upstream portion of the amino terminus of the α-amylase gene portion of the pAM29 plasmid DNA. Furthermore, the cleavage site of Hindl XPvu (2) is present downstream of the carboxyl terminus.

２）　　ｐＥｓ１５０とα−アミラーゼ遺伝子の結合お
よびα−アミラーゼの分泌生産 １）で得られたｐＡＭ２９１μ２を、制限エンドヌクレ
アーゼＳｓｔ工およびＨｉｎｄ［を用いて常法に従い切
断後、α−アミラーゼ遺伝子を含む１．８　ｋ　ｂの７
ラグメントを低融点アガロースゲル電気泳動によｐ分離
回収し、フェノール抽出、エーテル抽出およびエタノー
ル沈澱により精製した。2) Ligation of pEs150 and α-amylase gene and secretory production of α-amylase After cutting pAM291μ2 obtained in 1) using restriction endonucleases Sst and Hind according to a conventional method, 1 containing the α-amylase gene was cut. .8 k b 7
The fragment was separated and recovered by low melting point agarose gel electrophoresis and purified by phenol extraction, ether extraction and ethanol precipitation.

該精製ＤＮＡを乾燥後６２μｔの蒸留水に溶解し、実施
例１と同じ条件でＴ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて突出
末端部分を除去して平滑末端にした。After drying, the purified DNA was dissolved in 62 μt of distilled water, and the protruding ends were removed using T, DNA polymerase under the same conditions as in Example 1 to make blunt ends.

Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼによる反応後の精製も実施例１
と同じ方法を用いた。T, Purification after reaction with DNA polymerase is also carried out in Example 1.
The same method was used.

この精製ＤＮＡは乾燥後２０μｔの５０ｍｐトリスー塩
酸緩衝液（ｐＥ７．５　）に溶解した後うち１０μｔを
用いて、制限エンドヌクレアーゼ８ｐｈ工で切断開環後
Ｔ４ポリメラーゼで実施例１と同様に平滑末端にしたｐ
Ｅｓ１５０　（ｏ、ｓμｙ）とＴ４　リガーゼにより結
合した。結合の条件は実施例１で用いたものと同じであ
る。After drying, this purified DNA was dissolved in 20 µt of 50 mp Tris-HCl buffer (pE7.5), and 10 µt of the DNA was cut with restriction endonuclease 8ph to open the ring, and then made into blunt ends with T4 polymerase in the same manner as in Example 1. did p
It was ligated to Es150 (o, sμy) using T4 ligase. The bonding conditions are the same as those used in Example 1.

得られた反応混液を用いてα−アミラーゼ欠損株である
バチルス　ズブチリス　ｌＡ２８９株（オハイオ大学バ
チルスストックセンター保存株）をプロトプラスト法に
より形質転換後、ＤＭ−５再生培地に１％可溶性澱粉お
よびカナマイシン１５０μＶ／ａｔを加えたものにブレ
ーティングした。３７℃で２４時間培養後グレートにヨ
ードカリ溶液を噴霧しハローを形成する形質転換株５ｏ
株を得た。このうちのひとつであるＭＴ　−３３株から
プラスミドを調製して種々の制限エンドヌクレアーゼヲ
用いて物理地図を作成したところ、ｐＥｓ１５０の中性
プロテアーゼブロ構造の下流に約１．８　ｋ　ｂのα−
アεう・−ゼ遺伝子をコードする領域を含むＤＮＡ塩基
配列が結合したもの（ｐＰＡ３３と命名）であることが
判明した。The resulting reaction mixture was used to transform the α-amylase-deficient strain Bacillus subtilis lA289 (strain stocked at the Bacillus Stock Center of Ohio University) by the protoplast method, and then 1% soluble starch and kanamycin were added to the DM-5 regeneration medium at 150 μV/1. The mixture containing at was brated. After culturing at 37°C for 24 hours, spray iodopotassium solution on the grate to form a halo of transformed strain 5o.
I got the stock. When we prepared a plasmid from one of these, the MT-33 strain, and created a physical map using various restriction endonucleases, we found that approximately 1.8 kb of α-
It was found that the DNA base sequence containing the region encoding the aepsilon gene was linked (named pPA33).

ｐＰＡ５３は、α−アミラーゼ遺伝子の上流に中性プロ
テアーゼのプロ構造切断点からつながった形で第１図に
示すＤＮＡ塩基配列を有するものである。このＤＮＡ塩
基配列中には制限エンドヌクレアーゼＥｔｍａ工、およ
びＢａｍＨ工の切断部位が存在する。pPA53 has the DNA base sequence shown in FIG. 1, which is connected to the pro-structure cleavage point of neutral protease upstream of the α-amylase gene. This DNA base sequence contains cleavage sites for the restriction endonucleases Etma and BamH.

この組換え体ＤＮＡ　ｐＰＡ３３を有するバチルス　ズ
ブチリス　ＭＴ−５３を、ＢＹ培地（Ｈ，Ｕｅｈａｒａ
らＪ。Bacillus subtilis MT-53 containing this recombinant DNA pPA33 was grown in BY medium (H, Uehara
et al. J.

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　　、　１９７４　、１１９　、８
２　）を用いて３７℃で１８時間培養した培養上清を用
いてα−アばラーゼの活性をヨード−澱粉法（Ｈ，Ｆｕ
ｗａ　Ｊ、Ｂｉｏｃ−ｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）　１９５４
　、４１　、５８３　）を用いて測定した結果、培地上
清１　ｍｌ当り２５００単位の該酵素を分泌しているこ
とが認められた。対照として用いたＩ　Ａ２８９株の活
性に検出限界以下であった。Bacteriol, 1974, 119, 8
2) was cultured at 37°C for 18 hours, and the activity of α-abalase was measured using the iodo-starch method (H, Fu
wa J, Bioc-hem (Tokyo) 1954
, 41 , 583 ), it was found that 2500 units of the enzyme were secreted per ml of medium supernatant. The activity of the IA289 strain used as a control was below the detection limit.

実施例３　ヒト　インターフェロン−βの分泌生産 ヒトインターフェロン−β（ｈＩＦＮ−β）ハ該遺伝子
を含むプラスミドル工Ｆ２０を用いて調製した。Example 3 Secretory production of human interferon-β Human interferon-β (hIFN-β) was prepared using plasmid engineering F20 containing the gene.

該プラスミドはｈＩＦＮ−βの分泌に関与するシグナル
部分を削除した成熟インターフェロンをコードするＤＮ
Ａ塩基配列の両末端に制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３
ＡＩ切断部位が存在する様に合成りＮＡを用いて造成し
たものであシ、該プラスミドを５ａｕ３ＡＩで分解する
と０．５ｋｂのｈ工Ｆ’Ｎの成熟蛋白をコードするＤＮ
Ａ塩基配列（以下り工ＦＮ構造遺伝子とする）が得られ
るものである。The plasmid is a DNA encoding mature interferon from which the signal portion involved in the secretion of hIFN-β has been deleted.
Restriction endonuclease 5au3 at both ends of the A base sequence
The plasmid was constructed using synthetic NA so that an AI cleavage site was present, and when this plasmid was digested with 5au3AI, a 0.5 kb DNA encoding the mature protein of hEngF'N was obtained.
The A base sequence (hereinafter referred to as the engineered FN structural gene) is obtained.

該り工ＦＮ構造遺伝子１μｔを、実施例２で構築したｐ
ＰＡ３３（’μｓ’　）のＢａｍＨ工切断部位にＴ４リ
ガーゼを用いて挿入結合した。結合の条件は実施例１と
同じである。1μt of the FN structural gene was constructed in Example 2.
It was inserted into the BamH cleavage site of PA33 ('μs') using T4 ligase. The bonding conditions are the same as in Example 1.

この反応混液を用いてバチルス　ズブチリスｌＡ３１０
株をプロトプラスト法を用いて形質転換し、１％澱粉を
含有するＤＭ−５−カナマイシン（１５０μ２／−）培
地上で大型ハローを形成しないコロニーのうち２０株を
選択した。Using this reaction mixture, Bacillus subtilis IA310
The strains were transformed using the protoplast method, and 20 strains were selected from among the colonies that did not form a large halo on DM-5-kanamycin (150 .mu.2/-) medium containing 1% starch.

該形質転換株をＢＹ培地（カナマイシン５μ２／１１Ｌ
ｌ添加）で３０℃１８時間培養し、その培養上清を用い
てＥＩＡ法によりｈＩＦＮ−β活性を測定した。The transformed strain was grown in BY medium (kanamycin 5μ2/11L).
The cells were cultured at 30° C. for 18 hours, and the hIFN-β activity was measured by EIA using the culture supernatant.

その結果≠２５形質転換株は５Ｘ１０’μ／ＷＬｌのＩ
ＦＮを培養上清中に分泌していることが認められた。As a result, ≠25 transformants had an I of 5X10'μ/WLl.
It was observed that FN was secreted into the culture supernatant.

該株からプラスミドを調製して調べた結果第６図に示す
もの（ｐＰ工Ｆ２５　　と命名）であることが確認され
た。As a result of preparing and examining a plasmid from the strain, it was confirmed that the plasmid was the one shown in FIG. 6 (named pP engineering F25).

≠２５形質転換株を２．５培濃度のＢＹ培地（カナマイ
シフ５μり／ｄ金含有に１０ｍＭ　ＰＭＳＦを加えたも
ので３０℃１８時間培養した場合、上清中の工ＦＮ活性
は５　Ｘ　１０’μ／ｌｄに達した。≠25 When a transformed strain was cultured for 18 hours at 30°C in BY medium (Kanamy Schiff 5μl/d gold-containing and 10mM PMSF) at a concentration of 2.5, the FN activity in the supernatant was 5 x 10'. μ/ld was reached.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

各図面の簡単な説明すれば次の通シである。 第１図 制限エンドヌクレアーゼｓｍａ工、ＢａｍＨ工の切断部
位を有するＤＮＡ塩基配列を示す図である。 −二制限工／ドヌクレアーゼの認識部位。 ム：制限エンドヌクレアーゼの切断部位。 第２図 ｐＮＰ１５０からｐＥｓｌ　５０　、　ｐｓＢｌ　５０
およびｐＢｓ１５０の構築過程を示す図である。 Ｐ：プロモーター、Ｐ−Ｐ：プレープロ構造。 Ｍａｔ：成熟蛋白。 第３図 ｐＵＯｌ　５と断片Ａの連結部位のＤＮＡ塩基配列を第
４図 榊 ｐＡ％２９のα−アミラーゼ遺伝子を含む領域とｐＬＴ
ｃ１２との連結部位のＤＮＡ塩基配列を示す図である。 ロコ内はα−アミラーゼ遺伝子を含む領域のＤＮＡ塩基
配列。 第５図 ｐＰＡ３３の構築過程と物理地図を示す図である。 第６図 ｐｐ工Ｆ２５の物理地図を示した図である。 尚本発明のＤＮＡ塩基配列の図中Ａ、Ｃ，Ｇ、Ｔはそれ
ぞれアデニン、シトシン、グアニン、チばンを示す。A brief explanation of each drawing is as follows. FIG. 1 is a diagram showing a DNA base sequence having cleavage sites for restriction endonucleases SMA and BamH. - Two restriction enzymes/donuclease recognition sites. Mu: Restriction endonuclease cleavage site. Figure 2 pNP150 to pEsl 50, psBl 50
FIG. 3 is a diagram showing the construction process of pBs150. P: promoter, P-P: playpro structure. Mat: mature protein. Figure 3 shows the DNA base sequence of the joining site between pUOl 5 and fragment A. Figure 4 shows the region containing the α-amylase gene of Sakaki pA%29 and pLT.
It is a figure showing the DNA base sequence of the connection site with c12. Inside the loco is the DNA base sequence of the region containing the α-amylase gene. FIG. 5 is a diagram showing the construction process and physical map of pPA33. Fig. 6 is a diagram showing a physical map of pp construction F25. In the diagram of the DNA base sequence of the present invention, A, C, G, and T represent adenine, cytosine, guanine, and thiban, respectively.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １）組換え体ＤＮＡが、バチルス属細菌の菌体外中性プ
ロテアーゼ遺伝子の発現に関与するＤＮＡ塩基配列およ
びプレープロ構造をコードするＤＮＡ塩基配列を有する
ことを特徴とする発現・分泌ベクター。 ２）バチルス属細菌がバチルスアミロリキファシエンス
であることを特徴とする第１項記載の発現・分泌ベクタ
ー。 ３）菌体外中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与するＤ
ＮＡ塩基配列およびプレープロ構造をコードするＤＮＡ
塩基配列が次に示す塩基配列の全部または一部を含むも
のであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
発現・分泌ベクター。 【遺伝子配列があります】 ４）中性プロテアーゼのプロ構造切断点近傍をコードす
るＤＮＡ塩基配列に存在する制限エンドヌクレアーゼＳ
ｐｈＩ切断部位を切断しその結果生ずる突出末端をエキ
ソヌクレアーゼ活性を有する酵素により平滑末端にし、
しかる後に所望の蛋白をコードする領域を含むＤＮＡ塩
基配列を結合する際に使用可能な制限エンドヌクレアー
ゼ切断部位を有するＤＮＡ塩基配列を該平滑末端に結合
して構築することを特徴とする特許請求の範囲第１項に
記載の発現・分泌ベクター。 ５）所望の蛋白をコードする領域を含むＤＮＡ塩基配列
を結合する際に使用可能な制限エンドヌクレアーゼ切断
部位を有するＤＮＡ塩基配列が次に示されるものを含む
ことを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の発現・
分泌ベクター。 ５′ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＣＣ３′ ３′ＧＣＧＧＧＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧ５′ ６）中性プロテアーゼのプロ構造切断点近傍をコードす
るＤＮＡ塩基配列に存在する制限エンドヌクレアーゼｓ
ｐｈＩ切断部位を切断しその結果生ずる突出末端をエキ
ソヌクレアーゼ活性を有する酵素により平滑末端にし、
しかる後に特許請求の範囲第５項に記載するＤＮＡ塩基
配列を介して分泌シグナル領域をコードするＤＮＡ塩基
配列が除去されたバチルス　ズプチリスのα−アミラー
ゼ遺伝子が結合していることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の発現・分泌ベクター。 ７）発現・分泌ベクターの複製に関与する部分がバチル
ス属細菌で複製可能なプラスミドまたはファージに由来
するものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項
に記載する発現・分泌ベクター。 ８）所望の蛋白をコードする領域を含むＤＮＡ塩基配列
を発現・分泌ベクターと結合する際に菌体外中性プロテ
アーゼ遺伝子のプロ構造切断点近傍をコードするＤＮＡ
塩基配列に存在する制限エンドヌクレアーゼ切断部位を
用いて結合することを特徴とする特許請求の範囲第１項
に記載する組換え体ＤＮＡ。 ９）制限エンドヌクレアーゼ切断部位がＳｐｈＩのもの
であることを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載の
組換え体ＤＮＡ。 １０）所望の蛋白がバチルスズプチリスのα−アミラー
ゼであることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の
組換え体ＤＮＡ。 １１）所望の蛋白がヒト−β−インターフェロンである
ことを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の組換え体
ＤＮＡ。 １２）組換え体ＤＮＡを用いてバチルス属細菌を形質転
換し、得られた形質転換株を培養し、その培養上清から
所望の蛋白を回収することを特徴とする蛋白の製造方法
。 １３）特許請求の範囲第１０項記載の組換え体ＤＮＡを
用いることを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の
α−アミラーゼの製造方法。 １４）特許請求の範囲第１１項記載の組換え体ＤＮＡを
用いることを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の
ヒト−β−インターフェロンの製造方法。[Scope of Claims] 1) The recombinant DNA is characterized in that it has a DNA base sequence involved in the expression of an extracellular neutral protease gene of a bacterium belonging to the genus Bacillus and a DNA base sequence encoding a pre-pro structure. Expression/secretion vector. 2) The expression/secretion vector according to item 1, wherein the Bacillus bacterium is Bacillus amyloliquefaciens. 3) D involved in the expression of extracellular neutral protease gene
DNA encoding the NA base sequence and prepro structure
The expression/secretion vector according to claim 1, wherein the base sequence includes all or part of the base sequence shown below. [There is a gene sequence] 4) Restriction endonuclease S present in the DNA base sequence encoding the vicinity of the pro-structure cleavage point of neutral protease
cleaving the phI cleavage site and making the resulting overhanging ends blunt with an enzyme having exonuclease activity;
Thereafter, a DNA base sequence having a restriction endonuclease cleavage site that can be used when joining a DNA base sequence containing a region encoding a desired protein is ligated to the blunt end to construct a DNA base sequence. The expression/secretion vector according to scope 1. 5) A DNA base sequence having a restriction endonuclease cleavage site that can be used to join a DNA base sequence containing a region encoding a desired protein includes the following: Expression described in Section 4
secretion vector. 5'CGCCCGGGGGATCCCC3'3'GCGGGCCCCTAGGGGG5' 6) Restriction endonuclease s present in the DNA base sequence encoding the vicinity of the pro-structure cleavage point of neutral protease
cleaving the phI cleavage site and making the resulting overhanging ends blunt with an enzyme having exonuclease activity;
A patent claim characterized in that the α-amylase gene of Bacillus subtilis from which the DNA base sequence encoding the secretion signal region has been removed is linked via the DNA base sequence set forth in claim 5. The expression/secretion vector according to item 1. 7) The expression/secretion vector according to claim 1, wherein the portion involved in the replication of the expression/secretion vector is derived from a plasmid or phage that can be replicated in Bacillus bacteria. 8) DNA encoding the vicinity of the pro-structure cleavage point of the extracellular neutral protease gene when ligating the DNA base sequence containing the region encoding the desired protein with the expression/secretion vector.
The recombinant DNA according to claim 1, which is bonded using restriction endonuclease cleavage sites present in the base sequence. 9) The recombinant DNA according to claim 8, wherein the restriction endonuclease cleavage site is SphI. 10) The recombinant DNA according to claim 5, wherein the desired protein is α-amylase of Bacillus subtilis. 11) The recombinant DNA according to claim 6, wherein the desired protein is human β-interferon. 12) A method for producing a protein, which comprises transforming a bacterium belonging to the genus Bacillus using recombinant DNA, culturing the resulting transformed strain, and recovering a desired protein from the culture supernatant. 13) A method for producing α-amylase according to claim 12, which uses the recombinant DNA according to claim 10. 14) A method for producing human β-interferon according to claim 12, which comprises using the recombinant DNA according to claim 11.
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