JPS60501758A - タンパク質、医薬構成物、遺伝子、ベクタ−宿主生物及びそれらの生産方法 - Google Patents
タンパク質、医薬構成物、遺伝子、ベクタ−宿主生物及びそれらの生産方法Info
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- JPS60501758A JPS60501758A JP84502501A JP50250184A JPS60501758A JP S60501758 A JPS60501758 A JP S60501758A JP 84502501 A JP84502501 A JP 84502501A JP 50250184 A JP50250184 A JP 50250184A JP S60501758 A JPS60501758 A JP S60501758A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
タンパク質、医薬構成物、遺伝子、ヘクター、宿主生物及びそれらの生産方“法
技術分野
本発明は、クンバク質、医薬構成物、遺伝子、ヘククー、宿主生物及びそれらの
生産方法に関するものである。
背景技術
食餌の脂肪の分解は、高等動物の消化器系の重要な特徴である。
その消化は、脂肪が消化管を通過する間に、酵素を触媒とするトリグリセリドの
加水分解により、モノグリセリド、ジグリーしり1・、グリセリン及び遊離脂H
7]酸の?I1合物を41三成するごとて行ねヵ、る。
この加水分解による生成物は、腸に並んでいる精成細胞の−1−被膜を通過Jる
ことができる。これらは、−L!、吸収されると、十ロミクロンに含まれるl−
ジグリセリドのl+1合成に使用される。これらのキロミクし1ンは、リンパ系
により吸収場所から速く離れた場所へ連ばれる。トリグリセリドの加水分解を行
う酵素は、リパーゼと呼ばれ、胃腸管内に分泌される(デスヌエル、P、 (D
esnuelle。
p、) (1972)ザ・エンザイムズ、第7巻第3版、Acad、 Pres
s、二。
J、−ヨークとロンドン、P、575−616及びバーガー、 R,(Verg
er。
R,) (’+980)メリンス・イン・エンジモロジー、餅、 340−39
2 )。
トリグリセリドの加水分解に関する酵素の1つは、膵臓のリパーゼ(EC3,1
,1,3)である。ブタは酵素の供給源として便利であるため、ブタの膵臓リパ
ーゼは詳しく研究されている。ブタの膵液中には全タンパク質の約2.5%の膵
臓リパーゼが含まれており、これは現在均一のものに精製されている(バーガー
、R,(It(1969) Biochim、 Biophys、 Acta、
18影、272−282 ) 、この酵素の完全なアミノ酸配列が決定されて
いる(デ・カリ、 J、 (De Caro。
J、)他(1981) Biochim、 Biophys、八cta、 fj
71、+24+−138) 、 この酵素は、449個のアミノ酸(州4985
9 )より成るタンパク質部分から構成され、このアミノ酸配列中の166番目
にあるAsn残基には炭水化物部分(■約2000)が結合している。したがっ
て、この酵素の全分子量は約52000である。膵臓リパーゼの触媒作用は、可
溶性酵素と不溶性1−ジグリセリド基質の間に相分離があるため、複雑である。
酵素を基質と反応させるためには、コυバーゼ(colipase)として知ら
れ−(いる補酵素が必要である。こlリバ−セは、低分子量のタンパク質てあり
、これは溶l多と脂yJの界面に吸着した後、リパーゼに刻する固定剤として作
用し、酵素とその脂質基質問に反応を起こさせる。
膵臓リパーゼは、トリグリセリFの消失又は’JrV 離脂肪酸もしくはグリセ
リンの存在についての測定を含む種々の力l)、(1,述のデスヌJ刃し及びバ
ーガー参照)によって検定をすることができる。
放射性同位元素による標識、加水分解中のブ[l]−ン放出及び脂質車一層の物
理的性質GJ対するりバーゼの作用も、リパーゼの活性を検定するのに使用でき
る。いずれの場合でも、膵臓リパーゼ番才中性からアルカリ性のp11範囲(ず
なわぢpl[7〜pH9)で最も活性である(上述のパーカー外参照)。この酵
素は、酸性のpHに対しては非常に敏感であり、低いpHでは直ぢに不活性化す
る。
人体の脂質吸収不良の多くの病気は、膵)藏リパーゼの分泌が低いレヘルになっ
ていることに特徴がある。
嚢胞性繊維症にかかっている患者の約80%は、膵臓の機能が不充分である。膵
臓リパーゼの不足症状は、誕生後直くに現れ、患者の生涯にわたって続く。
膵臓炎は、膵臓機能が損なわれた状態である。膵臓炎は慢性アれに伴う栄養不良
に罹っている。
発育中の胎児は高炭水化物の栄養に依存しており、膵臓リパーゼを低し、ルでし
か生成しない、不充分に発達した膵臓機能を持っている。誕生後、乳児が母乳を
飲み始めるので、胎児期間の高炭水化物栄養は、高脂肪食に代えられる。脂肪に
より、乳児は、カロリー摂取量の約半分を取っている。臨月まで胎内にいた乳児
ですら膵臓機能は不充分であり、特に早産の乳児では脂肪を消化することができ
ず、これによって脂肪便(脂肪が消化されずに排便されること)が見られ、エネ
ルギーの損失が生している。
膵臓リパーゼが不足している患者に対する現在の治療は、ブタの膵臓酵素の未粕
製剤をを大量に経口投与するごとにより行っている。膵臓リパーゼは胃内の低p
l+状態によって不活性化されるため、経口投与された膵臓リパーゼは胃から腸
を通る間にほぼ不活性化される。投与される大量の製剤は、殆んどの患者には不
適当であり、これらは不純物を含みLl、つ味が悪いものである。幾種かの錠剤
は、胃の酸性領域は通過し、空隔のアルカリ411゛側の状態においてのみ酵素
を放出するように調製されている(ガラ、R,<Goh。
1?、)外(1981)ザ・ランセット、第2巻、!−復1070−1074
)。
しかし、膵臓障害に罹っている多くの患者の空隔は界雷な酸性状態となっており
、このような錠剤は酵素の放出かできないため効きl」がない。
現在、膵臓リパーゼの欠乏症患者に経口投与することができるリパーゼ製剤に対
する要望は、非常に大きい。
舌の背面後部にある古典液腺(フォノ・エブナー腺)は、舌リパーゼとして知ら
れる強いリパーゼを分泌することが見出された。
この酵素は、ラットで(ハモシュ、 M、 (Hamosh、 M、)とスカウ
ア−,R,O,(Scour、R,O,) (1973) J、Cl1n、In
vesL、5g、88−95) 、またヒ1−で(ハモシュ、M、とハーンス、
讐、へ、 (Burns、 W、^、(1!177)Lab、Tnvest、
37.603−608 )検出されている。この酵素は、吐液と共に飲み込まれ
て胃に入り、そこで脂質の部分的な消化を打う。
ラットのフォノ・エブナー腺からのこの酵素は、多少精製されている(フィール
ズ、 R,B、 (Fields、 R,B、)外(1983) J、Riol
、Chem。
η棧−114563−14569 、ハ%シz、M、外(1979) 、J、R
iol、Chcm、254.12121−12125 )。舌リパーゼは、トリ
グリセリドを生体内で及び試験管内でジグリセリド、モノグリセリド及び遊^1
(脂肪酸に加水分解する(ハモシュ、肥(1984) ”ザ・リパーゼ゛、編築
考ポルゲストロム+ B、 (Borgstrom、 B、 )とブロックマン
、 )1.0. (Brockman。
H,O,)エルシビア アムステルダム)。舌リパーゼと膵臓リパーゼの主要な
相違点は、舌リパーゼが特に食後の胃内のような酸性状態で安定であることであ
る。舌リパーゼは、2がら7までの範囲のpHでトリグリセリドを加水分解する
ことができることが明らかになった。舌リパーゼは、自然の供給源からはごく微
量しが取出せない。例えば、16匹のラットから調製しても約1.5nB+の不
純な酵素しかできない(フィールド−外(1983) 2ラ−8−114563
−14569)。
ヒトの胃から取り出した酸性で安定なリパーゼの精製法G31、チルパシ、 C
,(Tiruppathi、 C,)外((1982) Biochim、及び
Riophys八cta、 へ12 、692−697 )により報告され−(
いる。
上記の舌リパーゼについての研究報告は、ずべて専ら学トドI的l□1格をもつ
ものであり、リパーゼ欠乏症の治療に古リパーゼを用いることに関する何の記載
もない。我々は舌リパーゼをこのように使用することができると考えているが、
ぞれは古リパーゼを大量に且つ比較的安価に生産することができて、そうするこ
とが有利な場合だけである。しかし、これを動物やヒ[のP;がらの抽出によっ
て行うことは明らかに不可能である。
我々は、紹換えONΔ技術を用いた発明によって謁リパーゼを4を産することに
より、商業価値のある量の舌リパーゼを提1tiするものである。
発明の開示
本発明の第1の態様においては、リパーゼ欠乏症の治療に用いる舌リパーゼタン
パク質を提供する。
本明細書中において使用する“舌リパーゼクンバク質゛という用語は、真正の哺
乳類舌リパーゼ又は機能的に同しクンバク質となるように変更もしくは変換した
真正の哺乳fi8リパーゼを息味する。この舌リバーセタンバク質は、例えば、
N末端メチオニン・アミノ酸残基をもつ哺乳類の舌リパーゼ(メチ材ニンー活す
パーゼタンパク質)を含んでいる。この舌すパーゼタンパク質番J、ヒト又はラ
ットの古リパーゼタンパク質がよい。
、!;リバーセタンバク質は、組換えDNA技術によって生産するのが自利であ
る。
本発明の第2の態様においては、メチオニン−舌リバーセタンバク質のコートと
なる遺伝子を含むヘクターで形質転換された宿−L生物中にタンパク質を生成さ
せることより成る、メチオニン−舌リパーゼタンパク質の生産ツノ法を提供する
。宿主生物としてGコ、細菌(例えば大腸菌(E、coli) )又は酵母(例
えばサツカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces ccreri
siae) )が好ましい。
本発明の第3の態様においては、前駆体タンパク質のコードとなる遺伝子を含む
ヘクターで形質転換された宿主生物中に舌リパーゼ前駆体クンバク質を生成させ
、そしてその前駆体タンパク質を切断して舌リパーゼタンパク質を生成させるこ
とより成る、舌リパーゼタンパク質の生産方法を提供する。
舌リパーゼ前駆体タンパク質としては、前駆舌リパーゼクンバク質がよく、宿主
生物としては、前駆舌リパーゼタンパク質を切断して古リパーゼクンバク質を生
成することができるものがよい。
また、この宿主生物は、前駆舌リパーゼを切断して舌リパーゼタンパク質を培地
に運び出すものが最もよい。
本発明に係る第3の態様の別の形態では、前駆体舌リパーゼタンパク質は、異種
のクンバク質と舌リパーゼタンパク質より成る融合タンパク質である。この異種
のタンパク質は、宿主生物中で、好ましくは高レベルで生成することができるタ
ンパク質の全部又は一部であってもよい。このようなタンパク質は、β−ガラク
トシダーゼ及びtrpE遺伝子の生成物を含むものが適当である。融合タンパク
質は、異種タンパク質と舌リパーゼタンパク質との間に選択的な化学的又は酵素
的切断を受ける部位を含むものがよい。
この異種のタンパク質は酵母の信号配列とすることができ、また宿主生物は酵母
でもよい。この好ましい実施例では、酵母の宿主生物は、適切に融合タンパク質
を切断して成熟した西リパーゼタンパク質を産生ずる。
本発明の第4の態様においては、前駆古すパーゼタンパク饗を提供する。
本発明の第5の態様においては、メチオニン−舌リパーゼタンパク質を提供する
。
本発明の第6の態様においては、異種タンパク質と西リパーゼタンパク質より成
る融合タンパク質を提供する。
本発明の第7の態様においては、少なくとも舌リパーゼタンパク質のアミノ酸配
列のコートとなる遺伝子を提供する。この遺伝子は、本発明の第4、第5又は第
6の態様のタンパク質のコートとなるものがよい。更に、添付図面の第5図に示
す、ラットの舌リパーゼの少なくともアミノ酸のコードとなる遺伝子を提供する
。
本発明の第8の態様においては、本発明の第7の態様の遺伝子を含むヘクターを
提供する。ごのヘクターば、適当な選択可能なマーカー、プロモーター及びその
他の調節領域を適切に与えて所定宿主生物内において使用できるようにする。
本発明の第9の態様においては、本発明の第8の態様に基づくヘクターで形質転
換された宿主生物を提供する。この宿主生物は、発現が生じるような、舌リパー
ゼタンパク質のコードとなる遺伝子を含むヘクターにより形質転換できるもので
あれば、如何なる生物でもよい。このような宿主生物としては、細菌(例えば大
腸菌(R,coli) ) 、酵母(例えばサツカロミセス・セレビシェ(Sa
ccharomyces cgrevisiae) )及び組織培養した哺乳類
の細胞が適当である。宿主生物が細菌又は酵母の場合、ヘクターはメチオニン−
古リパーゼ又は融合タンパク質のコードとなる遺伝子を含むものがよく、また宿
主d゛物が組織培養の咄”7′L類細胞の場合、ヘククーは前駆舌すパーセのコ
ートとなる遺伝子を含むものかJyい。
本発明の第10の態様においては、古リパーゼタンパク質の抗原決定基に対して
特異性をもっている抗体を提供する。この抗体は、ポリクローナル抗体又はモノ
クローナル抗体のどららでもよいか、モノクロ−ナル抗体の力がよい。抗体は、
免疫学的検定法で用いるために検出可能なマーカー例えば放射性同位元素でラヘ
ルしておくことができる。
本発明の第11の態様においては、舌リバーセタンバク質及び1ダ楽基準に合っ
た賦形剤より成る医薬構成物を提供する。ごのリパーゼタンパク質としては、本
発明の第2又は第3の態様に係る方法で作られたヒト又はラットの古リパーゼか
よい。この医薬構成物は、リパーゼ欠乏症の治療用に供される。この構成物は、
経し1投与用に調製されたものがよい。この構成物は、錠剤、カプセル又は糖衣
錠のような単位投薬剤にすることができる・。
単位投薬剤を作るには、適当な形態の古リパーゼをラクトース、ショ糖、ソルビ
トール、マンニトール、デンプン、セルロース銹導体又はゼラチン又はその他の
同様の賦形剤のような医薬的にイ・活性な固形粉基剤と混合する。そして、ステ
アリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はポリエチレングリコールワ
ックスのようなW14?I!を剤を加えζもよい。得られた構成物は、押し固め
て単位投薬剤に形成する。
この単位投薬剤には、タルク、二酸化チタン、ゼラチン又はアラビアゴムのよう
な添加物の入った濃縮糖’M+?g液を塗ってもよい。
また、この単位投薬剤には、ラッカーを塗ってもよい。単位投薬剤を見分り易く
するために上塗りに着色を施すことができる。液体製剤又は固体製剤に応じて舌
リパーゼをカプセル化するため、軟質又は硬質のカプセルを使用することができ
る。
代わりに、活リパーゼは液状に調製することができる。液状の製剤を作るために
は、適当な形態よなってい、−′l)西リパーゼをl^体基剤に加える。この基
剤は、例えばシロップ又は広濁液がよい。
この液状製剤には、着色料、着香料、1F味料及び/又は濃化剤を加えてもよい
。
本発明の別の態様においては、占リパーゼタンパク質を医薬基準に適合した基剤
に結合させることより成る医薬構成物の生産方法を提供する。本発明の更に別の
態様においては、有効な量の7jリパーゼタンパク質を投与することより成るリ
パーゼ欠乏症の治St法を提供する。
使用した操作方法は、先ずう、トの古(ヒトの古と比べて、より豊循で便利な酵
素供給源)からの活リパーゼを精製したことである。精製されたラットの酵素は
、N末端アミノ酸配列とされて、構造上の特性とポリクローナル抗血清が画めら
れた。このう、トの酵素は、ラットのポリクローナル抗血清を使用してツノhの
フォノ・エブナー腺(ヒトの古の組織と比べてmRNAのよりJJ’+’Y+な
供給鯨)に由来する、発現されたcDNΔライブラリーをノ、クリ−ニー/グす
ることによりクローン化した。ラットの舌リバー、ゼの完全な核酸配列及びタン
パク質配列を決定した。発明を実施するための最良の形態において、組織培養し
ている適当な微生物又は動物細胞中でラットの酵素のクローンがどのように発現
されるかにつぃ乙また組換えられたラットの舌リパーゼがどのように生産される
かについ゛ζ説明する。また、ヒトの舌リパーゼ遺伝子をクローン化し、発現さ
せる方法及び組換えられたヒトの舌リパーゼの生産方法についても説明する。
発明を実施するための最良の形態において、図面1を参照して、糾換えIINA
技術を使用した古リパーゼの生産方法を説明する。
図面の簡単な説明
第1図は、精製したラットの舌リパーゼのSDSポリアクリルアミドゲルを使用
した電気泳動図である。
第2図は、精製したラットの舌リパーゼをエンドヌクレアーゼl]で水解したも
ののSOSポリアクリルアミドゲルを使用した電気泳動図である。
第3図は、プラスミドpLLIOの制限部位の地図である。
第4図は、ラットのLL DNAの制限地図(第4図1ll))、DN^配列を
有するラットのLLタンパク質の直線的配列(第4図b))及びβ=ガラクトシ
ダーゼと前駆舌リパーゼ遺伝子とが連結している(関連するアミノ酸を持ってい
る) DNA配列をそれぞれ示す図である。
第5図は、ラットの前駆舌リパーゼ遺伝子のDN八へ列を示す図である。
第6図は、pLLloによる前駆舌すパーセとβ−ガラクトシダーゼとの融合タ
ンパク質が産性されたことを示す、SDSポリアクリルアミドゲルを使用した電
気泳動図である。
発明を実施するための最良の形態
1、ラットのフォノ・エブナー腺からの舌リパーゼ酵素の精製法殺したばかりの
与ノドから完全な舌を取り出した後、解剖してフォノ・エブナー腺を取り出した
。ヘルガー外により説明されているよっに、約600個の腺を均質化した後、有
機l8剤を使用した抽出により脂質を除去し、次に真空乾燥して不純な粉状抽出
物を作った(ヘルガー、 R,(Verger、 R,)外(1969) Bi
ocbim。
1!1iophys、Acta、 188.272−282 )。
基本的にはヘルガーとノリウス外により説明されζいるように、不純でリパーゼ
にmむクリーム状のものを作ったが、多少の変更を施した(ヘルガー(Verg
et) (1969)とメリウス、P。
(Melius、 P、)外(1965) Biochim、Biophys、
AcLa、匹5 、60) 、。
この変更とは、最初の粉状物を、プロナイナーゼBr+害剤と一緒に2%(v/
v))リドン X100 (Triton X100 ) 、0.15MNaC
1′IJ液に懸濁させた後、遠心分離を行って’IN/B、にし、次にブタノー
ル−硫酸アンモニウム溶液で抽出した。このクリーム状のものは、(プロティナ
ーゼ阻害剤とトリトン X 100を含む)pH5の50mM酢酸ナトリウム/
8液で抽出した。懸濁液を、トリトン X 100を含まない試料緩衝液に対し
て透析を行った後、遠心分離により清澄にして和製抽出物を作った。この粗製抽
出物を、CトセフォロースCL6Bを用いてクロマトグラフィにかりた後、O−
0,7MのNaCIa度勾配となっているpH5の50m開¥酸ナトリウムi
l&を用いて溶出した。
リパーゼ活性の単一のピークが約0.27MのNaCl/W液で溶出し、これを
ためて、濃縮した後、50mM酢酸ナトリウム/8液でセファデックスG150
を用いたゲル濾過を行った。リパーゼ活性の単一のピークは、不要の/8液の約
1.7倍溶出した。リパーゼ活性を持っている試料分画を5O5−PAGE電気
泳動で分析した後、調製物を一20°Cで保存した。
酵素の脂質分解活性は、精製操作中を通して測定した。舌リパーゼは、電位差測
定法(ヘルガー外、(1969) )を使用し、ヘルガー、R1とバトン、 F
、 (Patton、 F、) (1982)ケミストリー・アント・フィズイ
クス・オブ・リビング、迎、189−227 )に記載されているように、脂質
の単層を拡げるという技術により種々のトリグリセリド基質を使用して酸性のp
UV4域で測定した。または、之の方法の代わりにハモソシュ外(1979)
J、Biol。
Chem、 25↓−11212142125に記載されているように、〔3H
〕 トリオレイン基質を使用した放射能検定法を用いることもできる。
この放射能検定法は、変更を施して、バトン外(1982) Biochim。
11iophys、Acta、 712□、400−407に記載されているよ
うに、乳濁化した無水グリセリンを用い、そしてヘルフリンジ(Belfrig
e)とホー7 (Vaughan ) (19[i9) J、リピノト、 Re
s、10.341に記載されているように、p)112.5のO’、iNグリシ
ン溶液を用いた&離脂肪酸の抽出と有機物相の抽出を行った。
」二連した最初の抽出操作は、脱脂したクリーノ・状抽出物中に通常のように最
初のリパーゼ活性の50%以上を回収したので満足すべきものであった。しかし
ながら、クロマトグラフィを1史用した操作では、最終のリパーゼ活性は低い収
・率(約10%)であり、またハツチ間で舌リパーゼの純度にばらつきがあった
。
5113、−PAGE電気泳動により分析すると、最終産物である個々のlF+
I 製物は、(フィールズ、 R,B、外(1983)によるラットの占リパー
ゼの推定分子量に近い) 52.000という見掛けの分子量をもって移3!1
」する1、(1−90%の一本のポリペプチド鎖を有していた。
このため、上記のクロマトグラフィによる操作を、セファロースと結合したポリ
クローナルウザギ抗うット古リパーゼ抗体を使用した1回の免疫精!!操作に置
き代えるごとにより、精製操作を改善した。
ラットの舌リパーゼは、(上述したように) CMセファロースCL6Bを使用
したクロマトグラフィとセファデックスGI50を使用したゲル濾過により多少
精製した。分子量約52.000.、重量的90%のタンパク質より成る100
μgの調製物を1mβの完全なフmlイン1−のアジュバントに解がした後、こ
れをウサギに辻射した。
14日後、不完全なフロイントのアジュハン]・を使ってtM lli ヲ4’
+び行った。28−30日後、ウサギから採血して抗血清を作り、これを30日
おきに繰り返した。抗血清の刀価は、標準的な免疫学的方法により測定した。
免疫グロブリンは、固定硫酸ナトリウムを用いて(18%w/v)晶力価つザギ
高う/ト舌すバーセ抗血1lltがら沈澱させた後、p119の0.1M炭酸水
素すトリウム溶液にIIJ熔解化、次に同し緩衝液に対して完全な透析を行った
。免疫グロブリンは、セファロース製造会社の指示に従って阜化シアンで活性化
さゎ、たセファロース(ファーマシア(Pharmasia ) )に結合させ
た。親和性吸着剤は、室温で2時間、1勅エタノールアミン溶液(+1)18に
調′!りで封鎖した後、重炭酸と酢酸の緩衝液を用いて洗浄し、次に使用するま
で4°Cで0.02%(W/ V )のアジ化す(・リウム熔〆l)、 [J−
1に保存した。
(−ト述した)リパーゼに富むクリーム状のものから可溶化したタンパク質ば、
ラット抗告リバーセーセファロースの詰まったカラムに充填した。このカラムは
リン酸塩緩衝液とLM NaClとなっているこのリン酸塩緩衝液を使用して洗
った。結合しているタンパク質は、0.01門グリシンHCI pl+2.3の
ン容液で溶出した後、p115の50mM酢酸アンモニウム溶液に対し“(透析
を行い、次ぎに凍結乾燥を行って一20℃で粉状で保存した。この操作により、
5O5−PAGE亀気泳動法によると約52,000の分子量をイjする純粋な
ラット古リパーゼができた。また、この免疫吸着カラムを使用することにより、
精製操作の収率、純度及び再現性が格段乙こ向1−シた。1個のラットの占につ
き、約11001rの亀気泳+h沈により純粋となったラットの古リパーゼが得
られ、これは約500 ri’l−位7’ 111gの比活性を持ゲ(いたく申
イ)旨よ37°Cで1分間に杉成される脂肪酸のマイクロ七ル)。
2、、N ;th (17)ラット−の店すパーセの特牲2.1ラノI・の古す
パーセの分子量の測定免疫親和11[り[−1マトクラフイによゲ(均一に粕栗
されカニラットの古リパーゼを、分子量のわがっている数種のタンパク質が存7
1し5ているSDSポリアクリルアミ1うル中−ご〒+1気〆〕kIriJJに
かりた(しJ入り (1,aemmli ) (1970) 2イチャ−122
7、fi80−685 ) 。511 gのラノ1〜の古すバーレを75%(w
/v)のアクリルアミ1−ゲル中に4人わ人:、、、これらのタ:/バク質(3
、クマシブル−(Coomassie Rlue)を使用して智、Yできるよ−
)にした。41成したゲルを第1図にホす。矢I’ll lよ、マーカタンパク
質につい−(の酵素の移動位置を小ずものであり、そこ6、二おおよぞの分Y−
量を示す。この酵素は、52,000のQf!)けの分子量を持った1本のハン
ドとして移動した。セフアゾ、ラスG150ζゲル濾過を11った不純の活リパ
ーゼのill定分子惜は、ポリアクリルアミ(−ゲル電気泳動法により得られた
分子量と田と一致しでいた。フィールド外(1983)により、セファデックス
G200によるゲル濾過が11われ、51.000という分子量が(1[定され
ている。この結果、精製したラットの占すバーセは、分子量約 52,000の
モノマーのとき活セ[であるといえる。
2.2ラノ[・の店すバーセにおけるグリフ2ンレーンヨンの存在の確定
アスパラギンが結合したN−グリコン[ハーショ1ンの存在は、ストレプトミセ
ス・ブリカフス(streptomyces plicatus )からのコー
ントグリコシタ′−ゼH(エンド−β N−アセチルグルニl′+ミュダ−ゼH
) を用いて、本?1製し人−ノ、1−の古すバーセを水解することにより確認
した。501翔酸す1−リウム、1酵フェニルメチルスルボニルフルメリ1−1
[0μj1の501Q4A’t/ m 1のエンドグリコシダーゼHを含むベゾ
スタチンA(pepstatin A )のl容?(k (pH5,5) 1m
/当たりう71o)−iリバーセをimg含む溶液を37℃で培養した。この代
わりに、ラットの舌リパーゼを0.4%(w/ v ) SDSの沸)氏液中−
ζ力11 p4>した後、0.1%(w/v ) SDS 1g液に4釈し、上
述のように培養した。両刀の場合で、ラットの7、リパ二セ氷解産物は、ウサギ
抗うット古すパーセ抗1m清を使用したウェスタン・ゾロノド(Western
旧o1)分析法(プル不)) 、 W、N、 (BurnetLe。
W、N、) (1,981)八nalyt、Biochem、□↓1.2、−1
1i15−20311により5l)S、−PAGIE (7,5%(皆/ν)ア
クリルアミF’ )で分t’ill L、、観察できるようにした。ラットの占
リパーゼ(分子が約52.[)f)0)の氷解により、最少の分子量が約41.
000である一群の低分子量のものが生成した(第2図)。エントクリコンクー
セ+−1の氷解により、Nに結合した炭化水素部分をイjする糖クンバク質から
ごの部分を除去することができた。このよ・ノ乙、−リJ断−・すると、糖部分
が除去されたタンパク質か生成するため、分子量かは−っきりと低下する。この
分子量の低干は、5DS−PAGE−(糖部分が除去されたタンパク質の移動度
が増加−4−るので観察することができる。エン1−グリコシダーセの処理ζこ
より一ン、ノドの古リパーゼの分子量が52.GOOから41,000に明らか
に減少するということは、(Tfffflで)酵素の約20%は炭化水素より旧
及びBgIl+を用いて水解した後、バイオケル(Bioget) A50クロ
マI・グラフィにより過剰のリンカ−から分とiIIシた。それぞれの分画から
のcDNAは、粘着性末端に結合させることにより(マニアナス外、−上記参照
)、3つの読み枠全部にβ−ガラクトンダーゼ又は1.r p E融合ポリペプ
チドが生成するような−ノ11の発現ヘクターのBam tlI部位に挿入した
。β−ガラクトシダーゼ融融合ダクタ一ついては、ラザー(Ruther)とミ
ュラー ヒル(1983) EMBo 、1. ′L、川791−1.794に
記載されており、またt r p E融合ヘクターについては同時係属中の国際
特許出願PCT /GB83100172 (1!1184年2月 2日にWo
8/1100380とし7て公開)に説明されている。
結合しているDNAは、ハナハン、 D、 ()lanaban、 D、 )
(,1,Mol。
Riol ↓リー1p557−580 (1983) )の方法により大腸菌(
E。
coli)のD旧細胞に入れて形質転換を行った。什成した絹換え体コロニーは
ニドじ2セルロースフイルタートで複製し、改心こ]ζ記に示すように、ラット
の舌すバーセ抗原決定基を持っているタンパク質を産生ずるものを探すためのス
クリーニングを行った。コロこm−は、クロロホルムが飽和した雰囲気中で10
m■トリス1(CI 、 1m門EIIT八へ pH7,5i液に叶尿素が入っ
ているものを用いてフィルター上で/8解した。細胞断片は、160mM N、
1lC1、10mMトリスIIcIを含むpH7,5の緩衝液を用いて充分に洗
うことによりフィルターから除去した。5μg / m I!のIINアーセを
DNAを取り除くために使用した。更に洗った後、フィルター上の非特異的な結
合部位は、0.5%カゼインを含む洗浄緩衝液を用いて培養することにより封鎖
した。
これらのフィルターは、コロニー(別を下向きにして、01%1−リドンX 1
00.0.1%SO5,1mM EDTA及び約2μg/m7!のIgG (ウ
サギ抗うット舌すパーゼ血lnから精製したもの、上記参照)を史に含む洗浄緩
衝液中で培斧ユし人−0このILζtj調製物(。1、大腸菌(E、Co11)
1)IIIからの全タンバタ宵抽出物C1二対し、て)−め吸収させておいま
たものである。改心、−8完谷−Qご洗浄をiIっ−(フィルターから結合して
いないIgGを1収り1徐き、引き続き1?−・Iてラヘルされ)こ1 p C
i/ m lのフ゛IIラーインへ (Prol、ein A )を月1い−ζ
フィルターを培養し2だ。最71aこ、これ(しのフィルタをに、、 ]Aiの
緩衝液を含むSO3と1−リ1ン×100を用いて洗った後、」−ラジオグラフ
ィにかけた。ラノ[−の−;リパーセ抗原決定基を自するタンパク質を産)1−
」る:l mlニーは8.’?I# ’4i i巽)尺枝往f(リチ了ルディ、
R,P、 (Ricciardi、 R,P、 )外(1979) Proc
、Na1t、Acad。
Sci、 (米国)7す、4927−4931. )により、りじl−ン化され
たラット舌リパーゼ配列が存5F シー(いるかどっかを(]在かめるために更
に分析した。
候補j0ニーからのプラスミド調製物についても、クローン化したDNA断片の
部分的DNA配列を分))1するごとによりスクリーニングを行った。DNA断
片は、M13ヘクターm1」8とm p 9に入れて配列させるためにクローン
化したく41.ノシンク (,1,hlessinL+)とJ、ベイラ(J、V
ieira) (1982)ジーン、川、269−276 )。配列は、クロー
ン化された部分に対して−J度3′領域に交雑した合成の一本鎖の一般的プライ
マーを用いて、ディデオキシ(dideoxy )配列法(サンガー、 F、S
、外(1977) PNAS、 74.5463 ;八、J、H,スミス(19
80)メリンス・イン・エンジモロシー、アカデミツク・プレス、亜、500)
により決定した。
pLLlo (第3図)と呼ばれるプラスミドが同定された。このプラスミドに
は、約1350の塩基より成るDNA挿入物が含まれており、これによりラット
の占リパーゼの全アミノ酸配列をコートすることができる。
プラスミドpLl、10は、プラスミドpUR292(ラザーとミュラ−ヒル、
上記参照)に由来するものである。クローン化した前駆舌リパーゼ(破線)は、
pUI?292のBam 旧部位に挿入する。
pLLloの制限エンドメクレアーゼ地図を作成しく第4図a) )、挿入物の
完全なりNA配列を決定した(第5図)。
第4図a)に、ラットの舌リパーゼDNA配列における幾つかの制限エンドヌク
レアーゼによる切断部位の位置を矢印で示す。
直線の下の数字は、第5図に示す塩基の番号と関連している。
第4図b)は、DNA配列を有するラットの舌すパーゼタンパク譬の直線的配列
を示す。直線の上の数字は、第51821に示すアミノ酸の番号と関連している
。→−1の位置は、成熟した舌リパーゼのN′f+端残基である。377の位置
は、成〃)シたタンパク質のC末端アミノ酸である。−1から−18までのアミ
ノ酸は、−18の位置にあるメチオニンで始まる、推定のラットの西リパーゼ信
号配列を表す。第4図C)は、β−ガラクトシダーゼと前駆舌リパーゼとの連結
配列を5くず。ブタスミt”pl凡10中で前駆ラットの古゛リパーゼのコード
領域は、リンカ−をβ−ガラクトシダーゼの1t121+J基に二I−卜する4
アミノ酸により融合する。図面は、β−ガラクトシダーゼと連結しているDNA
と誘導されたアミノ酸の配列及び占すパーゼ造伝子を示す。I)N A配列十の
文字は、この領域におりる誘導!アミノ酸配列をボす。アミノ酸コード文字の十
の数字は、β−ガラクトシダーゼ又は舌リパーゼ遺伝子中のアミノ酸番号を示す
。丁の線は、配列の起点を示1゜
第5N6こ、前T!jA占リパーゼ遺伝子のコード鎖のDNA配列を示寸。DN
A配列の士の数字は、塩基番号を表す。塩基の1は、lt疋の読め始めmet残
基であるATGコドンから6ヌクレアーゼ士流にイ1を、乙こイ律したものであ
る。” * ”は、終]トニノ1−ンT八八を不の直く上の文字は、誘導lアミ
ノ酸配列であり、これを従来の]、 1liilの文字によるアミノ酸略号を使
用して表す(即ち、A−アラニン、R−アルギニン、N−アスパラギン、D−ア
スパラギン酸、C−システィン、E−グルタミン酸、Q−グルタミン、G−グリ
シン、H−ヒスチジン、I −(ソロイシン、I−= [:フイシン、K−リジ
ン、M−メチオニン、F−フェニルアラニン、P−プロリン、S−セリン、T
−トレオニン、W−1,リブトファン、Y−チロシン及び■−バリン)。6力導
アミノ酸配列の上の士線を引いた文字は、精製したラノ1の誌リパーゼがら的接
得られたN末端アミノ酸配列を表す。括弧に人ゲ(いるアミノ酸は、DNA配列
により誘導されたアミノ酸配列と精製した一;リパーゼのアミノ酸配列決定より
CIられた配列との相違点を表す。
直接得られたアミノ酸配列中の隙間(−)(;l、未決定めアミノ酸を表す。ア
ミノ酸の−18から一用までは、CI定の信号配列を表し、+1から377まで
は成熟したタンパク質のアミノ酸配列を表す。破線は、アスパラギン残基付近の
潜在的に糖タンパク質化(グリコンレーション)が可能な配列をン1り’J。
11 +1Δ配列から予想されるアミノ酸配列は、成4ノ)シた舌すバーセが(
終ILコドンで終わる) 377111.Iのアミノ酸タンパク油3Lり成るこ
とを示している(第5図)。この成ρノ)シたタンパク質の予想分子量は42.
564であり、これは糖部分を除去1−だ酵素についてsos PAGEにより
決定した分子量と略一致している。0114配列から予想される、成〃)シた酵
素の全アミノ酸組成と分離しカニタンパク質から直接得られたものとの比較を表
1に示す。成シ)した古すパーセには、(一般式はX−Asn \Thr又はS
erである)潜在的にグリニ1シレーンヨンのnJ能な部イ)ンが5つある。ラ
ットの舌リパーゼは、ブタの膵臓リバーセ゛と比べてアミノ酸が72個短く、ま
たこの酵素とは配列の相同性又はアミンrθ絹成の類似性は殆どない。しかし、
ラットの舌リパーゼと、ブタの膵臓リパーゼの重要なセリン−152の領域にお
けるブタの膵臓リパーゼとは近情した相同性が確かに存在する。このセリンは、
膵臓リパーゼの脂質への界面での固定に関与していると考えられており (ギド
ニ、へ、 (Guidoni、八、)外(1981) 、Biochi+n。
Biophys、八cta、 61zQ=、14)1−150 )、ミセルのジ
エチル−p−ニトロフェニルツメスフエイトと反応する(ルワート、 M、 (
RouardM、) タト (1!J78) 、 Biochim、Bioph
ys、八cta、旦8】公−1227−235) 。
そして、次の主要なアミノ酸配列における略同し位置にも存−ゼにあるl(固の
グリコシレージョン位:首(八sn −166)であり、これはラットの舌リパ
ーゼにAsn −166として存在しζいることが明らかである。
11、β−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質としCのラットの前駆舌すバー
セの大腸菌中での発現
を37°Cでアンピシリンを加え、たし=プロ人中で1晩生育さセた。
1meの試料をアンピシリンの入った1001の1−−−ブロスに移した後、3
7℃で5時間生育させζ0D600で約1.0とした。培養物を氷で冷やした後
、4°Cで遠心分離により細胞を集めた。■から0.01までの光学濃度単位(
600ナノメータ)に相当する細胞試料を5DS−メルカプトエタノール試#1
桜南?&、中で煮た後、5%ポリアクリルアミドSOSゲルに充填し、クマシブ
ルーで染色した(第6図a)。レーン1は、pUI?292を含む細胞からの1
01分子量大腸菌タンパク質を示す。レーン2ば、pLLIOを含む細胞からの
全クンバク質を示す。全大腸菌クンバク質の5−1量%より成る大きなハンドが
、レーン2巾に約160,000の見掛けの分−7量を持って移動しているのが
観察できる(この値は、分子量約160,000の大腸菌RNAポリメラーゼの
β号ブユニットに近いものである)。このハントは2.UR292を含む細胞中
に観察することはできない。舌リパーゼとβ−ガラクトシダーゼの融合タンパク
質の分子量(古リパーゼのDNA配列とβ−ガラクトシダーゼの既知の分子量か
ら予想されたもの)は、約160,000である。
従って、pLLloから発現されたタンパク質は、融合タンパク質について予想
された分子量と略同しである。
このことは、同様のポリアクリルアミドゲルを使用したウェスタン・プロット分
析法により確認したく第6図b)。レーン1.2.3.4には、それぞれ大腸菌
/pLL]oの1.0.5.0.1及び0.01 0量goo単位から抽出した
全タンパク質が含まれている。レーン5には、大腸菌/pUR292の10量e
oo単位からの全タンパク質が含まれている。レーンらと7には、約1μgの精
製した真正のラットの舌リパーゼが含まれている。レーン1−4かられかるよう
に、低い分子量の幾つかのタンパク質と一緒に、分子量約160,000の主要
なタンパク質が検出されている。pLIR292から調製した抽出液中には、免
疫反応を起こすタンパク質ば検出されていない(レーン5)。ラットの舌から精
製したラットの舌リパーゼの試料も抗血清と反応する(レーン6.7)。この結
果、ラットの舌リパーゼは大腸菌中にβ−ガラクトシダーセと共に融合タンパク
質として曲しヘルで発現されたということが結論できる。
5、+1)大腸菌、(2)酵母、(3)組織培養した動物細胞におけるラットの
舌リパーゼの発現
5.1大腸菌(E、coli)
成熟したラットの舌すパーセを発現させるためのプラスミトヘクターは、p C
T 54に基ついて作成する(エムティン1.■。
S、 (Emtage、 J、S、)外、PNAS、米国(1983) 、靭、
3671−3675 )これらのヘククーには、trpプロモーター、即ち好ま
しくは(Met)舌すパーゼ造伝子と隅り合・う、最適化したシャインーデルガ
ーノΔTG塩基配列を含む。これらのヘククーを適当に作成することによっても
、前駆古リパーゼ又はtrpE遺伝子産物の融合タンパク質及び舌リパーゼ又は
2蒲駆舌リパーセか発現する。リパーゼを発現さ弔る人口めに最適条件でろL育
ご−Uた場合、これらのプラスミドを含む大腸菌は、全細胞クンバク質の10%
に及ふレヘルてメチオニン−西リパーゼ、前駆古リパーゼ又は融合タンパク質を
産生ずる。′aI泡全体の粗製抽出液中にこの酵素が存ン1していることは、ケ
ル走査と免疫沈降法により確認し、また定量する(エムティン、外(1983)
I’roc、Natl、Acad、Sci、(米国)、遺0.3671−367
5 > 。
粗製大腸菌抽出液からの可溶性タンパク質う1画は、上述の方法により検定を行
って脂肪分解酵素活性を調べた。大腸菌中に発現された酵素の一部又は全部は、
不溶性で不活性の形態となっていることがあり、このため上記検定では検出され
ない。この、Lうな場合、検定と精製の前に、キモシンの生産と関係して本出願
人の同時係属中の国際特許出願PCT /GB83100152 (曽0 83
/ 04418として公開)と公開された英国特許用IWJIGB 21007
37Aに記載されているように、酵素を可溶化し−(活性化さゼ°ておく。上述
の技術により可溶性で活性かあり、多少精製された酵素を得た後、この酵素を上
述したように、又は他の標準的な精製技術を使用して更に精製する。
5.2酵母
成熟したラットの舌リパーゼを発現させるためのプラスミトヘクターば、同時係
属中の公開された欧州特許出願EP A20073635に記載されているヘク
ターに基づいて作成j′る。これらのヘクターには、酵母のPGKプロモーター
と、PGKとメチオニン−すリパーゼ又は前駆古リパーゼ間に(メチオニン)舌
リパーゼ、前駆古リパーゼ又は融合タンパク質を介在さ−UでいるPGK遺伝子
3′末端と隣り合う配列が含まれている。
リパーゼを発現させるために最適条件で生育させた場合、これらのプラスミドを
含む酵母は、メヂオニン西リパーゼ、11;j駆古リパーゼ又は融合タンパク質
を全細胞タンパクiの10%に及ふレヘルで産生する。発現されたリパーゼは、
上述したように定量と検定と精製を行う。
5.3組織培養した動物細胞
ラットの前駆古リパーゼを発現させるためのプラスミトヘクターは、バブラキス
、 G、N、’(Pavlakis、 G、N、)とへイマー。
D、H,(Ilamer、 D、H,) (1983) Proc、Natl、
Acad、Sci、米国、80.397−401に記載されているヘクターに基
づいて作成する。
これらのヘクターには、メタロチオニン(metallothioninθ)遺
伝子ブロモ−クーと発現前駆舌すバーセが含まれている。
この方法で産生された酵素は、細胞膜を通って分泌される。
そして、この酵素を1達したように組織培養している培地で検定し、また組織培
養している培地から精製することかできる。
[i、ヒトの舌リパーゼ
l二連した操作は、ラットの舌リパーゼについてのクローニング、発現及び精製
法を説明したものである。同様の操作は、ヒトから類似の酵素を得る際にも行う
。
ヒトの舌のmRNAから出発して、ヒトの舌リパーゼのcDN^クローンが得ら
れる。RNAは、ヒ1−の舌の試料からグアニジンイソチオシアナートを使用し
た抽出により調製する(チャーブウィン、 J、M、 (Chirgwin、
J、M、)外(1979)バイオケミストリー、トグラフィにより精製する(ア
ビブ、H5(^viv、 H,)とレイグー、 P、 (Leder、 P、
) (1972) PNAS、 69.1408)。
最初の鎖のcDNA合成は、オリゴ(dT)でプライムされた逆転二りにより行
い(レソッlル(Retzel)外(1980)バイオケミストリー、−1馬5
13−518 ) 、DN八とRNへの雑種を生成させる。グブラー、 V、
(Guhler、 V、) 七ポフマン [(lIOffIIBnlR,3び大
腸菌リガーゼの作用により合成し、そして二本鎖cllNAにはポリ (dC)
の尾部を付ける(ビラ(Villa )−コマロフ(Komarof I’)れ
てアニールした後、切断し、そしてPst [部位にポリ (dG)の尾n1;
を付ける。これらの雑種は形質転換能力のある大腸菌のD開部分に入れて形質転
換した後、寒天培地上でテトラサイクリン耐性のあるものを選別する。形質転換
物は、ニトロセルロース系のフィルター上でコロニー交雑法によりスクリーニン
グを行う(ハナハン、 D’、 (Ilanahan、 D、 )とメセルソン
2M(Meselson、M、 ) (1980)ジーン、川、63−67 ”
) 。交雑のプローブは、ニック(nick)翻訳によりラベルされたラットの
舌リパーゼのためのコード領域を含むDNA断片である(リグビー。
DNAの交雑による検出が可能である。
推定のヒトの舌リパーゼクローンの地図を制限エンドヌクレアーゼを使用して作
り、ラットの舌リパーゼについて説明したようにDN^配列を行う。ヒトの前駆
舌リパーゼ又はメチオニン舌リパーゼの完全な長さのcllNAクローンは、ラ
ットのにリパーゼについて説明したように、大腸菌、酵母又は動物細胞中に発現
される。発現されたし1−の舌リパーゼは、ラットの古リパーゼについて説明し
たように、組織培養している大腸菌、酵母又番1動物細胞に対して検出、検定、
特・1j4−の解明及び精製を行・)。
本発明は、上述した通り、純粋に実施例によって説明されており、また本発明の
範囲と趣旨内で部分的な変更をなし得ることが当然理解されるであろう。
FIG、 2
+y 弓
Q) H,>
「IGG
第1頁の続き
■Int、CI、4 識別記号
優先権主張 01983年9月5日■
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、リパーゼ欠乏症の治療において使用するための舌リパーゼタンパク質。 2、 舌のリパーゼタンパク質はヒトの舌リパーゼタンパク質である、請求の範 囲第1項記載の舌リパーゼタンパク質。 3、 舌リパーゼタンパク質はラットの舌リパーゼタンパク質である、請求の範 囲第1項記載の舌リパーゼタンパク質。 4、 メチオニン−舌リパーゼタンパク質のコードとなる遺伝子を含むヘクター で形質転換された宿主生物中でクンバク質を産生させることより成る、メチオニ ン−舌リパーゼクンバク質の生産方法。 5、 前駆体タンパク質のコードとなる遺伝子を含むヘククーで形質転換された 宿二F住物中で舌リパーゼ前駆体クンバク質を産生さゼた後、該前駆体タンパク 質を切断して舌リパーゼタンパク質を生成させろことより成る、ゼ:リノマーセ クン・パり質の生産方法。 6 舌リパーゼ前駆体タンパク質は前駆舌リパーゼタンパク質であり、宿主4i 物は該前駆舌リパーゼタンパク質を切1υ〒して古リパーゼタンパク質を生成さ せることができるものである、請求の範囲第5項記載のP1リパーゼタンパク質 の生産方法。 7、 宿主生物は組織培養している咄乳動物の細胞である、請求の範囲第6項記 載の西リパーゼタンパク質のクト産方法。 8、 古リパーゼ前駆体タンパク質は異種のタンノマク質と舌1ノノマーゼタン パク質より成るものである、請求の範囲第5項記載の古リパーゼタンパク質の生 産方法。 !]、iij駆西リバすセクンバク質。 10 メチオニン−古リバーセタンバク質。 比后リパーゼタンパク質と異種クンバク質より成る融合タンノマク漢。 12、少なくとも舌リパーゼタンパク質のアミノ酸配列より成るタンパク質のコ ートとなる遺伝子。 13、請求の範囲第1,2,3.9.10及び11項のうちのいずれか1項に基 づくタンパク質のコートとなる、請求の範囲第12項記載の遺伝子。 14、請求の範囲第12項又は第13項に基づく遺伝子を含むヘクター。 15、請求の範囲第14項に基づくヘクターで形質転換した宿主生物916、占 リパーゼタンパク質の抗原決定基に幻して特異性を持っている抗体。 17、舌リパーゼタンパク質と医薬基準に合った賦形剤より成る医薬構成物。 18、舌リパーゼタンパク質は、請求の範囲第4項又は第5項に係る生産方法に より生産された請求の範囲第2項又は第3頃の古リバーセタンバク質である、請 求の範囲第17項記載の医薬構成物。 19 単位投薬剤となっている請求の範囲第17項又は第18項記載の医薬構成 物。 20、液状となっている請求の範囲第17項又は第18項記載の医薬+1′4成 物。
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