JPS6034918A - ジフテリア毒素と免疫交さ性を有するタンパク質の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ジフテリア毒素と相互関係にあるりンパク質
をコート化しかつその染色体内にノンタンデムモードで
、組込まれたλつの変異ファージを他゛するコリイ・バ
クテリウム・ジフデリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　ｄｉｐｂｔｈｅｒｊａ、ｅ　）に属する微生物
を、秩イオン０，０５ないしθ、汐ｔ４／ｙｒｔｌを含
有する液状栄養培地中で、温度３０ないしｌｌｏ’ｃ、
中性培地雰囲気において、好気的条件下で培養すること
によってジフテリア毒素と相互関係にあるタンパク質を
・艮、皆する方法に係わる。

ジフテリア毒素はへ核細胞に対して著るしい肩Ｓ刈ミを
発４軍するタンパクＩ偕である。

このような毒素は一つのザブユニットでなる。

すなわち、１つは真核ｉｉ１　：ＩＦｔの膜上に存在す
る受容％　Ｈ，（結合しうるＢ−フラグメントであり、
他の１つは赴件であってかつ１１ｉｌ胞内にｆｔ人後、
タンパク合成を阻害するＡ−フラグメントである。

（Ｃ，Ｒａｔｔｌ、　Ｒ，Ｒａｐｐｕｏｌｘ、　Ｅ、Ｏ
，Ｇｉａｎｏｉ　「ヌクレイツク・アシッド・リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｂ　）ｊ　
／　／　、乙！８：ｇ９．Ａ３９３Ｃ／９ｇ３））、ｉ
−にコリネバクテリウム・ジフテリアエに感染するいく
つかの相関するバクテリオファーン（β。

乙ω）のＤＮＡ　に存在することが知られている（　Ｊ
、Ｊ、Ｃｏ５ｔａら［ジャーナル・オブ・）くクテリオ
ロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ、ｏｌ、）Ｊ　／　Ｑ−ｇ
　、　／　、２’ｌ　〜／　３０（／９ｇ／）、Ｖ、Ｆ
ｒｅｅｍａｎ　「ジャーナル砦オブΦノくクテリオロジ
ー」ｔ’／、ｔ’）３〜４ｇｇ（／ｑｓｉ））。

これらファージは細菌に感〆々したのち、　；ｉｌ＋１
閑を、容解させて死滅させるか、あるいは細菌の染色体
内に組込まれ、休眠状態を惟持し、　ａｔ菌が↑夏製さ
れる場合には同時に複製される。組込捷れたファージの
ＤＮＡ　は、染色体とともに１浪細胞に遺伝され、この
ようにして娘細胞はタンノ々りａ＋コート化遺伝子を含
有するようになる。

現在では、ジフテリア毒素はＰＷ８菌株を培養すること
によって製造されており、ホルマール毒化されたのち、
抗ジフテリアワクチンの製造に使用されている。

最近，　Ｕｃｈｉｄａ　らは、ニトロノグアニジノによ
る処理によって、ファージβの変異体を得ている（「ネ
ーチャー・ニュー・バイオロジー（、ＮａｔｕｒｅＮｅ
ｗ　Ｂｉｏｌ，　）　Ｊ　２３旦，ｇ−／／　（／９’
）３））。

コリネバクテリウム・ジフテリアエのバクテリア染色体
内に組込−まれる上記変異ファージは、ジフテリア毒素
と相互関係にあるタンパク質の合成をコード化し、毒素
の構造遺伝子に挿入された７寸たはそれ以上の変異体の
存在のだめ、構造および／捷たけ機能について界なった
ものとなる。

上記種類のタンパク質は、これらがジフテリア４素と免
疫交さ反応を生ずるため、［交さ反応物質（ｃＲＩＪ　
と称される。

分離されたいくつかの変異ファージの中でも、タンパク
′−Ｉ　Ｃ　Ｒ　Ｍ　／　７乙，ＣＨＭ　／９１，ＣＲ
Ｍ　：１．２ｇおよＩ′〆ＣＲＭ　ｌｌ−３　をコード
化するものについて、背に検討されている（　Ｕｃｌｉ
ｃｌａ　ら１ジヤーナル・オブ・Ｘ・バイオロジカル・
ケミストリー（ＪＢｊｏｌ．Ｃｈｅｍｊ　Ｊ　、２／ｇ
　、、３ｇ３ｇ−、７ｇ４９（　／タフ３ン〕。

貞らに詳述づーれＩば，　ＯＲＭＩＩ−＆は、ジフテリ
ア毒素のものの構造および・１ア“、弓部に似たフラグ
メントＡと真核細胞の表面上に存在する受容器にタンノ
ヨク・−を結合させうるセグメントに欠けるフラグメン
トＢとによって構成されるタンパク質でちる。

研究によれば、ＣＲＭ１５は、［イン・ビトロ」におい
て充分に活性なフラグメン）Ａを■するものではあるが
、４Ｉ胞内に１見透しないため、［イン・ビボ」活性を
全く有していないことが判明している。逆に、フラグメ
ントＢは、変化なく　、　ｒｌ＋胞の円部にフラグメン
）Ａ紮移動させるに必要な疎水性構造を有している。こ
れらの特徴、すなわちｌｆ３件フラグメンｌ−　Ａの存
在、フラグメン）Ａを細胞内ｇｆＢに移動させるために
要求される構造のフラグメン）Ｂ中における存在、およ
び糾・泡膜の受容器を、９識させる領域の不存在、７考
・痘して，　４イ８神毒素を形厄するために０　１１　
Ｍ　ＩＩ−、ｔを第１１用することが４・θＳ付された
。実際、抗体、単りローン注抗［本、ホルモン捷たは生
化学的に興味のある他の物質などＤ、ターゲット細胞の
如きいくつかの細胞の表面−にで特殊な分子を認熾しつ
る物質によって、欠乏づーるセグメントを置換えること
により、いくつかの；Ｆｉｌｌ胞のみを選択的に死滅さ
せうる准種毒素が得られている。このような雑種毒素は
修学分野、とりわけいくつかの腫瘍の治療に選択的に応
用される（７９ｇ３）　）。

ｃｐ、Ｍ／ｑｑｋｊ：、ジフテリア１素と同じ分子−債
を有し、かつこの毒素のものと機能および１１４造につ
いて一致するフラグメントＢと非計１牛であってかつア
ミノ酸７個のため元のフラグメントとはａなるフラグメ
ン）Ａとでなる。無１＋ｊでめるＣＲＭ／９７はジフテ
リア毒素とは免役学問に区別され、したがって、現在ワ
クチンの製造に使用されているジフテリア毒素の代用と
なる。実際、ホルマールによるＣＲＭ／？’７の配合処
理により、Ｇｕｉ　ｎｅａ　棟の啄用のジフテリア抗体
の４１１４足できる保・助レベルが肖られている（　Ｍ
、Ｐｏｒｒｏらｌ　Ｊ、Ｔｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ、　Ｊ／
ｌｌ−ス、Ｓ　（／ワｇｏ）　）。

しかしながら、覗、在までのところ、ジフテリア毒素と
相互関係にありかつＵ　ｃ　ｂ　ｉ　ｄ　ａ　ｊｆｃよ
り開示された方法によって優られる生成吻の開発につい
ては、このようなタンパク質の培養合成の収率が低いた
め、制約を受けている。

本発明の目的は、ジフテリア・け素と相互関係にあるタ
ンパク質をコード化しかつその令色体内にノンタンデム
モードで組込まれた一つの変異ファージを有するコリネ
バクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ　）に・・属するｈ
ａ生・Ｉ勿ヲ、鉄イオン０．０左ないしｏ　、　ｓ　ｔ
ｔ＆−／ｍｅを含有する敵伏栄女培地中で、ｒａ　ＩＦ
”　３０ないし１ｌ−０°Ｃ１中注培養４囲気において
、好気的条件下で培養することによってジフテリア毒素
と・：１」ｑ関係にあるタンパク質を製〕責する方法と
提供することにある。

さらに詳・ホすれ（ば、本発明の目的ｄ：、染色体内に
ノンタンデムモードで組込まれたλつのβＬ／Ｓ変醍フ
ァ下ジをもつｃ、（β／Ｉり）１ｖ１８１Ｍ４未およ０
１染色体内にノンタンデムモードで、１１」込まれたλ
つのβ／９７フアージをもつｃ、（β／９７）Ｍ、菌株
を培養することにより、それぞれ、収率ＳＯないしλ０
ＯＬｆ／１／ＬｅでＣＲＭ’ｌ左をおよび収率３０ない
しＡ（ｎ−ｒ／、、１でＯＲＭ／１７金製造できる方法
を提供することにある。

本発明は、本質的には、コリネバクテリウム・ジフテリ
アエＣ，（ＡＴＯＯ−乏７０１０）菌株が染色体内に、
ファージＤＮＡ　が組込まれつる一つの付層部位（ａｔ
ｔｓ）を有しているとのかなり党くべき事実の発見に基
いている。

Ｃａｍｐｂｅｌｌ　氏％　（Ｅｐｉｔｏｍｅｓ　Ａｄｖ
、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｊが、その方法は特定部位ａｔ
ｔＰ　における環状ファージＤＮＡ　の開裂および、ｉ
＋ＩＩｌ菌染色体の同等の％　５ｌ部位ａｔｔＢ　Ｃ付
滑７５ｆ’ｓ位と呼ばれる）ての一体化である。現在捷
でのところ、公知のいずれの配置においても、７つのａ
ｔｔＰ　部位および７つのａｔｔＢ部位が一致していた
。

これに７寸し、コリネバクテリウム・ジフテリアエＣ，
（ＡＴＣＣ，ｉ７０／θ）菌株は、その染色体内に、ａ
つの付層部位ａｔｔＢ、およびａｔｔＢ２を有し、ここ
でファージＤＮＡ　が組込まれる。ＴＹＥ　培地（若ン
デム）、および一つのファージがその１つかれることが
新たに確認された（（７８図参照）。

本発明によれば、ＣＹ　培地」−で育種することにより
、コリネバクテリウム・ジフテリアエＣ（ＡＴＯｏ　、
２’）０１０）に、−ジフテリア僅素とイ目尾関係にあ
るタンパク質をコード化する変異ファージを感染させる
。温度３汐°Ｃで／１ｇ時１１４１育伸したのち、ファ
ージの溶菌プレートが９７ｆされ、これ体内で組込まれ
ている。ついで、菌株を無菌伏暢で取出し、ＣＹ　培地
で育種して個体コロニーを単るため［ファージ・リリー
ス・アッセイＪ　（Ｍｉ　１ｌｅｒら［ビｏｐギー（Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ　）　Ｊ　、！９．／１１０−＜ｘｉｓ
素と相互関係にあるタンノ；り質のだめのコード化：青
伝子λ個を有するため、これらはこのタンノくり質をユ
倍量舒成できるとの事実に基いて行なわれる。

それぞれジフテリア抗１ｊ素血７’ｌ”、”ｉ　乙、ｇ
または／；ｚ　ｕ　／ＴＬｌ　と含有するＴＹ！！：　
培地を使用しよって生成されたタンパクーノｆ　（、Ｊ
：　ｌ刈池中に存在する抗体から沈殿され量輪（ｈａｌ
ｏ）　ｆ：形成する。そのサイズは個体コロニーによっ
て生成されたＣＲＭ杭体９　＃、　３　Ｕ　／ｒｎｅの
グレートでは、すべての櫨ニーが同一の骨輪を形成する
。抗体を中位の１第ａ図は抗体Ａ　Ｕ／ｌｄ　を含有す
るＴＹＥ　プレー次に、常法に従って染色体ＤＮＡ　の
硝−・樅により込まれた一つのファージを含（−１する
ものであることを証明する。

第１Ｂ図では、部位ＡおよびＢにおいて制御″ａ酵素に
よりファージＤＮＡ　を切ケすれば７個のＡＢフラグメ
ントが得られるが、仮に同じ酵素をモノグメントＡおよ
びＢ（これらはいずれも細菌染色については３つのフラ
グメントが得られるはずであることがわかる。事実、第
３図に示すヌロく、３２ＰでラベルしたａｔｔＰ　部位
を含有するβＢａｍ　ＩＩフラグメントを指標として使
用してＳ　ｏ　ｕ　ｔ　ｂ　ｅ　ｒ　ｎｂｌｏ　ｔ　の
方法（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ８Ｍｏｌ、＋３：ｉｏｌ、）　Ｊ　９　ｇ　、　５
０３−、’ｒ／？。

＜／ｑｑｓ））に従って行なった分析では、第１８図の
分析に基いて予想したものとバンドの・奴および位置の
両方で一致した。

薗 Ｋ（Ｄ）は３つのバンドを与え、そのうちの７つはファ
ージのものとともに移動している。

もの）から個体コロニーを取出し、ＣＹ　培地上で育種
し、電輪法により／捷たけλつのファージの存在を確認
することによりチェックした。分析で本発明に従って、
ｃ、ｔｆｆｇ株にＯＲＭ　ｌｌ−３タンパク質をコード
化するβｔｔ！ｉ　変異ファー／あるい・け会畔ノでり
る。

このうち菌株ｃ、（β’ｌ　３　）　Ｍ、およびｃ、（
β／９））Ｍ。

は、吾託機関でちるアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション・アクセツノヨンＫＷＮしてあり、寄託番
号はそれぞれＡＴＣＣ−３９３，２Ａおよ鉄イオンＯ，
Ｏ、！ｉないしｏ、ｓ１１’ｊ／ｍｌ、好ましくはθ、
／μｆｔ　／７ｒＬｅを含有する液吠栄必培地中で、温
度３０ないしｒｔｏ″Ｃ１好址しく　Ｉｒｌ　３　Ｓな
いし３ブＣ，ＴＩＨ中注において、培地中に多層のタン
パク質が生成されるに必要な時間育成することによって
行なう［、ＲＭ／Ｉ５およびＣＲｌｖｌ　／　９７の生
成について試・倹した。つづいて、タンパク４を回収し
、当分野で公知の常法によＩ）清書した。

上記方法で使用される培ノルについて１説明する。

１ｇ、２０３〜．２Ｑ９（／９７７））に若干の変りを
力［］え、以下の組成とした。

ト　リ　ン゛　ト　−　ス　／　θ　ノ・酵母エキス　
、Ｓ−４％ ＮａＣ４３ｙ・ Ｋ１−１２ＰＯ４３ゾ〜 水　／　ｅ ｐ［（を９．／Ｉに６周、祭し、高温滅菌する前にＣａ
Ｃ／。

（ＳＯ％）λｔｎｌを添加する。沈殿物を浄Ｉ樅させた
のち、溶液ＩＩ　、２１ｌｌｌ’／　１３　＊溶液ｍ　
／　ｎｔｅ　／　ｇおよびｎｏｏｌ、ｅ　ａｇａｒ　−
ａｇａｒ　／　２１１ｔｅ　／　ｅを添加する。ｉ＆　
（＋に、馬面液種ジフテリア血清を、期待される丹輸に
応じて弐度ｑ、乙、ｇまたば／；ｚ　ｕ　／？ｔｌｅ！
　で添カロする。。

リグドア　７７５　ｍｌ、Ｋ１−１２ＰＯ４！ｉゾ・お
よび水／／ｌｌ！てなる徹（ｐＨ２，＜ｚ）を沸ノ騰さ
せ、Ｓ　Ｓ時Ｗｈａ　ｔｍａ　ｒｌフィルタ上で１ｗ過
する。溶液■Ω１７Ｉｌ！　、溶液ｉ１１　／　ｍｅを
添加し、ついで反応混合物をオートクレーブに導入する
。１更用前にマルトース−ＧｉａＣｆｆ１２の溶液を培
地１０ｏｍｌ当り３プの量で添加する。

溶液■ Ｉす、ｓ　Ｏ４”　７　Ｈ２０２２−５Ｗ〜、アラ＝７
／／３ｆｌｌｑ、ニコチン酸／／ｊｔを用意し、ついで
これら成分を溶アククさせるため水７ｍｌおよびｒｌＢ
４月０１全０１し、その後、ピメリンｆｌｉ　７．３　
ｍｌ、ＣｕＳＯ４伺」２０　（／％）Ｓ１１１ｇ、１％
Ｚｎ５Ｏ，ｅ　ｓ　Ｏ２０ｑ　ｍｌ！、／　％　ＭｎＣ
’２・ダ１］２０／、５ｒｎ１３および濃ＨｃＪ！　３
　ｍｌを加え、Ｍ　ｒｌｋに水を１ＪＯえて全゛喰／　
００　ｎｌｅとする。

溶液■ ｒ、−ンスチン、２ｏｙ−，４ＨｃＪ１．２ｏｍｅに水
を７Ｊ口、ｌｉ−て全量／　００７Ｉｌｌｉとする。

マルト−ス−ｃａｃＪ２市液 マルトースｓｏ＋Ｊ−１５０４ＣａＣ’２２　ｍｌ　Ｉ
　Ｋ８２Ｐ０４／７に水を加えて全量／　００　ｗｅと
すル。ｐＨ全７．／ｌＫ調整し、溶ｇｌｆ７　Ｖ＋’ｈ
ａ　ｔｌｌｌａｎ”ｌ　０１シ紙上ｆｉｔ３過り。

その後１．〉容液をオートクレーブに入゛比る。

次に図面について説明する。

Ｃａｍｐｂｅ１１氏法による棲寺工程 ファージＤＮＡ　を特殊な部位ａｔｔＰ　で切断し、細
菌染色体における同等の特殊部位ａｔｔＢ　で一体化さ
せる。

第ｌＢ図： ファー・ンＤＮＡ　を伺Ｎ　ｔｆＢ　ｆｆｆ　ａ　ｔも
Ｐ　で切断し１，４］ｊを生ずる。

第２図： 抗ジフテリア血ｌ肖Ａ　Ｕ　／Ｉｕｌを宵有するＴＹ１
４；　培地でなるグレート Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆ　ＢａｍＨ，で消化し、アガロースゲル
（／、３％）上でフラグメントを分帰し、ニトロセルロ
ースに移入させ、そのｉＬ　”ＰてラベルしたａｔｔＰ
部位を含有するβＢａｍ　’ｌフラグメントと交雑させ
る。８Ｂａｍ／ｌフラグメントは第７Ｂ図のフラグフラ
グメントが見られる。

イン←１．直株Ｃ，（β／９７）Ｍ、による１易合に係
わる。なお、記号−で示す曲尿は培地の光学密度の変化
を表わす。

以下の実を准ｓすは本発明を説明するだめのものであっ
て、本発明を限定するものて１はない。

夷悔例／ それぞれｃｙｔ音１也／θｍｌを収容するフラスコ（谷
：ｉ′ｔ／　−２３ｄ　）を用意し、７２０°Ｃて／３
−分１１１１すなわちｃ、（β／９７）ｒ、ｉ５．ｃパ
β／９７）Ｍ８　およびＣ，（β／　９７　）　Ｍ　Ｔ
　を白争耳／を薗に相当する：萩で接伸した。このよう
に啜・小したフラスコを３ｊ−’Ｃて／政培ρした。

各々の培地０　、　／　７を、そｉｚそれ脱鉄化したｔ
２ｙ培地／　Ｏ１ｌｌｅを収容するエルレンマイヤーフ
ラスコ（各Ａ４　／　２３　Ｈ１！　）に接１重し、Ｆ
ｅＡ−＋　θ、　／　ｔｔ９／ｍｄ　？添力ｎし、回’
ＥＣｊ’￥ｊ拌機上、−２’ｌ　Ｏｒｐｍ、　、’！　
５　時間、温度Ｊ５’Ｃで培養を行なった。

、２特出］−苺にザンブル；山出し、それぞれについて
、光学密度および上厳液に放出されたＣ）（Ｍ／９７の
含量を測定した。光学ｄ度については、Ｐｅｒｋ＋穐−
１：１ｍｅｒ　Ｍｏｄ　、　３　！；　分光光ｇ＝ｔ＜
光路／　ｎｒ・）　ｆ使用し、！ｉ９０　ｎｍ　で測定
を行ない、ＣＲＭ／９７の含量については、ロケット免
疫電気泳動法（Ｍｕｒｆｙら「ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・ミクロバイオロジー（Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、　）　Ｊ　７　、９／−９１ｓ（／９’）
ｇ））および／４た・けフロキュレーション法（０，Ｒ
ａｍｏｎ　「Ｃ，Ｒ，Ｓｏｃ、Ｂｉｏｌ、　Ｊ　ｇ　１
．　、乙乙／−乙７／（／ハ―））により測定した。な
お、フロキュレーションの単位を、０．１（ａｍｏｎが
１Ｍ記［ｃ。

Ｒ，Ｓｏｃ、Ｂｉｏｌ−（パリ）」に報告している如く
ｂｒ／１ｒｒ１３で示した。舛られた結果を第９図に図
示した。このグラフから吃られるように、ＣＦｔＭ／９
７の生成は、培地の光学密度かズ１戚増メ直期に相当す
るグ、りないし５（０，ＤＪに達する前には、開始され
ない。この対数期の終末期になるにつれて、ＯＲＭ／９
７の生成が始まり、定當期の開始まで続き（約、２０時
１ｆ＃］　）、この時点で１宥大光学密度およびＣＲＭ
／９７の最大量が観察される。育成２ヶ時減少は７Ｓ係
である。

実施例ス 実姉列／と同じ方法によって、Ｃ７（β／ｌ汐）　ｉＪ
、、Ｃ７（、βｉｉ−ｓ　）　”１＋　およびｃ、（β
４’４−）Ｍ８を調製した。

各培地０．／ｍｅを、それぞれ脱快化したＣＹ　培地／
　Ｏｌｕｌを収容するフラスコ（容積７２３ｍ１）に接
種し、Ｆｅ″＋ｏ、／１４−／ｐｔｌを添加した。谷フ
ラスコを回転撹１ｑ’　夜（２４’　Ｏｒｐｍ　）上、
３５°Ｃで３乙時間培凄じた。発酵開始から２０時間後
および３０時間後に取出したサンプルについて、光学・
ｄ度および上心、４１反中に放出されたＣＲＭＱ−３の
生成昂、を測定するために、実姉列／と同じ方法で分１
パした。

得られた結果を次表に示す。

Ｃ，（β１ｌ−５）、　Ｍ　ａ　ｌｌ、５　９−７　／
乙　３／、ｓＣ，（βり左）Ｍｌｌ　り、、５−　９．
ざ　」」　ゲ２ｅ、（β／Ｉ−ｌ−５）’％、７　１０
　／７−０　７０わかる。

（子にして調製し、この予培秦′吻−！７１１を、それ
ぞれ脱鉄化したＣＹ　培地３００　ｒｕｇを収容した２
つのエルレノマイヤーフラスコ（容積−０θｏ　１ｌｔ
ｌ　）　Ｋ　移植し、Ｆｅ＋＋０．／μＷ□／ｉ／！ｆ
添加し、攪拌（コク。ｒｐＨｌＪト形ファーメソファ−
メンタたＦｅ″−イオン：：贋＋ｙ０、／μＰ／ｒｕｌ
のＣＹ　培地りθ存に接種し、４度３７°Ｃにおいて、
底部から頂部に向って７５６７分で通気し、乙００ｒｐ
ｍでｔＸ、！ｌ拌しかつ培地の１）１４　を逮θ多グル
コース＠ｇｌまたはり規定Ｎ　ａ　ＯＨで乙、汐／よい
し７．！ｉに維持しながらｉｔｏ時間培讐を行なった。

発酵３０時間後のＣＲＭ４４５の−ｑｒｔｄ２ｏＯ’、
ｆ／ｙｒｉｌｉであった。川られたブロス培地をｊ東悦
流動・屯心汁離イ幾で遠心分離し、上澄液に硫１波アン
モニウムを飽和Ｊｆｆ７３φて添加することによりタン
パク質を沈殿させ、回収した。碍られたスラリを遠心分
２１１ｔ　ｌ、、沈殻物命ｐ［（７，、’ｆｆのりン設
塩緩伸工液で洗浄後、イオン交１灸樹脂（ジメチルアン
モニウムメチルセルロース）を光」Ａしだカラムを介し
て［６裂した。塩化ナトリウム溶可（剤で縮量すること
により、ｊメギｇ。

係でタンパク質が得られた。

【図面の簡単な説明】

力投化 第１八図はＯａｍｐｂｅｌｌ　代演による≠→工程を、
悦第λ図は抗ジフテリア血清を含■するＴＹＥ　培地を
示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ／　ジフテリア毒素と相互関係にあるタンパク質の製法
   において、ジフテリア毒素と相互関係にあるタンパク質
   をコード化しかつ物色体の一つの伺層部位においてノン
   タンデムモードで組込まれたλつの変異ファージを有す
   るコリネバクテリウム・ジフテリアエ（ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｉ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｔ
   ａｅ）に属する微勺三ζ勿を、鉄イオンｏ、ｏｓないし
   ｏ　、ｓ　ｔｔ’ｉ／ｎｔｅを含有する液仄栄、臂培池
   中で、温度３ｏないしり０°Ｃ，ｐＨ中性において、好
   気的条件下で培養することを特徴とする、ジフテリア毒
   素と相互関係にあるタンパク′？！ｆの・製法。 ユ　ジフテリア毒素と相互関係にあるタンパク質が０８
   Ｍ４’、！ｉ　タンパク環である特許請求の範囲ｌ耶／
   項記載の書法。 ３　前記微生物が、染色体ビ］にノンタンデムモードで
   組込寸れたユつのβヶ５　変異ファージる特許請求の範
   囲第ａ項記載の製法。 ｔａジフテリア毒素と相互１瑚係にあるタンパク′偕が
   ＣＲＭ’／ワフ　タンパク１色である特、午を青水の笥
   囲第１項記載の・製法。 ５　＠ｊｌ　６己イ：′！ｉ生Ｉ吻が、染色１本内にノ
   ンタンデムモードで姐込才れた２つのβ／ｑ７　変異フ
   ァージを有するＣ７（β／　ｑ７）　Ｍ　＋　Ａ　ＴＣ
   ＣＪ　９−２　Ｊ　５である特許請求の範囲第ｑ頃記或
   の製法。 乙　前記微生物の分離を、抗ジフテリア面清ダないし７
   ２　Ｕ／ｒａｌを含有する固仄栄養培地を使用して行な
   うｔＰｆ許諸求の・ｒｉｊχ四第１項第１項記載。 ７　前記液犬栄女培池中の汐くイオンのｉｌ典ルーが０
   、／μ於／２７１ｅである特許請求の範囲；ニジ／項記
   載の製法。