CN113755380A - 一种发酵生产白喉毒素crm197蛋白的菌种培养基、配制方法以及菌种复苏培养方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物工程领域，更具体地说，它涉及一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养基、配制方法以及菌种复苏培养方法；一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养基，由溶液A、溶液B、溶液C和溶液D制成；菌种培养基的配制方法为：S1、配制溶液；S1.1、配制溶液A；S1.2、配制溶液B；S1.3、配制溶液C；S1.4、配制溶液D；S2、溶液混合。菌种复苏培养方法，包括以下步骤：步骤一、复溶菌种；步骤二、一代固体培养；步骤三、二代固体培养；步骤四、菌液收集。本申请可构建具有较高活性的CRM197主种子库或工作种子库。
Description
技术领域
本申请涉及生物工程领域，更具体地说，它涉及一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基、配制方法以及菌种复苏培养方法。
背景技术
CRM197为白喉毒素的无毒形式，但其在免疫上与白喉毒素没有区别。CRM197由不产毒噬菌体β197tox感染的白喉棒杆菌产生，而β197tox是通过对产毒棒状噬菌体进行亚硝基胍诱突创造的(Uchida等Nature New Biology(1971)233；8-11)。CRM197蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但其结构基因不同，其中有单碱基变化。这导致52位的氨基酸从甘氨酸变为谷胺酰胺，使A片段不能结合NAD，因此无毒(Pappenheimer 1977，AnnRev，Biochem.46；69-94，RappuoliApplied and Environmental Microbiology Sept 1983p560-564)。由于没有毒性的 CRM197蛋白仍然可与敏感细胞的受体结合，即CRM197蛋白在丧失酶活性及毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性，因此是一种理想的多糖结合疫苗载体蛋白。
然而，无论是天然的CRM197菌种还是重组构建的CRM197工程菌，在实际的菌种发酵过程中，培养基和培养方式是制约其高量产的重要一环。因此，研发出一种恰当的培养基和培养方式，构建具有较高活性的CRM197主种子库或工作种子库是亟需所要解决的问题。
发明内容
为了获得高表达量的发酵菌液，构建具有较高活性的CRM197主种子库或工作种子库，本申请提供一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基、配制方法以及菌种复苏培养方法。
第一方面，本申请提供一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基，采用如下的技术方案：
一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基，由包括体积比为(1000)：(2-6)：(1-5)：(24-42)的溶液A、溶液B、溶液C和溶液D制成；
每1000mL所述溶液A由包括以下原料制成：酵母提取物20-32g、酪蛋白氨基酸7-13g、L- 色氨酸47-58mg、磷酸二氢钾3-8g、氯化钙1-2g；
每100mL所述溶液B由包括以下原料制成：七水硫酸镁20-24g、β-丙氨酸110-130mg、烟酸107-120mg、庚二酸6.5-10.5mg、五水硫酸铜0.3-1g、五水硫酸锌0.1-0.6g、四水硫酸锰 55-90mg、盐酸2-4mL；
每100mL所述溶液C由包括以下原料制成：L-胱氨酸15-23g、盐酸11-24ml；
每100mL所述溶液D由包括以下原料制成：麦芽糖30-55g、氯化钙0.5-2g。
通过采用上述技术方案，首先，本申请菌种培养基的配方中，除酵母提取物和酪蛋白氨基酸外，其余均为国产试剂，大大降低生产成本。
其次，通过本申请菌种培养基的配方，使CRM197菌种得以大规模扩增而获得高表达量的发酵菌液，从而构建具有较高活性的CRM197主种子库或工作种子库。
优选的，培养基由包括体积比为(1000)：(2)：(1)：(30)的溶液A、溶液B、溶液 C和溶液D制成。
优选的，每1000mL所述溶液A由包括以下原料制成：酵母提取物20g、酪蛋白氨基酸10g、L-色氨酸50mg、磷酸二氢钾5g、氯化钙1g；
每100mL所述溶液B由包括以下原料制成：七水硫酸镁22.5g、β-丙氨酸115mg、烟酸115mg、庚二酸7.5mg、五水硫酸铜0.5g、五水硫酸锌0.2g、四水硫酸锰75mg、盐酸3mL；每100mL所述溶液C由包括以下原料制成：L-胱氨酸20g、盐酸20ml；
每100mL所述溶液D由包括以下原料制成：麦芽糖50g、氯化钙0.5g。
优选的，所述溶液A、溶液B、溶液C、溶液D均采用50℃-60℃的注射用水加以配制。
注射用水为经过灭菌后的双蒸水，有效减少培养基被杂菌感染的风险；另外，50℃-60℃的注射用水一方面能够有效促进各组分的快速溶解，另一方面保证了各组分的有效性，以此使其处于一个平衡状态，因此将其作为优选。
第二方面，本申请提供一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基的配制方法，采用如下的技术方案：
一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基的配制方法的制备方法，包括以下步骤：
S1、配制溶液
S1.1、配制溶液A
将酵母提取物、酪蛋白氨基酸、L-色氨酸、磷酸二氢钾、氯化钙用注射用水进行充分混合溶解，再定容至1000ml，得到溶液A。
S1.2、配制溶液B
将七水硫酸镁、β-丙氨酸、烟酸、庚二酸、五水硫酸铜、五水硫酸锌、四水硫酸锰、盐酸用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，得到溶液B；
S1.3、配制溶液C
将L-胱氨酸、盐酸用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，得到溶液C；
S1.4、配制溶液D
将麦芽糖、氯化钙用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，得到溶液D；
S2、溶液混合
按比例在溶液A中加入溶液B和溶液C，灭菌；冷却后，加入溶液D，然后加入琼脂粉，灭菌分装即可得到菌种培养基。
优选的，S1.1、配制溶液A中，将酵母提取物、酪蛋白氨基酸、L-色氨酸、磷酸二氢钾、氯化钙用注射用水进行充分混合溶解，调节pH至7.4±0.2，再定容至1000ml，得到溶液A。
优选的，S1.1、配制溶液A，将酵母提取物、酪蛋白氨基酸、L-色氨酸、磷酸二氢钾、氯化钙用注射用水进行充分混合溶解，调节pH至7.4±0.2，再定容至1000ml，采用0.45um滤膜进行澄清过滤，得到溶液A。
第三方面，本申请提供一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种复苏培养方法，采用如下的技术方案：
一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种复苏培养方法，包括以下步骤：
步骤一、复溶菌种
开启一支发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种，反复吹打直至完全溶解，得到复溶菌液；
步骤二、一代固体培养
将复溶菌液接种于上述培养基，作为一代固体培养基，置于培养箱中28-38℃，培养4-24h；
步骤三、二代固体培养
用菌种杆刮去一代固体培养基表面的菌落，涂布于权利要求1-5任一项所述的培养基，作为二代固体培养，置于培养箱中28-38℃，培养4-24h；
步骤四、菌液收集
刮洗二代固体培养基表面菌落，然后吸取菌液转移至无菌瓶中，得到菌液。
优选的，步骤一，溶解原始菌种的溶液为溶液E，溶液E的制备方法为：将酵母提取物0-100g使用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml。
优选的，步骤四，采用溶液F刮洗二代固体培养基表面菌落，然后吸取菌液转移至无菌瓶中，得到菌液；溶液F的制备方法为：将海藻糖5-50g使用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，后经0.22um滤膜除菌过滤即可。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、构建具有较高活性的CRM197主种子库或工作种子库；
2、传代培养基相关试剂除酵母提取物和酪蛋白氨基酸皆为国产，成本低廉；
3、快速、便捷、高效的发酵培养扩增模式。
具体实施方式
菌种来源：菌种购买自美国典型培养物保藏中心，菌株编号为ATCC39255或ATCC39526 或ATCC11049或ATCC51926或ATCC51280。
每1000mL溶液A由包括以下原料制成，具体见表1。
表1溶液A配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 实施例1 |
| 酵母提取物 | OXOID | 20g |
| 酪蛋白氨基酸 | OXOID | 10g |
| L-色氨酸 | 国药 | 50mg |
| 磷酸二氢钾 | 国药 | 5g |
| 氯化钙 | 国药 | 1g |
每100mL溶液B由包括以下原料制成,具体见表2。
表2溶液B配方表
| 试剂 | 厂家 | 实施例1 |
| 七水硫酸镁 | 国药 | 22.5g |
| β-丙氨酸 | 国药 | 115mg |
| 烟酸 | 国药 | 115mg |
| 庚二酸 | 国药 | 7.5mg |
| 五水硫酸铜 | 国药 | 0.5g |
| 五水硫酸锌 | 国药 | 0.2g |
| 四水硫酸锰 | 国药 | 75mg |
| 盐酸 | 国药 | 3mL |
每100mL溶液C由包括以下原料制成,具体见表3。
表3溶液C配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 实施例1 |
| L-胱氨酸 | 国药 | 20g |
| 盐酸 | 国药 | 20ml |
每100mL溶液D由包括以下原料制成,具体见表4。
表4溶液D配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 实施例1 |
| 麦芽糖 | 国药 | 50g |
| 氯化钙 | 国药 | 0.5g |
每100mL溶液E由包括以下原料制成,具体见表5。
表5溶液E配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 实施例1 |
| 酵母提取物 | OXOID | 10g |
每100mL溶液F由包括以下原料制成,具体见表6。
表6溶液F配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 实施例1 |
| 海藻糖 | OXOID | 15g |
实施例
实施例1
一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基的配制方法，包括以下步骤：
S1、配制溶液
S1.1、配制溶液A
按配方将酵母提取物、酪蛋白氨基酸、L-色氨酸、磷酸二氢钾、氯化钙用注射用水进行充分混合溶解，再定容至1000ml，得到溶液A。
S1.2、配制溶液B
按配方将七水硫酸镁、β-丙氨酸、烟酸、庚二酸、五水硫酸铜、五水硫酸锌、四水硫酸锰、盐酸使用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，得到溶液B；
S1.3、配制溶液C
按配方将L-胱氨酸、盐酸使用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，得到溶液C；
S1.4、配制溶液D
按配方将麦芽糖、氯化钙使用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，得到溶液D；
S2、溶液混合
向1000ml溶液A中加入2ml溶液B和1ml溶液C，灭菌；冷却后，加入30ml溶液D，即，溶液A、溶液B、溶液C、溶液D的体积比为1000：2:1:30，然后按1wt％的比例加入琼脂粉，采用115℃灭菌10min，待冷却至温度50-60℃时，以100ml/瓶分装入无菌克氏瓶中，平铺待彻底凝固后，储存于2-8℃冰箱中待用。
一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种复苏培养方法，包括以下步骤：
步骤一、复溶菌种
开启一支发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种，加入1ml溶液E，反复吹打直至完全溶解，得到复溶菌液；溶液E的制备方法为：将酵母提取物10g使用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml；
步骤二、一代固体培养
将复溶菌液接种于上述培养基，作为一代固体培养基，置于培养箱中28-38℃，培养4-24h；
步骤三、二代固体培养
用菌种杆刮去一代固体培养基表面的菌落，涂布于上述培养基，作为二代固体培养，置于培养箱中28-38℃，培养8-12h；
步骤四、菌液收集
采用20ml溶液F刮洗二代固体培养基表面菌落，然后吸取菌液转移至无菌瓶中，得到菌液；
溶液F的制备方法为：将海藻糖15.0g使用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，后经0.22um滤膜除菌过滤即可。
实施例2
与实施例1的区别在于，溶液A、溶液B、溶液C、溶液D的体积比为1000：4：3：24。
实施例3
与实施例1的区别在于，溶液A、溶液B、溶液C、溶液D的体积比为1000：6：5：42。
实施例4-5
与实施例1的区别在于，溶液A的配方不同，具体见表7。
表7溶液A配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 实施例1 | 实施例4 | 实施例5 |
| 酵母提取物 | OXOID | 20g | 32g | 28g |
| 酪蛋白氨基酸 | OXOID | 10g | 7g | 13g |
| L-色氨酸 | 国药 | 50mg | 47mg | 58mg |
| 磷酸二氢钾 | 国药 | 5g | 8g | 3g |
| 氯化钙 | 国药 | 1g | 2g | 1g |
实施例6-7
与实施例1的区别在于，溶液B的配方不同。具体见表8。
表8溶液B的配方表
| 试剂 | 厂家 | 实施例1 | 实施例6 | 实施例7 |
| 七水硫酸镁 | 国药 | 22.5g | 20g | 24g |
| β-丙氨酸 | 国药 | 115mg | 130mg | 110mg |
| 烟酸 | 国药 | 115mg | 107mg | 120mg |
| 庚二酸 | 国药 | 7.5mg | 6.5mg | 10.5mg |
| 五水硫酸铜 | 国药 | 0.3g | 0.5g | 1g |
| 五水硫酸锌 | 国药 | 0.2g | 0.1g | 0.6g |
| 四水硫酸锰 | 国药 | 55mg | 75mg | 90mg |
| 盐酸 | 国药 | 3mL | 2mL | 4mL |
实施例8-9
与实施例1的区别在于，溶液C的配方不同。具体见表9。
表9溶液C的配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 实施例1 | 实施例8 | 实施例9 |
| L-胱氨酸 | 国药 | 20g | 23g | 15g |
| 盐酸 | 国药 | 11ml | 20ml | 24ml |
实施例10-11
与实施例1的区别在于，溶液D的配方不同。具体见表10。
表10溶液D的配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 实施例1 | 实施例10 | 实施例11 |
| 麦芽糖 | 国药 | 50g | 30g | 55g |
| 氯化钙 | 国药 | 0.5g | 2ml | 1ml |
实施例12-13
与实施例1的区别在于，溶液E的配方不同。具体见表10。
表11溶液E的配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 实施例1 | 实施例10 | 实施例11 |
| 酵母提取物 | OXOID | 10g | 0g | 100g |
实施例14-15
与实施例1的区别在于，溶液F的配方不同。具体见表10。
表12溶液F的配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 实施例1 | 实施例14 | 实施例15 |
| 海藻糖 | 国药 | 15g | 5g | 50g |
对比例
对比例1
与实施例1的区别在于，菌种培养基中不包括溶液C。
对比例2
与实施例1的区别在于，菌种培养基中不包括溶液D。
性能检测试验
一、种子菌液活性测试
参照2015版《中国药典》中记载的活菌计数法对实施例1-15和对比例1-2进行菌液活性测试，记录菌液细菌浓度cfu/ml，检测结果见表13。
表13种子菌液活性检测结果表
二、冻干测试
取实施例3获得的菌液依次稀释至1.0×105、5.0×105、1.0×106、5.0×106、1.0×107、 5.0×107、1.0×108、5.0×108、1.0×109、5.0×109；
取对比例1获得的菌液依次稀释至1.0×105、5.0×105、1.0×106、5.0×106、1.0×107、5.0 ×107；
取对比例2获得的菌液依次稀释至1.0×105、5.0×105、1.0×106、5.0×106、1.0×107、5.0 ×107。
将上述稀释后的菌液冻干后形成CRM197主种子库或工作种子库并检验冻干后细菌浓度(cfu/ml)；冻干存活率(％)；种子库复苏1h浓度(cfu/ml)；种子库复苏2h浓度(cfu/ml)；种子库复苏4h浓度(cfu/ml)；种子库复苏4h对数增长率，上述细菌浓度测试均参照2015 版《中国药典》中记载的活菌计数法。
菌液的冻干方法包括以下步骤：
S1、预冻
将含有冻干保护剂的菌液按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘中，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-40℃，预冻温度-40℃，常压下维持10h。
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度20pa，升温速率2℃/min，升温至-30℃，并维持10h。
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度10pa，升温速率0.2℃/min，升温至0℃，并维持5h。
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度10pa，升温速率2℃/min，升温至28℃，并维持8h，制得CRM197菌种冻干粉。
表12实施例3稀释菌液的检测结果表
表13对比例1稀释菌液的检测结果表
表14对比例2稀释菌液的检测结果表
由实施例1-15和对比例1-2可得，采用本申请的菌种培养基可大大提升CRM197菌液浓度。
从冻干后菌种存活率来看，控制在细菌浓度1×106cfu/ml-5×109cfu/ml之间进行冻干，细菌存活率水平皆大于52％，是较适宜的冻干前菌液浓度范围。
从种子库复苏4h的生长水平来看，若以比生长速率增长大于0.2来评价的话，控制细菌浓度在1×106cfu/ml～1×109cfu/ml之间进行冻干，冻干后的种子库复苏水平较理想。
若以比生长速率增长大于0.3来评价的话，控制细菌浓度在5×106cfu/ml～1×108cfu/ml之间进行冻干，冻干后的种子库复苏水平最为理想。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基，其特征在于，由包括体积比为（1000）：（2-6）：（1-5）：（24-42）的溶液A、溶液B、溶液C和溶液D制成；
每1000mL所述溶液A由包括以下原料制成：酵母提取物 20-32g、酪蛋白氨基酸 7-13g、L-色氨酸 47-58mg、磷酸二氢钾3-8g、氯化钙1-2g；
每100mL所述溶液B由包括以下原料制成：七水硫酸镁 20-24g、β-丙氨酸110-130mg、烟酸107-120mg、庚二酸6.5-10.5mg、五水硫酸铜0.3-1g、五水硫酸锌0.1-0.6g、四水硫酸锰55-90mg、盐酸 2-4mL；
每100mL所述溶液C由包括以下原料制成：L-胱氨酸 15-23g、盐酸 11-24ml；
每100mL所述溶液D由包括以下原料制成：麦芽糖30-55g、氯化钙0.5-2g。
2.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基，其特征在于，由包括体积比为（1000）：（2）：（1）：（30）的溶液A、溶液B、溶液C和溶液D制成。
3.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基，其特征在于，每1000mL所述溶液A由包括以下原料制成：酵母提取物 20g、酪蛋白氨基酸 10g、L-色氨酸50mg、磷酸二氢钾 5g、氯化钙 1g；
每100mL所述溶液B由包括以下原料制成：七水硫酸镁 22.5g、β-丙氨酸 115mg、烟酸115mg、庚二酸 7.5mg、五水硫酸铜 0.5g、五水硫酸锌0.2g、四水硫酸锰75 mg、盐酸 3mL；
每100mL所述溶液C由包括以下原料制成：L-胱氨酸 20g、盐酸 20ml；
每100mL所述溶液D由包括以下原料制成：麦芽糖50g、氯化钙0.5g。
4.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基，其特征在于，所述溶液A、溶液B、溶液C、溶液D均采用50℃-60℃的注射用水加以配制。
5.一种根据权利要求1-4中任意一项所述的发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基的配制方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配制溶液
S1.1、配制溶液A
将酵母提取物、酪蛋白氨基酸、L-色氨酸、磷酸二氢钾、氯化钙用注射用水进行充分混合溶解，再定容至1000ml，得到溶液A；
S1.2、配制溶液B
将七水硫酸镁、β-丙氨酸、烟酸、庚二酸、五水硫酸铜、五水硫酸锌、四水硫酸锰、盐酸用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，得到溶液B；
S1.3、配制溶液C
将L-胱氨酸 、盐酸用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，得到溶液C；
S1.4、配制溶液D
将麦芽糖、氯化钙用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，得到溶液D；
S2、溶液混合
按比例在溶液A中加入溶液B和溶液C，灭菌；冷却后，加入溶液D，然后加入琼脂粉，灭菌分装即可得到菌种培养基。
6.根据权利要求5所述的一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基的配制方法，其特征在于，S1.1、配制溶液A中，将酵母提取物、酪蛋白氨基酸、L-色氨酸、磷酸二氢钾、氯化钙用注射用水进行充分混合溶解，调节pH至7.4±0.2，再定容至1000ml，得到溶液A。
7.根据权利要求6所述的一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基的配制方法，其特征在于，S1.1、配制溶液A，将酵母提取物、酪蛋白氨基酸、L-色氨酸、磷酸二氢钾、氯化钙用注射用水进行充分混合溶解，调节pH至7.4±0.2，再定容至1000ml，采用0.45um滤膜进行澄清过滤，得到溶液A。
8.一种采用权利要求1-4任一项所述的发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基的菌种复苏培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、复溶菌种
开启一支发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种，反复吹打直至完全溶解，得到复溶菌液；
步骤二、一代固体培养
将复溶菌液接种于权利要求1-5任一项所述的培养基，作为一代固体培养基，置于培养箱中28-38℃，培养4-24h；
步骤三、二代固体培养
用菌种杆刮去一代固体培养基表面的菌落，涂布于权利要求1-5任一项所述的培养基，作为二代固体培养，置于培养箱中28-38℃，培养4-24h；
步骤四、菌液收集
刮洗二代固体培养基表面菌落，然后吸取菌液转移至无菌瓶中，得到菌液。
9.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种复苏培养方法，其特征在于，步骤一，溶解原始菌种的溶液为溶液E，溶液E的制备方法为：将酵母提取物0-100g使用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml。
10.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种复苏培养方法，其特征在于，步骤四，采用溶液F刮洗二代固体培养基表面菌落，然后吸取菌液转移至无菌瓶中，得到菌液；溶液F的制备方法为：将海藻糖5-50g使用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，后经0.22um滤膜除菌过滤即可。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211207 |
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