JPS60256393A - 分枝鎖脂肪又は芳香族l‐アミノ酸の発酵的製法 - Google Patents
分枝鎖脂肪又は芳香族l‐アミノ酸の発酵的製法Info
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- JPS60256393A JPS60256393A JP11061885A JP11061885A JPS60256393A JP S60256393 A JPS60256393 A JP S60256393A JP 11061885 A JP11061885 A JP 11061885A JP 11061885 A JP11061885 A JP 11061885A JP S60256393 A JPS60256393 A JP S60256393A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は培養培地中で分枝鎖脂肪族又は芳香族L−アミ
ノ酸を類似のα−ケトカルボン酸から発酵製造するため
の方法に関する。
ノ酸を類似のα−ケトカルボン酸から発酵製造するため
の方法に関する。
従来技術
人及び動物に必須のアミノ酸としてはL−ロイシン、L
−イソロイシン及びL−バリンが著しく重要である。
−イソロイシン及びL−バリンが著しく重要である。
水
っ 蛋白質の加ス分解による大量生産における古典的な
獲得法の他に1最近20年間において特に微生物的及び
酵素的合成法が開発された。微生物的合成法においては
主に、分枝鎖アミノ酸の生合成経路の制御機構を突然変
異により、突然変異体が多量のアミノ酸を発酵性炭素源
から形成し、発酵培地中に蓄積するように、変化させた
コリンバクテリウム(Oorynebacterium
)、デレキパクテリウ、IA (Brevibacte
rium)及びアルトロバクター(Arthro ba
a to r )の菌をf重用する(例えばブレビバク
テリウム・チオデニタリス(Brevi、baoter
ium thiogenitalis )を用いるイソ
ロイシン、米国特許第4329427号明細書)。−炭
素源の例は炭水化物、例えばグルコース、フルクトース
、マルトース、テンシン加水分解物、セルロース加水分
解物及び糖みつ、有機酸、例えば酢酸及びコハク酸、ア
ルコール、例えばグリセリン及びエタノール及び炭化水
素、例えばn−パラフィンでbる。通常の窒素源の例は
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、尿素及びアンモニア錯化合物である。燐酸塩及び硫
酸塩のような無機塩、並びにカルシウム、マグネシウム
、マンガン及び鉄も使用される。ビタミン、例えばビオ
チン及びチアミン又は複合栄養素、例えば酵母抽出物、
ペゾトン、カブミノ酸(Oasamino−Acids
)及び大豆加水分解物の添加も微生物の最適な成長を可
能とする。
獲得法の他に1最近20年間において特に微生物的及び
酵素的合成法が開発された。微生物的合成法においては
主に、分枝鎖アミノ酸の生合成経路の制御機構を突然変
異により、突然変異体が多量のアミノ酸を発酵性炭素源
から形成し、発酵培地中に蓄積するように、変化させた
コリンバクテリウム(Oorynebacterium
)、デレキパクテリウ、IA (Brevibacte
rium)及びアルトロバクター(Arthro ba
a to r )の菌をf重用する(例えばブレビバク
テリウム・チオデニタリス(Brevi、baoter
ium thiogenitalis )を用いるイソ
ロイシン、米国特許第4329427号明細書)。−炭
素源の例は炭水化物、例えばグルコース、フルクトース
、マルトース、テンシン加水分解物、セルロース加水分
解物及び糖みつ、有機酸、例えば酢酸及びコハク酸、ア
ルコール、例えばグリセリン及びエタノール及び炭化水
素、例えばn−パラフィンでbる。通常の窒素源の例は
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、尿素及びアンモニア錯化合物である。燐酸塩及び硫
酸塩のような無機塩、並びにカルシウム、マグネシウム
、マンガン及び鉄も使用される。ビタミン、例えばビオ
チン及びチアミン又は複合栄養素、例えば酵母抽出物、
ペゾトン、カブミノ酸(Oasamino−Acids
)及び大豆加水分解物の添加も微生物の最適な成長を可
能とする。
前駆物質からのアミノ酸の微生物学的獲得は、いくつか
のアミノ酸、例えばインドール及びセリン又はアントラ
ニレートからのトリシトファン、L−アミノテチレー)
、D−)1zオニン、L−ヒドロキシブチレート又はD
T、+−α−プロモゾチレートからのインロイシンに関
して公知である。
のアミノ酸、例えばインドール及びセリン又はアントラ
ニレートからのトリシトファン、L−アミノテチレー)
、D−)1zオニン、L−ヒドロキシブチレート又はD
T、+−α−プロモゾチレートからのインロイシンに関
して公知である。
類似のα−ケトカルがン酸からのアミノ酸の獲得はα−
ケトグルタV−)からのし−グルタメートに関して〔オ
ツ力(Otsuka)等著、工。
ケトグルタV−)からのし−グルタメートに関して〔オ
ツ力(Otsuka)等著、工。
Gen、 Appl Miorobiol+第6巻1号
、第65〜56頁、1957年〕及びピルベートからの
DL−アラニンに関して〔シャー(Shah)等著、工
Gen、 Mlorob:Lol、第17巻、620
〜624頁、1957年〕の記載がある。これに対して
バシラス・ズゾテイリス(BaO1llu88ubti
li8)を用いるα−ケトイソカプロエートからのL−
ロイシン及びα−クトインバレリエートからのL−バリ
ンの微生物学的獲得のだめの試みはあまり有望ではなか
った。
、第65〜56頁、1957年〕及びピルベートからの
DL−アラニンに関して〔シャー(Shah)等著、工
Gen、 Mlorob:Lol、第17巻、620
〜624頁、1957年〕の記載がある。これに対して
バシラス・ズゾテイリス(BaO1llu88ubti
li8)を用いるα−ケトイソカプロエートからのL−
ロイシン及びα−クトインバレリエートからのL−バリ
ンの微生物学的獲得のだめの試みはあまり有望ではなか
った。
使用した微生物は大部分のケト酸を脱カルボキシル化し
、これによりわずかな収率しか達せられなかったので、
分枝鎖メ脂肪族アミノ酸をその類似のα−ケトカルボン
酸から獲得するためにはこの微生物は不適であった。
、これによりわずかな収率しか達せられなかったので、
分枝鎖メ脂肪族アミノ酸をその類似のα−ケトカルボン
酸から獲得するためにはこの微生物は不適であった。
問題点を解決するための手段
この問題は培養培地中で分枝鎖脂肪族又は芳香族L−ア
ミノ酸を類似のα−ケトカルボン酸から発酵的に製造す
る方法において、グルタミン酸生成バクテリアなα−ケ
トカルボン酸に作用させ、反応が終了した後所望のアミ
ノ酸を単離することにより解決した。
ミノ酸を類似のα−ケトカルボン酸から発酵的に製造す
る方法において、グルタミン酸生成バクテリアなα−ケ
トカルボン酸に作用させ、反応が終了した後所望のアミ
ノ酸を単離することにより解決した。
コリンバ〉チリウム(Oorynebacterium
)属、特にコリンバクテリウム・グルタミクム(oor
ynebaot、erium glutamicum)
の菌、殊にコリンバクテリウム・グルタミクムATOO
13032及びブレビバクテリウム(Brevibac
terium)属、特にブレビバクテリウム・フラブム (Brevibactsrium flavum)の菌
、殊にブレビバクテリウム@7ラデムATOO1406
7が好適である。
)属、特にコリンバクテリウム・グルタミクム(oor
ynebaot、erium glutamicum)
の菌、殊にコリンバクテリウム・グルタミクムATOO
13032及びブレビバクテリウム(Brevibac
terium)属、特にブレビバクテリウム・フラブム (Brevibactsrium flavum)の菌
、殊にブレビバクテリウム@7ラデムATOO1406
7が好適である。
培養培地中には同化性の炭素源及び窒素源が含有されて
いる。炭素源としては炭−水化物、例えはグルコース又
は低級脂肪酸もしくはそのナトリウム塩例えば酢酸ナト
リウムを使用するのが有利である。
いる。炭素源としては炭−水化物、例えはグルコース又
は低級脂肪酸もしくはそのナトリウム塩例えば酢酸ナト
リウムを使用するのが有利である。
本発明方法においては、類似のα−ケトカルボン酸から
のアミノ酸の形成はバクテリアの成長と結合していない
ので、前記の物質は本発明方法においては主にエネルギ
ー源として意味を有する。
のアミノ酸の形成はバクテリアの成長と結合していない
ので、前記の物質は本発明方法においては主にエネルギ
ー源として意味を有する。
このことは同時に、同化性の炭素源の濃度を〉
低く保持すること、及びα−ケトカルボン酸を例えばバ
イオマス保持装置を有する発酵器中で連続的に類似のア
ミノ酸に変換すること、及び高い生成物濃度を達成する
ことを可能とする。
イオマス保持装置を有する発酵器中で連続的に類似のア
ミノ酸に変換すること、及び高い生成物濃度を達成する
ことを可能とする。
これに対して例えば発酵性炭素源からイソロイシンを製
造するだめの生合成はバッチ式に経過し、非常にわずか
な、従って後処理を困難にするアミノ酸濃度に導く。α
−ケトカルボン酸としCは特にα−ケトイソカプロン酸
、α−ケトイソ吉草酸及びα−ケト−β−メチル吉草酸
が好適である。
造するだめの生合成はバッチ式に経過し、非常にわずか
な、従って後処理を困難にするアミノ酸濃度に導く。α
−ケトカルボン酸としCは特にα−ケトイソカプロン酸
、α−ケトイソ吉草酸及びα−ケト−β−メチル吉草酸
が好適である。
この発酵は有利に…値5〜9で、温度25〜40 ’O
で、好気性条件下に2〜10日間実施する。培養基は特
に50μi/lより高いビオチン−濃度を有している。
で、好気性条件下に2〜10日間実施する。培養基は特
に50μi/lより高いビオチン−濃度を有している。
低いビオチン濃度においては成長は最適よりわずかに低
い。このことにより収率は低下する結果になる。発酵培
地のα−ケトカルボン酸に関する出発濃度は30.9/
lを越えるべきではない、それというのもこれより高″
譲度にお7ては著し“成長抑制が生 、・しるためでめ
る。しかしながら、前駆物質の連続的な補充により臨界
ケ)d濃度の回避下に高いアミノ酸濃度が達せられる。
い。このことにより収率は低下する結果になる。発酵培
地のα−ケトカルボン酸に関する出発濃度は30.9/
lを越えるべきではない、それというのもこれより高″
譲度にお7ては著し“成長抑制が生 、・しるためでめ
る。しかしながら、前駆物質の連続的な補充により臨界
ケ)d濃度の回避下に高いアミノ酸濃度が達せられる。
発酵液からのアミノ酸の単離及び精製は従来の方法によ
り行なわれる。
り行なわれる。
本発明により製造されたL−ロイシン、L−イソロイシ
ン又はL−バリンをアミノ酸分析機並びにL−アミノ酸
オキシダーゼでの酵素テストにより同定し、定量した。
ン又はL−バリンをアミノ酸分析機並びにL−アミノ酸
オキシダーゼでの酵素テストにより同定し、定量した。
実施例
例 1
そらせ板2枚を備える5 00 mlエルレンマイヤー
フラスコZ〆中に次の組成の培養液100dを加えたニ ゲルコース・H2O401/ l Na−α−ケトイソカプロン酸 20g/1(NH4)
280. 201 / I K2HP0. 0.511 / l KH2PO40,5Il/ l MgSO4・7H200,2511/ lPe1304
・7 ′H200,0111/ lMnSO4・4 H
2Oo、o 111 / 1ビオチン 0.4Iη/I
I チアミンジクロリド 21nf//1 0aO0320、!i’ / 1 オートクレーブ処理(121’O及び1気圧で20分)
の前に一値を2NNaOHで7.4に調節した。グルコ
ース及びα−ケトイソカゾロエートを分離してオートク
V−デ処理し、チプミンジクロリドを滅菌濾過し、01
!LOO3を乾燥滅菌しく150’0で8時間)、かつ
冷却した後、該溶液に無菌条件下に添加した。
フラスコZ〆中に次の組成の培養液100dを加えたニ ゲルコース・H2O401/ l Na−α−ケトイソカプロン酸 20g/1(NH4)
280. 201 / I K2HP0. 0.511 / l KH2PO40,5Il/ l MgSO4・7H200,2511/ lPe1304
・7 ′H200,0111/ lMnSO4・4 H
2Oo、o 111 / 1ビオチン 0.4Iη/I
I チアミンジクロリド 21nf//1 0aO0320、!i’ / 1 オートクレーブ処理(121’O及び1気圧で20分)
の前に一値を2NNaOHで7.4に調節した。グルコ
ース及びα−ケトイソカゾロエートを分離してオートク
V−デ処理し、チプミンジクロリドを滅菌濾過し、01
!LOO3を乾燥滅菌しく150’0で8時間)、かつ
冷却した後、該溶液に無菌条件下に添加した。
そらせ板2枚を備えるエルレンマイヤーフラスコ5[]
Qm中の複合培地(グルコース20.9/l、ペゾトン
1011/)、酵母抽出物10J/1SNaOJ 2.
51/l、 pH7,4) 100+m中30℃及び1
00 rpmで成長した、15時間後のコリンバクテリ
ウム・グルタミクムATO○13032の予培地を滅菌
0.9 S Na01中で2回洗浄し、滅菌肌9チMa
012 O1ILl中に再懸濁させた。仁の細胞懸濁液
2祷を主培養の接種用に使用し、この主培養を60′C
及び100 rpmで恒温保持した。培養時間57時間
の後、発酵培地はL−ロイシン15.811/lを含有
した。
Qm中の複合培地(グルコース20.9/l、ペゾトン
1011/)、酵母抽出物10J/1SNaOJ 2.
51/l、 pH7,4) 100+m中30℃及び1
00 rpmで成長した、15時間後のコリンバクテリ
ウム・グルタミクムATO○13032の予培地を滅菌
0.9 S Na01中で2回洗浄し、滅菌肌9チMa
012 O1ILl中に再懸濁させた。仁の細胞懸濁液
2祷を主培養の接種用に使用し、この主培養を60′C
及び100 rpmで恒温保持した。培養時間57時間
の後、発酵培地はL−ロイシン15.811/lを含有
した。
α−ケトイソカプロエートを含有しないコントロール配
合物の発酵培地は全くL−ロイシンな示さなかった。
合物の発酵培地は全くL−ロイシンな示さなかった。
例 2
例1に記載したようにおこなったが、デラビバクテリウ
ム・フラブムATOO14067を使用した。
ム・フラブムATOO14067を使用した。
培養期間72時間後に、発酵培地はL−ロイシン14.
511/Itを含有した。
511/Itを含有した。
例 6
例1と同様に行なったが、培養液はグルコースのかわり
に酢酸ナトリウム4011/lを含有した。
に酢酸ナトリウム4011/lを含有した。
培養期間72時間後に、培養液はL−ロイシン10.9
Jl/lを含有した。
Jl/lを含有した。
例 4
1) 例3と同様に実施したが、プVビバクテリウム−
7ラデムATOO14067を使用した。培養期間96
時間の後、発酵培地はL−ロイシン7.11!/lを含
有した。
7ラデムATOO14067を使用した。培養期間96
時間の後、発酵培地はL−ロイシン7.11!/lを含
有した。
例 5
例1に記載したと同様に行なったが、培養液はグルコー
ス601/lXwa−α−ケトインカプロン酸6011
/l及び(NH4)2B04401 /lを含有した。
ス601/lXwa−α−ケトインカプロン酸6011
/l及び(NH4)2B04401 /lを含有した。
培−i1期間96時間の後、発酵培地はL−ロイシン2
1.Elを含有した。
1.Elを含有した。
例 6
α−クトインカプロエート6%W/vより高い出発濃度
では著しい成長抑制が生じるので、α−ケトイソカプロ
エートを後から供給することにより高いα−ケトイソカ
ゾロエート濃度の回避下に高いL−ロイシン濃度が達せ
られた。
では著しい成長抑制が生じるので、α−ケトイソカプロ
エートを後から供給することにより高いα−ケトイソカ
ゾロエート濃度の回避下に高いL−ロイシン濃度が達せ
られた。
例1に記載したと同様に実施したが、培養液はグル:I
−ス60 g / l及び(NH4)2B044011
/lを含有した。培養期間48時間の後、Na−α−ケ
トイソカシロン酸2%W/Vを後供給し、更に56時間
恒温保持した。この方法により、発酵培地中でL−ロイ
シン24.9J/Jが達せられた。
−ス60 g / l及び(NH4)2B044011
/lを含有した。培養期間48時間の後、Na−α−ケ
トイソカシロン酸2%W/Vを後供給し、更に56時間
恒温保持した。この方法により、発酵培地中でL−ロイ
シン24.9J/Jが達せられた。
例 7
例1に記載したと同様に行なうが、培養液はNa−α−
ケトイン吉草酸2011/lをき有した。48時間の培
養期間後、発酵培地はL−バリン12.31+’/Jを
含有した。
ケトイン吉草酸2011/lをき有した。48時間の培
養期間後、発酵培地はL−バリン12.31+’/Jを
含有した。
例 8
例1と同様に行なうが、培養液はNa −D/L−α−
ケト−β−メチルバレリアン酸201171を含有した
。96時間の培養期間後、発酵培mはL−トレオーイソ
ロイシン4.811/l及びL−アローイソロイシン1
.8jl/11を含有した。
ケト−β−メチルバレリアン酸201171を含有した
。96時間の培養期間後、発酵培mはL−トレオーイソ
ロイシン4.811/l及びL−アローイソロイシン1
.8jl/11を含有した。
例 9
例1に記載したよう(心付なうが、培−液はグルコース
・l12o 601 / l % (NH4)2804
4011/l及びOa−α−ケトインカプロン= 20
y/lを含有した。α−ケトイソカプロン酸のカルシ
ウム塩は離溶性であるので、不溶の形で培養液の他の成
分と一緒にオートクンーデ処理した。
・l12o 601 / l % (NH4)2804
4011/l及びOa−α−ケトインカプロン= 20
y/lを含有した。α−ケトイソカプロン酸のカルシ
ウム塩は離溶性であるので、不溶の形で培養液の他の成
分と一緒にオートクンーデ処理した。
培養期間72時間の後、発酵培地はL−ロイシン12.
51j/lを含有した。α−ケトイソカシロン酸のNa
塩での、、コントロール配合物はL−。
51j/lを含有した。α−ケトイソカシロン酸のNa
塩での、、コントロール配合物はL−。
イシン12.3g/zを含有した。
前記の反応は芳香族α−ケト酸の相応する芳香族α−ア
ミノ酸、例えばフェニルアラニンに変換するためにも適
用できる。
ミノ酸、例えばフェニルアラニンに変換するためにも適
用できる。
第1頁の続き
優先権主張 [相]19849月28日[相]西トイ@
発明者 ベルマン・ザーム 0発 明 者 ヴオルフガング・ロイ ヒテンベルガー (MB 願人 ケルンフオルシュング スアンラーゲ・ユーリ ッヒ・ゲゼルシャフ ト・ミツトφベシュレ ンクテル・ハフラング ツ(DE)[株]P 3435674.6ドイツ連邦共
和国ユーリッヒ・つ゛エンデリヌスシュトラーセ71 ドイツ連邦共和国ブルーフ−ベル・ゲシュヴイスターー
ショルーシュトラーセ1
発明者 ベルマン・ザーム 0発 明 者 ヴオルフガング・ロイ ヒテンベルガー (MB 願人 ケルンフオルシュング スアンラーゲ・ユーリ ッヒ・ゲゼルシャフ ト・ミツトφベシュレ ンクテル・ハフラング ツ(DE)[株]P 3435674.6ドイツ連邦共
和国ユーリッヒ・つ゛エンデリヌスシュトラーセ71 ドイツ連邦共和国ブルーフ−ベル・ゲシュヴイスターー
ショルーシュトラーセ1
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、培養培地中で分枝鎖脂肪族又は芳香族L−アミノ酸
を類似のα−ケトカルギン酸から発酵的に製造するため
に、グルタミン酸生成バクテリアをα−ケトカルボン酸
に作用させ、反応が終了した後生じたアミノ酸を単離す
ることを特徴とする分枝鎖脂肪族又は芳香族り一アミノ
酸の発酵的製法。 2、pH値5〜9、温度20〜45℃で好気性条件下に
1〜10日間の間処理し、かつ培養培地が同化性の炭素
源及び窒素源を含有する特許請求の範囲第1項記載の方
法。 6、 成長細胞を使用する特許請求の範囲第1項又は第
2項記載の方法。 4、非成長(″′静止”)細胞を使用する特許請求の範
囲第1項又は第2項に記載の方法。 5、 α−ケトカルぜン酸の濃度が609/lを越えな
い特許請求の範囲第1項から第4項までのいずれか1項
記載の方法。 6、 ♂オチン濃度が50μI/lより高い特許請求の
範囲第1項から第5項までのいずれか1項記載の方法。 1 使用したα−ケトカルボン酸がα−クトイソカゾロ
ン酸、α−ケトイソ吉草酸又はα−ケト−β−メチル吉
草酸である特許請求の範囲第1項から第6項までのいず
れか1項記載の方法。 a コリンバクテリウム属の菌を使用する特許請求の範
囲第1項から第7項までのいずれか1項に記載の方法。 2 ブレビバクテリウム属の菌を使用する特許請求の範
囲第1項から第7項までのいずれか1項に記載の方法。 10、コリンバクテリウム・グルタミクム株の菌を使用
する特許請求の範囲第8項記載の方法。 11、プVビバクテリウム・フラブム株の菌な使用する
特許請求の範囲第9項記載の方法。 12.コリンバクテリウム・グルタミクムATOO13
0、s2.を使用する特許請求の範囲第10項記載の方
法。 15、デレピバクテリウムーフラプムATO○1406
7を使用する特許請求の範囲第11項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3419585.8 | 1984-05-25 | ||
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Family Applications (1)
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