JPS60248617A - 精製されたヒトマクロファージ遊走阻止因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、精製されたヒト−マクロファージ遊走阻止
因子（ヒ）　−ＭＩＦ　）及びその個々の蛋白質、ヒ）
　−ＭＩＦの精製及び個々の蛋白質の単離方法、ヒト−
ＭＩＦに対する新規なモノクローナル抗体及びその誘導
体、該モノクローナル抗体及びその誘導体の製造方法、
該抗体を産生ずるハイプリドーマセルライン、該ハイシ
リドーマセルラインの製造方法、生物学的液体中及び細
胞表面上のヒ）−ＭＩＦの定性的及び定量的測定のため
の前記モノクローナル抗体及びその誘導体の使用、ヒト
−ＭＩＦの精製のためのモノクローナル抗体の使用、並
びに精製されたヒ）　−ＭＩＦ、その個々の蛋白質、ヒ
）−ＭＩＦに対するモノクローナル抗体又はその誘導体
を′含有する医薬に関する。

〔発明の背景〕

ヒト細胞からのと）−ＭＩＦは従来活性なものとしては
知られているが、混合物として、そして生物学的液体中
の他の蛋白質と一緒に記載されているに過ぎず、そして
構造的観点からは未だ特徴付けられていない。ＭＩＦは
いわゆるリンフ才力イン群に属し、このリン７オカイン
は生物学的に活性な可溶性ポ’Ｉ）−？ｆチドを含んで
成シ、このものはリンパ球及び単球又はマクロファージ
が抗原、マイトジェン等によシ刺激された場合にこれら
の細胞から分泌される。リンフ才力インの他の例として
、免疫インターフェロン（γ−インターフェロン）、イ
ンターロイキン１及び２、並びにマクロファージ活性化
因子（ＭＡＦ　）を挙げることができる。これらのリン
フ才力インは、免疫系の種々の細胞タイプの分化、活性
化及び増殖を制御する。

知られている技術的状況によれば、ヒ）−ＭＩＦ”は、
マクロファージの遊走能力を阻害するポリペプチドの一
群から成る。ヒ）　−ＭＩＦは活性化されたリン／ｆ球
、Ｔ−及びＢ二細胞からのみならず、非リンパ性細胞、
例えば成長中の線維芽細胞及びある種の腫瘍細胞からも
分泌される。ＭＩＦは、γ−インターフェロン、マクロ
ファージ活性化因子（ＭＡＦ　）及び他のリンフ才力イ
ンから明確に区別される。しかしながら今まで、ヒト−
細胞からのＭＩＦを純粋に調製し、そしてその構造を解
明することは不可能であった。ヒ）−ＭＩＦについて、
これが約８．５，１８，２７．３６．４５、及び６７１
０１（キロダルトン、ｋＤ）の分子量及び約ｐＨ５，１
及び２．９の等電点を有する構造的に異るポリペプチド
の混合物らしいことが知られているＣＧ。

Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ、　Ｈ，５ｔｅｆｆｅｎ、　Ｕ、
Ｆｅｊｇｅ、及びＣ０Ｃ０５ｏｒイムノバイオロジー（
Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）１６０．１５（１９８１
））。

ヒ）−ＭＩＦは炎症反応（遅延型過敏性反応）の初期に
おいて決定的な役割を演する。このものは単球及び無活
動組織マクロファージが炎症性マクロファージに分化す
るのを導誘する。従って、精製されたヒ）　−ＭＩＦ及
びその個々の蛋白質並びにヒ）　−ＭＩＦを特異的に結
合してその活性を阻害するモノクローナル抗体は、免疫
調節疾患及び慢性炎症疾患の診断及び治療のために重要
である。ヒ）−ＭＩＦを結合しそしてそれを阻害するモ
ノクローナル抗体は、接触湿疹、−次的慢性多発関節炎
及び種々の自己免疫疾患の克服のために有用である。精
製されたヒ）　−ＭＩＦ及びその個々の蛋白質は感染に
対する耐性、例えば結核、らい病又はレーシュマニアに
対する耐性、及びキャンディダ症に対する耐性、並びに
腫瘍、例えば転移に対する耐性を上昇せしめる。

診断及び治療における抗体の用途の範囲は最近まで非常
に限定されていた。抗体は、種々の蛋白質の複雑な混合
物として動物の血清から非常に少量得られた。免疫され
た各動物個体、及び１つの個体でさえ、反復して免疫さ
れた場合には、各場合に種々の組成の抗体を含有する血
清をもたらすので、抗体の標準化は不可能であった。Ｋ
’ｏｈｌｅｒ及びＭｌ　ｉｓ　ｔｏ　ｉｎ［Ｇ、に’ｏ
　ｌｅｒ及びＣ−Ｍｉ　１ｓｔｅｉｎ　＋ネイチュアー
（Ｎａｔｕｒｅ）２５６，４９５（１９７５））により
開発された技法を用いて、今や均質な形の抗体、すなわ
ちいわゆるモノクローナル抗体を、細胞培養により工業
的な量において再現性を伴って得ることができるように
なった。適当な骨髄腫細胞と抗原により免疫された供与
体からの抗体産生リンパ球との融合によシ、無限の細胞
***及び無限の増殖を行う能力と均一な抗体を産生ずる
能力とを共に有するハイプリドーマ細胞が生ずる。従っ
て、特定の抗原に対する生物の免疫応答を独立させ、そ
してハイツリドーマ細胞の連続的培養によシモノクロー
ナル抗体を製造することが可能である。

ハイプリドーマ技法によシ特定の抗体を製造するための
多くの例が今まで知られておシ、そして一般的手段が原
理的に記載されているが、新しい例に特有の問題点は、
特定の場合に技法を適合させること要求する。このよう
な適合なくしては、所望のハイプリドーマを生成せしめ
ること、該ハイプリドーマが所望の抗体産生じそして遺
伝的に安定であること、及びこのようにして製造された
゛抗体が所望の特異性を有することが保証されない。

成功の程度は、原理的には、供与体の免疫に使用する抗
原の種類及び純度細胞融合の技法、適当なハイプリドー
マセルラインを選択するための手段、並びに抗体の単離
及び精製のための方式及び態様によシ左右される。

均一なモノクローナル抗体の大量入手を前提とする抗体
の重要な用途、例えば今ハイブリドーマ技法によシ可能
となった用途はイムノアフィニティークロマトグラフィ
ーである。この場合、所望の特異性を有する抗体を固体
担体上に適用する。

多数の異る化合物を含有する溶液から、抗体によって認
識されそしてそれに結合される構造因子（決定基、エピ
トープ）を有する化合物が抗体に結合され、そして従っ
て固体担体に結合される。

不所望の化合物を含有する溶液を除去した後、抗体への
結合を破壊する試薬によシ洗浄することによって担体か
ら所望の化合物を溶出し、そして常法によシ単離する。

この発明の課題はヒ）　−ＭＩＦ及びその個々の蛋白質
を得ることであシ、この課題はこの発明のモノクローナ
ル抗体によって解決される。

以下余白 〔発明の記載〕 この発明は精製されたヒト−マクロファージ遊走阻止因
子（ヒ）　−ＭＩＦ　）及びその個々の蛋白質に認識さ
れそして結合されるエピトープを有するヒト由来の蛋白
質のみを含有する。精製されたヒ）　−ＭＩＦは約８、
約１４、約２８、及び約４５ｋＶＭｏ　ｌの分子量を有
する少なくとも４種類の個々の蛋白質、及び場合によっ
てはさらに約４５に９／Ｍｏ　１より大きい分子量を有
するオリゴマー蛋白質凝集体又は他の個々の蛋白質を含
んで成る。精製されたヒ）−ＭＩＦは、マクロファージ
の遊走を測定する標準的試験方法において活性である。

精製されたヒ）−ＭＩＦの個々の蛋白質は、蛋白質分析
の常用法、例えば５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドダル電気泳動）又はダルテ
過ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）において均
一な、マクロファージの遊走を測定する標準的試験法に
おいて活性な、そして精製されたヒ）　−ＭＩＦの構成
要素である蛋白質である。個個の蛋白質の分離及び単離
の過程で洗剤又は他の変性剤を添加した場合、−次構造
は変化しないで維持されるが蛋白質の天然の三次構造が
変化し、そしてそれと共にマクロファージの遊走を阻害
する性質が変化する。このような変性された形の個個の
蛋白質もまたこの発明の対象である。精製されたヒ）　
−ＭＩＦの個々の蛋白質の例として、それぞれ約８　ｋ
ｌｉｌ／Ｍｏ　１及び約１４ｋｙ／１ｌｄｏ　１の分子
量並びにＮ一端アミノ酸配列：　Ｘ、−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｕ−ＬＲｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
Ａｓｎ−８ｏｒ−１１ｓ−１１ｓ−Ａ＠ｐ　−Ｖ’ａ５
１−Ｔｙｒ−Ｈｉ　５−Ｌｙｅ−Ｔｙｒ（ここで、アミ
ノ酸Ｘ。

の意味は特定されない）を有する２種類の蛋白質さらに
は約２８　ｋｌｂ’Ｍ’６１％及び約４５　ｋｇＡｌｏ
　１　（Ｄ分子量を有する蛋白質を挙げることができる
。

この発明は特に、およその分子量８ｋｇ／Ｍ◇１を有し
そしてＮ一端アミノ酸配列：　Ｍｅｔ　−ｂｕ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
Ａｓｎ−８ｅｒ−１１ｅ−１１ｓ＋−Ａｓｐ−ＶＬ５１
−Ｔｙ　ｒ　−Ｈｉ　ｍ　−Ｌｙ　ｓ　−Ｔｙ　ｒ−♂
ｌ！’ｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−
Ｐｈｅ−Ｈｌ　ａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌ、’ｓ　−Ｌｙｅ　−Ｌｅ
　ｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ　−ＴＶｒ−Ｇｌ　ｕ−Ｘ４２−
Ｐｒ　ｏ　−Ｇｌ　ｎ−Ｔ会−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｇ−♂１０ｙ−Ａｌ　ａ−Ａａ　ｐ−Ｖａ　１−
Ｔｒ　ｐ−ｌＲｅ　−ＬｙＩＩ−Ｇ　ｌ　ｕ　−Ｌｅ　
ｕ−、Ａｓ　ｐ　−ｆ’Ｐｅ　−Ａｓ　ｎ−Ｘ６２−Ｘ
６５−Ｘ６４−Ａ’ｉ’ａ−Ｖａ　ｌ　（ここで、アミ
ノ酸Ｘ４２．Ｘ６２ＬＸ６３゜及びＸ６４は特定されず
、しかしＸ４２はＳｅｒ又はＣｙｓのみを意味すること
ができる）を有する精製さ′れたヒ）−ＭＩＦの個々の
蛋白質に関する。

この発明はさらに、精製されたヒ）　−ＭＩＦ及びその
個々の蛋白質の製造方法に関し、この方法は、ヒ）−Ｍ
ＩＦ含有溶液、例えばヒト細胞の細胞抽出液、細胞培養
上清液又は細胞培養Ｆ液を、所望によシそれ自体公知の
精製段階の後で、 ａ）ヒト−ＭＩＦに特異的なモノクローナル抗体を有す
る担体と接触せしめ、非結合蛋白質及び他の外来性物質
を除去し、抗体に結合したヒ）　−ＭＩＦを選択的に切
シ離し、そして単離し、 ｂ）そして所望によシ、精製されたヒ）　−ＭＩＦをそ
の個々の蛋白質に分離することを特徴とする。

ＭＩＦを含有する液、例えばヒト細胞の細胞抽出液、細
胞培養上清液叉は細胞培養Ｆｆｆはそれ自体公知の方法
によシ調製される。適当なヒ）・細胞は例えば単核細胞
であり、この細胞は、クエン酸塩又はヘパリンを添加さ
れた静脈血を遠心する際に堆積する白血球の層である「
バフィーコート」から、ロイカフニレシス（ｌｅｕｃａ
ｐｈｅｒｅａｌｇ）及び／又は密度勾配中での遠心分離
によりて得ることができる。単核細胞は適当な助剤、例
えばコンカナバリンＡ又はフィトヘマグルチニンによ！
＋　ＭＩＦ及び他のリンフ才力インを産生ずるように刺
激されそして常法に従って約１２〜約７２時間、好まし
くは１８〜３６時間、適当々培地、例えばＲｉ’Ｍ１１
６４０培地（これには所望によシウシ胎児血清、緩衝剤
及び／又は抗生物質、例えばペニシリンもしくはストレ
プトマイシンが添加される）中で、約、３．７℃におい
て、そして所望によりＣ０２ガス通気のもとで培養され
る。ヒ）　−ＭＩＦを含有する溶液は、細胞又は細胞培
養土清液から、例えば抽出、濾過及び／又は遠心分離に
よって得られ、そして所望により抗生物質及び／又はグ
ロテアーゼ阻害剤の添加により安定化される。このよう
力ヒトーＭＩＦ溶液を、段階ａ）において、担体に結合
した抗体と直接接触せしめることができ、しかし好まし
くは約６　ｋｖ′Ｍｏ　ｌ又はこれよシ小分子量の分離
限界を有する膜上での限外濾過によシあらかじめ前精製
し、濃縮し、場合によっては透析し、そして所望により
クロマトグラフィー、例えばＤＥＡＥ−セルロース又は
セファデックス（商標）によシさらに精製する。

段階ａ）においては、と）−ＭＩＦが溶液に含有されて
いる他の蛋白質及び外来性物質から分離され、この場合
、ヒ）−ＭＩＦに対して特異的な抗体とヒトーＭＩＦ上
の認識される抗原決定基との間の強制的ガ相互作用に基
く分離作用が用いられる。このために、ＭＩＦ含有液を
、それ自体公知のイムノアフィニティークロマトグラフ
ィー法に従って、ヒ）　−ＭＩＦに特異的なモノクロー
ナル抗体が結合している担体と接触せしめる。

無機物又は有機物を基礎とする適当な担体、例えば珪酸
塩、架橋アガロース、デキストラン、又は適当に官能化
された形の？リアクリ、にアミドに、それ自体公知の方
法によシ、後に詳細に記載するこの発明のモノクローナ
ル抗体又轄その誘導体を付加する。例えば、活性化され
たエステル官能基、例えばＮ−ヒドキシサクシンイミド
エステル基を含有する担体を水性緩衝液に懸濁し、モノ
クローナル抗体の溶液と混合し、次に未結合モノクロー
ナル抗体を洗浄除去し、そして担体のふさがれていない
反応性部位を例えば第一級アミン、例えばエタノールア
ミンによシブ口、りする。担体を、適当な水性溶剤、例
えば塩溶液、例えばＮａＣＬ溶液、又は緩衝液、例えば
燐酸緩衝化ＮａＣｔ溶液、ＮａＨＣＯｓ　溶液又は３−
（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸溶液に懸濁し、
そしてと）　−ＭＩＦを含有する溶液と接触せしめる。

例えば、クロマトグラフカラムに充填し、そしてヒトー
ＭＩＦ含有液を導入し、そして所望によシ加圧を伴って
、担体中に／ング通過せしめる。未結合蛋白質及び他の
汚染物を、水性液、例えば約５〜約９のｐＨを有する′
緩衝液及び／又は塩溶液、例えばＮａＣｔ溶液で洗浄除
去する。担体上の抗体に結合したヒ）　−ＭＩＦを、適
当な水性液、例えば約２〜約５のｐＨ範囲の緩衝液、例
えばグリシン緩衝液、又は種々の混合物もしくは塩溶液
、例えば濃ＮＨ４５ｃＮ溶液のｐＨダラシエンドによシ
溶出する。得られた精製ヒト−ＭＩＦ含有液を場合によ
っては中和し、そしてそれ自体公知の方法によシ、例え
ばセファデックス（商標）上でのクロマトグラフィー、
電気透析、電気泳動濃縮及び／又は真空濃縮にょシ、精
製されたヒト−ＭＩＦを単離する。

所望によシ段階ｂ）において、精製されたヒト−ＭＩＦ
をその個々の蛋白質に分離し、この場合例えばそれ自体
公知の方法に従って、蛋白質混合物をクロマトグラフィ
ーによシ異る分子量を有する両分に分離する。例えば精
製されたヒ）−ＭＩＦを調製用ドデシル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ
　）により分離し、均一な分子量画分をｒルから溶出し
、そして例えばセファデックス（商標）上でのクロマト
グラフィー、電気泳動濃縮及び／又は真空濃縮により純
粋な形で単離する。精製されたヒ）−ＭＩＰ’はまた、
調製用グル濾過ＨＰＬＣにより均一な分子量画分に分離
し、そしてこれかＣ′ｌＩｌ々の蛋白質を単離すること
もできる。

この発明はさらに、ヒト−マクロファージ遊走阻止因子
（ヒ）−ＭＩＦ）Ｋ対する新規な抗体、及びその誘導体
に関する。

この発明のモノクローナル抗体はヒト−ＭＩＦを結合し
、そして／又はその生物学的活性を阻害する。ヒト−Ｍ
ＩＦへのモノクローナル抗体の結合はイムノアッセイに
よシ便利に決定することができ、例えば固体担体上にヒ
）　−ＭＩＦを適用し、この被覆された担体をモノクロ
ーナル抗体溶液と共にインキュベートシ、そしてこれに
よって結合したモノクローナル抗体を、ラジオアイソト
ープ又は酵素で標識した第２の抗体によシ表示する方法
によシ決定することができる。すなわち、ヒト−ＭＩＦ
に結合したモノクローナル抗体を、放射能又は酵素−基
質反応の測定によシ決定する。例えば、モノクローナル
抗体を担体上に固定し、と）　−ＭＩＦ含有溶液と共に
インキュベートし、そして次にこの溶液の残留ヒト−Ｍ
ＩＦ’活性を測定する方法もまた適当である。

溶液のヒ）　−ＭＺＦ活性は、それ自体公知の方法によ
シ、適当に活性化されたヒト−マクロファージの遊走に
対する阻害作用を測定することによシ、測定することが
できる。例えば、タイタープレート上のアガロース筒中
に配置されたグローブ溶液中マクロファージの試験溶液
中での遊走距離を測定する試験方法を選択することがで
きる。

マウス／マウス−、ラット／ラット−１又はラット／マ
ウス−ハイプリドーマ細胞によシ産生される、ヒ）　−
ＭＩＦに対するモノクローナル抗体が好ましい。例えば
、この発明のモノクローナル抗体として、ハイツリドー
マセルラインＩＣ５により産生されるＩＣ５と称するサ
ブクラスＩ　ｇＧ　、Ｌのモノクローナル抗体、及びハ
イブリドーマセルライン７Ｄ１０によシ産生される７Ｄ
１０と称するサブクラスＩｇＧ２ＩＬのモノクローナル
抗体が好ましい。モノクローナル抗体ＩＣ５及び７Ｄ１
０はヒ）　−ＭＩＦの生物学的活性を阻害すること々く
ヒ）−ＭＩＦに結合する。

モノクローナル抗体のむの発明の誘導体は、例えば、ヒ
）−ＭＩＦの抗原決定基に対するその特異性を保持して
いる断片、例えばＦａｂ　＋　Ｆａｂ’もしくはＦ（ａ
ｂ’）２断片、；例えば放射性ヨウ素（工、１３１■）
、炭素＜　ｃ＞、硫黄（Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）もし
くはこれらに類似するものによシ標識された放射性標識
モノクローナル抗体：ビオチンもシくハアビジンとのモ
ノクローナル抗体接合体；又は酵素、例えばホースラデ
ィツシュ−パーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファター
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシ〆−ゼ、グリコースオキシダー
ゼ、グルコアミラーゼ、カーがニックアンヒドラーゼ、
アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデ
ヒドロダナーゼもしくはグリコース−６−１ｔスフエー
トデヒｒロケ９ナーゼとのモノクローナル抗体接合体で
ある。好ましい誘導体は　Ｉで標識されたモノクローナ
ル抗体、及びビオチンとの抗体接合体である。

以下余白 この発明はさらに、ヒ）−ＭＩＦに対するモノクローナ
ル抗体及びその誘導体のそれ自体公知の製造方法に関し
、この方法は、前記の抗体を産生ずるハイツリドーマ細
胞を、 ａ）イン−ビトロ培養し、そして培養土清液がらモノク
ローナル抗体を単離し、又は ｂ）適当な哺乳動物中でイン−ビデ増幅し、そして該哺
乳動物の体液からモノクローナル抗体を単離し、 Ｃ）そして所望によシ、得られたモノクローナル抗体を
その誘導体に転換する、 ことを特徴とする。

変法ａ）のイン−ビトロ培養のだめの適当な培地は常用
の標準培地、例えば、ウシ胎児血清が補充されている場
合があるドゥルペコ（Ｄｕｌｂｅｅｃｏ　）の変形イー
グル（Ｅａｇｌｅ）培地又はＲＰＭＩ　１６４０培地で
ある。モノクローナル抗体の単離のために、培養土清液
中の蛋白質を硫酸アンモニウム又はこれに類似するもの
によって沈澱せしめ、そして常用のクロマトグラフ法、
例えばダル沖過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥ
ＡＥ　−セルロースクロマトグラフィー、又は免疫アフ
ィニティークロマトグラフィーによシ精製する。

変法ｂ）に従うハイブリドーマ細胞のインービポ増幅に
よシ目的とする抗体を多量に得ることができる。この目
的のために、細胞クローンを哺乳動物＼好ましくは同系
（Ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ　）哺乳動物に注射し、そして１
〜３週間後、モノクローナル抗体を該哺乳動物の体液か
ら単離する。例えば、Ｂａ１ｂ／ｃマウス由来のハイブ
リドーマ細胞を、場合によってはシリスタンのごとき炭
化水素によシ前処理されたＢａ１ｂ／ｃマウスに腹腔内
注射し、そして８〜１０日後に該動物から腹水を採取す
る。

目的とするモノクローナル抗体を該体液から、それ自体
公知の方法によシ、例えば塩化アンモニウム又はこれに
類似するものによる沈澱、及びクロマトグラフｎ’Ｍ、
例え１ｌｊＤＥＡＥ−セルロース、ヒドロキシルアノ七
タイト（ＨＰＨＴ　、　高速ヒドロキシルアノやタイト
カラムクロマトグラフィー）、イオン交換樹脂によるク
ロマトグラフィー、ｒル濾過又は免疫アフィニティーク
ロマトグラフィーにょシ単離する。

ヒト−ＭＩＦの抗原決定基に対する特異性が保持されて
いるこの発明のモノクローナル抗体断片、例えばＦａｂ
　％　Ｆａｂ’又はＦ（ａ　ｂ’）　２断片は、それ自
体公知の方法によシ製造することができ、例えば変法ａ
）又はｂ）によシ得られたモノクローナル抗体をペゾシ
ンもしくはパパインのごとき酵素にょシ処理し、そして
／又は化学還元によシリスルフィド結合を切断すること
により製造することができる。

ヨウ素（工、工）によシ放射性標識されタモ／りｅ＋−
ナル抗体は、この発明のモノクローナル抗体から、それ
自体公知の方法によシ、例えば放射性ヨウ化ナトリウム
又はヨウ化カリウムと化学的酸化剤、例えば次亜塩素酸
ナトリウム、クロラミンＴもしくはこれらに類似するも
の、又は酵素的酸化剤、例えばラクトパーオキシダーゼ
、グルコースオキシダーゼとグルコースとを用いて得ら
れる。この発明の放射性標識されたモノクローナル抗体
はまた、それ自体公知の方法により、放射性標識された
炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、硫黄（Ｓ）又は
これらに類似するものを含有する栄養素、例えばＬ−（
１４Ｃ）−ロイシン、Ｌ−（’Ｈ）　−ロイシン又はｒ
、−＜　３５　ｓ　）−メチオニンをイン−ビトロ培養
のだめの培地に添加し、そして変法＆）に従ってモノク
ローナル抗体を得ることによシ製造することができる。

酵素標識されたこの発明のモノクローナル抗体はそれ自
体公知の方法によシ得られ、この方法においては、変法
ａ）又はｂ）によって製造されたモノクローナル抗体と
所望の酵素とを、カップリング剤、例えばグルタルアル
デヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ、Ｎ’−ｏ−フェニレンシマ
レイミド、Ｎ　−（ｍ　−マレイミドベンゾイルオキシ
）−サクシンイミド、Ｎ−（３−（り゛−ピリジルジチ
オ）−プロピオンオキシ）−サクシンイミド又はこれら
に類似するものと共に反応せしめる。同様に、この発明
のモノクローナル抗体どアビジンとの接合体が得られる
。ビオチンとの接合体がそれ自体公知の方法により得ら
れ、この方法においてはこの発明のモノクローナル抗体
を例えばビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジルエ
ステルと反応せしめる。

この発明はさらに、ヒト−マクロファージ遊走阻止因子
（ヒ）　−ＭＩＦ　）に対するモノクローナル抗体を産
生ずることを特徴とするハイブリドーマセルラインに関
する。

マウス−骨髄腫セルラインとマウス−又はラット−リン
／４’球との雑種である、ヒト−ＭＩＦに対して向けら
れたモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマセル
ラインが好ましい。

パスツール研究所（ノクリ）の’　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎＮａ口ｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅｇ　ｄｅ　
Ｍｆｃｒｏｏｒｇａｎｉ−ｓｍｅｓ”　にＮｏｌ−３１
６として１９８４年７月１３日に寄託され、そしてＩＣ
５と称するハイブリドーマセルラインが非常に好ましい
。セルラインＩＣ５は、マウス骨髄腫セルラインＰ３−
Ｘ６３−Ａｇ８．６５３とＢａ１ｂ／ｃマウスの肺臓の
Ｌ−’＋７ンパ球との雑種である。同様に、ツクスツー
ル研究所（ノヤリ）の”　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａ
ｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅＭｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ　”にＮｏ！−４１８として
１９８５年１月２９日に寄託され、そして７ＤｉＯと称
するハイブリドーマセルラインが好ましい。セル５イン
７Ｄ１０は、マウス骨髄腫セルラインＰ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３　とＤＡ−ラットめ肺臓のＢ−リンパ球と
の雑種である。これらのセルラインはいずれも遺伝的に
安定であシ、不変の特異性を有するモノクローナル抗体
を分泌し、そして凍結された培養物を解凍しそして再ク
ローン化することによって活性化され得る。

この発明はさらに、ヒ）−ＭＩＦに対するモノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマの製造のだめのそれ自
体公知の方法に関し、この方法は、適当な哺乳動物をＭ
ＩＦ又はＭＩＦ接合体で免疫し、該哺乳動物から取り出
された抗体産生細胞を骨髄肺細胞と融合せしめ、得られ
たバイブリド細胞をクローン化し、そして目的とするモ
ノクローナル抗体を産生ずる細胞クローンを選択するこ
とを特徴とする。

抗原としてＭＩＦ含有蛋白質画分又はＭＩＦ接合体のい
ずれをも使用することができ、例えばヒトの単核細胞か
らのもの、例えば上記のようにして得られたＭＩＦ含有
蛋白質画分、又はこの蛋白質画分と適当な免疫原担体、
例えば蛋白質、ポリサッカライド、ラテックス粒子もし
くは細胞との接合体を用いることができる。動物−ＭＩ
Ｆ及びヒト−ＭＩＦが同一のエビトーゾを示すことが、
当該動物、例えばネズミのＭＩＦを含有する蛋白質画分
を使用するための前提である。接合体はそれ自体公知の
方法によシ、例えばカルボジイミド、過ヨウ素酸塩、ク
ルタルアルデヒド、Ｎ、Ｎ−ｏ−７エニレンジマレイミ
ド、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）−サクシ
ンイミド、Ｎ　−（３−（２’−ピリジルジチオ）−グ
ロピオンオキシ）−サクシンイミド又はこれらに類似す
るものを用いるカップリングにより製造することができ
る。免疫するために、グルタルアルデヒドであらかじめ
処理された羊赤血球とヒト又はマウス細胞からのＭＩＦ
含有蛋白質画分との接合体が好ましい。

ヒ）　’−ＭＩＦにより免疫するだめの好ましい哺乳動
物はマウス又はラット、特にＢａ１ｂ／ｃマウスである
。マウス−ＭＩＦにより免疫するためにはラット、例え
ばＤＡ−ラットを用いるのが好ましい。免疫操作はそれ
自体公知の方法により行い、例えば抗原性ヒ）−ＭＩＦ
接合体を、所望によりリンパ球産制刺激助剤、例えば完
全フロインドアジュバント又は不完全フロインドアジュ
バントと共に、１〜１０日の間隔で、３〜８回非経口的
に、例えば腹腔内又は皮下に注射することにより行う。

さらに、動物を２〜４回の注射によシ前免疫し、そして
８〜１２ケ月後にさらに注射を行うこともできる。

免疫された動物の抗体産生細胞、好ましくは肺臓細胞を
、最後の免疫の２〜６日後に動物から取シ出し、そして
融合促進剤の存在下で適当なセルラインの骨髄腫細胞と
融合せしめる。適合な融合のパートナ−として種々の異
る骨髄腫セルライン及びそれから誘導されたセルライン
が知られている。酵素ヒポキサンチンーダアニンーホス
ホリポシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ　）又は酵
素チミジンキナーゼ（ＴＫ　）が欠落しておシ、そして
それ故にヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン
を含有する選択培地（、ＨＡＴ培地）、又はヒポキサン
チン及びアザセリンを含有する選択培地中で生存するこ
とができない骨髄腫細胞が好ましい。

ＨＡＴ培地又はヒポキサンチン／アザセリン培地中に生
存せず、そして免疫グロブリン又はその部分を分泌しな
い骨髄腫細胞及びそれから調製されたセルライン、例え
ばセルラインＸ６３−Ａｇ３．６５３、及びＳｐ　２１
０−Ａｇ　１４が特に好ましい。Ｂａ１ｂ／ｃマウス由
来のセルラインＸ６３−Ａｇ３．６５３　はマウス、例
えばＢａ１ｂ／（！マウスのリンノや球との融合に適当
であるのみならず、ラット、例えばＤＡラットのリンパ
球との融合のためにも適当である。

融合促進剤として、場合によってはＵＶ不活性化された
形であるセンダイウィルス又は他のパラミキノウイルス
、カルシウムイオン、界面活性脂質、例えばリンレシチ
ン、又はポリエチレングリコールを挙げることができる
。骨髄腫細胞と、２〜１０倍過剰量の免疫された動物か
らの牌臓細胞とを、約１０００〜約６０００の分子量を
有するポリエチレングリコールの約３０〜約５０％の溶
液中で融合せしめるのが好ましい。

融合の後、細胞を分離し、そして選択用のＩ（ＡＴ培地
又はヒポキサンチン／アザセリン培地中で培養する。こ
の際、ハイブリドーマ細胞は骨髄腫細胞由来のイン−ビ
トロ生存能力、及び免疫された動物の抗体産生細胞由来
のＨＧＰＲＴ遺伝子又はＴＫ遺伝子の欠落そしてそれに
よる選択培地中での生存能力を兼備するため、ハイブリ
ドーマ細胞のみが生存する。

ハイブリドーマ細胞増殖のだめの適当な培地は常用の標
準的培地、例えばドゥルベコの変形イーグル培地又はＲ
ＰＭＩ　１６４０培地である。好ましくは細胞増殖の最
初にいわゆるフィーダー細胞、例えば正常な腹腔性のマ
ウス浸出細胞、牌細胞、骨髄マクロファージ又はこれら
に類するものを添加する。）・イブリドーマ細胞の上に
通常の骨髄腫細胞が増殖するのを防止するために、規則
的な間隔で上記の培地に選択用のＨＡＴ培地又はヒポキ
サンチン／アザセリン培地を補充する。

次に、ハイブリドーマ細胞の細胞培養上清液を、それが
目的モノクローナル抗体を含有するか否かについて試験
する。このために好ましくは、すでに記載されているよ
うに、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセ
イ、及び／又はＭＩＦ活性の決定を用いる。このように
して選択した細胞クローンを常用の標準的培地中で培養
し、そして所望によシそれ自体公知の方法で凍結し、そ
して／又は限界稀釈法によシもしくは寒天上での分散に
よシ再クローン化する。

この発明はさらに、特に生物学的液体中又は細胞表面上
のヒト−マクロファージ遊走阻止因子（ヒ）　−ＭＩＦ
　）の定量的測定のためにヒ）−ＭＩＦに対するモノク
ローナル抗体を使用することに関する。例えば、この発
明のモノクローナル抗体は、抗原（ヒ）−Ｍ！Ｆ）とモ
ノクローナル抗体との間の結合相互作用を用いるそれ自
体公知のイムノアッセイ法のいずれかにおいて使用する
ことができる。このような測定方法の例として、ラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）　、エンザイムイムノアッセ
イ、免疫螢光試験、ラテックス凝集試験、又は血球凝集
試験を挙げることができる。

この発明の抗体は、それ自体として、又は放射性標識誘
導体として、場合によっては他の標識抗体及び／又は蛋
白質と組合わせて、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ　）
において使用することができる。

ＲＩＡの公知の変法のいずれか、例えば均一相中でのＲ
ＩＡ　、固相もしくは不均一相ＲＩＡ　、又はシングル
ＲＩＡもしくはダブル（サンドイッチ）　ＲＩＡを用い
てヒト−ＭＩＦの直接又は間接（競争的）測定を行うこ
とができる。

好ましいＲＩＡにおいては、適当な担体、例えばタイタ
ープレートのプラスチック表面、又は例えばポリスチレ
ン、ポリプロピレンもしくはポリ塩化ビニル製の試験管
、ガラス製もしくはプラスチック製のビーズ、Ｐ紙、デ
キストラン−、セルロースアセテート−もしくハニトロ
セルロースーシート、又はこれらに類似するものに、ヒ
）−ＭＩＦ？−五十一μ１ｆｔ−Ｐ払次１７訃価傭に恭
呟−以仝市■み莫ｔｙ　？　ｈ又は場合によっては担体
を例えばグルタルアルデヒドもしくはブロムシアンで活
性化した後に被覆し、そしてこの発明のモノクローナル
抗体とインキュベートしそして次に第２の抗体溶液とイ
ンキュベートする。この場合、第２の抗体、例えばラビ
ット抗−マウス免疫グロブリンがこの発明のモノクロー
ナル抗体を認識し、そしてこれと結合する。結合した第
２抗体の量を、第２抗体が放射性標識されている場合に
は直接に、又はこの第２抗体に対して高い親和性を有す
る放射性標識された蛋白質、例えばスタフィロコッカス
・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ
ｅｕｓ）由来のプロティンＡとの反応の後に、決定する
。

この発明のモノクローナル抗体はそれ自体として、又は
酵素標識された誘導体としてエンザイムイムノアッセイ
において使用される。このようなイムノアッセイ法は、
例えば、この発明のモノクローナル抗体のエピドーグを
認識しそして結合するそれ自体公知の酵素標識された抗
体、又は酵素標識されたこの発明のモノクローナル抗体
誘導体を使用する試験方法である。酵素標識された抗体
のほかに、抗体−ビオチン接合体及びアビジン−酵素接
合体も使用される。エンデイムイムノアッセイにおいて
使用する酵素の例としてホースラディツシュ−パーオキ
シダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラー
ゼ、カービニツクアンヒドラーゼ、アセチルコリンエス
テラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロダナーゼ、又
はグルコース−６−ホスフェートデヒドロ’）”ｆ−−
Ｗを挙げることができる。

ＥＬＩＳＡ　法（エンザイム・リンクド・イムノンルベ
ント・アッセイ）が好ましく、この方法においては、担
体（これは例えばシングルＲＩＡ試験について前記した
もので１）、そして場合によっては赤血球が付加されて
いる）に単純吸着により、又は場合によっては担体もし
くは担体に結合した赤血球をグルタルアルデヒドによシ
活性化した後に、ヒ）−ＭＩＦ含有試験液７、は標準液
を被覆し、あるいはヒ）−ＭＩＦを測定すべき細胞を付
加し、そして次にとの担体をこの発明のモノクローナル
抗体と共にインキュベートしそ・して次にこの発明のモ
ノクローナル抗体を認識しそして結合する酵素標識され
た第２の担体の溶液と共にインキュベートする。この場
合、結合した第２抗体、例えばパーオキシダーゼで標識
されたラビット抗−マウス免疫グロブリンの量を、酵素
基質を用いる発色にょシ可視化し、そして決定する。

次のＥＬＩＳＡ法が特に好ましい。すなわち、担体、例
えばシングルＲＩＡ法について前記した担体に、単純吸
着によシ、又は場合によっては担体をグルタルアルデヒ
ドもしくはブロムシアンによシ活性化した後、この発明
のモノクローナル抗体の溶液を被覆し、次にとの担体を
ヒ）　−ＭＩＦ含有試験液又は標準液とインキュベート
シ、そして次にヒト−ＭＩＦの他のエピトープを認識す
る場合がある酵素で標識されたこの発明の担体の溶液と
共にインキュベートするか、あるいは好ましくはビオチ
ン暮接合したこの発明の抗体の溶液とインキュベートし
そして次にアビジン−酵素接合体と共にインキュベート
する。この際、結合した酵素標識又はビオチン標識され
た担体が、酵素基質を用いる発色により可視化されそし
て決定される。

この発明のエンディムイムノアッセイにおける好ましい
酵素基質５−アミノサリチル酸、０−７エニレンジアミ
ン、３．３’−ジメトキシベンジジン、３．３’、５．
５’−テトラメチルベンジジン、２，２′−アジノービ
ス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
又はこれらに類似するもの及び過酸化水素によシ発色す
ることができるホースラディッシューノ！−オキシダー
ゼ、並びに酵素基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートか
らｐ−ニトロフェノールを遊離せしめるアルカリ性ホス
ファターゼである。

ヒ）−ＭＩＦの定性的又は定量的測定のための、ヒト−
ＭＩＦに対するモノクローナル抗体及びその誘導体のこ
の発明の使用には、前記以外のそれ自体公知のイムノア
ッセイ、例えば螢光物質と抗体接合体又は抗原接合体を
用いる免疫螢光法、抗体又は抗原で被覆されたラテック
ス粒子を用いるラテックス凝集法、抗体又は抗原で被覆
された赤血球を用いる血球凝集法、等が含まれる。

前記のイムノアッセイは、生物学的溶液、特にヒトの血
液中に存在するか、又は固定された形で細胞表面上に存
在するヒ）−ＭＩＦの量の決定に使用することができ、
そしてこれによって免疫調節障害を有する患者の診断が
容易になる。例えば、血液中にヒト−ＭＩＦが存在せず
又はその量が平均以下である場合、低い感染耐性につい
て、原因となる免疫調節障害を診断することができる。

さらに、ＭＩＦは特定の組織タイプ及び特定の病理状態
においてのみ生ずる（次の表）から、病理組織中、例え
ば黒色腫、肉芽腫及び肥厚中のヒ）−ＭＩＦの測定が簡
単な診断を可能にする。

以下余白 凍結組織片へのモノクローナル抗体１０５の結合＋結合
が検出された。　−結合が検出されず。

この発明はさらに、ヒト−マクロファージ遊走阻止因子
（ヒ）　−ＭＩＦ　）の定性的丞び定量的測定の几めの
試験キットに関し、このキットは、ヒト−ＭＩＦに対す
るモノクローナル抗体及び／又はその誘導体、並びに場
合によっては付属物を含んで成ることを特徴とする。

ラジオイムノアッセイのためのこの発明の試験キットは
、例えば適当な担体、この発明の抗体又は放射性標識さ
れたこの発明の抗体誘導体の場合によりては凍結された
又は濃縮された溶液、放射性標識されている場合がある
第２抗体及び／又は場合によっては、スタフィロコッカ
ス・アウレウス由来の放射性標識されたプロティンＡ、
精製されたヒト−ＭＩＦ又はその個々の蛋白質の標準溶
液、緩衝液、グルタルアルデヒドを含有する固定液、非
特異的結合及び凝集体形成を防止するための洗剤、ビ被
ット、反応器、ｖｐ算凹曲線を含む。

エンザイムイムノアッセイのためのこの発明の試験キッ
トは例えば、適当な担体、この発明のモノクローナル抗
体の場合によっては凍結された又は濃縮された溶液、酵
素標識又はビオチン標識されているこの発明の抗体誘導
体、この発明のモノクローナル抗体を認識しそして結合
する酵素標識された抗体の場合によっては凍結された又
は濃縮された溶液、アビジン−酵素接合体の場合によっ
ては凍結された又は濃縮された溶液、固体の形又は溶解
した形の酵素基質、精製されたヒト−ＭＩＦ又はその個
々の蛋白質の標準溶液、緩衝液、グルタルアルデヒＰを
含有する固定液、洗剤、ピ啄ット、反応器、換算曲線等
を含む。

この発明はさらに、ヒ）　−ＭＩＦを精製するための、
ヒト−ＭＩＦに対するモノクローナル抗体及びその誘導
体の使用に関する。例えば、モノクローナル抗体とヒ）
−ＭＩＦの抗原決定基との間の結合相互作用に基く分離
作用を利用するそれ自体公知の技法を用いてヒ）　−Ｍ
ＩＦを分離することができる。好捷しい分離方法は、前
に記載した免疫アフィニティークロマトグラフィーであ
る。

この発明はさらに、医療的に有効な量の精製されたヒ）
　−ＭＩＦ、その個々の蛋白質、ヒ）　−ＭＩＦに対す
るモノクローナル抗体又はこのようなモノクローナル抗
体の誘導体、及び有童量の医薬担体を含んで成る医薬に
関する。モノクローナル抗体の適当な誘導体は、ヒ）　
−ＭＩＦの抗原決定基に対するその特異性を保持してい
る断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ　（ａ　ｂ’）
　２断片である。

この発明の医薬は、経腸投与により、例えば鼻内投与、
直腸投与又は経口投与により、そして好壕しくけ非経腸
投与により、例えば筋肉内投与、皮下投与、又は静脈内
投与により、温血動物、例えばヒトに投与される。意図
される投与方法に依存して、この医薬は単位投与形、例
えばアンプル、バイアル、生薬、糖衣丸剤、錠剤、カプ
セル、又は流体もしくは固体の形の鼻内スプレーとして
存在することができる。

医療的に有効力この化合物の投与すべき量は、温血動物
、例えばヒトの状態、例えば体重、疾患の種類及び重症
度、並びに一般的状態、さらには投与方法に依存し、そ
して治療に当る医師による評価に従う。ヒ）　−ＭＩＦ
及びその活性な個々の蛋白質の有効量は０．００１〜１
μｇＡ体重／日の範囲テアリ、ヒ）−ＭＩＦに対するモ
ノクローナル抗体及びその誘導体はｏ、ｏｏｉ〜１９／
に９体重／日の範囲である。

この発明の医薬は常用の無機又は有機の固体又は液体の
医薬として許容される担体を、場合によっては他の医薬
として活性な化合物及び／又は助剤と供に含有する。活
性物質の溶液又は懸濁液、特に等張溶液又は懸濁液、さ
らには使用直前に水に溶解する凍結乾燥品が好ましい。

医薬は殺菌することができ、そして／又は防腐剤、安定
剤、浸潤剤、乳化剤、溶解促進剤、増粘剤、浸透圧調節
塩及び／又は緩衝剤、さらには他の蛋白質、例えばヒト
ー血清アルブミン又はヒト−血漿標品を含有することが
できる。

医薬として有効な量のヒ）　−ＭＩＦ又はその個々の蛋
白質を含有する水性分散体中リポゾームの形の医薬が好
ましい。特に、可能な限シ均一な大きさの集団からなり
、約２．０Ｘ１０−８〜５．ＯＸｌｏ−６ｍの直径を有
し、リビド成分、例えば両親媒性リピド、例えばホスホ
リピド、例えばレシチン、ケファリン又はホスファチジ
ル酸、及び場合によっては中性リビド、例えばコレステ
ロールから成る１又は複数の２重層から構成されており
、そしてこの発明の精製されたヒ）　−ＭＩＦ−又はそ
の個々の蛋白質を含有する水性内部空間を包囲している
リポゾームが好ましい。

次に例によりこの発明をさらに詳細に説明するが、これ
によってこの発明の範囲を限定するものではない。

例において使用する略号は次の意味を有する。

ＥＬＩＳＡ　エンザイムアッセイ（エンザイムリンクド
イムノンルＲントアッセイ） ＨＡＴ　ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン ＨＰＬＣ高圧液体クロマトグラフィー ＨＴ　ヒポキサンチン／チミジン ＭＩＦ　マクロファージ遊走阻止因子 ＰＢＳ　燐酸緩衝化生理的食塩水 ＲＩＡ　ラジオイムノア、７セイ ＳＤＳ　ドデシル硫酸ナトリウム ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動 ５ＲＢＣ羊赤血球 トリス（Ｔｒｉｓ））　！Ｊスス−ヒドロキシメチル）
−アミノメタン ｒｐｍ　回転数７分 以下余白 例１　ヒト−ＭＩＦを含有する蛋白質画分の取得単核細
胞を、“バフィーコート”、すなわちクエン酸塩又はへ
・ヤリンを添加した静脈血の遠、儲分離によシ堆積する
白血球層から得、そしてロイカフェレシスゼ（Ｌｅｕｃ
ａｐｈｅｒｅｓｉｇ）及びＩＢＭ血球分離機（ＩＢＭ　
２９９７）中でのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）　（商標
）−グラジェントでの連続遠心分離から成る２段階法に
より精製する［Ｕ、Ｆｅｉｇｅ及びＣＣ１５ｏｒ　＋ジ
ャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄａ）　６６、１６１（１
９８４）］。単核細胞をスピンナー（Ｓｐｉｎｎｅｒ）
培地（セロメト）中で洗浄し、そして培養器底ｃｒｎ２
当、９０．１７ｄのＲＰＭＩ　１６４０培地中５　Ｘ　
１０’細胞の濃度において２時間、１６　個の細胞当ｊ
５０．６７μｇのコンカナバリンＡによシ刺激する。Ｒ
ＭＭＩ　１６４０培地の更新及びそれに続く３７℃にて
２０時間の５　％　Ｃｏ３を通気しながらのインキーペ
ーションヲ行いリンフ才力インを含有する培養上清液を
得る。これを、４℃、１７．００Ｏｒｐｍ（８８３４０
−ター、ツルパル遠心機）にて３０分間遠心分離する。

無細胞上清液を、０．０５ＭのＮｕ（４）ＩＧＯ，中で
平衡化されたセファデックスＧ２５（商標）上で脱塩し
、そして次に蛋白質含有画分を凍結乾燥する。この凍結
乾燥物を、０．１　Ｍ　ＮａＣＡが添加されている０、
０１燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７゜５に入れ、そして同
じ緩衝液中でセファデックスＧ１００を用いてクロマト
グラフ処理する。８〜１４に９／Ｍｏ１（キロダルトン
）の範囲の分子量を有する蛋白質を含有するヒトＭＩＦ
−含有画分を一緒にし、そしてローターペーパー中で１
６倍濃縮する。

ム ２．５−の包装された羊赤血球〔羊赤血球細胞。

５ＲＢＣ、ベーリングペルケ（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｓｒｋ
＠）　〕を２０ｄのＰＢＳに懸濁する。この８ＲＢＣ懸
濁液１００μｌを、ＰＢＳ　中ルグタルアルデヒドの溶
液９００μｌと共に、グルタルアルデヒドの最終濃度が
０．０５チとなるようにして５分間インキ−ベートする
。

このようにして前処理した５ＲＢＣを水冷蒸留水で２回
洗浄し、遠心分離し、そして例１からのヒトーＭＩＦ含
有画分３００μｌと共に２０℃にて１時間インキ−ベー
トする。この懸濁液を免疫処理のために使用する。

２．２免疫処理 Ｂａ１ｂ／ｃ　マウスを、０，７．及び１０日０に、例
２．１からのヒ）　−ＭＩＦと結合した５ＲＢＣ懸濁液
０．５−ずつを、０．５ｄずつの完全フロイントアジ−
バンドと共に３回注射することによシ免疫する。

この場合、注射量の半分を腹腔内（１，ｐ、）に注射し
、そして他の半分は４部分に分けて皮下（ａ、ｃ、）注
射する。１３日０及び１４日０に、アジュバントを伴わ
ないで０．５ｄずつの接合体懸濁液をさらに２回ｔ、ｐ
、投与によシ１追加（ｂｏｏｓｔｅｒ）”免疫注射する
。１８日０に、画壇れたマウスの肺臓乞摘出する。

２．３　細胞融合 に６ｈｌｓｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法［Ｇ−ＫＭｈ
ｌｅｒ及びＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、ネイチュア−（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　２５６゜４９５　（１９７５）　）に従っ
て、１０８個の肺臓リン・９球を、ドゥルペコの変形イ
ーグル培地中３５ｑｂポリエチレングリコール４０００
　（メルク、／ルムスタット）及び９．７チジメチルス
ルホキシドの溶液１．５ｄ中で３．３Ｘ１０　個の！ウ
ス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ　８．６５３　［Ｊ、
Ｆ、　Ｋｅａｒｎ、ｅｙ　、　Ａ、　Ｒａｄｂｒｕｃｈ
。

Ｂ、　Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ及びに、　Ｒａｊｅｖｓｋｙ
　、ジャーナＡ／。

オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　１２３
．１５４８（１９７９）　）と混合する。融合の後、細
胞をフアシヨン３０４０の９６−ウェルグレートの６０
０個のウェル中にグレートし、そしてリトルフィールド
のＲＡＭ培地（ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミ
ジン標準培地）　［、ｙ、ｗ、　Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌ
ｄ。

サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１４５．７０９　（１
９７４）　）中でフィーダー細胞としての骨髄マクロフ
ァージと共に培養する。ＨＡＴ培地中で１０日間培養し
た後、ＲＰＭＩ　１６４０　ＨＴ培地中で培養を継続す
る。

の試験 ３．１　γ−グロブリンの検出 ハイブリドーマ細胞培養液の上清液をＥＬＩＳＡ（エン
ザイム・リンクド・イムノソルベント・アッセイ）にお
いて試験゛する。この方法においては、ラビットから得
られ、パーオキシダーゼと接合されており、そしてマウ
スｒ−グロブリンを認識しそしてこれを結合する第２の
抗体を用いる６１０３個のハイブリドーマセルラインの
内７２個のクローンがγ−グロブリンを産生ずる。

異性 同系マウスの赤血球（ホール当シ１００μ！のＰＢＳ中
Ｉ　Ｘ　１０’個の赤血球）を、＆１−Ｌ−リジン（２
５〜／ＷＬｌ　）で被覆された９６−ウェルプレート（
グイナテック・ミクロタイター）に適用し、そして４℃
にて一夜インキーペートスる。ＰＢＳ　テ反復洗浄する
こと蹟より未結合赤血球を除去する。

こうして結合した赤血球を例２．１に記載したようにし
てグルタルアルデヒド中で固定し、洗浄、そして８〜１
４　ｋｇ　／　Ｍｏｌの分子量範囲のヒトーＭＩＦ含有
画分（例１）とインキ−ベートする。反復洗浄によって
未結合蛋白質を除去し、そしてこのプレートをｏ、　１
　％　Ｎ＆Ｎｓを含有するＰＢＳ中に貯蔵する。プレー
トをハイブリドーマ細胞の培養上***とインキ−ベート
し、そして次にアルカリ性ホスファターゼと結合したラ
ビット抗−マウス免疫グロブリン第２抗体とインキ−ベ
ートし、そして２−アミノ−２−エチル−１，３−ゾロ
／ＩＰンジオー、ｌ［ｉｉ中ｐ−二トロフェニルホスフ
ェート（セルパ）によシ発色せしめる。放出されたｐ−
ニトロフェノールを４０５　ｎｍにおいて分光的に検出
する。このＥＬＩＳＡ法により、例１からのヒトーＭＩ
Ｆ含有分子量画分に結合するモノクローナル抗体が同定
される。γ−グロブリンを分泌する７２個の細胞クロー
ンの内１５クローンがこの測定において結合されるモノ
クローナル抗体を産生ずる。

３．３　ヒトーＭＩＦＫ対する特異性 例３．２に従って同定されたクローンの培養土清液から
のγ−グロブリンを硫酸アンモニウムｔ−用いて５０％
飽和において沈澱せしめ、そしてこの沈澱物をＰＳＢに
入れ、そして製造者によシ指示された方法によシＡｆｆ
ｉ−Ｇｅｌ　（商標）１０（ビオ−ラド）に結合せしめ
た。こうして固定化したγ−グロブリンを４℃にて一夜
、コンカナバリンＡによシ刺激された単核細胞のヒ）−
ＭＩＦ含有上清液（例１）と共にインキュベートし、そ
して次にＩＩＣ遠心分離機中で３００Ｏｒｐｍ、４℃に
て１０分間遠心する。次に上清液を、例４のＭＩＦ試験
におけるヒ）−ＭＩＦの残留量について試験する。この
方法において、ヒ）−ＭＩＦに対するモノクローナル抗
体を産生ずるＩＣ５と称するセルラインが同定される。

ｓｉｌ、ｏ０７の／ぐ一コル（商標、ファルマシア）９
部、１０倍濃縮されたエール（Ｅａｒｌ）のＭＥＭ（セ
ロメト）１部、及びスピンナー培地（セロメト）１０倍
を、ツルパル遠心分離機（デーポン）中で１２．ＯＯＯ
ｒｐｍ　、２０℃にて１２分間混合する。

４．２．　ＭＩＦ試薬のための標的細胞の取得９〜１２
の供与体からの６パフイーコート”すなわち白血球の細
胞濃縮物を１：２の比率でスピンナー培地（セロメト）
Ｋより稀釈し、２０℃に加熱し、そしてフィコール・ノ
ぐり（Ｆｉｃｏｌｌ　ｐｉｑｕｅ）（商標、ファルマシ
ア）上で２０℃にて製造者によって指示された方法で分
離する。中間相の単核細胞を遠心分離した後、同じ培地
で２回洗浄し、そして次ＫＩＥＣ遠心分離機中で２０℃
、　１６００ｒｐｍにて４０分間にわたり遠心すること
によシ、例４．１に従って調製し九パーコルグラジェン
ト中で単球とリンパ球とに分離する。単球をスピンナー
培地で３回洗浄し、２０％のウマ血清が添加されている
マツコイ（ＭｃＣｏｙ）　培地（セロメト）Ｋ入れ、そ
してテフロンノクッグ中の同じ培地中で７チＣ０２を通
しながら３７℃にて一夜培養する。

４．３　ＭＩＦ試験の実施 例４．２からの培養された単球をドゥルベコのＭＥＭ　
（セロメト）中で２回洗浄し、そして細胞濃度が５×１
０細胞／ｄとなるように、２倍濃度のドゥルペコＭＩｉ
ｌｉＭ　１部及び０．４１アガロース（マイルス）１部
の混合物中に入れる。この細胞懸濁液を、ハミルトンシ
リンジによシ、９６−ウェルプレート（ファルコン、ミ
クロテストｍ＞の内側の６０ウエルにｌμｌの滴として
移す。４℃にて１５分間の後アガロースが固化する。次
に、試験すべきサンプル溶液１００μｌを各ウェルに加
える。対照溶液として、１チのウマ血清が加えられてい
るドゥルペコＭＥＭを使用する。試験すべきサンプル溶
液の稀釈物を同じ培地中で調製する。プレートを、７１
　Ｃｏ２を通気しながら湿潤雰囲気下で３７ＣＩＣで１
５時間インキ−ベートスル。

アガロース滴からの単球の遊走を、顕微鏡の接眼レンズ
中の目盛付線目印によシ測定する。この測定は、滴の縁
に接するように網目の１つの軸を配置し、そして滴の縁
から細胞の遊走限界までの距離をそれに対して垂直な軸
を用いて測定することによシ実施する。目盛によシ測定
された対照溶液における細胞の遊走を１００％の遊走又
は０％の遊走阻害とする。サングル溶液において達成す
れた遊走距離を、それに関して遊走阻害チとして表示す
る。サンプル溶液の生物学的活性をＭＩＦ単位として表
示する。ＭＩＦ単位は、前記の試験方法において３０％
の遊走阻害を生じさせる生物学的活性として定義される
。従って、サンプル溶液のＭＩＦ単位の数値は、正確に
３０％の遊走阻害を生じさせるために溶液を稀釈しなけ
ればならないその稀釈係数に対応する。

精製 Ｂ　ａ　１　ｂ／ｃマウスヲ０．４コのプリスタン（カ
ール・ロス）により腹腔自前処理する。１週間後、２〜
５　Ｘ　１０’個のクローン化・・イブリドーマ細胞を
腹腔内注射する。各マウスから反復して腹水を採取し、
そして−８０℃にて凍結する。集められた液を解凍し、
そして４℃、１６．００　Ｏｒｐｍにて３０分間遠心分
離する。脂肪を吸引炉去し、そして残った破片を含有し
ない上清液に、０℃にて撹拌し万がら、５０％の濃度に
達するまで、飽和硫酸アンモニウム溶液をゆりくシと滴
加する。こうして沈澱した粗免疫グロブリン画分を、Ｄ
ＫＡＥ　Ａｆ　ｆ　ｉ　−Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅ　（商標、
ビオ−ラド）上で０．１Ｍ）リス−ａｃｔ（ｐＨ８，２
）を用いて、製造者によシ特定された方法によ勺クロマ
トグラフ処理する。活性画分を集め、そしてアミコンＸ
Ｍ５０　フィルター（アミコン）を用いて濃縮する。

Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　１０　（商標、ビオ−ラド）を、製
造者によシ特定された方法に従って、冷蒸留水及びカッ
プリング緩衝液ｐＨ７，５［ＭＯＰＳ、　３−　（Ｎ−
モルホリノ）プロ・千ンスルホン酸ＩＫより洗浄スル。

カップリング緩衝液（１ｄ）中上言上グルの５０チ懸濁
液をグラ゛スチックチーープに移し、同じ量の精製抗体
溶液（２０１ｖのモノクローナル抗体ＩＣ５）と混合し
、そして室温にて４時間回転せしめる。

次にグルをカップリング緩衝液で洗浄する。まだ遊離し
ている活性部位をブロックするため、グル１ｒｎｌ当ｆ
ｉＯ，ｌｌｌの１Ｍエタノールアミン−Ｈｃｔ（ｐＨ８
，０）Ｋよシ室温にて２時間グルを処理し、そしてグル
１ｒｎｌ当、９１０ｍモルのナトリウムアシドを含有す
るＰＢＳによシ洗浄し、そしてこの中で４℃にて保持す
る。カップリングの程度を２８０ｎｍにおける吸収を測
定することによシ決定する。これはグルｌｌ７Ｍ、９１
２〜３０■のモノクローナル抗体である。

以下余白 例７．　ヒ）−ＭＴＦ蛋白質の単離及び精製７．１　ヒ
ト−ＭＩＦの製造 例１に記載した方法に従って、１０　個の単核細胞をバ
フィーコートから単離し、そしてコンカナバリンＡ　（
ｃｏｎ　Ａ　）で刺激してリンフ才力インを産生せしめ
る。刺激された細胞を、２４時間、３７℃にて、５％Ｃ
Ｏを通気しながら、６０００ｃｒｎ２の培養面積を有す
るＮｕｎｃ積層槽中で、各場合に面積ｃｒｎ２当り０．
２５７１１ＪのＲＰＭＩ　１６４０培地中５×１０６細
胞の細胞濃度において培養する。次に、細胞培養土清液
を３５０００Ｘｇ、４℃にて３０分間遠心分離する。次
に、透明な上清液にフェニルメタンスルホニルフルオリ
ド、セリンゾロテアーゼ阻害剤（最終濃度５０μモル／
ｌ）、及びナトリウムアジド（最終濃度０．０５％）を
加える。

７．２　細胞培養上清液の濃縮 例７．１からの細胞培養土清液を、アミコン攪拌セル中
ＹＭＳメンプラン（名目分離限界二分子量５ｋｇ／Ｍｏ
１）上での限外沖過によシ１５倍に濃縮する。蛋白質の
吸着による損失を回避し、そして生する可能性のある凝
集を防止するために、限外濾過はトリトンＸ−１００（
商標）（アルキル−フェニルポリエチレングリコール、
ローム・アンド・ハース）を添加して行う。トリトンＸ
−１００の最終濃度は約０．２　ｗ／ｖ％とする。濃縮
物を３５０００ＸＩにて遠心分離し、そして０．２５μ
ｍのフィルターｃミリーア）を通してｐ遇する。

例７．２からの１１のリンフ才力イン濃縮物を、４℃に
て、約１０−７時の流速で、グルｍｌ当シ１２ｍｇの抗
体のカップリングの程度を有するグル４ｒＬ１．全収容
する抗体カラム（例６）に、ポンプを用いて通す。非特
異的に結合した蛋白質及び随伴する物質を、１ｏｏｍｚ
のＰＢＳ　／　０．５　ＭＮａＣｔ／　０．２係トリト
ンＸ−１００１０，０２％ナトリウムアジド、ｐＨ７，
３により洗浄し、そして次に２０ＭのＰＢＳによシ、そ
して最後に１０　ｍｌ　／　０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１に
よシ１５ｙｎｌ／時の流速で洗浄することによりカラム
から溶出する。特異的に結合したヒ）−ＭＩＦ蛋白質を
０．１Ｍグリシンヒドロクロリド／　０．　Ｉ　Ｍ　Ｎ
ａＣｔ。

Ｐ）１２．６の溶液で溶出する。この溶出は２８０ｎｍ
における吸収の自動測定（ユビコードＳ、ＬＫＳインス
トルメ／ツ）によシ監視する。吸着による損失を回避す
るため、溶出液′ｆｒ：ｌｏＯμｌの３　％　ＳＤＳ溶
液を収容するポリプロピレンチューブ中に３１ずつの両
分として集める。蛋白質含有画分を集め、そしてＩＭ）
リス溶液の添加によシ中和する。

７．４　電気透析、電気泳動濃縮 ″ｒｓｃｏエレクトロフォレテインク・コンセントレー
タ−”モデル１７５０　（ｌ５ｃｏ社）及び分子量３．
５に９／Ｍｏｌの名目分離限界を有するスペクトラポー
ル（商標）膜（７，ペクトラム・メディカル・インダス
トリーズ社）を用いて、例７，３からの中和された溶出
液を２５ｍモルの酢酸アンモニウム１０．０１チＳＤＳ
　、　ｐＨ８，３に対して透析し、そして同時に０．２
１ｄの容量に濃縮する。透析された濃縮物を真空遠心機
（スピード・バク・コンセントレータ−、サパント社）
中で蒸発によ）濃縮乾固して酢酸アンモニウムを除去す
る。

以下余白 ７．５　８ＤＳ−７リアクリルアミドグル電気泳動透析
された濃縮物（例７．４）のアリコート（約２　％　）
　ｋ、Ｌａｅｍｍｌｌ法［Ｕ、に、　Ｌａｅｍｍｌｌ　
、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ　）　２２７．６８０−
６８５（１９７０）　）に従って、１５％ポリアクリル
アミドスラブゲル上テの電気泳動にかける。蛋白質バン
ドを、クマッシーブリリアントブルー（フル力）による
染色及びＣ，Ｒ，Ｍｅｒｒｉｌ等〔アナリティカル・ビ
オケミストリー（Ａｎａｌ、　ＢＩｏｃｈｅｍ、）１１
０．２０１（１９８１））に従う銀染色法によシ可視化
する。これによれば、抗体カラムから溶出された物質は
分子量が約８ゆ／Ｍｏｌの蛋白質及び約１４ｋ１７７Ｍ
ｏｌの蛋白質、並びに相対的に非常に少量の分子量が約
２８に９／Ｍｏｌの蛋白質及び約４５に９７Ｍｏｌの蛋
白質を有する。

付は ヒ）−ＭＩＦの個々の蛋白質の低損失調製分離及び単離
は洗浄、例えばＳＤＳの存在下で有利に行われる（例７
．３．７．４及び７．７を参照のこと）。蛋白質のＭＩ
Ｆ活性ＦｉＳＤＳとの相互作用によシ破壊される。ＭＩ
Ｆ’活性は、次のようにして生合成的に放射性標識され
たリンフ才力インによシ個々の分子量画分に帰属せしめ
る。１０８個のヒト単核細胞を、３μｇ／―のコンカナ
バリンＡを含有するＲＰＭ１１６４０培地５１ｄＫ懸濁
し、そして２５（１）２の面積を有する細胞培養器〔ヌ
ンコロン（商標）ＴＣ２５）中で５％ＣＯ３を通気しな
がら３７℃にて２時間インキュベートする。次に培地を
除去し、そして細胞をロイシン不含ＲＰＭＩ　１６４０
培地中で２０時間培養し、これに１０μＣｔ　７ｍｌの
Ｌ−［Ｕ−”Ｃ）ロイシンを加える。放射性細胞培養上
清液全５００１ｄの非標識ヒ）−ＭＩＦ含有含有細胞培
養土例７１）と−緒にし、そして例７．２に記載したよ
うにして１５倍に濃縮する。例７，３と同様にして、０
．５ｍｌのグルを収容するカラムを用いてイムノアフィ
ニティークロマトグラフィーによシ単離し゛、ＳＤＳを
加えないで溶出液を集める。Ｉ　Ｍ　）　ＩＪス溶液で
中和した後、溶出液を５０ｍモルの炭酸水素アンモニウ
ム中セファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア）上
でのクロマトグラフィーに移し、ぞして凍結する。残渣
を０．５−のＰＢＳに溶解し、そして約３５０００Ｘｐ
において遠心する。０，１ｄのアリコートをＢｌｏ−８
ｉｌ　（商標）　ＴＳＫ−１２５カラム（７゜５Ｘ３０
０ｍ、　Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）を用いるＨＰＬＣによシ画
分する。画分を、放射能を測定しく標識された蛋白質と
して）、そしてＭＩＦ活性を決定する（例４）ことによ
り特徴付ける。放射能及びＭＩＦ決性が、約８　ｋｌｉ
ｌ／Ｍ　ｏ　１及び約１４　ｋｇ／Ｍｏｌの分子量領域
に対応する位置の画分に存在する。放射性溶出液の他の
アリコートを例７．５と同様にしてＳＤＳ　−ＰＡＧＥ
にかける。放射性蛋白質をオートラジオグラフィーによ
り可視化する。約８に９７Ｍｏｌ及び約１４　ｋｐ／Ｍ
ｏｌの分子量領域に強いバンドが現われ、そして約２８
に９７Ｍｏｌ及び約４５ｋｌ；ｌ／Ｍｏｌの領域に弱い
バンドが現われる。

約５０／の細胞培養上清液から成る例７．４に従って調
製された材料を、垂直スラブダル電気泳動系でのＬａｅ
ｍｍｌｉ法〔ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）２２７゜６
８０（１９７０））Ｋ従う不連続緩衝液系において５Ｄ
８−ＰＡＧＥによシ分離する。サンプルを、０．０５ト
リス−ＨＣＬ／３　ｖｒ／ｖ％８ＤＳ１０．０２Ｍジチ
オスレイトール／１０ｖ／ｖチグルセリン（ｐＨ６，８
）から成る組成の緩衝液３００μを中忙溶解し、そして
幅１．５ノ、厚さ１．５　ｃｍの、１５％アクリルアミ
ドを含有するグルに適用する。グル中の遊離基及び酸化
剤によって生ずる可能性がある蛋白質の誘導体化を回避
するため、ナトリウムチオグリコレ−）ｅｏ、１ｍモＷ
の濃度になるようにカソード緩衝液に加える（　Ｍ　、
Ｗ、Ｈｕ　ｎｋ　ａｐ　ｉ　１１　ｅ　ｒ等、メンッズ
・イン・エンチそロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ）９１＊２２７（１９８３）を参照の
こと〕。蛋白質を可視化するため、グルを氷冷した０、
２５　Ｍ　ＫＣ１溶液中に５分装置（（Ｄ、Ａ、Ｈａｇ
ｅｒ及びＲ，Ｒ，Ｂｕｒｇｅｓｓ　、アナリティカル・
ビオケミストリー（Ａｎａｌ　、Ｂｉｏｃｈａｍン里、
７６（１９８０）を参照のこと〕。８ｋｇハ０１及び１
４に９／Ｍｏｌの分子量領域の可視バンドを切シ取シ、
そしてＢｈｏｖｎ等〔アナリティカル・ビオケミストリ
ー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　１０３　、１８４
（１９８０））によシ記載された技法を用いて蛋白質を
グルから溶出する。この目的のため、スペクトロポール
（商標）膜（スペクトラム・メディカル・インダストリ
ーズ、名目分離限界３．５に９７Ｍ　ｏ　１　）を有す
る”ｌ５ＣＯエレクトロホーレテイツク・コンセントレ
ータ−”モデル１７５０　（Ｉ２Ｏ３社）中で、０．０
５Ｍ酢酸アンモニウム１０．０１％５ＤＥｉを用いて、
２ワツトの出力において８時間にわたって溶出する。溶
出した蛋白質は約１５０μｔの容量でサンプリングカッ
プ中に見出され、そして緩衝物質（グリシン、トリス）
を含有しない。酢酸アンモニウムを除去するため、電気
溶出液を真空遠心機（スピード・バク・コンセントレー
タ−、サパント社）中での蒸発により濃縮乾固する。

溶出された蛋白質の均−性及び収量を、各場合に約５％
の溶出液を分析用５ＤＳ−ＰＡＧＥ例７．５）にかける
ことによシ試験する。この際、既知の分子量を有する規
定された量の蛋白質をサンプルと平行して電気泳動にか
ける。５ＤＳ−ＰＡＧＥは、８に９／　Ｍ　ｏ　１の分
子量領域からの溶出液中の均一蛋白質バンド、及び１４
ｋｇ／Ｍｏｌの分子量領域からの溶出液中の均一・々ン
ドを示す。

例７．２からのヒ）−ＭＩＦ含有培養土清液の濃縮液２
ｔｆ、約１５ｄ／時の流速で、グルｄ当シ約１２Ｗ９の
ＩＯ２抗体のカップリングの程度を有するグル５Ｗｔｌ
ヲ収容する抗体カラム（例６）に、ポンプにより通す。

例７．３と同様にしてカラムを洗浄し。

そして特異的に結合したヒ）　−ＭＩＦ蛋白質を０．１
Ｍグリシンヒドロクロ゛リド１０．ＩＭ　ＮａＣＬ　（
ｐＨ２，６）によシ溶出する。溶出液は、　８ＤＳを添
加してないポリプロピレンチューブ中に画分して集める
。溶出液は２８０　ｎｍにおける吸収の測定、及びＭＩ
Ｆ活性の検出（例４）によシ監視する。

４パツチ（合計８ｔの培養上清濃縮液から成る）からの
−緒にした溶出液を、０．００５　Ｍ酢酸アンモニウム
（ｐＨ７，５）に対して透析し、そして例７．４と同様
にして同時に０．２　ｄの容量に濃縮する。この濃縮物
を、　Ｓｔ　３００Ｐｏｌｙｏｌ　（商標）０．００３
ｍを収容する０、０５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７，５
）で平衡化されたＨＰＬＣカラム（セルパ、ハイデルベ
ルグ、***）に導入し、そして４０パールの圧力及び０
．３１！Ｌｌ／分の通流速度で０．０５Ｍ酢酸アンモニ
ウム（ｐＨ７，５）によシ溶出する。２８０ｎｍにおけ
る吸収の測定、　ＭＩＦ活性の決定（例４）、及び例１
０のエンザイムイムノアッセイによシ溶出を監視する。

蛋白質含有量及びＭＩＦ活性に関する主要部分が約８　
ｋｌｉ’／Ｍ　ｏ　１及び約１４に９ハｏｆの分子量領
域に対応する位置の画分に見出され、一層少い部分が約
２８ｋｇ／Ｍｏ　ｌ及び約４５に９／Ｍｏｌの分子量領
域の画分中に見出される。酢酸アンモニウムを除去する
ため、ヒ）−ＭＩＦ蛋白質を含有する両分を反復して凍
結乾燥する。

以下余白 例８、アミノ酸配列分析 例７．７からの分子量８嬌’Ｍｏ　ｌの精製蛋白質を１
ガス−７エーズ・プロティン・シークエンサー・モデル
４７０”（アプライド・ビオシステムス）を用いて、Ｍ
、Ｗ、　Ｈｕｎｋａｐｉ　ｌ　ｌｓｒ及びり、Ｅ、Ｈｏ
ｏｄ　（メソッズ・イン・エンチモロジー（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎＥｎｚ）ｒｍｏｌｏｇｙ）　９１　ｔ３９９
（１９８３）：ｌに従って配列決定する。フェニルチオ
ヒダントイン−（ＰＴ）Ｉ）　−アミノ酸へのアニリノ
−チアゾリノン誘導体の再配置を、５０℃にて２５％ト
リフルオロ酢酸で処理することにより行う。ＰＴ）（ア
ミノ酸をゾルパックス（Ｚｏｒｂａｘ　）　ＣＮ　（商
標）カラム（ｙ”　ｚポン、２００Ｘ４．６ｍ）上で分
析する（　Ｒｅ　Ｋｎｅｃｈｔ等。

アナリティカル・ビオケミストリー（Ａｎａｌ。

Ｂｌｏｃｈｅｍ、）１３０，６５（１９８３）を参照の
こと〕。

次のような明確なＮ一端アミノ酸配列が見出される。

０ Ｍｅ　ｔ−Ｌａｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌ　ｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　
ｕ−Ｌｙｓ　−Ａｌ　ａ−Ｌｅ　ｕ−Ａｓｎ−８ｅ　ｒ
−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｉ　１　ｅ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−Ｔｙｒ
−Ｈｌ　ａ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−８ｅ　ｒ−Ｌｅ　ｕ−Ｉ
　１　ｅ　−４５５０ Ｔｙｒ（ｌ　ｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａ
ｌ　ａ−Ａｓｐ’−Ｖａ　１−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ　−Ｌｙ
ｇ−Ｇｌ　ｕ　−Ｌｅ　ｕ−Ａｓ　ｐ−Ｉ　１　ｅ−Ａ
ｓｎ−Ｘ６２−Ｘ６３−Ｘ６４−Ａｌ　ａ　−Ｖａ　１
この配列中、Ｘ４２はＳｅｒ又はＣ１０である。Ｘ６２
　＋　Ｘ６５及びＸ６４は特定でれていないアミノ酸を
示す。

８．２　分子量１４　ｋｐ／Ｍｏ　ｌのＭＩＦ蛋白質例
７．７からの分子量１４　ｋｇ７Ｍｏ　１の精製蛋白質
を例８．１と同様にして配列決定する。次のような明確
なＮ一端アミノ酸配列が見出される。

Ｘ　１−Ｌｅ　ｕ−Ｔｈ　ｒ　−Ｇｌ　ｕ−Ｌｅ　ｕ　
−Ｇｌ　ｕ−Ｌｙｓ−Ａｌ　ａ−Ｌｅｕ　−Ａｓ　ｎ−
８ｓ　ｒ　−５ １１ｅ−１１ｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｌ
ｙａ　−Ｔｙｒこの配列中Ｘ、は特定されていないアミ
ノ酸を示す。

例９．　マウスＭＩＦに対するモノクローナル抗体の製
造 ９．１　マウスＭＩＦを含有する蛋白質画分の取得Ｃ，
Ｓｏｒｇ　Ｉ：モレキュラー−イムノロジ−（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＩｒｔ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ）　１７．５６５
（１９８０）　：ｌによｐ記載シ＋１争・士辻Ｖ庁−イ
　１００面のＲ負１ｈ／−マウスからの肺臓細胞をコン
カナバリンＡで刺激することによシ細胞上清液を得、こ
れをセファデックスＧ−１００上でクロマトグラフ処理
することによシ４０〜７０に９７Ｍｏｌの範囲の分子量
のマウス−ＭＩＦ蛋白質を含有する溶液的５０１ｎｌを
得る。

９．２　羊赤血球へのマウス−ＭＩＦ含有蛋白質画分の
接合 例９．１からの両分を４．５ｄの合計容量に濃縮し、そ
して例２．１と同様にして、グルタルアルデヒドによシ
前処理された羊赤血球（ＳＲＢＣ）に連結する。

９６３　ラットの免疫 ０．１０，４３．及び３０９日目Ｋ１例９．２からのマ
ウスＭＩＦと連結された０、５ｄずつの５ＲＢＣを、Ｑ
、５ｍ／ずつの完全フロインドアジュバントと一緒に７
回注射することにより、ＤＡブラット免疫する。この場
合注射量の半分を腹腔内（１−ｐ−）注射し、そして他
の半分は４分割して皮下（、、Ｃ，）注射する。さらに
、３１２，３１３．及び３１４日目Ｋ１０．５ｄずつの
接合体懸濁液をアジュバントを伴わないで”追加”免疫
注射（１，ｐ、）する。処理されたラットの肺臓を３１
７日目に摘出する。

９．４　細胞融合 例２，３と同様にして、免疫されたラットの肺臓リンパ
球１．１４Ｘ１０　個を３．５×１０７個のマウス骨髄
腫細胞Ｐ　３−　Ｘ６３−　Ａｇ　８．６５３と融合せ
しめ、そして）ＥＡＴ培地中で培養する。

例３１及び３．２に記載した方法と同様にして、例９，
４に従って得られた２４４個のノ・イブリドーマセルラ
インから、ラット赤血球に連結された（例９．２と同様
にして連結する）マウスＭＩＦを含有する両分からの蛋
白質に結合するモノクローナル抗体を分泌する４９クロ
ーンを選択する。これら４９細胞クローンの培養土清液
からのγ−グロブリンを、例３．３の方法に従ってＡｆ
ｆｉ−Ｇ＠ｌ（商標）１０（ビオ−ラド）に連結し、そ
してコンカナバリンＡで刺激された膵臓細胞のマウス−
ＭＩＦ含有上清液（例９，１）と共にインキュベートす
る。次に、上清液をマウス−ＭＩＦのその残留量につい
て試験する。この目的のために、マウス−ＭＩＦの含量
を例４，３と同様にして行われるＭＩＦ試験により決定
する。しかしながらこの場合、培養されたヒト単球の代
シに、１０％ＦＣ８を含有するドゥルペコＭＥＭに入れ
られそしてアガロース筒中に固定されたマウス腹腔マク
ロファージを使用する。

この選択法を用いて、マウス−ＭＩＦに対するモノクロ
ーナル抗体を産生ずる６個のハイツリドーマセルライン
、特に７Ｄ】０と称する細胞クローンが同定される。こ
れらの抗体はまた例４に従うＭＩＦ試験においてヒ）−
ＭＩＦと結合し、従って交差活性を示す。

９．６　腹水からのモノクローナル抗体の単離及び精製 例５と同様にして、グリスタンにより前処理されたＢａ
１ｂ／ａ−ｃｒラウス　ｎｕ／ｎｕ）に、１×１０７個
のクローン化ハイプリドーマ細胞を腹腔内注射し、そし
て腹水から抗体を得る。

１０μ９／ＴＬｌの濃度の精製された抗体溶液ＩＣ５（
抗−ヒト−ＭＩＦ）　１００μｔを９６−ウェルミクロ
タイタープレート（コスタ−、テクノラマ）の各ウェル
中で３７℃にて１時間インキュベートする。

ＰＧＴ−２０−緩衝液〔０，２％ゼラチン（メルク）及
び０．０５％）ウィーン２０が添加されているＰＢＳ）
により３回洗浄し、そしてプレート底の々お存在する蛋
白質反応性結合部位を、ウェル当υ２５０μｔのＰＧＴ
　−２０−緩衝液との３７℃にて１時間にわたるインキ
ュベーションによ勺飽和する。試験溶液の一連の稀釈物
５０μを又はヒト−ＭＩＦを含有する標準溶液をミクａ
タイターグレートのウェル中で３７℃にて１時間インキ
ュベートする。未結合部分をＰＧＦ−２０−緩衝液で３
回洗浄して除去し、そして次に抗体７Ｄ１０　（抗−マ
ウス−ＭＩＦ、ヒト−ＭＩＦと交差反応性である）とビ
オチンＮ−ヒドロキシザクシンイミジルエステルとから
調製され（マデック、ビオチンと抗体７Ｄ１０とのモル
比＝４〜７：１）そしてセファデックスＧ−２５上で精
製貞れデー枡仝伏（Ｉ　Ｑ　Ｂｉｊ／ｍｌ　）の１）’
ＲＱ山戻這ルウエル中で３７℃にて３０分間インキュベ
ートする。プレートをＰＧＴ　−２０＝緩衝液によ９３
回洗浄した後、プレートに結合したビオチン−抗体接合
体ヲ、アビジン−ホースラディツシュ／？−オキシダー
ゼ接合体（０，３μ！ｊ／ｍ／）（シグマ）の１：３０
００稀釈溶液１００μｔとインキュベートすることによ
シ反応せしめる。プレートを洗浄した後、２．２′−ア
ジノービス−（３−エチルペンツチアゾリン−６−スル
ホン酸）ジアンモニウム塩の溶０．０５Ｍクエン酸塩、
０．１　Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ，、、ｐ”　４．０中５５ｍ
ｇ）による発色、及び４０５　ｎｍにおける光度計によ
る測定により、捕捉された酵素の量を決定する。

ビオチン−抗体７Ｄ１０接合体の代シに、同様にして調
製されたビオチン−抗体工Ｃ５接合体を使用することが
できる。しかし、この方法によシ行われるＥＬＩＳＡは
ヒ）　−ＭＩＦに対して低い感度を有する。

例１１．　ＭＩＦ−ＥＬＩＳＡ用の試験キット例１０に
記載したエンザイムイムノアッセイ用試験キットは次の
ものを含む。

０ポリグロビレンミクロタイターフレート。

０モノクローナル抗体ＩＣ５の溶液（１０μ９／ｍ１）
２０−０ ０モノクローナル抗体７Ｄ１０のビオチン接合体（ビオ
チンと抗体７Ｄ１０とのモル比＝５＝１．１０μｇ／ｍ
ｌ　）　１０　ｍｌ。

０アビジン−ホースラディツシュパーオキシダーゼ接合
体（０，３μ９７ｍ１　）　１　ｍｌ　００２　、２’
−アジノービス−（３−エチルベンツチアゾリン−６−
スルホン酸）ジアンモニウム塩１１ｒｖ。

０クエン酸／燐酸緩衝液（０，０５Ｍクエン酸塩１０、
　ｉ　Ｍ　Ｎａ　２ＨＰＯ４）　２０　ｍｌ　００３０
％Ｈ２Ｏ２１ｄ０ ｏＰＢＳ　１００ｍ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、精製されたヒト−マクロファージ遊走阻止因子（ヒ
   ）　−ＭＩＦ　）及びその個々の蛋白質。 ２、ヒ）−ＭＩＦに対する抗体によシ認識されそしてそ
   れに結合されるエビドーグを有するヒト−由来の蛋白質
   のみを含有し、そしてマクロファージの遊走が測定され
   る標準的試験方法において活性であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の精製されたヒト−ＭＩＦ。 ３　分子量が約８ｋｇ／　Ｍｏ　１、約１４に９／Ｍｏ
   ｌ、約２８　ｋＬ’Ｍｏ　ｌ及び約４５　ｋｌ／Ｎｏ　
   １の少なくとも４種類の個々の蛋白質、並びに場合によ
   ってはさらに、個々の蛋白質又は約４５　ｋｌ；Ｊ／Ｍ
   ｏ　１よシ高い分子量を有するオリゴマー蛋白質凝集体
   から成ることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第
   ２項記載の精製されたヒ）−ＭＩＦ。 ４、Ｎ一端アミノ酸配列がＸ、−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
   ｕ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓ
   ｎ−８ｅｒ−１１ｅ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
   −Ｈｉｓ−Ｌｙｌｌ−Ｔｙｒ　（ここで、アミノ酸Ｘ、
   は特定されない）で表わされる特許請求の範囲第１項記
   載の蛋白質。 ５、Ｎ一端アミノ酸配列がＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｂｒ−Ｇ
   ｌｕ　−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｈｌ　５−Ｌｙｅ−
   Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−４１ｅ−０ Ｌｙａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｈｉｇ−Ａｌａ−Ｖ
   ａｌ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−５ Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌ
   ｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ　−Ｇｌｕ−Ｘ４２−Ｐｒｏ−Ｇ
   ｌｎ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａａ
   ｐ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｘ６２−Ｘ６５−Ｘ６４−Ａｌａ
   −Ｖａｌ　（ここで、アミノ酸Ｘ４□、Ｘ６２、Ｘ６３
   及びＸ６４は特定されず、しかしＸ４２はＳｅｒ又はｃ
   ｙ、のみを意味することができる）で表わされる特許請
   求の範囲第１項又は第４項に記載の蛋白質。 ６、およその分子量が８に９／Ｍｏｌである特許請求の
   範囲第１項、第４項又は第５項記載の蛋白質。 ７、およその分子量が１４に９／Ｍｏｌである特許請求
   の範囲第１項又は第４項記載の蛋白質。 ８．精製されたヒ）　−ＭＩＦ及びその個々の、蛋白質
   の製造方法であって、所望によシそれ自体公知の精製段
   階の後に、ヒ）−ＭＩＦを含有する溶液を、ａ）ヒト＝
   ＭＩＦに対して特異的なモノクローナル抗体を有する支
   持体と接触せしめ、非結合蛋白質及び他の外来性物質を
   除去し、前記抗体に結合したヒト−ＭＩＰを選択的に切
   シ離しそして単離し、ｂ）そして所望によシ、精製され
   たヒ）−ＭＩＦを個々の蛋白質に分離する、 ことを特徴とする方法。 ９、前記ヒト−ＭＩＰ含有溶液がコンカナバリンＡで刺
   激されそＩ−て培養された単核細胞の細胞培養上清液で
   ある特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、前記ヒ）−ＭＩＦ含有溶液をあらかじめ限外沖過
   にかけそして濃縮する特許請求の範囲第８項又は第９項
   記載の方法。 １１、段階ａ）において精製されたヒ）−ＭＩＦを調製
   用ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電
   気泳動によシその個々の蛋白質に分離する特許請求の範
   囲第８項、第９項又は第１０項記載の方法。 １２、段階ａ）において精製されたヒ）−ＭＩＦを調製
   用ダル濾過ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）に
   よシ個々の蛋白質に分離する特許請求の範囲第８項、第
   ９項又は第１０項に記載の方法。 １３、ヒト−マクロファージ遊走阻止因子（ヒ）　−Ｍ
   ＩＦ　）に対するモノクローナル抗体、及びその誘導体
   。 １４、マウス／マウス−ハイブリドーマ細胞によって産
   生されることを特徴とする特許請求の範囲第１３項記載
   のモノクローナル抗体及びその誘導体。 １５、ラット／マウス−ハイブリドーマ細胞によって産
   生されることを特徴とする特許請求の範囲第１３項記載
   のモノクローナル抗体及びその誘導体。 １６、特許請求の範囲第１３項記載のモノクローナル抗
   体ＩＣ５゜ １７、％許請求の範囲第１３項記載のモノクローナル抗
   体７Ｄ１０゜ １８、ヒト−マクロファージ遊走阻止因子（ヒ）　−Ｍ
   ＩＦ　）に対するモノクローナル抗体及びその誘導体の
   製造方法であって、該モノクローナル抗体を産生ずるハ
   イブリドーマ細胞を、 ａ）イン−ヒドロ培養し、そして培養上清液からモノク
   ローナル抗体を単離し、又は ｂ）適当な哺乳動物中でインーピが増幅し、そして該哺
   乳動物の体液からモノクローナル抗体を単離し、 Ｃ）そして所望にょシ、得られたモノクローナル抗体を
   その誘導体に転換する、 ことを特徴とする方法。 １９、Ｂａ１ｂ／ｃマウス由来のハイブリドーマ細胞を
   炭化水素で前処理されている場合があるＢ　ａ　１　ｂ
   　／ｃマウスに注射し、８〜１ｏ日間の後肢動物から腹
   水全採取し、そして硫酸アンモニウムによる沈澱及びク
   ロマトグラフ精製にょシ抗体を単離することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０　ヒト−ＭＩＦに対するモノクローナル抗体を産生
   ずることを特徴とするハイツリドーマセルライン。 ２１、マウス骨髄腫細胞とマウスリンパ球とのハイブリ
   ドーマであることを特徴とする特許請求の範囲第２０項
   記載のハイブリドーマセルライン。 ２２、マウス骨髄腫細胞とラットリンパ球とのハイブリ
   ドーマであることを特徴とする特許請求の範囲第２０項
   記載のハイブリドーマセルライン。 ２３、ノ母スツール研究所（）千す）の”　Ｃｏ１１ｅ
   ｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｓ　ｄ＠Ｃｕ１ｔｕｒｅ
   ｓ　ｄｅＭｉｅｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ　”にＡ　Ｉ
   −３１６として寄託されている特許請求の範囲第２０項
   記載のハイブリドース・セルラインＩＣ５゜ ２４、ノｆスツール研究所（パリ）の ”　Ｃｏ１１ｓｅｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｓ　ｄｅ
   　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄ。 Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ”にＡ　Ｉ　−４１８
   として寄託されている特許請求の範囲第２０項記載のハ
   イブリドーマセルライン７Ｄ１０゜ ２５、ヒト−ＭＩＦに対するモノクローナル抗体を産生
   するハイブリドーマ細胞の製造方法であって、適当な哺
   乳動物をＭＩＦ又はＭＩＦ接合体にょシ免疫し、該哺乳
   ｉ物から取シ出された抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合
   せしめ、得られたハイブリドーマ細胞をクローン化し、
   そして所望のモノクローナル抗体を産生ずる細胞クロー
   ンを選択することを特徴とする特許請求の範囲第２０項
   記載の方法。 ２６、Ｂａ１ｂ／ｃマウスからの抗体産生細胞をセルラ
   インＸ６３−Ａｇ　８．６５３又はｓｐ　２１０−Ａｇ
   　１４の骨髄腫細胞と融合せしめることを特徴とする特
   許請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７、ＤＡクラットらの抗体産生細胞をセルラインｘ６
   ３−Ａｇ　８．６５３の骨髄腫細胞と融合せしめること
   を特徴とする特許請求の範囲第２５項記載の方法。 ２８、免疫するためにヒ）−ＭＩＦ含有蛋白質画分と免
   疫原担体との接合体を使用することを特徴とする特許請
   求の範囲第２５項記載の方法。 ２９、免疫するためにマウス−ＭＩＦ含有蛋白質両分と
   免疫原担体との接合体を導入することを特徴とする特許
   請求の範囲第２５項記載の方法。 ３０、ヒト−マクロファージ遊走阻止因子（ヒ）−ＭＩ
   Ｆ）の定性的及び定量的測定のための、ヒ）−ＭＩＦに
   対するモノクローナル抗体及びその誘導体の使用。 ３１、ラジオイムノアッセイにおける、特許請求の範囲
   第３０項記載のモノクローナル抗体及びその誘導体の使
   用。 ３２、エンザイムイムノアッセイにおける、特許請求の
   範囲第３０項記載のモノクローナル抗体及びその誘導体
   の使用。 ３３、ヒト−ＭＩＦに対するモノクローナル抗体及び／
   又はその誘導体、並びに場合によっては付属物を含むこ
   とを特徴とするヒ）−ＭＩＦの定性的及び定量的測定の
   ための試験キット。 ３４、ラジオイムノアッセイのための特許請求の範囲第
   ３３項記載の試験キット。 ３５、エンザイムイムノアッセイのための特許請求の範
   囲第３３項記載の試験キット。 ３６、ヒ）−ＭｒＦを精製するための、ヒト−ＭＩＦに
   対するモノクローナル抗体及びその誘導体の使用。 ３７、医薬として有効な量の精製されたヒト−ＭＩＦ又
   はその個々の蛋白質、及び有意量の医薬助剤を含んで成
   る医薬。 ３８、医薬として有効な量のヒ）−ＭＩＦに対するモノ
   クローナル抗体又はその誘導体、及び有意量の医薬助剤
   を含んで成る医薬。 ３９、合成ホスファチジルセリン及びホスファチジルコ
   リンの混合物から成るリポゾームの水性分散体の形であ
   る特許請求の範囲第３７項記載の医薬。 以下余白