JPS60237998A - Method of measurement of alpha-amylase activity - Google Patents

Abstract

PURPOSE:In the titled method of measurement using a novel-amylase substrate, to provide method of measurement with a small error and improved reproducibility, by using an alpha- and/or beta-phenylmatooligoside having a modified nonreducing end as a substrate. CONSTITUTION:An alpha- and/or beta-phenylmaltooligoside (formula) obtained by modifying a nonreducing end of maltooligosaccharide such as maltotetraose, maltopentaose, etc. with a halogen atom, -X-R<3> or glucopyranose residue is used as a substrate. A test specimen is brought into contact with it in the presence of alpha-flucosidase and/or glucoamylase, and, if necessary, beta-glucosidase, and a free phenolic compound is measured, to measure alpha-amylase activity in the test specimen.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なα−アミラーゼ基質を用いたαアミラー
ゼ活性測定法に関するものである。最近、ヒト体液中の
アミラーゼ活性の測定用基質として、構造の明確なマル
トオリゴ糖、例えばマルトテトラオース、マルトペンタ
−オース、マルトヘキサオースなどが使用される様にな
りつつある。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for measuring α-amylase activity using a novel α-amylase substrate. Recently, maltooligosaccharides with well-defined structures, such as maltotetraose, maltopentaose, and maltohexaose, have come to be used as substrates for measuring amylase activity in human body fluids.

これらのうち代表例としてマルトペンタオースを基質と
して使用する場合をとりあげて説明すると、測定様式は
次の様に表わすことができる。Taking up and explaining the case where maltopentaose is used as a substrate as a typical example of these, the measurement format can be expressed as follows.

（１）　マルトペンタオースーーーーーーー１戸アミラ
ーゼ マ　ル　ト　−　ス　＋　１ワレトトリオース＋２１　
マルトース＋マルトトリオース一一］７ここに生成した
グルコースは、公知の方法、例えコムターゼ／グルコー
ス−６−ホスフｚ−）ｆヒロ ドへゲナーゼ／ＮＡＤＨ系等で測定される。(1) Maltopentaose---1 unit amylasemaltose + 1waretotriose+21
Maltose+maltotriose 1]7 Glucose produced here is measured by a known method, such as a commutase/glucose-6-phosphz-)fhydrogenase/NADH system.

ところがこの測定系には、基質（マルトオリゴ糖）に対
しわずかではあるが、α−グルコシダーゼが作用すると
いう欠点があり、ブランク値が上昇する。However, this measurement system has the drawback that α-glucosidase acts, albeit slightly, on the substrate (maltooligosaccharide), which increases the blank value.

他方、マルトオリゴ糖の還元末端にフェニル基、ナフチ
ル基或はそれらの類似体を結合した基質が合成され、次
の様なものを基質とするアミラーゼ測定試薬が提案され
ている。On the other hand, substrates in which phenyl groups, naphthyl groups, or analogs thereof are bonded to the reducing end of malto-oligosaccharides have been synthesized, and amylase measurement reagents using the following substrates have been proposed.

ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオサイト（特公昭５７
−５３０７９号公報） ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオサイド（特公昭５７
−５３０７９号公報） ｐ−ニトロフェニルマルトへブタオサイド（特１：１１
ｉ１昭５４−５１８９２号公報）２．４−ジクロロフェ
ニルマルトペンタオサイト（特開昭５６−３５９９８号
公報） これらの化合物を基質とするアミラーゼ活性の測定様式
を例示すると、次の様になる。p-Nitrophenylmaltopentaosite (Special Publication 1984)
-53079 Publication) p-Nitrophenylmaltohexaoside (Special Publication No. 1983)
-53079 Publication) p-Nitrophenylmaltohebutaoside (Special 1:11
i1 Publication No. 54-51892) 2,4-Dichlorophenylmaltopentaosite (Japanese Patent Application Laid-open No. 35998-1987) Examples of the measurement format for amylase activity using these compounds as substrates are as follows.

ｐ−ニトロフェニル−α−マルトペンタサイトの場合 ｆｉｌ　ｐ−ニトロフェニル−α−マルトペンタオサイ
ド−ＬＬムニヱ→ｐ−ニトロフェニル−α−マルトサイ
ド＋マルトトリオース トロフェノール＋グルコース この系においても、基質のｐ−ニトロフェニル−ａ−マ
ルトペンタオサイドにα−グルコシダーゼが作用してブ
ランク値が上昇する。In the case of p-nitrophenyl-α-maltopentasite, fil p-nitrophenyl-α-maltopentaoside-LLmuniie → p-nitrophenyl-α-maltoside + maltotriostrophenol + glucose Also in this system, α-glucosidase acts on the substrate p-nitrophenyl-a-maltopentaoside, increasing the blank value.

（１１２，４−ジクロロフェニル−β−マルトヘンタオ
サイド　ｙｓｔ二二→２，４−ジシクロロフェニルーβ
−マルトサイド＋マルトトリオース（２−ａ　）　２．
４−クシクロロフェニル−β−α−グルコシ マルトサイド＋マルトトリオース□ ダーゼ 一一一→２．４−ジクロロフェニル−β−グルコサイド
＋グルコース （２−ｂ）２．４−ジｌクロロフェニルーβ−β−グル
コシダーゼ グルコサイド　２．４−ジ クロロフェノール＋グルコース この系においても、基質である２、４−ジクロロフェニ
ル−β−マルトペンタオサイトニα−クルコシダーゼが
作用してブランクが上昇する。(112,4-dichlorophenyl-β-maltohentaoside yst22→2,4-dicyclophenyl-β
-Maltoside + maltotriose (2-a) 2.
4-cyclophenyl-β-α-glucosymaltoside + maltotriose □ Dase 111 → 2.4-dichlorophenyl-β-glucoside + glucose (2-b) 2.4-dichlorophenyl-β- β-glucosidase glucoside 2.4-dichlorophenol+glucose In this system as well, the blank increases due to the action of the substrate 2,4-dichlorophenyl-β-maltopentaocytoid α-glucosidase.

結局、従来提供されてきた基質を使用する測定系では、
α−グルコシダーゼが基質に作用することから、試薬ブ
ランク値の上昇が著しいという問題点がある。さらにα
−グルコシダーゼ液と基質液の一液化は、α−グルコシ
ダーゼの基質分解により、試薬の安だ性を著しく損うと
いう共通の問題点があった。In the end, in the measurement system that uses conventionally provided substrates,
Since α-glucosidase acts on the substrate, there is a problem in that the reagent blank value increases significantly. Further α
- Consolidation of glucosidase solution and substrate solution into one solution has a common problem in that the stability of the reagent is significantly impaired due to substrate decomposition of α-glucosidase.

　５− そこで、本発明者等は種々研究した結果、非遣元末端に
置換基を導入することにより、これらの問題点が解決で
きることを知り、本発明を完成するに到った。5- Therefore, as a result of various studies, the present inventors found that these problems could be solved by introducing a substituent at the terminal of the non-selecting group, and thus completed the present invention.

すなわち本発明は、 （式中　Ｒ−はハロゲン原子または−Ｘ−Ｒ″　または
グルコビラノース残基を示す。That is, the present invention has the following characteristics: (In the formula, R- represents a halogen atom, -X-R'', or a glucobylanose residue.

Ｘは０、ｏｏｃ、ｏｓｏ、またはＮＨｅ示し、ＲｓたＲ
２は置換または未置換のフェノール残基を示す。ｎは０
〜８の整数を示す。）で表わされる非還元性末端を修飾
したα−および／またはβ−フェニルマルトオリゴサイ
ドを基質として、α−グルコシダーゼおよび／またはグ
ルコアミラーゼお　６− よび必要によりβ−グルコシダーゼの共存下に、試料を
接触させ、遊離するフェノール系化合物を測定すること
により、試料中のα−アミラーゼ活性を？Ｉ１．ｌＩ定
することを特徴とするα−アミラーゼ活性測Ｔ法である
。X represents 0, ooc, oso, or NHe;
2 represents a substituted or unsubstituted phenol residue. n is 0
Indicates an integer of ~8. ) using α- and/or β-phenylmalto-oligoside modified with a non-reducing end as a substrate in the presence of α-glucosidase and/or glucoamylase and β-glucosidase if necessary. By measuring the released phenolic compounds, the α-amylase activity in the sample can be determined. I1. This is a T method for measuring α-amylase activity, which is characterized by determining II.

本発明の基質はマルトオリゴ塩の非還元性末端が・・ロ
ゲン原子、−Ｘ　−Ｒ’　またはグルコビラノース残基
により修飾されている。In the substrate of the present invention, the non-reducing end of the maltooligosalt is modified with a rogen atom, -X-R' or a glucobylanose residue.

本発明に用いるマルトオリゴ塩は糖の数が２〜１０であ
り、具体的にはマルトース、マルトトリオース、マルト
テトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
ス、マルトヘプタオース等がある。特にマルトテトラオ
ース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マル
トヘプタオースが好ましい。The maltooligo salt used in the present invention has 2 to 10 sugars, and specific examples include maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, and maltoheptaose. Particularly preferred are maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, and maltoheptaose.

本発明の基質に修飾されるノ・ロゲン原子としては、喝
素、臭素、フッ素、沃素が挙げられる。Examples of the nitrogen atom to be modified in the substrate of the present invention include nitrogen, bromine, fluorine, and iodine.

本発明の基質に修飾される一Ｘ　−Ｒ”は、　Ｘが０、
ＯＯＣ％Ｏ８Ｏ，またはＮＨを示し、Ｒ′は炭素原子数
１〜６のアルキル基、置換アルキル基、フェニル基マタ
はアルキル置換フェニル基、アルコキシ置換フェニル基
等の置換フェニル基またはピリジル基を示し、具体的に
はメトキシ、エトキシ等のアルコキシ基、フェノキシ基
、アルキル置換フェノキシ基、アルコキシ置換フェノキ
シ基、ピリジルオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基
、ペンツイルオキシ基、アルキル置換ベンゾイルオキシ
基、アルコキシ置換ヘンジイルオキシ基、ピリジルカル
ボニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、フェニ
ルスルホニルオキシ基、トシルオキシなどのアルキル置
換フェニルスルホニルオキシ基、アルコキシ置換フェニ
ルスルホニルオキシ基、ヒリジルスルホニルオキシ基、
モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アニリノ
基、トルイジノなどのアルキル核置換アニリノ基、アニ
シジンなどのアルコキシ置換アニリノ基、ピリジルアミ
ン基などが挙げられる。1X-R” modified to the substrate of the present invention, X is 0,
OOC%O8O, or NH, R' represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a substituted alkyl group, a phenyl group represents an alkyl-substituted phenyl group, a substituted phenyl group such as an alkoxy-substituted phenyl group, or a pyridyl group; Specifically, alkoxy groups such as methoxy and ethoxy, phenoxy groups, alkyl-substituted phenoxy groups, alkoxy-substituted phenoxy groups, pyridyloxy groups, alkylcarbonyloxy groups, pentyloxy groups, alkyl-substituted benzoyloxy groups, and alkoxy-substituted hendiyloxy groups. group, pyridylcarbonyloxy group, alkylsulfonyloxy group, phenylsulfonyloxy group, alkyl-substituted phenylsulfonyloxy group such as tosyloxy, alkoxy-substituted phenylsulfonyloxy group, hyridylsulfonyloxy group,
Examples include monoalkylamino groups, dialkylamino groups, anilino groups, alkyl-nucleus-substituted anilino groups such as toluidino, alkoxy-substituted anilino groups such as anisidine, and pyridylamine groups.

本発明の基質に修飾されるグルコビラノース残基として
は、αおよびβ（ｌ→６）のグルコビラノース残基など
が挙げられる。Examples of the glucobylanose residues to be modified in the substrate of the present invention include α and β (l→6) glucobylanose residues.

本発明の基質は還元性末端に置換または未置換のフェニ
ル基を有するα−および／またはβ−フェニルマルトオ
リゴサイドでもある。The substrates of the present invention are also α- and/or β-phenyl malto-oligosides having a substituted or unsubstituted phenyl group at the reducing end.

本発明の基質にα−および／またはβ−結合により結合
した置換または未置換のフェノール類とコキシ基、アル
コキシカルボニル基またはニトロ基を有するフェノール
類であり、例えばクロロフェノール、ジクロロフェノー
ル、ヒドロキシフェノール１アルキルフエノール、アル
コキシフェノール、安息香酸またはニトロフェノール、
ハロゲン化ニトロフェノール、アルキル化ニトロフェノ
ール、アルコキシ化ニトロフェノール、ニトロ化安息香
酸、ジニトロフェノールなどが挙げられる。Substituted or unsubstituted phenols bonded to the substrate of the present invention through α- and/or β-bonds and phenols having a koxy group, an alkoxycarbonyl group, or a nitro group, such as chlorophenol, dichlorophenol, hydroxyphenol 1 Alkylphenols, alkoxyphenols, benzoic acids or nitrophenols,
Examples include halogenated nitrophenol, alkylated nitrophenol, alkoxylated nitrophenol, nitrated benzoic acid, and dinitrophenol.

特に少なくとも１つのニトロ基を有するフェノ−に類、
例工ＬＩ’　４−ニトロフェノール、２−クロロ−４−
二トロフェノール、２．６−ジクロロ−４−二トロフェ
ノール、２．６−ジプロモー４−ニトロフェノール、２
−プロモー４−二トロフェノール、２−ニトロフェノー
ル、２−ヒドロキシ−９− ４−ニトロフェノール、３−ヒドロキシ−４−二トロフ
ェノールなどが好ましい。In particular, phenols having at least one nitro group,
Example LI' 4-nitrophenol, 2-chloro-4-
ditrophenol, 2,6-dichloro-4-nitrophenol, 2,6-dipromo-4-nitrophenol, 2
-promo 4-ditrophenol, 2-nitrophenol, 2-hydroxy-9-4-nitrophenol, 3-hydroxy-4-nitrophenol and the like are preferred.

次に本発明の基質ｆｉ＋を更に具体例によって説明４−
ニトロフェノール　０−６−泰４０−６−デオキシーα
−Ｄ−グルコピラノシル−（（ｉ→４）−〇−σ−Ｄ−
グルコピラノシルー１−ｏ−メトキシ−６−ジオキシ−
α−０−グルコピラノシル−（（ｉ→４）−〇−α−Ｄ
−グルコピラノーβ−マルトペンタオシド〕 ４−ニトロフェノール　α−Ｄ−グルコピラノミル−（
（１→４）−〇−σ−Ｄ−グルコピラノー　ｌ〇　− シルーに’−”−β−Ｄ−グルコピラノシド〔４−ニト
ロフェニル−β−マルトペンタオシグルコピラノシル−
（（ｌ→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー）ｓ　
−ｏ−β−Ｄ−グルコピラデオキシ−６−（（２−ピリ
ジル）アミノ〕−α−Ｄ−グルコピラノシル−（（ｌ→
４）−〇−４ヒ０ −Ｄ−グルコ電シラノシル−、−〇−α−Ｄ−グルエニ
ルーα−マルトペンタオシド〕 ４−ニトロフェノール　０−６−ｐ−）ルエンスルホニ
ルオキシー〇−α−Ｄ−グルコピラノシル−（（１→４
）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシル）、−〇−α−Ｄ−
グルコピラノシド〔トシルオキシ　４−ニトロフェニル
−α−マルトヘプタオシド〕 本発明の基質ｆＩｌは新規な化合物であり、例えばｆａ
ｔ非還元末端クロル置換の基質は、式ｆｌＴｌで表わさ
れる化合物とｐ−）ルエンスルホニルクロライドを反応
させ、生成した式（１）で表わされる化合物にテトラメ
チルアンモニウムクロライドと反応させて製造する。大
通らの研究報告Ｌ　？４−ＰＯＭＩＣＨＸｒＪ、旧ｏｅ
ｈｅｍ　６．８４，８３５−８４１（１９７Ｂ））を参
照しくｂｌメトキシ基置換の基質は、式（ｍｌで表わさ
れる化合物とメタノールを反応させて製造する。Ｇ、　
Ｎ。Next, the substrate fi+ of the present invention will be further explained with specific examples 4-
Nitrophenol 0-6-Tai 40-6-deoxy-α
-D-glucopyranosyl-((i→4)-〇-σ-D-
Glucopyranosyl-1-o-methoxy-6-dioxy-
α-0-glucopyranosyl-((i→4)-〇-α-D
-glucopyrano β-maltopentaoside] 4-nitrophenol α-D-glucopyranoyl-(
(1→4)-〇-σ-D-glucopyrano l〇-Silu ni'-”-β-D-glucopyranoside [4-nitrophenyl-β-maltopentaosiglucopyranosyl-
((l→4)-〇-α-D-glucopyranosyl)s
-o-β-D-glucopyradeoxy-6-((2-pyridyl)amino]-α-D-glucopyranosyl-((l→
4) -〇-4hi0 -D-glucoelectrocyanosyl-, -〇-α-D-gluenyl-α-maltopentaoside] 4-nitrophenol 0-6-p-)luenesulfonyloxy〇-α-D -glucopyranosyl-((1→4
)-〇-α-D-glucopyranosyl), -〇-α-D-
Glucopyranoside [tosyloxy 4-nitrophenyl-α-maltoheptaoside] The substrate fIl of the present invention is a novel compound, for example fa
The chloro-substituted substrate at the non-reducing end of t is produced by reacting a compound represented by the formula flTl with p-)luenesulfonyl chloride, and reacting the resulting compound represented by formula (1) with tetramethylammonium chloride. Odori et al.'s research report L? 4-POMICHXrJ, old oe
hem 6.84, 835-841 (197B)), the bl methoxy group-substituted substrate is produced by reacting a compound represented by the formula (ml) with methanol.
N.

ＢＯＬＬＫＮＢＡＣＫの報告ＣＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　
ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＢＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ｖｏｗ
、　［３２６）を参照した。BOLLKNBACK REPORT CMETHODS IN
CARBOHYDRATBCHEMISTRY vow
, [326].

（ｃ）トシルオキシ基置換の基質は式ｔｉｔで表わされ
る化合物を意味する。(c) The tosyloxy group-substituted substrate means a compound represented by the formula tit.

ｆｄｌピリジルアミノ基置換の基質は、式（川で表わさ
れる化合物とピリジルアミンを反応させて製造する。大
通らの研究報告 （Ｋ、ＯＭＩＣＨＩ　ＩＪ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９３
．１０５５−１０６０（１９８３）〕を参照した。The fdl pyridylamino group-substituted substrate is produced by reacting a compound represented by the formula (kawa) with pyridylamine. Research report by Odori et al. (K, OMICHI IJ, Biochem, 93
．． 1055-1060 (1983)].

ｔ、ｌアニリノ基、トルイジノ基またはアニシジノ基置
換の基質は、式＋ｆｉ＋で表わされる化合物とアニリン
、トルイジンまたはアニシジを反応させて製造する。ｔ
ｄｌの方法を参照した。A substrate substituted with t, l anilino group, toluidino group or anisidino group is produced by reacting a compound represented by the formula +fi+ with aniline, toluidine or anisidi. t
Refer to the method of dl.

（ｆｌフェノキシ基置換の基質は、式（ＴＩＩで表わさ
れる化合物とフェノールを反応させて製造する。（ｂｌ
の方法を参照した。(fl The phenoxy group-substituted substrate is produced by reacting a compound represented by the formula (TII) with phenol. (bl
The method was referred to.

Ｉｇｌベンゾイルオキシ基置換の基質は式ｔｕｔで表わ
される化合物とベンジルアルコールを反応させて　１３
− 製造する。（ｂｌの方法を参照した。Igl benzoyloxy group-substituted substrate is obtained by reacting a compound represented by the formula tut with benzyl alcohol. 13
- Manufacture. (Reference was made to the method of bl.

また、式＋ＩＴＩで表わされる化合物の代わりα、β（
、）テトラメチルアンモニウムクロライドｔｂ＋メタノ
ール ｌｃｌ　ｐ　−）ルエンスルホニルクロライト（ｄ）ピ
リジルアミン ＋−）アニリン、トルイジンまたはアニシジンＴｆｌフ
ェノール （ｇｌベンジルアルコール とそれぞれ反応させて、 質 ｆｃｌ非還元末端（Ｃ−６位）トシルオキシ基ｌ置換の
基質 アニ ｆ、ｌ非還元末端（Ｃ−６位）　、ヤ＋　リノ基、トル
イジノ基またはアニシジノ基置換の基質 　１４− ｆｆｌ非還元末端（Ｃ−６位）フェノキシ基置換の基質 （ｇｌ非還元末端ベンジルオキシ基置換の基質を製造し
、さらにサイクロデキストリントランスフェラーゼを作
用させて、目的のマルトオリゴ糖を製造する方法とがあ
る。In addition, instead of the compound represented by the formula + ITI, α, β(
,) tetramethylammonium chloride tb + methanol lcl p -) luenesulfonyl chlorite (d) pyridylamine + -) aniline, toluidine or anisidine Tfl phenol (gl) is reacted with benzyl alcohol, respectively, to give a free fcl non-reducing end (C-6 position) Substrate with tosyloxy group l substitution Anif, l non-reducing end (C-6 position), Y+ Substrate with lino group, toluidino group or anisidino group substitution 14- ffl non-reducing end (C-6 position) phenoxy group substitution There is a method of producing a substrate (gl substituted with a benzyloxy group at the non-reducing end) and then reacting with cyclodextrin transferase to produce the desired maltooligosaccharide.

本発明に使用するα−グルコシダーゼは動物、随物、微
生物など如何なる起源のものを用いてもよいが、特に酵
母から得たものが、その基質特異性の点で好ましい。す
なわち、酵母起源のα−グルコシダーゼはアグリコン特
異性が広く、さらにマルトトリオシト以下のグリコシド
にはよく作用するが、マルトテトラオシド以上のグリコ
シドには作用しない点で特に本発明の目的に適合してい
る。The α-glucosidase used in the present invention may be of any origin, such as animal, parasitic, or microbial origin, but it is particularly preferable to use one obtained from yeast in view of its substrate specificity. That is, α-glucosidase derived from yeast has a broad aglycone specificity, and furthermore, it acts well on glycosides smaller than maltotrioside, but does not act on glycosides larger than maltotetraoside, so it is particularly suitable for the purpose of the present invention. ing.

β−グルコシダーゼも如何なる起源のものを用いてもよ
く、例えばアーモンドから得たものが使用できる。β-glucosidase of any origin may be used; for example, one obtained from almonds can be used.

グルコアミラーゼに関しても如何なる起源のものを用い
てもよく、例えばリゾプスデレマーから得たものが使用
できる。Glucoamylase of any origin may be used; for example, glucoamylase obtained from Rhizopus deremer can be used.

α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミ
ラーゼの使用法は具体的には、（１）α−グルコシダー
ゼ （１）α−グルコシダーゼおヨヒβ−グルコシダ〜ゼ （＋１１１グルコアミラーゼ （１ｖ）グルコアミラーゼおよびα−グルコシダーゼｆ
Ｖｌグルコアミラーゼおよびβ−グルコシダーゼ（ｖｌ
ｌ　グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼおよびβ−
グルコシダーゼ のいずれの使用法でもよく、特に、α−グルコシダーゼ
、グルコアミラーゼを共存した方法（１ｖ）、（ｖｌ）
が好ましい。Specifically, the usage of α-glucosidase, β-glucosidase, and glucoamylase includes (1) α-glucosidase (1) α-glucosidase and β-glucosidase (+111 glucoamylase (1v) glucoamylase and α- glucosidase f
Vl glucoamylase and β-glucosidase (vl
l Glucoamylase, α-glucosidase and β-
Any method of using glucosidase may be used, especially methods using α-glucosidase and glucoamylase (1v) and (vl)
is preferred.

本発明の方法は、必要によりその他の添加物を添加して
もよい。In the method of the present invention, other additives may be added as necessary.

本発明は上記基質に、追随酵素の共存下に、試料を接触
させ、遊離するフェノール系化合物を測定することによ
り、試料中のα−アミラーゼ活性を測定する。In the present invention, the α-amylase activity in the sample is measured by contacting the sample with the above-mentioned substrate in the presence of a follower enzyme and measuring the liberated phenolic compound.

フェノール系化合物の測定法としては、基質から解離し
たフェノール系化合物が基質とは異なるスペクトル吸収
を示す場合には、反応生成物のスペクトル吸収を直接測
定する。As a method for measuring phenolic compounds, when the phenolic compound dissociated from the substrate exhibits a spectral absorption different from that of the substrate, the spectral absorption of the reaction product is directly measured.

また基質から解離したフェノール系化合物が基質とほぼ
同じスペクトル吸収を示す場合には、呈色試薬、例えば
４−アミノアンチピリンなどの化合物と酸化縮合させ、
その発色強度を測定する。In addition, when the phenolic compound dissociated from the substrate exhibits almost the same spectral absorption as the substrate, it is oxidized and condensed with a coloring reagent, such as a compound such as 4-aminoantipyrine,
Measure the color intensity.

フェノール系化合物の測定方法としては、α−アミラー
ゼの反応を連続的に追跡するレート法あるいは一定時間
反応させた後、反応を止めて測定する法、いずれの方法
を用いてもよい。As a method for measuring the phenolic compound, either a rate method in which the reaction of α-amylase is continuously monitored or a method in which the reaction is stopped after a certain period of time and the measurement is performed may be used.

本発明では上記基質ケ用いることにより、α−グルコシ
ダーゼの基質に対する作用を防ぎ、試薬ブランクの上昇
抑制に著しい効果があり、追随酵素液、基質液の一液化
が可能となった。In the present invention, by using the above-mentioned substrate, the action of α-glucosidase on the substrate is prevented, and the rise of the reagent blank is significantly suppressed, making it possible to integrate the follower enzyme solution and the substrate solution into one solution.

また、無置換非還元末端のマルトオリゴ糖基質において
、適用不可能だったグルコアミラーゼ（無置換還元末端
のマルトオリゴ糖はグルコアミラーゼの基質となる）の
使用も可能となった。In addition, it has become possible to use glucoamylase (maltooligosaccharides with unsubstituted reducing ends serve as substrates for glucoamylase), which was previously not applicable to maltooligosaccharide substrates with unsubstituted non-reducing ends.

　１７− α−グルコシダーゼはマルトトリオシト以下の低分子グ
リコシドにはよく作用するが、マルトテトラオシド以上
のグリコシドには作用しない。17-α-glucosidase acts well on low-molecular-weight glycosides below maltotrioside, but does not act on glycosides above maltotetraoside.

マルトヘプタオサイド以上の高分子グリコシドをアミラ
ーゼ基質とした場合、マルチトラシト以上のグリコシド
が生成する。ｄ−グルコシダーゼを追随酵素として用い
た場合は、アミラーゼによる氷解生成物のマルトトリオ
シト以下の低分子グリコシドにのみ作用するＪしかし、
グルコアミラーゼを用いた場合、マルチトラシト以上の
グリコシドにも作用し、測定系の感度が上昇するという
グルコシダーゼ使用の優位点がある。When a high molecular weight glycoside of maltoheptaoside or higher is used as an amylase substrate, a glycoside of maltoheptaoside or higher is produced. When d-glucosidase is used as a follower enzyme, J, which acts only on low-molecular-weight glycosides below maltotriocytate, which are the ice-melting products produced by amylase,
When glucoamylase is used, the advantage of using glucosidase is that it acts on glycosides of multitracytate or higher, increasing the sensitivity of the measurement system.

本発明の測定法は自動分析機にも容易にかけられる優れ
た方法である。The measurement method of the present invention is an excellent method that can be easily applied to automatic analyzers.

以下、本発明を実施例により説明する。The present invention will be explained below using examples.

実施例１ 下記の試薬を用い、下記方法によりブランク値を測定し
た。Example 1 A blank value was measured using the following reagents and the following method.

試薬：５０ｍＭ　グツドバッファーｐＨ７，０α−グル
コシダーゼ　８０　Ｕ　／　ｍｌ１８− β−グルコシダーゼ　ＩＯＵ／耐 第１表に示される基質　２ｍＭ 第　１　表 測足法： 上記試薬３　ｗｇを取り、試薬ブランクの経時変化を見
た。（測定波長４００ｎｒｎ、温度３７℃）その結果を
！＠２表に示す。Reagent: 50mM Gud buffer pH 7,0 α-glucosidase 80 U/ml 18-β-glucosidase IOU/resistance 2mM substrate shown in Table 1 Table 1 Foot measurement method: Take the above reagent 3 wg and observe the change over time in the reagent blank. saw. (Measurement wavelength 400nrn, temperature 37℃) Check out the results! @2 Shown in table.

本発明の試薬Ａ、Ｂは試薬Ｃ，Ｄと比較して、試薬ブラ
ンクの上昇が小さい。Reagents A and B of the present invention have a smaller rise in reagent blanks than reagents C and D.

実施例２ 試料中のび一アミラーゼ活性を、下記の試薬を用い、下
記方法により測定した。Example 2 Nobiichi amylase activity in a sample was measured using the following reagent and the following method.

試薬Ａ：５０ｍＭ　グツドバッファ　−ｐ　Ｉ（７，０
ド　２ｍＭ 試薬Ｂ：５０ｍＭ　グツドバッファ　−ｐ　Ｈ７，０−
マルトペンタオシド　２ｍＭ 測定法： 試薬ＡまたＢ各３　ｗｅを取り、３７℃での試薬ブラン
ク経時変化を４００ｎｍで測定した。Reagent A: 50mM Gudbuffer-pI (7,0
2mM Reagent B: 50mM Gut buffer - pH 7,0-
Maltopentaoside 2mM Measurement method: Three samples each of reagent A or B were taken, and the change over time in a reagent blank at 37°C was measured at 400 nm.

試料（血清）５０／’ｊに、試薬ＡまたはＢ各３−を添
加し、添加後５〜６分後の吸光度変化（α−アミラーゼ
活性）を測定した。（測定波長４００　ｎｍ、反応温度
３７℃） 試薬ブランクの経時変化を第３表に、血清の吸光度測定
を第４表に示す。Reagent A or B was added to 50/'j of the sample (serum), and the change in absorbance (α-amylase activity) was measured 5 to 6 minutes after the addition. (Measurement wavelength: 400 nm, reaction temperature: 37° C.) Table 3 shows the change over time of the reagent blank, and Table 4 shows the absorbance measurement of the serum.

第　４　表 本発明の試薬Ａは試薬Ｂに比較して、試薬ブランクの上
昇は小さく、α−アミラーゼ活性値は試薬ＡＳＢともに
差はない。Table 4 Reagent A of the present invention shows a smaller increase in reagent blank than Reagent B, and there is no difference in α-amylase activity value between Reagent ASB and Reagent ASB.

実施例３ 試料中のα−アミラーゼ活性を、下記の試薬を用い、下
記方法により測定した。Example 3 α-amylase activity in a sample was measured using the following reagents and the following method.

試薬Ａ：５０ｍＭ　グツドバッファー（ｐ　Ｈ７，０２
１− α−グルコシダーゼ　８０Ｕ／ｄ グルコアミラーゼ　１０　＃ トシルオキシ　４−ニトロフェニル− α−マルトヘプタオシド　２ｍＭ 試薬Ｂ：５０ｍＭ　グツドバッフｙ　−（ｐ　Ｈ７，０
）α−グルコシダーゼ　８０　Ｕ／ｌ／ トシルオキシ　４−ニトロフェニル− α−マルトヘプタオシド　２ｍＭ 試薬Ｃ：５０ｍＭ　グツドバッフアー（ｐＨ７，すα−
グルコシダーゼ　８０Ｕ／ａｇ ゲルコアばラーゼ　１０　Ｕ／ｄ ４−ニトロフェニル−α−マルトヘプ タオシド　２ｍＭ 測定法： 試薬Ａ、ＢまたはＣ各３　ｍｌを取り、３７℃での試薬
ブランク経時変化を４００ｎｍで測定した、試料血清５
０１Ｌｔに試薬Ａ、ＢまたはＣ各３ｄを添加し、添加後
５〜６分後の吸光度変化（アミラーゼ活性）を測定した
。（測定波長４００ｎｍ、反応温度３７℃） 試薬ブランクの経時変化を第５表に血清の吸光度変化を
第６安に示す。Reagent A: 50mM Gud buffer (pH 7,02
1-α-glucosidase 80U/d Glucoamylase 10 # Tosyloxy 4-nitrophenyl-α-maltoheptaoside 2mM Reagent B: 50mM Gutdbuffy-(pH 7,0
) α-glucosidase 80 U/l/tosyloxy 4-nitrophenyl-α-maltoheptaoside 2mM Reagent C: 50mM Gutud buffer (pH 7, α-
Glucosidase 80 U/ag Gel coavalase 10 U/d 4-nitrophenyl-α-maltoheptaoside 2 mM Measurement method: Take 3 ml each of reagents A, B, or C and measure the change over time in a reagent blank at 37°C at 400 nm. sample serum 5
3 d each of reagents A, B, or C were added to 01Lt, and the change in absorbance (amylase activity) was measured 5 to 6 minutes after the addition. (Measurement wavelength: 400 nm, reaction temperature: 37° C.) Changes in reagent blank over time are shown in Table 5, and changes in serum absorbance are shown in Table 6.

　２２− 第　５　表 第６表 本発明の試薬ＡまたはＢは試薬Ｃに比較して、試薬ブラ
ンクの上昇は小さい。αアミラーゼ活性値は試薬Ｂ、Ｃ
に差はない。試薬Ａはグルコアミラーゼ添加により感度
が上昇した。22-Table 5 Table 6 Reagent A or B of the present invention has a smaller increase in reagent blank than Reagent C. α-amylase activity values are for reagents B and C.
There is no difference. The sensitivity of reagent A increased with the addition of glucoamylase.

特許出願人　東洋紡績株式会社 手続補正書（方式） ％式％ １　事件の表示 昭和５８年特許願第２４２８９０号 ａ　発明の名称 ａ−アミラーゼ活性測定法 ＆　補正をする者 事件との関係　特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 昭和６０年５月８日 （発送日　昭和６０年５月２８日） ａ　補正の内容 １　明細書第１頁第３行目 ｒａ−ラミラーゼ活性測定法」を「α−アミラーゼ活性
測定法」に訂正する。Patent Applicant Toyobo Co., Ltd. Procedural Amendment (Method) % Formula % 1 Indication of Case 1982 Patent Application No. 242890a Title of Invention a - Amylase Activity Measuring Method & Person Who Makes Amendment Relationship with Case Patent Applicant 2-2-8 Dojimahama, Kita-ku, Osaka City, May 8, 1985 (Delivery date: May 28, 1985) a Contents of amendment 1 Specification, page 1, line 3, RA-lamylase activity measurement method.” amended to "alpha-amylase activity measurement method".

Claims (1)

【特許請求の範囲】 Ｃ式中　いはノ・ロゲン原子または−　−Ｒ１またはグ
ルコビラノース残基を示す。 Ｘは０．ＯＯＣ，０８０，またはＮＵを示し、ａ　Ｓは
、を換または未置換のアルキル基・置換または未置換の
フェニル基またはピリジル基を示す。またＲ′は置換ま
たは未置換の７１ノール残基を示す。ｎは０〜８の整数
を示す。）で表わされる非還元性末端を修飾したα−お
よび／またはβ−フェニルマルトオリゴサイドを基質と
して、α−グルコシダーゼおよび／またはグルコアミラ
ーゼおよび必要によりβ−グルコシダーゼの共存下に、
試料を接触させ、遊離するフェノール系化合物を測定す
ることにより、試料中のα−アミラーゼ活性を測定する
ことを特徴とするσ−アミラーゼ活性測定法。[Scope of Claims] In the formula C, or represents a norogen atom, --R1, or a glucobylanose residue. X is 0. OOC, 080, or NU, and a S represents a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted phenyl group, or a pyridyl group. Further, R' represents a substituted or unsubstituted 71nol residue. n represents an integer of 0 to 8. ) in the coexistence of α-glucosidase and/or glucoamylase and optionally β-glucosidase, using α- and/or β-phenyl malto-oligoside modified with a non-reducing end as a substrate,
1. A method for measuring σ-amylase activity, which comprises measuring α-amylase activity in a sample by contacting the sample and measuring the liberated phenolic compound.