JPS60224041A - 生理活性物質の検出方法 - Google Patents
生理活性物質の検出方法Info
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- JPS60224041A JPS60224041A JP8010784A JP8010784A JPS60224041A JP S60224041 A JPS60224041 A JP S60224041A JP 8010784 A JP8010784 A JP 8010784A JP 8010784 A JP8010784 A JP 8010784A JP S60224041 A JPS60224041 A JP S60224041A
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
- G01N15/0211—Investigating a scatter or diffraction pattern
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[技術分野]
本発明は、免疫学的検査におりる生理活性物質の検出方
法に関するものである。さらに詳しくは、粒子状担体に
免疫活性物質を固定化してなる免疫活性粒子を用いてヒ
トまたは動物の体液中成弁の検出、もしくは測定、ある
いは細胞を識別する免疫学的検査法において担体粒子の
凝集状態を光回折技術を用いて定(目的に測定する生理
活性物質の検出方法に関するものである。
法に関するものである。さらに詳しくは、粒子状担体に
免疫活性物質を固定化してなる免疫活性粒子を用いてヒ
トまたは動物の体液中成弁の検出、もしくは測定、ある
いは細胞を識別する免疫学的検査法において担体粒子の
凝集状態を光回折技術を用いて定(目的に測定する生理
活性物質の検出方法に関するものである。
[従来技術]
生体の生理活性に関与する物質は概して微量であり、し
かも生体に対して非常に重要な役割を演じるものが少な
くない。したがって、このような微量の生理活性物質を
検出することは医学、生化学等の生物関連分野にとって
は重要であり、そのための種々の方法が考案され、実用
化されている。゛そのうち、放射性同位元素、化学発光
物質、螢光物質などを用いて標識する免疫測定は非常に
高精度であるが、装置が大がかりであり測定をするに当
り特殊な技術を必要とする。さらにこの方法は結果を出
すのに時間を要し、臨床現場などで直ちに結果を必要と
する目的には不適当である。
かも生体に対して非常に重要な役割を演じるものが少な
くない。したがって、このような微量の生理活性物質を
検出することは医学、生化学等の生物関連分野にとって
は重要であり、そのための種々の方法が考案され、実用
化されている。゛そのうち、放射性同位元素、化学発光
物質、螢光物質などを用いて標識する免疫測定は非常に
高精度であるが、装置が大がかりであり測定をするに当
り特殊な技術を必要とする。さらにこの方法は結果を出
すのに時間を要し、臨床現場などで直ちに結果を必要と
する目的には不適当である。
また、簡便な方法として、目的とする微量物質を直接捕
捉するのではなく、生理活性物質の大部分がそれと相補
的な物質を選択性良く検出し、結合してコンプレックス
をつくる事実を利用する方法(例えば抗原−抗体反応)
がある。この場合、まず相補物質を微小担体に固定化さ
せたものを適当な媒体中に分散させる。そしてこれに目
的とする物質を含む溶液を混合すると、両物質が選択的
に結合することにより担体が凝集するので、その凝集状
態を観察するのである。
捉するのではなく、生理活性物質の大部分がそれと相補
的な物質を選択性良く検出し、結合してコンプレックス
をつくる事実を利用する方法(例えば抗原−抗体反応)
がある。この場合、まず相補物質を微小担体に固定化さ
せたものを適当な媒体中に分散させる。そしてこれに目
的とする物質を含む溶液を混合すると、両物質が選択的
に結合することにより担体が凝集するので、その凝集状
態を観察するのである。
凝集状態を観察するには、従来からいくつかの方法が用
いられてきた。そのうち、マイクロプレート法は微小四
部に種々の濃度の目的試薬を入れ、一定時間経過後の沈
降パターンの違いから陰陽の判定をするものである。し
かしながら、この方法では定性的な比較判定を行なうた
めパターンに中間段階がある場合、その判定の境界に個
人差が生じていた。またスリッピングという一種の沈降
凝集塊の崩れによるパターンの乱れが生じた場合には判
定を誤ったり判定不能となる場合があった。
いられてきた。そのうち、マイクロプレート法は微小四
部に種々の濃度の目的試薬を入れ、一定時間経過後の沈
降パターンの違いから陰陽の判定をするものである。し
かしながら、この方法では定性的な比較判定を行なうた
めパターンに中間段階がある場合、その判定の境界に個
人差が生じていた。またスリッピングという一種の沈降
凝集塊の崩れによるパターンの乱れが生じた場合には判
定を誤ったり判定不能となる場合があった。
また、別の方法として顕微鏡で直接観察する方法もある
。この場合には視野内の凝集塊の状態を見て同じく陰陽
判定を行なう。しかし、この方法に於いても、視野によ
る凝集状態のバラツキや観察者の主観などが入るので判
定に個人差が生じやすい。さらに、従来から一般的に用
いられていた粒子は、慨して0.1μm以下であり、可
視光波長より短いものが多かった。そのため、粒子その
ものは顕微鏡下では直接見えず、凝集状態は凝集が相当
進行し、可視化できる大きさになって始めて認識できる
ため、弱い凝集の場合は判定が困難であった。また、こ
れらの方法は熟練を要し、さらには人力によるため、多
数の測定をこなすことが困難であった。
。この場合には視野内の凝集塊の状態を見て同じく陰陽
判定を行なう。しかし、この方法に於いても、視野によ
る凝集状態のバラツキや観察者の主観などが入るので判
定に個人差が生じやすい。さらに、従来から一般的に用
いられていた粒子は、慨して0.1μm以下であり、可
視光波長より短いものが多かった。そのため、粒子その
ものは顕微鏡下では直接見えず、凝集状態は凝集が相当
進行し、可視化できる大きさになって始めて認識できる
ため、弱い凝集の場合は判定が困難であった。また、こ
れらの方法は熟練を要し、さらには人力によるため、多
数の測定をこなすことが困難であった。
機器を用いる方法としては、濁度や光散乱強度を測定す
る方法などがある。例えば、凝集状態の変化を濁度の変
化として光学的に見る方法どしては、特開昭57−14
9951号公報に見られる技術や文献(L A −S
l/stemによるCRP定量測定、J、J、C,L、
A、 、VOL、8、NO。
る方法などがある。例えば、凝集状態の変化を濁度の変
化として光学的に見る方法どしては、特開昭57−14
9951号公報に見られる技術や文献(L A −S
l/stemによるCRP定量測定、J、J、C,L、
A、 、VOL、8、NO。
1 、+1 、−161〜165.1983)等を掲げ
ることができる。
ることができる。
これらの方法は装置を用いて結果を客観化できるという
利点はあるものの、用いる試薬が多聞であったり、また
、試料を均一にするため攪拌りる必要がある等、取扱い
上に問題があった。さらに、これらの方法では、被検液
での透過光や散乱光の強度変化のみを見るというような
散乱源となる凝集塊の情報の一部のみを利用するだけで
あり、例えば、不純物が混入しているような場合、それ
らを除去することが精度の良い測定に不可欠であったり
、場合によっては、そのための複雑な前処理が必要とな
ることがあった。
利点はあるものの、用いる試薬が多聞であったり、また
、試料を均一にするため攪拌りる必要がある等、取扱い
上に問題があった。さらに、これらの方法では、被検液
での透過光や散乱光の強度変化のみを見るというような
散乱源となる凝集塊の情報の一部のみを利用するだけで
あり、例えば、不純物が混入しているような場合、それ
らを除去することが精度の良い測定に不可欠であったり
、場合によっては、そのための複雑な前処理が必要とな
ることがあった。
以−[説明した様に、従来技術においては、必ずしも得
られたデータの再現性、客観性は十分であるとは言えな
かった。
られたデータの再現性、客観性は十分であるとは言えな
かった。
[発明の目的]
本発明の目的は、光回折技術を用いてこのような従来の
方法の持つ欠点を改良し、観察者の主観による判定基準
の曖昧さを除去して、凝集状態を客観的に、しかも少な
い試薬量で定量化する生理活性物質の検出方法を提供す
ることにある。
方法の持つ欠点を改良し、観察者の主観による判定基準
の曖昧さを除去して、凝集状態を客観的に、しかも少な
い試薬量で定量化する生理活性物質の検出方法を提供す
ることにある。
し発明の構成」
本発明は0.5〜10μm1より好ましくは1〜6μm
と光の波長と同程度か士数倍の微小粒子がコヒーレント
な光によって生じる回折パターンを光学的手段を用いて
検出する。そして、その対象物たる微小粒子の凝集によ
る外形形状および大きさの変化を回折パターンの変化と
してとらえることにより、凝集状態に関する情報を数値
化して、それによって凝集の程度まで定量化することを
特徴としている。すなわち、本発明にかかる方法では、
1点での光強度を測定するのではなく、光の分布状態を
測定することにJ一つて凝集状態を判別するのであり、
必然的に外来雑音に強く信頼性の高い測定結果が得られ
る。なお、回折パターンの認識には通常のパターン認識
で使用される面積差、相互相関、あるいはマツチドフィ
ルター等による手段が適応できる。
と光の波長と同程度か士数倍の微小粒子がコヒーレント
な光によって生じる回折パターンを光学的手段を用いて
検出する。そして、その対象物たる微小粒子の凝集によ
る外形形状および大きさの変化を回折パターンの変化と
してとらえることにより、凝集状態に関する情報を数値
化して、それによって凝集の程度まで定量化することを
特徴としている。すなわち、本発明にかかる方法では、
1点での光強度を測定するのではなく、光の分布状態を
測定することにJ一つて凝集状態を判別するのであり、
必然的に外来雑音に強く信頼性の高い測定結果が得られ
る。なお、回折パターンの認識には通常のパターン認識
で使用される面積差、相互相関、あるいはマツチドフィ
ルター等による手段が適応できる。
以下、本発明の原理について詳述する。
単一の波長の光によって照射される場に行かれた物体は
、その光学的特性が周囲のものと異なっている場合(屈
折率、反射率、透過率など)必ずその物体の持つ光学的
特性や、大ぎさ、形状に応じて光と相互作用し、独自の
回折光を生じせしめる。この様な微小粒子を均一な光学
的な場に置いた場合に得られる光の回折については色々
な場合について論じられている。例えばごく基本的に微
小粒子が光学的に不透明である場合、しかもそれが球形
形状をしている場合については次に述べるような文献に
詳細に議論されている。
、その光学的特性が周囲のものと異なっている場合(屈
折率、反射率、透過率など)必ずその物体の持つ光学的
特性や、大ぎさ、形状に応じて光と相互作用し、独自の
回折光を生じせしめる。この様な微小粒子を均一な光学
的な場に置いた場合に得られる光の回折については色々
な場合について論じられている。例えばごく基本的に微
小粒子が光学的に不透明である場合、しかもそれが球形
形状をしている場合については次に述べるような文献に
詳細に議論されている。
P rinciples of Optics M a
x B orn& Emil Wolf Peroamon Press p 、 395以下、
上記の文献に従い第2図を用いて、本発明の原理につい
て説明する。今、簡単のため、均一な平面光波の場に置
かれた粒子Sが1個ある場合を考える。ただし、Sは球
形形状でその直径はRであるとする。
x B orn& Emil Wolf Peroamon Press p 、 395以下、
上記の文献に従い第2図を用いて、本発明の原理につい
て説明する。今、簡単のため、均一な平面光波の場に置
かれた粒子Sが1個ある場合を考える。ただし、Sは球
形形状でその直径はRであるとする。
Sがレンズ(焦点距離f)を介して焦点面上に作るフラ
ウンボーファー回折パターンの強度分布は、 と表わせる。ここで1(X)はレンズLの焦点面上で、
かつ光軸中心Oから距離Xにある点Pでの強度であり、
J工は1次のベッセル関数である。
ウンボーファー回折パターンの強度分布は、 と表わせる。ここで1(X)はレンズLの焦点面上で、
かつ光軸中心Oから距離Xにある点Pでの強度であり、
J工は1次のベッセル関数である。
ここでXは、
と表わせる。
なお、λは用いた光の波長、fはレンズLの焦点距離で
ある。もし粒子Sが1個だけではなく同じ形状のN個の
粒子が分散して存在するのであれば、各々の粒子の回折
波面を無事面上で位相を考慮して加算し、それを2乗し
たものが回折パターンの強度分布となる。しかしこの場
合、平行光束により照らされたN個の粒子の回折光波の
互いの位相関係はランダムであり、回折粒子が十分に多
い時には事実上、統計的に無相関であると考えることが
可能である。この条件は実際上、第2図のような光学系
では十分溝たされている。なぜなら、たとえ、十分コヒ
ーレントな光で照明したとしても、担体粒子を分散させ
ている媒体溶液の屈折率ゆらぎ、粒子表面の微細な反射
率の分布等により、互いの粒子間の回折波の位相関係は
乱れてしまうからである。
ある。もし粒子Sが1個だけではなく同じ形状のN個の
粒子が分散して存在するのであれば、各々の粒子の回折
波面を無事面上で位相を考慮して加算し、それを2乗し
たものが回折パターンの強度分布となる。しかしこの場
合、平行光束により照らされたN個の粒子の回折光波の
互いの位相関係はランダムであり、回折粒子が十分に多
い時には事実上、統計的に無相関であると考えることが
可能である。この条件は実際上、第2図のような光学系
では十分溝たされている。なぜなら、たとえ、十分コヒ
ーレントな光で照明したとしても、担体粒子を分散させ
ている媒体溶液の屈折率ゆらぎ、粒子表面の微細な反射
率の分布等により、互いの粒子間の回折波の位相関係は
乱れてしまうからである。
上述の理由によって、この様なN個の粒子がある場合、
それらのP点での光強度のフラウンホーファー回折パタ
ーンの強度は粒子の位置によらないので(但し、位相は
粒子の位置によって異なる。
それらのP点での光強度のフラウンホーファー回折パタ
ーンの強度は粒子の位置によらないので(但し、位相は
粒子の位置によって異なる。
)、
とN個の個々の粒子の回折パターンの強度の重ね合せと
して示される。
して示される。
今J本発明における場合を考えると、凝集反応が生ずる
前には、多数の粒子は互いに同じ形状で各々独立に媒体
中に分散している。これらの粒子の作る回折パターンは
(3)式で示される強度分布を持ってd3す、粒径がそ
ろっている場合には、式中のX′に含まれる粒径Rが一
定のため全体のパターンはきわめC規則的なものとなっ
ている。:疑集が進行し、各々の粒子が互いに結合して
くると、見かけ上の粒径がRと異なるものが生じてくる
。
前には、多数の粒子は互いに同じ形状で各々独立に媒体
中に分散している。これらの粒子の作る回折パターンは
(3)式で示される強度分布を持ってd3す、粒径がそ
ろっている場合には、式中のX′に含まれる粒径Rが一
定のため全体のパターンはきわめC規則的なものとなっ
ている。:疑集が進行し、各々の粒子が互いに結合して
くると、見かけ上の粒径がRと異なるものが生じてくる
。
(3)式で容易に判るように粒径が異なる場合ベッセル
で示されるJ工の周期パターンの周期がそれぞれの粒径
ごとに異なり、それがP点上で重ね合されることとなり
、最初の規則パターンが崩れてくることになる。この均
一分散の示すパターンからのずれは生じた凝集塊の程度
に忠実に対応している。
で示されるJ工の周期パターンの周期がそれぞれの粒径
ごとに異なり、それがP点上で重ね合されることとなり
、最初の規則パターンが崩れてくることになる。この均
一分散の示すパターンからのずれは生じた凝集塊の程度
に忠実に対応している。
ここで、実際に用いられる担体粒子が透明であるような
場合には上述の単なる形状による回折パターンのみでな
く、内部に入る屈折波や、内部での多重反射波による回
折パターンへの寄与も厳密には考慮する必要があるが、
本発明にお−ける基本パターンからの変化として凝集塊
の生成を判定する場合、各々の粒子が光学的にほぼ同等
と兄なぜ、また各々独立に回折パターン強度に寄与する
という条件下では、このような厳密な考察は必要でなく
、結果として、ここで述べたような回折パターンの変化
として凝集生成をとらえられることば明らかである。
場合には上述の単なる形状による回折パターンのみでな
く、内部に入る屈折波や、内部での多重反射波による回
折パターンへの寄与も厳密には考慮する必要があるが、
本発明にお−ける基本パターンからの変化として凝集塊
の生成を判定する場合、各々の粒子が光学的にほぼ同等
と兄なぜ、また各々独立に回折パターン強度に寄与する
という条件下では、このような厳密な考察は必要でなく
、結果として、ここで述べたような回折パターンの変化
として凝集生成をとらえられることば明らかである。
本発明にお番プる微小担体粒子としては、ヒトを含む哺
乳動物や鳥類の赤血球、カオリン、炭素などの無機物の
粒子、天然ゴムラテックスやポリスチレン、カルボキシ
ル化スチレン−ブタジェンコポリマー、アクリロニトリ
ルポリマー、塩化ごニル−アクリレートコポリマー、メ
タクリル酸ポリマー、さらには、メタクリル酸グリシジ
ル共重合体などの有機高分子化合物のラテックスなどを
用いることができる。なお、このような担体粒子に固定
化し、免疫学的な生理活性物質の検出に利用することが
できると思われる物質と、それにより検査できると考え
られる項目の一例を第1表に掲げる。
乳動物や鳥類の赤血球、カオリン、炭素などの無機物の
粒子、天然ゴムラテックスやポリスチレン、カルボキシ
ル化スチレン−ブタジェンコポリマー、アクリロニトリ
ルポリマー、塩化ごニル−アクリレートコポリマー、メ
タクリル酸ポリマー、さらには、メタクリル酸グリシジ
ル共重合体などの有機高分子化合物のラテックスなどを
用いることができる。なお、このような担体粒子に固定
化し、免疫学的な生理活性物質の検出に利用することが
できると思われる物質と、それにより検査できると考え
られる項目の一例を第1表に掲げる。
第1表、凝集反応検出に使用できる分野また、本発明は
単に生理活性物質を固定化するための微粒子担体として
ではなく、例えば血小板自体の凝集反応の測定や、赤血
球、白血球細胞の形状の変化や分布を測定したり、形状
の異なる異種細胞の識別にも利用でき、さらには特定の
細胞と選択的に結合する物質を固定化した粒子状担体を
用いて、その粒子が細胞と結合するか否かによって細胞
を識別するというような手段に6利用可能である。
単に生理活性物質を固定化するための微粒子担体として
ではなく、例えば血小板自体の凝集反応の測定や、赤血
球、白血球細胞の形状の変化や分布を測定したり、形状
の異なる異種細胞の識別にも利用でき、さらには特定の
細胞と選択的に結合する物質を固定化した粒子状担体を
用いて、その粒子が細胞と結合するか否かによって細胞
を識別するというような手段に6利用可能である。
さらに言及すれば、本発明はこのような生物的分野に限
らず、高分子ラテックスの粒径分布の測定や該ラテック
スの液中での分散状態のモニタ〜にも応用でき、また、
無機物質、例えば金属等の微粒子やセラミック微粉末の
粒径分布の測定等にも用いることができる。あるいは、
微粒子の製造工程での製品の品質管理で本発明の方法に
よる回折パターンを基準パターンとして製品ロットごと
のパターンと比較し、両者の差が一定の範囲内に収まる
ようにロンl−管理に適用するような使用法にも本発明
の原理が適用可能であることは明らかである。
らず、高分子ラテックスの粒径分布の測定や該ラテック
スの液中での分散状態のモニタ〜にも応用でき、また、
無機物質、例えば金属等の微粒子やセラミック微粉末の
粒径分布の測定等にも用いることができる。あるいは、
微粒子の製造工程での製品の品質管理で本発明の方法に
よる回折パターンを基準パターンとして製品ロットごと
のパターンと比較し、両者の差が一定の範囲内に収まる
ようにロンl−管理に適用するような使用法にも本発明
の原理が適用可能であることは明らかである。
以上詳述した様に、本発明は本質的に周囲と光学的に差
異のある微粒子の形状、大きさ、結合状態やその変化を
光回折技術を用いて検知し、それらの情報を数値化、定
量化する生理活性物質の検出方法であり、以上に述べた
様な微粒子を用いる限り、本発明の目的に対して特に支
障のあるものではない。
異のある微粒子の形状、大きさ、結合状態やその変化を
光回折技術を用いて検知し、それらの情報を数値化、定
量化する生理活性物質の検出方法であり、以上に述べた
様な微粒子を用いる限り、本発明の目的に対して特に支
障のあるものではない。
第1図は本発明を実施するために用いた測定装置のブロ
ック図である。レーザ等の光源1がら出た光ど一ムはエ
クスパンダ2、アパーチャ3で適当な大きさの平行光束
にされた後、試料セル部4に照tJJされる。試料レル
部4には試料保持機構部15が付いていおり、コントロ
ーラ部12で温度制御等が可能である。4で回折された
光はフーリエ変換レンズ5で無事面6上に回折パターン
として結像され、その強度分布は光電管7を用いて測定
される。7はスキャン部8によって6上を走査されめる
強度分布パターンを測定づる。スキャン部8は走査制御
部10で制御され、受光部7が検出している6上での位
置情報をコントローラ部12に与える。一方、7で得た
光強度信号はアンプ・フィルタ部11で処、理され、回
折パターン強度信号としてコントローラ部12に与えら
れる。
ック図である。レーザ等の光源1がら出た光ど一ムはエ
クスパンダ2、アパーチャ3で適当な大きさの平行光束
にされた後、試料セル部4に照tJJされる。試料レル
部4には試料保持機構部15が付いていおり、コントロ
ーラ部12で温度制御等が可能である。4で回折された
光はフーリエ変換レンズ5で無事面6上に回折パターン
として結像され、その強度分布は光電管7を用いて測定
される。7はスキャン部8によって6上を走査されめる
強度分布パターンを測定づる。スキャン部8は走査制御
部10で制御され、受光部7が検出している6上での位
置情報をコントローラ部12に与える。一方、7で得た
光強度信号はアンプ・フィルタ部11で処、理され、回
折パターン強度信号としてコントローラ部12に与えら
れる。
コントローラ部12は、これらの情報をもとにパターン
分布を再措成する。そしてコントローラ部12は基準パ
ターンとの差をしかるべき手順で数値化したり、グラフ
、あるいは粒径分布の計算等の処理を行なう。
分布を再措成する。そしてコントローラ部12は基準パ
ターンとの差をしかるべき手順で数値化したり、グラフ
、あるいは粒径分布の計算等の処理を行なう。
この様にして得た結果はディスプレイ装置13に出力さ
れる。
れる。
実施例1
第3図には、本測定法でめられた粒体の回折強度パター
ンを示しである。用いた試料の調整方法は次の通りであ
る。メタクリル酸グリシジル、メタクリルM2−とドロ
キシエチル及びトリエチレングリコールジメタクリレー
トを 85.7/9.5/4.8 (モル比)の割合で
、プロピオン酸エチルと四塩化炭素(重量比1:1)か
らなる溶媒中で混合し、■−65を開始剤として45℃
、16時間で共重合した。この粒子をアセ、トン中ビク
トリアブルーを用いて青色に染色した後、8%アンモニ
ア水溶液で40℃、2.5時間処理してメタクリル酸グ
リシジル由来のエポキシ基をアミノ基とした。さらに、
0.16%希硫酸水溶液中で50℃、24時、間処理し
て残存エポキシ基を加水分解量環した。このように、調
整した粒子を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化したアルギン
酸ナトリウムの水溶液で処理し、洗浄し、リン酸バッフ
ァー中ウシ血清アルブミン(BSA)と反応させ目的と
する粒子を得た。以下、この粒子をBSA固定化粒子と
略す。
ンを示しである。用いた試料の調整方法は次の通りであ
る。メタクリル酸グリシジル、メタクリルM2−とドロ
キシエチル及びトリエチレングリコールジメタクリレー
トを 85.7/9.5/4.8 (モル比)の割合で
、プロピオン酸エチルと四塩化炭素(重量比1:1)か
らなる溶媒中で混合し、■−65を開始剤として45℃
、16時間で共重合した。この粒子をアセ、トン中ビク
トリアブルーを用いて青色に染色した後、8%アンモニ
ア水溶液で40℃、2.5時間処理してメタクリル酸グ
リシジル由来のエポキシ基をアミノ基とした。さらに、
0.16%希硫酸水溶液中で50℃、24時、間処理し
て残存エポキシ基を加水分解量環した。このように、調
整した粒子を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化したアルギン
酸ナトリウムの水溶液で処理し、洗浄し、リン酸バッフ
ァー中ウシ血清アルブミン(BSA)と反応させ目的と
する粒子を得た。以下、この粒子をBSA固定化粒子と
略す。
このBSA固定化粒子をさらに洗浄後、ヒト血清アルブ
ミン()−18A〉を1%含むリン酸バッファ中に分散
させ、容積比で0.0625%に混ぜたものを用いた。
ミン()−18A〉を1%含むリン酸バッファ中に分散
させ、容積比で0.0625%に混ぜたものを用いた。
顕微鏡で均一に分散していることを確認後、試料セル部
に注入し、その回折パターンを光電管を介して測定した
。要した試液量は22μaであった。
に注入し、その回折パターンを光電管を介して測定した
。要した試液量は22μaであった。
第3図(a )は粒径3μmのBSA固定化粒子の場合
であり、焦点距離125mmのレンズを用い、無事面上
での光軸位置を原点とし、X軸は原点からの距離、Y軸
は回折パターンの強度に原点からの距離を掛けたものを
示しである。これは、粒径による周期的な回折パターン
を強Hするために行なった演算処理であり、データ自体
の判定には全く関与しない処理である。
であり、焦点距離125mmのレンズを用い、無事面上
での光軸位置を原点とし、X軸は原点からの距離、Y軸
は回折パターンの強度に原点からの距離を掛けたものを
示しである。これは、粒径による周期的な回折パターン
を強Hするために行なった演算処理であり、データ自体
の判定には全く関与しない処理である。
第3図(b)は同じく6μm径のものである。
両者を比較すると、明らかに粒径の違いによる回折パタ
ーンに差が生じている。
ーンに差が生じている。
第3図(C)は全体の粒子濃度が同じ<0.0625%
となるようにし、各々6μmと3μmの粒径のものを等
濃度で1=1の割合で混合したものである。(a )と
(b)の各々の周期性の中間の状態が表われている。こ
れは両者の粒径のものの混合比を連続的に変えることに
より、(a)から(b)へと連続的に変わるものである
。
となるようにし、各々6μmと3μmの粒径のものを等
濃度で1=1の割合で混合したものである。(a )と
(b)の各々の周期性の中間の状態が表われている。こ
れは両者の粒径のものの混合比を連続的に変えることに
より、(a)から(b)へと連続的に変わるものである
。
この様に本発明による測定法に於ては、異なる粒径のも
のが混在することにより回折パターンが変化し、その変
化の程度は混合比により一意的に決る。例えば、凝集に
より均一な粒径の分散系の内に凝集塊が生じた場合、そ
の塊は異なる粒子として回折を生じ、ここでの図(0)
の様にもとの基本パターンとずれたパターンを与える。
のが混在することにより回折パターンが変化し、その変
化の程度は混合比により一意的に決る。例えば、凝集に
より均一な粒径の分散系の内に凝集塊が生じた場合、そ
の塊は異なる粒子として回折を生じ、ここでの図(0)
の様にもとの基本パターンとずれたパターンを与える。
実施例2
第4図は粒径3μmのBSA固定化粒子を用いたtn度
0.125%の分散溶液に、所定の抗BS△抗血清液を
倍々希釈していったものをそれぞれ1:1の容積比で混
入し、最終粒子濃度を0.0625%に調整し、数分間
励振し、2時間静置後、沈降°したものを再びごくゆる
やかにMmさせ、スポイトで試料セル部に注入し、本発
明による測定法で回折パターンをとったものである。
0.125%の分散溶液に、所定の抗BS△抗血清液を
倍々希釈していったものをそれぞれ1:1の容積比で混
入し、最終粒子濃度を0.0625%に調整し、数分間
励振し、2時間静置後、沈降°したものを再びごくゆる
やかにMmさせ、スポイトで試料セル部に注入し、本発
明による測定法で回折パターンをとったものである。
なお、各試料は、従来法と比較するため、マイクロプレ
ート法でも同じ濃度で測定し凝集の有無を判定した。さ
らには必要に応じて顕微鏡下でも観察した。データに見
られる周期性は主に(3)式でのベッセル関数J1から
出ている。データ処理として、個数Nのバラツキによる
寄与をなくするため、各々第2番目のピークで規格化し
、さらには強度■に原点からの距#tXの2乗をかけて
縦軸Inorn+alは となるように計算処理を施した。
ート法でも同じ濃度で測定し凝集の有無を判定した。さ
らには必要に応じて顕微鏡下でも観察した。データに見
られる周期性は主に(3)式でのベッセル関数J1から
出ている。データ処理として、個数Nのバラツキによる
寄与をなくするため、各々第2番目のピークで規格化し
、さらには強度■に原点からの距#tXの2乗をかけて
縦軸Inorn+alは となるように計算処理を施した。
第4(a)図は抗B、SA抗血清原液を320倍希釈し
たもので、■は比較基準(以下、コントロールと称す。
たもので、■は比較基準(以下、コントロールと称す。
)用に抗血清を含まない液、◎は含む液を用いたもので
ある。以下、■、Oの意味は全て同じである。(b )
は1280倍希釈、(C)ハ2560 倍、(d )
は5120(81釈FiF3る。
ある。以下、■、Oの意味は全て同じである。(b )
は1280倍希釈、(C)ハ2560 倍、(d )
は5120(81釈FiF3る。
希釈度が増すに従い、抗血清St度が下がるため、マイ
クロプレート、顕微鏡でいずれも凝集反応は生じにくく
なっている。本発明の方式の結果では(つのコントロー
ルに対する回折パターンの変化は320.1280倍は
大体同じであるが、2560倍では違いは少なくなり、
5120倍希釈では■のコントロールと◎との差は殆ど
なくなっている。マイクロプレート法では5120倍は
陰性、320,1280倍t、t 4性r1280倍は
判定の境界であった。両者を比べて陰陽判定ではマイク
ロプレート法と同じ結果となった。
クロプレート、顕微鏡でいずれも凝集反応は生じにくく
なっている。本発明の方式の結果では(つのコントロー
ルに対する回折パターンの変化は320.1280倍は
大体同じであるが、2560倍では違いは少なくなり、
5120倍希釈では■のコントロールと◎との差は殆ど
なくなっている。マイクロプレート法では5120倍は
陰性、320,1280倍t、t 4性r1280倍は
判定の境界であった。両者を比べて陰陽判定ではマイク
ロプレート法と同じ結果となった。
また、顕微鏡観察では2560倍は凝集しているものの
、320,1280倍に比べ、凝集塊が視野内で少く、
塊の大きさもがなり小さがった。
、320,1280倍に比べ、凝集塊が視野内で少く、
塊の大きさもがなり小さがった。
定単的な判定をするため、−例として、このグラフ上で
の■と◎の両者の面積差をX=25mmから7’5mm
の間で比べて見ることとすると、第2表に示すように5
120倍に比べ320倍と1280倍は共におよそ8倍
程度の差があった。
の■と◎の両者の面積差をX=25mmから7’5mm
の間で比べて見ることとすると、第2表に示すように5
120倍に比べ320倍と1280倍は共におよそ8倍
程度の差があった。
第2表
また、中間である2560倍では値も中間の値を示し、
顕微鏡観察とよく対応して定量性もあることが明らかで
ある。
顕微鏡観察とよく対応して定量性もあることが明らかで
ある。
他の判定法としては例えば、周期パターンの山と谷との
差の大小をもとることができる。この方法でも上述の様
な判定が正しく行なえることは図を見ても明らかである
。
差の大小をもとることができる。この方法でも上述の様
な判定が正しく行なえることは図を見ても明らかである
。
実施例3
第5図は粒径6μmのBSA固定化粒子を、濃度0.1
25%の分散溶液に調整し、抗BSA抗血清液原液を所
定の倍率に希釈したものと、コントロール用として抗B
SA抗体を含まない血清液を同倍率に希釈したものとを
用い、両者を比較したものである。
25%の分散溶液に調整し、抗BSA抗血清液原液を所
定の倍率に希釈したものと、コントロール用として抗B
SA抗体を含まない血清液を同倍率に希釈したものとを
用い、両者を比較したものである。
混合比は共に1=1とし、コントロール、試料共、粒子
の最終温度は0.0625%に調整した。
の最終温度は0.0625%に調整した。
また、凝集状態の比較検証のため、同希釈度でのマイク
ロプレート法測定、顕微鏡下での観察も同時に行なった
。ここでは、64.0(!15と1280倍に希釈した
2例について掲げである。マイクロプレート、顕微鏡共
にコントロール用試料では凝集は観察されず、抗体含有
血清を用いたものでは640倍は凝集(陽性)、128
0倍は未凝集(陰性)となっていた。
ロプレート法測定、顕微鏡下での観察も同時に行なった
。ここでは、64.0(!15と1280倍に希釈した
2例について掲げである。マイクロプレート、顕微鏡共
にコントロール用試料では凝集は観察されず、抗体含有
血清を用いたものでは640倍は凝集(陽性)、128
0倍は未凝集(陰性)となっていた。
ここでは、測定における光学系からの反射、迷光等の測
定データへの影響を除くため、試料セル部にブランクデ
ータ測定用として蒸溜水を注入し、無事面での強度パタ
ーンデータをとり、それをバックグラウンドデーターど
して利用した。
定データへの影響を除くため、試料セル部にブランクデ
ータ測定用として蒸溜水を注入し、無事面での強度パタ
ーンデータをとり、それをバックグラウンドデーターど
して利用した。
目的とづ゛る試液、コントロール液を用いて各々回折強
度パターンデータを測定後、バックグラウンドデータを
引き、次いで原点からの距離の2乗を掛けることにより
、演算後の強度データ(norlalを得た。
度パターンデータを測定後、バックグラウンドデータを
引き、次いで原点からの距離の2乗を掛けることにより
、演算後の強度データ(norlalを得た。
第5図の(a )、(b)共に■はコントロール、◎は
試液での(normal 対 Xを示す回折パターパタ
ーン変化(コントラスト低下)が観測され、1280倍
(b)ではその差は小さい。マイクロプレート法、顕微
鏡観察と一致した結果となっている。
試液での(normal 対 Xを示す回折パターパタ
ーン変化(コントラスト低下)が観測され、1280倍
(b)ではその差は小さい。マイクロプレート法、顕微
鏡観察と一致した結果となっている。
Xが25mm〜75mmでの■と◎の本グラフでの面積
差は(a)では10.8cr#、、b (b )rは2
.90cdと約3.7倍の差があった。
差は(a)では10.8cr#、、b (b )rは2
.90cdと約3.7倍の差があった。
実施例4
第6図は試料セル部において、試料注入後の凝集の進行
を経時的に観測したものである。3μ指粒径のBSA固
定化粒子を用い、粒子担体11度は0.125%に調整
し、抗体としては抗BSA抗血清液を1280倍に希釈
したものを粒子含有液と同容量用意した。測定に先たち
、コントロール用として、抗体を含まない血清液を同じ
く1280倍に希釈し、粒子含有液と1:1に混合し、
最終粒子濃度を0.0625%に調整した。
を経時的に観測したものである。3μ指粒径のBSA固
定化粒子を用い、粒子担体11度は0.125%に調整
し、抗体としては抗BSA抗血清液を1280倍に希釈
したものを粒子含有液と同容量用意した。測定に先たち
、コントロール用として、抗体を含まない血清液を同じ
く1280倍に希釈し、粒子含有液と1:1に混合し、
最終粒子濃度を0.0625%に調整した。
実施例3の場合と同じようにして、バックグラウンドデ
ータをとり、上記コントロール液での測定パターンデー
タから減算し、次いで原点からの距離の2乗を掛(プた
ものを第6図(a >、(b)の■のコントロールデー
タとした。経時変化測定のデータ第6図(a)、(b)
の◎についてもデータ処理はこれと同様に行なった。
ータをとり、上記コントロール液での測定パターンデー
タから減算し、次いで原点からの距離の2乗を掛(プた
ものを第6図(a >、(b)の■のコントロールデー
タとした。経時変化測定のデータ第6図(a)、(b)
の◎についてもデータ処理はこれと同様に行なった。
前記の粒子含有液と抗体含有希釈血清を1=0で1:1
に混合し、最終粒子濃度を0.0625%としてt=8
分経時後に測定したものが第6図<a >の◎であり、
t =171分後が第6図(b)の◎である。この測定
と同時に試験管内にこの混合液の一部をとり、本発明に
よる測定法での測定と同時間後(8分、171分後〉に
顕微鏡下で直接凝集状態を観察した。
に混合し、最終粒子濃度を0.0625%としてt=8
分経時後に測定したものが第6図<a >の◎であり、
t =171分後が第6図(b)の◎である。この測定
と同時に試験管内にこの混合液の一部をとり、本発明に
よる測定法での測定と同時間後(8分、171分後〉に
顕微鏡下で直接凝集状態を観察した。
その結果、この実施例における試料では8分経過では非
常に凝集が弱く、171分後も凝集が進行するが、凝集
程度は低く、凝集塊もあまり大きくならなかった。
常に凝集が弱く、171分後も凝集が進行するが、凝集
程度は低く、凝集塊もあまり大きくならなかった。
ここで(a>、(b)共にコントロールと化較し、その
回折パターンの変化を定量化するにあたり、原点からの
距IIIItXにおける■と◎の両者の強度の差の絶対
値をめ、グラフ上で両者の差が3111m以上ある部分
のみの強度差に対応するところでの面積のみをめた(
3 mmにスレッシュホールドを設定)。これはコント
ロールと測定データとの差が小さい場合、全体としてパ
ターンに差が無くても、両者は完全に重なることはあり
得ず、実施例1〜3のように面積をめた場合、この僅か
な違いも積算の内に入り、パターンの差の有無判定にお
ける本方式での定量化のダイナミシクレンジを下げるた
めである。このことを示したのが(a )、(b)での
下部でのパターンであり、これは両者■と◎の差を約3
倍拡大したものであ、1点鎖線は3n+m差に対応づる
スレッシュホールドレベルを示す。これより大きい差の
出ている部分のみが面積差算出に於いて寄与する部分で
ある。計算にあたってはX−25111111から75
mmの範囲を用いた。
回折パターンの変化を定量化するにあたり、原点からの
距IIIItXにおける■と◎の両者の強度の差の絶対
値をめ、グラフ上で両者の差が3111m以上ある部分
のみの強度差に対応するところでの面積のみをめた(
3 mmにスレッシュホールドを設定)。これはコント
ロールと測定データとの差が小さい場合、全体としてパ
ターンに差が無くても、両者は完全に重なることはあり
得ず、実施例1〜3のように面積をめた場合、この僅か
な違いも積算の内に入り、パターンの差の有無判定にお
ける本方式での定量化のダイナミシクレンジを下げるた
めである。このことを示したのが(a )、(b)での
下部でのパターンであり、これは両者■と◎の差を約3
倍拡大したものであ、1点鎖線は3n+m差に対応づる
スレッシュホールドレベルを示す。これより大きい差の
出ている部分のみが面積差算出に於いて寄与する部分で
ある。計算にあたってはX−25111111から75
mmの範囲を用いた。
この方法で算出した面積は(a )では0.70cJ、
(b )では3.74cr#と約5倍の差を示した。
(b )では3.74cr#と約5倍の差を示した。
両者■どOの差を示す各図下部のパターンでは、171
分後のものの方がスレッシュホールドレベルを越すもの
が圧倒的に多く、顕微鏡観察での弱い凝集ながら、経時
的に凝集が進行することと良く対応している。なお、ス
レッシュホールドレベルは本発明に於いて、ここで述べ
た方法に限定されるものではなく、例えば測定系に合せ
て上下させたり、またXに対応して適当に重み付けした
りしても何ら差支えがないことは言うまでもない。
分後のものの方がスレッシュホールドレベルを越すもの
が圧倒的に多く、顕微鏡観察での弱い凝集ながら、経時
的に凝集が進行することと良く対応している。なお、ス
レッシュホールドレベルは本発明に於いて、ここで述べ
た方法に限定されるものではなく、例えば測定系に合せ
て上下させたり、またXに対応して適当に重み付けした
りしても何ら差支えがないことは言うまでもない。
このように本発明によれば、従来人力で行なっていた凝
集判定法とよい対応をづ−る測定が人手を介さず、また
定量化させて行ないうる。さらには、経時的な凝集状態
変化も、定量的に容易に自動化し得る形で行なうことが
できる。
集判定法とよい対応をづ−る測定が人手を介さず、また
定量化させて行ないうる。さらには、経時的な凝集状態
変化も、定量的に容易に自動化し得る形で行なうことが
できる。
ざらに6及ずれば、回折強度パターンをさらに詳細に検
討することにより、凝集塊分布、凝集塊形状についての
解析にも利用可能であり、さらには異なる粒子径を持つ
分散液での粒子分布についての解析にも利用できること
は言うまでもない。
討することにより、凝集塊分布、凝集塊形状についての
解析にも利用可能であり、さらには異なる粒子径を持つ
分散液での粒子分布についての解析にも利用できること
は言うまでもない。
第1図は本発明を実施するのに用いた測定装置の構成を
示すブロック図、第2図は本発明における測定原理を説
明するための図である。 第3図は、3μmと6μmの粒子とそれらの混金粒子を
用いて、測定された回折パターンデータで、粒径ににる
違いを示ず図、第4図、第5図1よ、それぞれ本発明の
実施例であって抗BSA抗血清り度による凝集程度の違
いを測定した回折パターンデータの差として示した図、
第6図は、本発明の実施例において凝集反応の経時変化
を回折パターンの変化として測定した結果を示す図であ
る。 特許出願人 東し株式会社 猶2日 (八) 第30 (C) 募3図 (a) 纂引m 第1/−口 (a) 第60 手続補正書 特許庁長官 志 賀 学 殿 1、事件の表示 昭和59年 特許願 第80107号 2、発明の名称 生理活性物質の検出方法 3、補正をする者 つ 5、補正により増加する発明の数 0 6、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」、「図面の簡単な説明」
の各欄および図面 7、補正の内容 (1)明細書5頁下から3〜2行目 「本発明は0.5〜10μm、より好ましくは1〜6μ
mと光の波長と同程度か士数倍の」を「本発明は0.1
〜10μm1より好ましくは0.1〜6μmと光の波長
より少し小さいか士数倍の」に補正する。 (2)明細書6頁1・かう6行目〜7頁13行目[単一
の波長の光・・・Rであるとする。]を[光ど物体の相
H作用にJ3いて、光の波長に対して物体が十分小さく
近似的に点と見”做してよい場合の散乱をレイリー(R
ayleigh )散乱と言う。 この場合には一般的に散乱体の形状に関する情報は含ま
れていない。一方、物体が波長より少し小さいか同程度
以上である場合、物体内の各点からの散乱光は互いに干
渉する。これを回折ともいう。 この回折パターンは物体内各点からの散乱光を位相も含
めて全体積にわたり積分するため、その物体の持つ光学
的特性、大きさ、形状などの情報を反映している。本出
願において扱う粒子は丁度後者の場合に相当している。 この様な微小粒子を均一な光学的な場に置いた場合の光
の回折については色々な場合について論じられている(
Mie。 [) ebyeの理論等)。ここで本出願の意図する所
を判りやすくするために話をごく簡単化して説明する。 すなわち、微小粒子が光学的に不透明で、しかもそれが
球形形状をしており、その断面形状より円形の吸収体で
あるとする。この場合については次に述べるような文献
に詳細に議論されている。 P rinciples of Q ptics M
ax B orn& Emil Wolf Peroamon Press p、395以下、上記
の文献に従い第2図を用いて、本発明の原理について説
明する。今、簡単のため、均一な平面光波の場所に置か
れた粒子Sが1個ある場合を考える。ただし、Sは上記
のような仮定を満し、その直径はRであるとする。」に
補正する。 (3)明細書箱10頁3行目 「粒径が異なる場合」を削除する。 (4)明細書第14頁下から7行目 [15が付いていおり」を 「15が付いており」と補正する。 (5)明m書第25頁10行目 「拡大したものであ、」を 「拡大したものであり、」と補正する。 (6)明細書筒26頁6行目 「このように本発明・・・」の前に次の文章を挿入する
。 [実施例5 次に市販のラテックス試薬を本発明に適応した例につい
て述べる。第7図は、リューマチ因子(RA因子〉検出
用試薬キットを用いて得た凝集度と希釈度の対応結果で
ある。使用ラテックスの粒径は0.5μm以下であるた
め、光学顕微鏡では粒子形状を明瞭に観察できない。 コントロールとしてキット内同封の対照陰性面 清を用
い、さらに同封の対照陽性血清をグリシン食塩緩衝液で
倍々希釈してRA因子濃度を変え、実施例4と同様なデ
ータ処理により、コントロールでの回折パターンとの面
積差として凝集度を算出し縦軸とした。横軸は希釈倍率
である。希釈によるRA囚子濃度の減少と凝集度が良く
対応しているのが判る。なお、陰性血清でも同様に希釈
し、測定の再現性を見たのが図中の■印である。これか
ら希釈倍率を変えても陰性血清では凝集度は変化せず、
ラテックスの分散状態が変わらないことが判る。この結
果は顕微鏡観察と良く一致し、本発明が粒子の分散状態
を再現性良く測定し得ることを示している。この試薬は
ガラス板上での凝集の有無を単に肉眼で定性的に判定す
るよう開発されたものであるため、定量性は保証されて
いないが、本発明によれば、この様な試薬でもある程度
の定量測定ができることを示している。なお、測定は、
試薬をマイクロプレート上で混合攪拌後第5図(a、)
に示すようなセルに注入して行なった。 実施例6 第8図は、α−フェトプロティン(AFP)用の定量分
析ラテックス試薬を用いて同様な測定を行なった結果で
ある。ラテックス粒径は約0.2μmである。データの
処理や測定試薬セル作成方法等は実施例5の場合と同様
である。この試薬は定量用として凝集度がAFPffl
に対して連続的に変化するように調整されである。縦軸
が凝集度、横軸がAFP濃度を示す。この結果から、A
FP濃度約12.5nMIIlα以上で凝集し始め、そ
の濃度増加と共に凝集度が向上することが判る。なお、
コントロールとしては凝集を生ぜしめないウマ血清を用
いた。複数のコントロール試液間での回折パターンの相
違、すなわち、凝集度データのバラツキは十分小さく、
再現性の有ることは第7図の場合と同様であった。 実施例5および実施例6は、本発明に係る方法が、波長
よりも小さい粒子を用いる凝集試薬にも適用でき、かつ
その結果も定量的な評価が出来るものであることを示し
ている。前述した様に従来市販されている粒子は0.5
μm以下のものが多く、それらがそのまま本発明の方法
に適応できることは有意義であると言える。 (7)明1書27頁7行目 [・・・結果を示す図である。」の次に「第7図は本発
明の実施例としてリューマチ因子検出用試薬キットを用
いた場合の凝集度と希釈度の対応を示す図、第8図は、
本発明の実施例としてAFP用の定量分析ラテックス試
薬を用いた場合の凝集度と111度の対応を示す図であ
る。」を挿入する。 (8)別紙の図面、第7図および第8図を追加する。 希釈倍率 (倍) 濃 度 (ng/ml)
示すブロック図、第2図は本発明における測定原理を説
明するための図である。 第3図は、3μmと6μmの粒子とそれらの混金粒子を
用いて、測定された回折パターンデータで、粒径ににる
違いを示ず図、第4図、第5図1よ、それぞれ本発明の
実施例であって抗BSA抗血清り度による凝集程度の違
いを測定した回折パターンデータの差として示した図、
第6図は、本発明の実施例において凝集反応の経時変化
を回折パターンの変化として測定した結果を示す図であ
る。 特許出願人 東し株式会社 猶2日 (八) 第30 (C) 募3図 (a) 纂引m 第1/−口 (a) 第60 手続補正書 特許庁長官 志 賀 学 殿 1、事件の表示 昭和59年 特許願 第80107号 2、発明の名称 生理活性物質の検出方法 3、補正をする者 つ 5、補正により増加する発明の数 0 6、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」、「図面の簡単な説明」
の各欄および図面 7、補正の内容 (1)明細書5頁下から3〜2行目 「本発明は0.5〜10μm、より好ましくは1〜6μ
mと光の波長と同程度か士数倍の」を「本発明は0.1
〜10μm1より好ましくは0.1〜6μmと光の波長
より少し小さいか士数倍の」に補正する。 (2)明細書6頁1・かう6行目〜7頁13行目[単一
の波長の光・・・Rであるとする。]を[光ど物体の相
H作用にJ3いて、光の波長に対して物体が十分小さく
近似的に点と見”做してよい場合の散乱をレイリー(R
ayleigh )散乱と言う。 この場合には一般的に散乱体の形状に関する情報は含ま
れていない。一方、物体が波長より少し小さいか同程度
以上である場合、物体内の各点からの散乱光は互いに干
渉する。これを回折ともいう。 この回折パターンは物体内各点からの散乱光を位相も含
めて全体積にわたり積分するため、その物体の持つ光学
的特性、大きさ、形状などの情報を反映している。本出
願において扱う粒子は丁度後者の場合に相当している。 この様な微小粒子を均一な光学的な場に置いた場合の光
の回折については色々な場合について論じられている(
Mie。 [) ebyeの理論等)。ここで本出願の意図する所
を判りやすくするために話をごく簡単化して説明する。 すなわち、微小粒子が光学的に不透明で、しかもそれが
球形形状をしており、その断面形状より円形の吸収体で
あるとする。この場合については次に述べるような文献
に詳細に議論されている。 P rinciples of Q ptics M
ax B orn& Emil Wolf Peroamon Press p、395以下、上記
の文献に従い第2図を用いて、本発明の原理について説
明する。今、簡単のため、均一な平面光波の場所に置か
れた粒子Sが1個ある場合を考える。ただし、Sは上記
のような仮定を満し、その直径はRであるとする。」に
補正する。 (3)明細書箱10頁3行目 「粒径が異なる場合」を削除する。 (4)明細書第14頁下から7行目 [15が付いていおり」を 「15が付いており」と補正する。 (5)明m書第25頁10行目 「拡大したものであ、」を 「拡大したものであり、」と補正する。 (6)明細書筒26頁6行目 「このように本発明・・・」の前に次の文章を挿入する
。 [実施例5 次に市販のラテックス試薬を本発明に適応した例につい
て述べる。第7図は、リューマチ因子(RA因子〉検出
用試薬キットを用いて得た凝集度と希釈度の対応結果で
ある。使用ラテックスの粒径は0.5μm以下であるた
め、光学顕微鏡では粒子形状を明瞭に観察できない。 コントロールとしてキット内同封の対照陰性面 清を用
い、さらに同封の対照陽性血清をグリシン食塩緩衝液で
倍々希釈してRA因子濃度を変え、実施例4と同様なデ
ータ処理により、コントロールでの回折パターンとの面
積差として凝集度を算出し縦軸とした。横軸は希釈倍率
である。希釈によるRA囚子濃度の減少と凝集度が良く
対応しているのが判る。なお、陰性血清でも同様に希釈
し、測定の再現性を見たのが図中の■印である。これか
ら希釈倍率を変えても陰性血清では凝集度は変化せず、
ラテックスの分散状態が変わらないことが判る。この結
果は顕微鏡観察と良く一致し、本発明が粒子の分散状態
を再現性良く測定し得ることを示している。この試薬は
ガラス板上での凝集の有無を単に肉眼で定性的に判定す
るよう開発されたものであるため、定量性は保証されて
いないが、本発明によれば、この様な試薬でもある程度
の定量測定ができることを示している。なお、測定は、
試薬をマイクロプレート上で混合攪拌後第5図(a、)
に示すようなセルに注入して行なった。 実施例6 第8図は、α−フェトプロティン(AFP)用の定量分
析ラテックス試薬を用いて同様な測定を行なった結果で
ある。ラテックス粒径は約0.2μmである。データの
処理や測定試薬セル作成方法等は実施例5の場合と同様
である。この試薬は定量用として凝集度がAFPffl
に対して連続的に変化するように調整されである。縦軸
が凝集度、横軸がAFP濃度を示す。この結果から、A
FP濃度約12.5nMIIlα以上で凝集し始め、そ
の濃度増加と共に凝集度が向上することが判る。なお、
コントロールとしては凝集を生ぜしめないウマ血清を用
いた。複数のコントロール試液間での回折パターンの相
違、すなわち、凝集度データのバラツキは十分小さく、
再現性の有ることは第7図の場合と同様であった。 実施例5および実施例6は、本発明に係る方法が、波長
よりも小さい粒子を用いる凝集試薬にも適用でき、かつ
その結果も定量的な評価が出来るものであることを示し
ている。前述した様に従来市販されている粒子は0.5
μm以下のものが多く、それらがそのまま本発明の方法
に適応できることは有意義であると言える。 (7)明1書27頁7行目 [・・・結果を示す図である。」の次に「第7図は本発
明の実施例としてリューマチ因子検出用試薬キットを用
いた場合の凝集度と希釈度の対応を示す図、第8図は、
本発明の実施例としてAFP用の定量分析ラテックス試
薬を用いた場合の凝集度と111度の対応を示す図であ
る。」を挿入する。 (8)別紙の図面、第7図および第8図を追加する。 希釈倍率 (倍) 濃 度 (ng/ml)
Claims (1)
- 微小粒子の凝集反応を利用して生理活性物質を検出する
方法において、媒液中に分散する該微粒子にコヒーレン
トな光を照射し、その回折パターンを測定して、それと
未凝集試料の回折パターンとの比較から該微小粒子の凝
集状態を定量化することを特徴とする生理活性物質の検
出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8010784A JPS60224041A (ja) | 1984-04-23 | 1984-04-23 | 生理活性物質の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8010784A JPS60224041A (ja) | 1984-04-23 | 1984-04-23 | 生理活性物質の検出方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60224041A true JPS60224041A (ja) | 1985-11-08 |
Family
ID=13708956
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8010784A Pending JPS60224041A (ja) | 1984-04-23 | 1984-04-23 | 生理活性物質の検出方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS60224041A (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6347660A (ja) * | 1986-08-13 | 1988-02-29 | Hiroaki Inoue | 物質の生理活性判定方法並びにそれに使用する装置 |
GB2273772A (en) * | 1992-12-16 | 1994-06-29 | Granta Lab Ltd | Detection of macromolecules utilising light diffraction |
WO1996012962A1 (en) * | 1994-10-21 | 1996-05-02 | Biocircuits Corporation | Particle diffraction assay |
KR100431112B1 (ko) * | 1998-12-04 | 2004-05-12 | 프라운호퍼-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 안게반텐 포르슝에.파우. | 반도체 제조시 마이크로 구조화 표면의 제조 프로세스를광학적으로 모니터링하기 위한 방법 및 장치 |
US7003149B2 (en) | 1998-12-04 | 2006-02-21 | Semiconductor 300 Gmbh & Co. Kg | Method and device for optically monitoring fabrication processes of finely structured surfaces in a semiconductor production |
-
1984
- 1984-04-23 JP JP8010784A patent/JPS60224041A/ja active Pending
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6347660A (ja) * | 1986-08-13 | 1988-02-29 | Hiroaki Inoue | 物質の生理活性判定方法並びにそれに使用する装置 |
GB2273772A (en) * | 1992-12-16 | 1994-06-29 | Granta Lab Ltd | Detection of macromolecules utilising light diffraction |
WO1996012962A1 (en) * | 1994-10-21 | 1996-05-02 | Biocircuits Corporation | Particle diffraction assay |
KR100431112B1 (ko) * | 1998-12-04 | 2004-05-12 | 프라운호퍼-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 안게반텐 포르슝에.파우. | 반도체 제조시 마이크로 구조화 표면의 제조 프로세스를광학적으로 모니터링하기 위한 방법 및 장치 |
US7003149B2 (en) | 1998-12-04 | 2006-02-21 | Semiconductor 300 Gmbh & Co. Kg | Method and device for optically monitoring fabrication processes of finely structured surfaces in a semiconductor production |
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