JPS60222772A - 抗一酵素標識特異結合分析法、試薬系及び試験キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 産業上皇■且分野 特異結合分析技術の発達は、極めて低濃度で液体媒体中
に存在する、診断、医薬、環境及び工業的に重要な種々
の有機物質を測定するため極めて有用な分析法を提供し
てきた。特異結合分析は、本明細書において″被分析物
”と記す測定すべき物質とその結合相手との間の特異的
反応に基づくものである。被分析物及びその結合相手の
一方が抗体であり、他方が対応ずるハプテン又は抗原で
ある場合には、分析は免疫分析として知られている。

當用の特異結合分析技術では、分析すべき液体媒体の試
料を種々の組成の試薬系と混合する。このような組成物
は、標識と結合した結合成分を含む標識接合体を含む。

標識接合体中の結合成分は試薬系の他の成分があれば、
その成分及び分析すべき媒体中の被分析物と反応して２
種の標識接合体、即ち結合種及び遊離種を形成する。結
合種においては、標識接合体中の結合成分、例えばハプ
テン又は抗原は対応する結合相手、例えば抗体によって
結合され、遊離種では、結合成分はそのように結合され
ていない。遊離種と比べた、結合種を生じる標識接合体
の相対的量又は割合は、試験試料中の被分析物の存在又
は量の函数である。

結合種の標識接合体が遊離種の標識接合体の存在では標
識を監視するため使用される手段によってほとんど識別
されない場合には、分析を完結するため、結合種及び遊
離種を物理的に分離しなげればならない。この種の分析
法は、この分野で“不均質型”と言われる。標識接合体
の結合種及び遊離種を、相互の存在で区別することがで
きる場合には、“均質型”により、分離工程を省くこと
ができる。

本発明は、液体媒体中の被分析物を定量的又は定性的に
測定するための特異結合分析法及び試薬系に関する。特
に、本発明は、使用する標識が抗−酵素、例えば酵素に
対する抑制抗体又はそのフラグメントである分析法及び
試薬系、特に均質型の分析法及び試薬系に関する。

従来■肢血 発見すべき最初の高感度特異結合分析は、標識として放
射性同位元素を使用するラジオイムノアノセイであった
。このような分析法は、標識の監視可能な特性が遊離種
及び結合種において同一であるので、必ず不均質型によ
らなければならない。

放射性物質を取り扱う不便さ及び困難さ並びに分離工程
の必要があるので、酵素、ハタテリオファージ、金属及
び有機金属錯体、補酵素、酵素基質、酵素変調剤、例え
ば活性化剤及び抑制剤、閉環反応体、スピンラジカル、
有機及び無機触媒、補欠分子団、化学発光反応体及び螢
光分子を含めて標識成分として放射性同位元素以外の物
質を使用する均質型分析系が工夫された。

このような均質型特異結合分析の一般に代表的なものは
、米国特許第４，１３４，７９２号、同第４，２２６，
９７８号、同第４，２３０，７９７号、同第４．２３８
，１９５号、同第４．２３８，５６５号、同第３，９３
５，０７４号、同第４，２０８，４７９号、同第４，２
３３，４０１号、同第４，２５６，８３４号、同第３．
８１７，８３７号、同第４，０４３，８７２号、同第３
，９９６，３４５号、同第４，２３３，４０２号、同第
４，１６０．６４−５号、同第３，６９０，８３４号及
び４，２７８，８６６号明細書、及び英国特許第１，５
９５，１０１号明細書に記載されている。これらの技術
のうぢ、下記のものは、ある意味で、抗一酵素による酵
素活性の変調に基づく反応を監視する標識に関するもの
である。

米国特許第４，１３４，７９２号及び同第４，２７８，
８６６号明細書及び英国特許第１，５９５，１０１号明
細書は、標識として酵素変調因子を使用する特異結合分
析を記載している。均質法で実施する場合、酵素に対す
る標識接合体の変調作用、多くの場合、酵素活性の抑制
は、結合種において変化し、通常、減少する。

米国特許第４，２０８，４７９号及び同第４，２３３，
４０１号明細書は、酵素を標識として使用する均質特異
結合分析を記載している。標識する酵素の触媒活性が実
質的に保有されるように標識接合体か形成される。しか
しながら、標識接合体に結合相手、例えば抗体を結合す
ると、酵素活性が低減する。

特に均質型の特異結合分析に抗一酵素標識を使用するこ
とは、１９８１年７月２１日に出願され、現在の譲受人
の親会社であるアメリカ合衆国インジアナ州エルクハー
トのマイルス・ラボラトリイーズ社（ＭｉｌｅｓＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に譲渡されている米国
特許出願第２８５．６０５号明細書に記載されている。

このような特許出願は、特異結合分析法において標識と
して種々の異なる酵素に対する抗体を使用することを記
載し、抗−ベルオキシダーゼを標識として使用する特別
の例を示している。抗一ペルオキシダーセ標識の使用は
、米国特許出願第２８５，６０５号明細書の発明者との
共同研究者によってフエブス・レタース（ＦＥＢＳＬｅ
ｔｔｅｒｓ）１１６（２）：２ａｓ−２ｓｓ（１９８０
年７月）一ンゴー（Ｎｇｏ）及びレンホフ（Ｌｅｎｈｏ
ｆｆ）にも記載されている。

ｌ訓序ｌＷ児 本発明は、グルコース−６−ボスフェートデヒドロゲナ
ーゼ（０６ＰＤＨ）を抗一酵素（抗−Ｇ６ＰＤＨ）標識
によって抑制されうる酵素として選択することによって
、抗一酵素標識特異結合分析法及び試薬系を明らかに改
良するものである。

分析の進行は、抗−Ｃ；６ＰＤＨ標識によるＧ６ＰＤＨ
の抑制の程度を測定することによって監視しうる。抗−
０６ＰＤＨ標識は、常用の多クローン性又は単クローン
性の完全抗体又はそのフラグメン１・である。分析は不
均質型又は均質型であってよいが、後者が特に有利であ
る。゛低分子量ハプテン、例えば薬剤、ホルモン及び代
謝産物から、高分子量抗原、例えば蛋白質及びポリペプ
チドまで多様な被分析物を測定することができる。本発
明方法は液体試験系から固体状態の試験具まで、また手
操作系から自動操作系まで、多様な型で使用ずるため適
用ずることができる。

本発明による改良は、従来の抗一酵素標識結合分析、特
に抗−ベルオキシダーゼ標識分析、例えばンコ及びレン
ボノフの前掲文献によって記載された分析に比べて特定
の利点をもたらす。抗一Ｇ６ＰＤＨ標識接合体か、監視
する酵素、即らＧ６ＰＤＨの酵素活性を１００％抑制し
うろことが判明したが、ベルオキシダーセ／抗一ベルオ
キシダーセ系に関する公表された最良の結果は、その系
が約７５％しか抑制しないことを示している。本発明の
抗−Ｇ６ＰＤＨ標識の抑制能がこのように顕著に増加す
ることにより、分析は一層鋭敏になり、かつ試薬、特に
合成により輩潰される標識接合体を著しく少量しか必要
としないものとなる。

更に、本発明のＧ６ＰＤＨ／抗一０６ＦＩＤＨ系は、試
料の干渉に対して著し《少ししか影響を受けず、従来の
ベルオキシダーゼに基づく方法より試薬系として著しく
安定であることか判明した。微生物源であるリューコノ
ストソク・メゼンテロイデス（ＥＣ１．１．１．４９）
から得られるＧ６ＰＤＨを使用ずるのが特に好ましい。

それというのは、このような形の酵素は補助因子として
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ’Ｄ）を
使用することができるが、咄乳動物の体液、例えばヒト
の尿及び血清試料に対して内因性の０６ＰＤＨは活性の
ため異なる補助因子、即ちニコチンアミトアデニンジヌ
クレオチドポスフェート（ＮＡＤＰ）を必要とするから
である。他方、過酸化物活性は分析的に問題の生物学的
液体中にかなりの濃度で存在する。更に、分析試薬とし
てベルオキシダーゼが免疫分析に使用するのに必要な低
濃度ではあまり安定でないことは公知である。

本発明の改良された分析法は、高感度分析法を提供する
方法で、即ち、競合結合、均質型に従つて１ナノモル（
ｎＭ；１０”モル）より少ない被分析物を検出しうる方
法で実施することかできる。このような感度は、競合結
合反応に対して６０分の範囲の静置時間及び酵素監視反
応に対して２０分の範囲の静置時間で比色終点法を選択
した結果である。生物学的液体の成分による典型的吸光
より長い波長での吸光を有する色原体指示薬を選択する
ことができる。螢光指示薬を使用することによって更に
鋭敏にすることができる。

試験試料中の被分析物を測定する本発明方法は標識成分
として抗−Ｇ６ＰＤＨを有ずる標識接合体を含む分析試
薬と試験試料を混合又は接触ざせることを含み、このよ
うな抗−Ｇ６ＰＤＨ標識はＧ６ＰＤ１１の触媒活性を測
定可能に抑制することができる。抗−Ｇ６ＰＤＨ標識が
結合する結合成分及び分析試薬の別の結合要素（あると
すれば）は、公知のとおり所望の分析法により選択する
。

例えば、競合結合法により、標識接合体中の結合成分は
被分析物又はその類縁体であり、分析試薬は更に被分析
物に対する結合相手、例えば抗体を含むであろう。

試験試料と分析試薬との混合の正味の結果は、標識接合
体の結合種及び遊離種を有する反応混合物の形成である
。分析は、結合種又は遊！ｉｉｌｆ種の標識接合体によ
るＧ６ＰＤＪ｛の抑制の程度を測定することによって達
成される。選択した種におけるＧ６ＰＤ｝ｆ活性の測定
によりｆ．Ｑられる分析値は、試験試料中の被分析物の
量の函数である。不均質型によれば、結合種及び遊離種
を分離し、その一方におけるＧ６ＰＤＨ活性を測定する
が、均質型によれば分離する必要はなく、反応混合物中
で直接Ｇ６ＰＤＨ活性を測定する。

好圭互ｙ夫漏月蔵勿退泗一 本明細書において、特に断らない限り、下記の用語は下
記のように定義される： 被分析物一液体媒体中のその存在又は量を測定すべきで
ある物質又は類縁物質類 被分析物の結合相手〜被分析物に対して特異結合親和性
、通常可逆的な特異結合親和性を有する任意の物質又は
物質類、 被分析物の特異結合類縁体一被分析物の結合相手による
結合に関して被分析物と頬似した挙動を示す任意の物質
又は物質類、 試薬系一本発明の分析法を実施する際に使用する試薬の
組成物、試験具、試験キット又は他の物理的配列若しく
は組合せ。

被分析物 本発明の分析法を、利用しうる特異結合相手がある被分
析物の検出に適用することができる。被分析物は、通常
、ペプチド、ポリペプチト、蛋白質、炭水化物、糖蛋白
、ステロイド、又は生物学的系に特異結合相手が存在す
るか、若しくは合成される他の有機分子である。被分析
物は、機能的には、通富、抗原とそれに対する抗体；ハ
プテンとそれに対する抗体；ボルモン、ビタミン、代謝
産物及び医薬、並びにそれらの結合相手、及びハイブリ
ソド形成可能な核酸、例えばＤＮＡ及びＲＮＡを含む群
から選択される。被分析物ぱ、通富約ｉ，ｏｏｏ〜約１
０，０００，’０００の分子量を有する免疫学的に活性
なポリペプチド又は蛋白質、例えば少なくとも約１００
、通富約１５００以下の分子量を有する抗体又は抗原性
ポリベブチド若しくは蛋白質又はハプテンであるのが普
通である。

代表的ポリペプチド被分析物はアンギオテンシンｌ及び
■、Ｃ−ペプチド、オキシドシン、バソブレソシン、ニ
ューロフィシン、ガストリン、セクレチン、ブラジキニ
ン及びグルカゴンである。

代表的蛋白質被分析物は、プロタミン、ムコ蛋白、糖蛋
白、グロブリン、アルブミン、硬蛋白、燐蛋白、ヒスト
ン、リボ蛋白、色素蛋白及び核蛋白の類を含む。特異性
蛋白質は、例えばブリアルブミン、α１−リボ蛋白、ヒ
ト血清アルブミン、α１一酸糖蛋白、α，一抗トリブシ
ン、α＋Ｕｎ蛋白、１一ランスコルチン、チロキシン結
合グロブリン、ハブトグロビン、ヘモグロビン、ミオグ
１」ビン、セル口プラスミン、α２−リボ蛋白、α２一
マクログロブリン、β−リボ蛋白、エリスロポエチン、
トランスフェリン、ヘモペキシン、フィブリノーゲン、
免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ，Ｉｇ
Ｄ及びＩｇＥ及びそれらのフラグメント、例えばＦＣ及
びＦａｂ、補体因子、プロラクチン、血液凝固因子、例
えばフィブリノーゲン、トロンビン等、インシュリン、
メラノト口ピン、ソマトトロピン、チロトロピン、卵胞
刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ゴナドト口ピン、甲
状腺刺激ホルモン、胎盤ラクトゲン、内因子、トランス
コバラミン、血清酵素、例えばアルカリホスファターゼ
、乳酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、リバーゼ、ホス
ファターゼ、コリンエステラーゼ、グルタミン酸オキサ
ロ酢酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸ピルビン酸ト
ランスアミナーゼ、及びウロベプシン、エンドルフィン
、エンケファリン、プロタミン、組織抗原、細菌抗原、
及びウィルス抗原、例えば肝炎関連抗原（例えば｝ｌＢ
ｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びｌＩＢｅＡｇ）である。

代表的ハプテン被分析物は、一般的薬剤、代謝産物、ホ
ルモン、ビタミン及び同様の有機化合物を包含する。ハ
プテンホルモンはチロキシン及びトリョード号イロニン
を包含する。ビタミンは、ビタミンＡ，Ｂ、例えばＢ１
２、Ｃ，Ｄ，Ｅ及びＫ１葉酸及びチアミンを包含する。

薬剤は抗生物質、例えばアミノグルコシト類、例えばゲ
ンクマイシン、トブラマイシン、アミ力シン、シソマイ
シン、カナマイシン及びネチルマイシン、ペニシリン、
テトラサイクリン、テラマイシン、クロロマイセチン及
びアクチノマイセチン；ヌクレオシド及びヌクレオチド
、例えばアデノシンニ燐酸（ＡＤＰ）、アデノシン三燐
酸（ＡＴＰ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及び
その燐酸誘導体（ＮＡ’ＤＰ）、チミジン、グアノシン
及びアデノシン；プロスタグランジン類；ステロイド、
例えばエストロゲン、例えばエストリオール及びエスト
ラジオール、ステロゲン、アンドロゲン、ジゴキシン、
ジギトキシン及び副腎皮質ステロイド；及びその他、例
えばフェノバルビタール、フェニトイン、プリミドン、
エトスクシミド、カルバムアゼピン、バルプロエート、
テオフイリン、カフェイン、プロプラノロール、プロ力
インアミド、キニジン、アミトリプチリン、コルチゾー
ル、デシプラミン、ジソピラミド、ドクセピン、ドクソ
ルビシン、ノルトリプチリン、メトトレクセート、イミ
プラミン、リドカイン、プロ力インアミド、Ｎ−アセチ
ルブロ力インアミド、アンフェタミン、カテコールアミ
ン及び抗ヒスタミンを包含する。

抗一〇６ＰＤＨ 本発明の明細書において使用する用語“抗−０６ＰＤＨ
”は、Ｇ６ＰＤＨと結合しうる抗体又はＧ６ＰＤＨと結
合する能力を保有するこのような抗体の誘導体若しくは
変性体を意味する。従って、一般に抗体から１個以上の
０６ＰＤＨ一特異結合部位を含む任意の物質を使用する
ことができる。

このような抗体は、利用しうる任息の技術によって完全
又は変性Ｇ６ＰＤＨに対して生成させることができる。

完全酵素、凝集若しくは重合酵素、酵素フラグメント（
例えば酵素から抗原決定因子を選択することによって）
、合成抗原決定因子等で免疫処置することによって適切
な抗体源を刺激して抗−Ｇ６ＰＤｐを産生ずることがで
きる。一般に、任意のＧ’６ＰＤ｝｛源又は形態を使用
しうる゛が、試験試料、例えば咄乳動物体液に内因性の
０６ＰＤＨを用いては有効でない補助因子を利用しうる
酵素を産生ずる微生物源を選択するのが特に好ましい。

Ｇ６ＰＤＨの微生物源は、リューコノストソク・メゼン
テロイデス、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓａａｕｒｏｇｉｎｏｓａｓ緑膿菌）、
ヒドロゲノモナス（ｌｌｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ）
Ｈ１６、チオバシラス・フエロオキシダンス（Ｔｈｉｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）及びハシ
ラス・ステアロサーモフィラス（ＢａｃｉｌｌｕｓｓＬ
ｅａｒｏＬｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を含む。補助因子
としてＮＡＤを利用σうるリューコノストソク・メゼン
テロイデス（ＩＥＣ１．１．１．４９）からの０６ＰＤ
Ｈが特に好ましく、噛乳動物源からのＧ６ＰＤＨはＮＡ
ＤＰを必要とする。

完全抗体の形の場合、抗一Ｇ６ＰＤＨは公知の免疫グロ
ブリン、例えばＩｇＧ，ＩｇＭ、ＩｇＥ等の類及び小分
類に属することができる。Ｇ６ＰＤＨに対ずる特異結合
親和性を保有するような抗体の任意のフラグメント、例
えば従来Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２とし
て知られているＩｇＧのフラグメントを使用ずることも
できる。更に、免疫グロブリン又はそのフラグメントの
凝集物、ポリマー及び接合体を、適切な場合、使用する
ことができる。このようなポリ（抗−０６ＰＤＨ）を、
Ｇ６ＰＤＨに対ずる結合親和性を保有するように利用し
うる方法で製造することができる。選択した材料がＧ６
ＰＤＨに対ずる特異結合親和性を有する限り、他の形の
抗−Ｇ６ＰＤＨを使用することができる。

抗一０６ＰＤＨに対する免疫グロブリン源は、任意の利
用しうる方法で得ることができる。通當、當用の抗血清
技術又は単クローン性技術によって抗一〇’６ＰＤＨ免
疫グロブリンが得られる。抗−Ｇ６ＰＤＨを含む抗血清
は、適切な免疫源で動物、例えばウサギ、モルモソト又
はヤギを免疫処理する周知技術によって得られる。現在
の技術水準の概要は、パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）、ラデ
ィオイムノアソセイ・オブ・ハイオロジカリイ・アクテ
ィブ・コンパウンズ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙｏｆＢｉ６１ｏｇｉｃａｌｌｙＡｃｔｉｖｅＣｏｍｐ
ｏｕｎｄｓ）、プレンテイスーホール（Ｐｒｅｎｔｉｃ
ｅ−Ｈａｌｌ％アメリカ合衆国ニュージャージー州エン
グルウソド・クリフス、１９７６年）、バトラー（Ｂｕ
ｔｌｅｒ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．７：１−
２４（１９７５）；ワインリブ（Ｗｅｉｎｒｙｂ）及び
シュロソフ（Ｓｈｒｏｆｆ）、ＤｒｕｇＭｅｔａｂ．Ｒ
ｅｖ．１０：２７１〜２８３（１９７５）；ブロー′ト
ン（Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ）及びストロング（Ｓｔｒｏｎ
ｇ）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２２：７２６〜７３２（１
９７６）；及びプレイフェア（Ｐｌａｙｆａｉｒ）ら、
Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．３０：２４〜３１（１９７４
）によって与えられる。体細胞ハイブリソド形成法によ
ってこのような抗体を得ることもでき、このような抗体
は一般に単クローン性抗体と言われる。単クローン性抗
体技術の概要は、リンフォサイト・ハイブリドーマＣＬ
ｙｍｐｈｏｃｙｔｅｌｌｙｂｒｉｄｏｍａｓ）、メルヒ
ヤース（Ｍｅ１ｃｈｅｒｓ）ら編集、スブリンガ一一フ
エルラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）（ニ−
Ｌ−ヨーク、１９７Ｂ）、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）
２６６：４９５（１９７７）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）２０８：６９２（１９８０）及びメソソヅ・イン
・エンツィモロジイ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）７３（Ｂ部）：３〜４６（１９８１）に見ら
れる。

標識接合体 標識接合体は、例えば直接化学結合、例えば共有結合を
含む直接化学結合、又は間接結合、例えば他方の成分に
化学結合する、マイクロカプセル又はリポソーム中に一
方の成分、通富、標識を組み込むことによって相互に会
合又は結合する２種の主要成分を含む。標識接合体の一
方の成分は、結合成分であり、その機能はこの分野にお
いて周知である。結合成分は、反応混合物中に存在する
任意の被分析物と特異結合反応系に関与する。実施する
特定の分析型に応じて、結合成分は通當被分析物自体、
被分析物の特異結合類縁体又は被分析物の結合相手であ
る。特定の分析法のための結合成分及び標識接合体にこ
れを組み込む方法の選択は、当業者の常識の問題である
。

標識接合体の他方の成分は本発明の新規標識成分、即ち
抗一０６ＰＤＨである。結合に化学結合が関与する場合
には、結合成分上の結合部位及び標識を選択するための
一般的水準での重要な考慮事項は、（１）結合した結合
成分が選択した結合分析系に有効に関与する能力を保有
し、（２）結合した抗−Ｇ６ＰＤＨ標識がＧ６ＰＤＨの
触媒活性を変調する能力を保有することであり、両方の
場合に、分析すべき特定の被分析物及びそれが検出され
る特定の濃度に対して有用な分析法が生じる程度に前記
能力を保有する。通常、結合基は、化学結合、通雷単結
合、又は１〜２０個、更に一般には１〜ｌＯ個の炭素原
子及び０〜１０個、更に一般には１〜５個のへテロ原子
（窒素、酸素及び硫黄から選択）を含む連鎖を含む。結
合基の選択に関する詳細は更に、前記文献、例えば米国
特許第４．２．３８，５６５号及び３，８１７，８３７
号明細書に記載されている。

最も普通の場合、本発明の抗一０６ＰＤＨ標識及びこれ
と結合すべき結合成分は、常用のペプチド縮合反応によ
って結合するため利用しうるアミノ及びカルボキシル官
能基を有する。蛋白質としては、Ｇ６ＰＤＨはペプチド
縮合に関与するため多故の活性アミノ基及びカルポキシ
ル基を有する。

被分析物自体が、しばしば、例えば被分析物が蛋白質又
はポリベプチトであるか又は一級アミン又はカルボン酸
であるハプテンである場合のように、ペプチト縮合によ
り標識に結合するため有用なアミン基又はカルボキシル
基を含む。被分析物は標識に結合するため利用しうる官
能基を有しない場合、官能基は被分析物のアミン又はカ
ルボキシル誘導体を形成することによって容易に導入す
ることができる。この型の典型的被分析物誘導体（即ち
、被分析物の特異結合類縁体）及びペプチド縮合及び同
等な技術による検出試薬の形成に関する詳細は、米国特
許第４，２２６，９９２号明細書、特にその３〜１０欄
に記載されている。

常用のペプチド縮合反応はカルボシイミド反応〔サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１４４：１３４４（１９６４）
〕、混成無水物反応〔エルランガー（ｒ！ｒｌａｎｇｅ
ｒ）ら、メソソズ・イン・゛イムノロジイ・アンド・イ
ムノケミストリイ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ウィ
リアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）及びチェイス（Ｃｈａｓ
ｅ）ｋＡ集、アカデミノク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）（ニューヨーク１９６７）、１４９頁〕、
及び酸アジト及び活性エステル反応〔コソプル（Ｋｏｐ
ｐｌｅ）、ベプクイヅ・アンド・アミン・アシッ゛ゾ（
ＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ）、ヘン
ジャミン・インコーポレイティド（Ｗ．八．Ｂｅｎｊａ
ｍｉｎ，Ｉｎｃ．）（−ユーヨーク１９６６））を含む
。

ＣＩｉｎ．Ｃｈｅｍ．２２：７２６（１９７６）の一般
的記載についても参照。

もちろん、被分析物及び標識を結合させて本発明の標識
接合体を形成させるため他の周知の方法を利用すること
ができる。例えば、アミンをアミンと結合させるため二
官能性試薬、例えばビスイソシアネート、ビスイミトエ
ステル及びグルクルアルデヒドを使用することもできる
（１ｍｍ，ｕｎｏｃｈｅｍ．６：５３（１９６９））。

もちろん、被分析物又はその結合類縁体及び標識上の、
アミノ基及びカルポキシル基以外の官能基を、選択した
合成法に依存する結合部位として使用することもできる
。これらの合成法は、文献から当業者に利用されうる。

分析技術 原則として、本発明の分析方法を常用の均質又は不均質
型のいずれによっても実施することができる。しかし、
これらの状況で、標識接合体によって生じる変調作用が
結合種と非結合種との間で本質的に区別されない場合に
、分析法を実施するには、不均質型によらねばならない
であろう。

１．均質型 均質分析技術、即ち結合種と非結合種との物理的分離を
必要としない分析技術では、標識接合体中の結合成分と
対応する結合相手との反応が、反応混合物中の０６ＰＤ
Ｈに対する抗−Ｇ６ＰＤＨの変調作用において陽性又は
陰性で測定可能の変化を起こす。結合種と非結合種との
間の標識接合体の分布は、変調因子が結合種の場合に酵
素活性に影響できないか又は影響する能力が変化するこ
とによって区別される。競合結合法である一般的技術と
共に均質分析を実施するため若干の操作技術を利用する
ことができる。競合結合技術においてば、液体媒体を被
分析物の結合相手、被分析物又はその特異結合類縁体に
結合ずる抗一Ｇ６ＰＤＨを含む標識接合体及びＧ６ＰＤ
Ｈと混合し、その後、反応混合物中のＧ６ＰＤＩ−１活
性を測定する。

均質競合結合技術は、一般に、抗原蛋白質及びポリペプ
チド及びハプテンを含めてほとんどの被分析物の測定に
通用することができる。抗一抗体抗体を使用して、分析
すべき抗体を認識し、結合することによって抗原蛋白質
として抗体を測定することができる。この抗体分析法は
、類（ｃｌａｓｓ）特異性であり、その抗原特異性によ
り抗体を区別することができないであろう。

抗体又は他の結合蛋白質、受容体又は結合物質が、一般
にその抗原又は相手特異性により測定される場合、直接
法を使用することができる。液体媒体を、被分析物の結
合相手に結合した抗一Ｇ６ＰＤＨを含む標識接合体、及
びＧ６ＰＤＨと混合し、その後、０６ＰＩ）Ｈ活性を再
び反応混合物中で測定する。この場合に、被分析物は特
定の抗原又はハプテンに対する特異性を有する抗体（そ
のままの形又は結合類縁体の形で標識接合体中の結合相
手として作用する）であるか、又は試料中の特定の結合
蛋白質、受容体、担持物質等の存在により特定の物質を
結合する、試験試料の結合能力、例えばトリョードチロ
ニン又はチロキシン結合能（Ｔ．摂取又はＴ４摂取）で
あってもよい。

一般に、均質分析技術による場合、分析反応の成分、即
ち、被分析物を含むと推察される液体媒体、標識接合体
、Ｇ６ＰＤＨ及び必要に応して、被分析物の結合相手を
任意の量、方法及び順序で混合することができるが、液
体媒体が分析の目的で有意義な量又は濃度で被分析物を
含む場合に、Ｇ６ＰＤＨ活性が測定可能に変化する。特
異結合反応のすべての成分が液体媒体に可溶性であるの
が好ましい。更に、検出可能な応答、例えば吸光度、色
、螢光、化学発光等をＧ６ＰＤＨの触媒活性の函数とし
て生じる常用の指示薬組成物を含む反応混合物を形成す
る。

ｂ．不均質型 本発明の分析法を、結合種及び非結合種の標識接合体を
分離し、一方又は他方の標識成分を測定する雷用の不均
質型分析技術に適用することもできる。このような不均
質分析を実施する試薬手段は、多数の異なる形をとるこ
とができる。一般に、このような手段は３種の基本成分
、即ち（１）検出すべき被分析物、（２）被分析物の結
合相手及び（３）標識接合体を含む。結合反応成分を同
時に又は順次混合し、適当な静置期間をお《と、標識接
合体は対応する結合相手に結合して、その結合の程度、
即ち、未結合の標識接合体（遊離種）に対する結合相手
に結合した標識接合体（結合種）の量の比が、存在する
被分析物の量の函数となる。

結合種及び非結合種を物理的に分離し、その一方に存在
する標識の量を、Ｇ６ＰＤＨ活性を測定し、それを陰性
対照又は標準的結果、例えば標準曲線と比較することに
よって測定する。． 分離工程を実施し、結合反応系を形成する種々の手段が
、この分野で利用されている。分離は、固相抗体又は抗
原、第二抗体又は固相第二抗体、並びに免疫複合体沈澱
剤、吸着剤等の使用を使用する常用の技術に関する。実
施しうに結合反応系は、いわゆる競合結合法、連続飽和
法、“サンドイソチ”法等を含む。種々の公知の不均質
系に関する詳細は、更に、文献、例えば米国特許第４，
２３０，７９７号明細書において容易に利用されうる。

本明細書で具体化する本発明の概念から逸脱することな
く、均質型及び不均質型特異結合分析法を実施するため
他の添加順序及び他の結合反応型に関する操作方法を工
夫することができる。

反応混合物 分析すべき液体媒体は、被分析物を含むと予想される天
然産又は人工的に形成した液体であってよ《、通常生物
学的液体又はその希釈液である。

分析することができる生物学的液体は、血清、血漿、尿
、唾液、並びに羊水及び脳脊髄液を包含する。

゛結合反応は、ほとんどすべての場合に、緩和な条件下
に進行することができる。反応混合物は、一般に、少量
存在する所望の有機補助溶媒を含む水性媒体である。反
応温度は、静置期間及び酵素測定工程の間、普通の条件
で一定水準に保持される。温度は一般に５〜５０℃、更
に普通には２０〜４０゜Ｃである。反応は室温で進行す
るのが好ましい。反応混合物のｐｌ＋は５〜１０、更に
普通には６〜９である。種々の試薬の濃度は試験媒体中
に予測される被分析物の水準に左右され、そのような水
準は通常工０−３〜１０−１２モル（Ｍ）である。

前記の反応パラメータの場合と同様に、選択は第一に、
通常の基準で分析を最終的に実施する技術者の好みと必
要を調和させて、経験的に誘導される最適化に基づく。

従って、パラメータはいずれも、本発明に対して決定的
なものではなく、むしろすべてこの分野の布識に属する
。

試薬系 本発明の試薬糸は、本発明に包含される所望の分析法を
実施するために必要な必須化学成分をすべて含む。試薬
系は、工業的に包装された形で、試薬が相溶性である場
合、組成物又は混合物として、試験具構造として又は試
験キノト、即ち必要な試薬を保持する１個以上の容器の
包装された組合せとして提供される。所望の結合反応系
に適当な試薬を試薬系に含み、富に抗一〇６ＰＤＨ標識
接合体及び０６ＰＤＨを必要とする。このような結合反
応試薬は、標識接合体の他に、被分析物に対する結合相
手、Ｇ６ＰＤＨ指示薬組成物等を含んでいてもよい。も
ちろん、試薬系は、この分野で公知であり、商業及び消
費者の観点から所望の他の試薬、例えば緩衝剤、希釈剤
、標準品等を含んでいてもよい。

次に、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は
これに限定されるものではない。

尖滌珂 ■、試薬 Ａ．物質のリスト リューコノストノク・メゼンテロイデス（ＥＣ１．１．
１．４９）からのグルコースー６−ボスフェートデヒド
ロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、７５９国際単位／ｍｇ（１
．Ｕ．／＋ｎｇ）は、日本国大阪府のオリエンタルイー
スト社から購入した。

０６ＰＤＨに対する抗体（抗一０６ＰＤＨ）はパイツカ
イチス（Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ）らのＪ．ＣＩｉｎ，
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３３：９８８（１９８１）の方
法に基づいてログ（Ｒｏｄａ）及びポレソリ（Ｂｏｌｅ
ｌｌｉ）のＪ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．１３：
４４９〜４５４（１９８０）の方法により抗原としての
Ｇ６ＰＤＨに対してウサギにおいて産生じた。

ジアフォラーゼ（ＮＡＤＨ染料オキシドレダクターゼ、
Ｅ．Ｃ．１．６．９９）３７Ｕ／＋ｎｇは、日本国東京
都の東洋醸造株式会社から得られた。

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニ
コチンアミトアデニンジヌクレオチドボスフエート（Ｎ
ＡＤＰ）及びグルコース−６−ボスフェート（Ｇ６Ｐ）
は、西ドイツのベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｍｂ｝Ｉ）から得ら
れた。

ニトロブルーテトラゾリウム、オキサミド酸ナトリウム
塩、卵白からのアビジン及びビオチンは、アメリカ合衆
国ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社（Ｓｉ
ｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）がら得られた。

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（ＮＨＳ−ビオ
チン）は、オランダ国ロソテルダムのピーアス・ユーロ
ヘミー（ＰｉｅｒｃｅＥｕｒｏｃｈｅｍｉｅＢＶ）から
得られた。

ウサギで産生したジニトロフェニルに対する抗体（抗−
ＤＮＰ）；ヒｌ−１ｇＧ；及びヤギで産生じタ抗一ヒｌ
ｌｇＧ（γ一鎖特異性）は、イスラエル国レホ柵のマイ
ルスーイエダ社（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ，＼，Ｌｔｄ．
）から得られた。

ジニトロフルオロヘンゼン（ＤＮＦＢ）及びジニトロフ
ェニル（ＤＮＰ）とリジン（ＤＮＰ−リジン）との接合
体は、西ドイツ、ハイデルヘルクのセルハ・フエンビオ
へミカ（ＳｃｒｖａＦｅｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）から
得られた。

Ｂ．抗一０６ＰＤＨの精製 完全抗血清を５０％硫酸アンモニウム Ｃ（ＮＨ４）２Ｓ０４〕で処理し、次いで、ウルトラゲ
ル（Ｕｌｔｒａｇｅｌ）＾ｃＡ４４（スウェーデン国ブ
ロソマのＬＫＢ）上でゲルＰ過クロマトグラフィー処理
した。

Ｃ．ＤＮＰ一抗−Ｇ６ＰＤｌ−１接合体の製造燐酸塩緩
衝液（０．１Ｍ，ｐｌｌ７．４）１．５ｍｌ中の抗−Ｃ
．６ＰＤＨ２．５６■の攪拌溶液に、室温で無水エタノ
ール中のＤＮＦＢ（５ｍｇ／ｍｌ）４００ｐＩ！を添加
した。ＤＮＦＢの添加は、２０分毎に５０μβずつ段階
的に実施した。ＤＮＦＢを１００、２００、３００、４
００ｐｌ＠添加した後、１０μβの反応混合物を採取し
、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むｐＨ
７．９の０．１Ｍ｝リス〔トリス（ヒト−ロキシメチル
）一アミノメタン〕緩衝液中で希釈し、抗一ＤＮＰの不
存在で酵素に対する免疫活性及び過剰の抗一ＤＮＰを使
用して抗−ＤＮＰに対する免疫活性を分析した。

ＤＮＦＢを更に添加しても抗−ＤＮＰに対する免疫活性
を増加しない場合、反応混合物をセファデソクス（Ｓｅ
ｐｂａｃｌｅκ）Ｇ２５Ｃスウェーデン国ウプサラのフ
ァルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））で１ｒ″過し、０
．５％のＢＳＡを含むトリス緩衝液でｌ：２に希釈し、
５℃で貯蔵した。

Ｄ．ビオチンー抗−Ｇ６ＰＤｌ｛接合体の製造ＤＮＦＢ
の接合と実質的に同一の方法で、ＩｇＧ抗一０６ＰＤＨ
に対するビオチンの接合を実施した。

抗一０６ＰＤ８５．３５■を含むｐＨ７．６の０．１Ｍ
燐酸塩緩衝液の攪拌溶液（２．５ｍｌ）に、２０分間隔
で無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＮＨＳ−ヒ
オチン（８■／ｍｌ）の１０μｌを添加した。ＮＨＳ−
ビオチンの添加毎に、その添加から２０分後に接合体の
形成を監視するため、反応混合物を採取し、０．５％の
ＢＳＡを含むトリス緩衝液で希釈し、過剰のアビジンの
存在及び不存在で免疫活性を分析した。接合体がその元
の免疫活性の最高、１０〜２０％を失い、過剰のアビジ
ンの存在で約５０％の反応率に達するまで、接合反応を
続けた。次に、接合体をセファデソクスＧ２５上で戸過
し、平衡にし、トリスＨＣＩ緩衝液で希釈した。熔離液
を同じ緩衝液に対して２４時間透析し、０．５％ＢＳＡ
の存在で４℃で貯蔵した。

Ｅ．ヒトＩｇＧ一抗一Ｇ６ＰＤＨ接合体の製造この接合
体は、村山ら著、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．１５：５２３
（１９７Ｂ）の方法により製造した。

抗−Ｇ６ＰＤＨ５．３５■を含むｐｌ１７．４の０．０
５Ｍ燐酸塩緩衝液１ｍｌを希酢酸でｐｌ１４に調節した
。

この溶液にｐ１ｌ４の０．ＯＩＭの酢酸緩衝液中の０．
２Ｍ過沃素酸ナトリウム（ＮａｌＯ４）０．１ｍｌを添
加した。２５分後、エチレングリコール５０μｌを添加
し、溶液をセファデソクスＧ２５カラムで一過した。こ
の活性化抗一Ｇ６ＰＤＨにｐＨ９．５の０．１Ｍ炭酸塩
緩衝液中のヒトＩｇＧ（粉末７０ｍｇ）２ｍｌを添加し
、生じる溶液のｐｌ１を直ちにｐＨ９．５にし、そのｐ
Ｈに維持した。２．５時間後、硼水素化ナトリウム（Ｎ
ａＢＨ４）１．５■を添加し、反応混合物を更に４０分
４℃で静置した。次いで、溶液を限外一過し、セフアク
リル（Ｓｅｐｂａｃｒｉｌ）Ｓ３００（ファルマシア）
上でクロマトグラフィー処理した。

酵素及び抗−ヒ｝ＩｇＧに対して免疫学的に反応性のフ
ラクションを集めた。

■．分析法 Ａ．紫外線吸収読碁取りによるハプテンの分析ＤＮＰ−
リジン分析 プラスチック試験管列のそれぞれに順次下記のものを添
加した： −ＢＳＡ０．５％及びナトリウムアジド０．０５％を含
むｐｌ１７．９の０．１ＭトリスーＨＣＩ中のＤＮＰ−
リジン標準品（０〜９．４μｇ／ｍｌ）０．１ｍｌ−抗
−ＤＮＰの不存在で酵素を８０％抑制する濃度で１・リ
ス緩｛Ｉｉ液中のＤＮＰ−抗−Ｇ６ＰＤＨ接合体０．１
ｍｌ −１：２に希釈した抗−ＤＮＰ及び接合体の不存在でΔ
Ａ／分一（１．５ｓｏを生じる濃度でＧ６ＰＤＨを含む
トリス緩衝液中の抗−ＤＮＰ／Ｇ６ＰＤＨ混合物０．２
ｍｌ 試験管を１５分間室温で静置し、各試験管に基質／指示
薬溶液０．６ｍｌを添加した。基質／指示薬溶液は、ｐ
ｌ１７．９のトリスー１１ｃＩ緩衝液中のＮＡＤ５．３
ｍＭ及びＧ６Ｐ１８．２ｍＭからなる。反応混合物を直
ちに恒温槽（３０℃）を付けた光度計の流動セル中に吸
引し、最初の酵素触媒による反応速度を３４０ｎｍで、
３０秒の遅延及び読み取り時間を使用して測定した。

ビオチン分析 プラスチック試験管列のそれぞれに順次下記のものを添
加した： −ＢＳＡ０．５％及びナトリウムアジト０．０５％を含
むｐｌ１７．９の０．１Ｍ＋−リス−１１Ｃｌ中のビオ
チン標準品（０〜３２０ｎｇ／ｍ＋）０．１ｍｌ−アビ
ジンの不存在で酵素を８０％抑制ずる濃度でトリス緩衝
液中のビオチンー抗−Ｇ６ＰＤＨ接合体０．１ｍｌ −アビジン１８μｇ／ｍｌ及び接合体の不存在でΔＡ／
分＝０．５８０を生じる濃度でＧ６ＰＤＨを含むトリス
緩衝液中のアビジン／０６ＰＤＨ混合物０．２ｎ＋１ 基質／指示薬溶液を添加し、ＤＮＰ−リジン分析に関し
て読み取る前に、試験管を室温で６０分静置した。

Ｂ．比色計読み取りによるハプテンの分析プラスチック
試験管列のそれぞれに順次下記のものを添加した： −ＢＳＡ０．５％及びナトリウムアジド０．０５％を含
むｐｔ＋７．９の０．１ＭＩ−リス−１１ＣＩ中のビオ
チン標準品（０〜８０ｎｇ／ｍｌ）０．１ｍｌーアビジ
ンの不存在で酵素を８０％抑制する濃度でトリスｋａＩ
Ｍ液中のビオチン−抗−Ｇ６ＰＤＨ接合体０．１ｍｌ −アビジン４．４ｐｇ／ｍｌ及びΔＡ／２０分−２．３
を生じる濃度のＧ６ＰＤＨ及びシアフオラーゼ１００，
ｔｌｇ／ｍｌを含むアビジン／Ｇ６ＰＤＨ／ジアフォラ
ーセ混合物０．２ｍｌ 室温で４０分間静置した後、各試験管にｐｌ１５．７の
３３ｍＭ燐酸塩クエン酸塩緩衝液中にＮＡＤ１８．７ｍ
Ｍ，ＮＢＴ１．９ｍＭ及び０６Ｐ６５ｍＭを含む基質／
指示薬溶液０．２ｍｌを添加し、試験管を室温で更に２
０分静置した。次いで、トリ１〜ン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ
−１００洗浄剤を１％含むＩＭ塩酸（Ｉ｛ＣＩ）０．５
ｍｌを添加して反応を停止し、吸光度を５８００ｍで測
定した。

Ｃ．比色計読み取りによる抗原の分析 プラスチック試験管列のそれぞれに順次下記のものを添
加した： −ＢＳＡ０．５％及びナ１〜リウムアジド０．０５％を
含むｐＨ７．１の０．１Ｍｌ−リス−１１ＣＩ中の対照
血清〔ヘルギー国ツーラニのテクニコン・ケミカルス（
ＴｅｃｈｎｉｃｏｎＣｈｅｍｉｃａｌｓ）に対して検定
し、１：４１に希釈したヒトＩ．Ｇ標準品。１：４ｌに
希釈する前には、標準品の濃度は９〜２７．４ｍｇ／ｍ
ｌであった。０．１ｍｌ 一トリス緩衝液中に１：２．２５に希釈された抗−ヒト
ＩｇＧ、抗−Ｇ６ＰｐＨ接合体の不存在でΔＡ／２０分
−１．４４を生じる濃度のＧ６ＰＤＨ及びジアフォラー
ゼ１００μｇ／ｍｌを含む抗一ヒ目ｇＧ／Ｇ６ＰＤＨ／
ジアフォラーゼ混合物０；２ｍｌ 試験管を室温で１５分静置し、次いで、８０％の酵素抑
制を生しる濃度のヒトｌｇＧ＝抗一〇６ＰＤＨ接合体０
．２ｍｌを各試験管に添加し、室温で更に４０分静置し
た。次に、基質／指示薬溶液０．２ｍｌを添加した。ト
リトンＸ−１００洗浄剤を１％含むＩＭ塩酸０．５ｍｌ
を添加して反応を停止し、吸光度を５８０ｎｍで測定し
た。

■．結果 Ａ．ＤＮＰ−リジンの紫外線吸収率分析の標準曲線 ＤＮＰ−リジン濃度と３４０ｎｍでの吸収率の変化（３
４０ｎｍでのΔＡ／分）に関する標準曲線（第１図）を
、前記のｎ−Ａ部に記載した分析法により作製した。

Ｂ．ヒオチンの紫外線吸収率分析の標準曲線ビオチン濃
度と３４０ｎｍでのΔＡ／分に関する標準曲線（第２図
）を前記の■〜Ａ部に記載した分析法により作製した。

Ｃ．ビオチンの比色終点分析の標準曲線ヒオチン濃度と
５３Ｑｎｍての終点吸光度に関する標準曲線（第３図）
を、前記のＩＩ−Ｂ部に記載した分析法により作製した
。０６Ｐｌ）Ｈの不存在での反応混合物の吸光度に関す
るフランク値は０．０４０であり、分析値から差し引い
た。

Ｄ．ヒ｝ＩｇＧＯ比色終点分析の標準曲線ヒｌｌｇＧ？
ｉ度と５８０ｎｍでの終点吸光度に関する標準曲線（第
４図）を、前記のＵ−Ｃ部に記載した分析法により作製
した。

２０個の血清試料についで、免疫混濁測定法（１’ＴＡ
）による相関試験を行った。相関は、本発明方法−０．
９５＋１．１３１ＴＡ；ｒ＝０．８６４であった。

■．干渉試験 Ａ．酵素反応の干渉 １．血冫青干渉 ５０μｌのヒト血清を分析に組み込む場合、緩衝液単独
中におけるより酵素活性は２５％高かった。この陽性干
渉は、ＮＡＤ及び次に、ＮＢＴを還元する内因性乳酸塩
及び乳酸デヒｌ・ロゲナーセ（ＬＤ１−１）に主として
よることか認められた。乳酸デヒトロゲナーゼの抑制因
子であるオキサミト酸を添加すると、分析の実施に影響
することなく、ＬＤＨが完全に抑制された。しかしなか
ら、血清５０〜１００μβの存在での試験はなお緩衝液
中より高い活性を生じたが、これは他の未確認の干渉因
子による。

これらの干渉の最大の変動可能性を検Ｂ・Ｊずるたエモ
ライズ化 め、１８の混７の又は黄痕のヒＩ・血清１００μβの存
在でＧ６ＰＤＨ活性（緩衝液中ΔＡ／２０分−０．２８
２）を測定した。分析Ｇどは、オキサミド酸を含んだ。

結果を第１表に示す。

第１表 謀体５８０ｎｍ／２０＼でのＩ１シ庁 ブランク試料 ’Ｅ１ｈＵＬ０．０２００．２８２ 血遺 ｘＯ．Ｏ５５０．３４９ ＳＤＯ．０１６０．０１７ ＣＶ２９４．８７ ｎ１８１８ オキサミド酸塩の存在でなお存在する比色計読み取り法
での陽性血清干渉を排除する目的で、酵素比色反応後に
発生ずる色のスペクトルに対するトリトンＸ−１００の
影客を研究した。Ｇ６ＰＤ’Ｈ分析において、ヒ１・血
清１００μｌの存在及び不存在で種々の濃度のトリトン
Ｘ−１００を組み入れ、反応停止後に形成した色のスペ
クトルを記録することによって実験を行った。ＢＳＡＩ
％、オキザム酸３８ｍＭ及びシアフォラーゼ１４．３μ
ｇ／ｍｌを含むｐｌ１７．９の０．１Ｍトリスー１１ｃ
Ｉ中のＧ６ＰＤｔＩ１１．４ｎｇ／ｍｌの？容液０．７
ｍｌを、ｐｌ１５．７の３３ｍＭ燐酸塩−クエン酸塩緩
衝液中のＮＡＤ１Ｂ．７ｍＭ，Ｇ６Ｐ６５ｍＭ，ＮＥＴ
１．９ｍＭ及び種々の濃度のトリトンＸ−１００からな
る基質／指示薬溶液２００μｒと混合した。反応を室温
で２０分進行させ、次いで、１％のトリトンＸ−１００
を含むＩＭＩＩＣＩで反応を停止させ、各溶液のスペク
トルを６６０ｎｍ〜４８０ｎｍで記録した。１列の分析
試験管は試薬及び１００μｌのヒト血清のプールを含み
、他は試薬及び血清の代わりに緩衝液１００μｌを含ん
でいた。

第２表に結果を示すが、トリトンＸ−１００の濃度は、
反応停止前の反応混合物中の濃度であり、λｍａｘは最
高吸光度の波長である。

第２表 １・リトンＸ一媒体 １００の濃度 ｇ／１００ｍｌ緩衝液血清 ５８０ｎｍでのλｍａｘ５８０ｎｍでのλｍａｘΔＡ／
２０分ｎｍΔＡ／２０分ｎｍ Ｏ．２５１．０４７５２８１．２８４５３６０．５１．
０９３５２４１．１９８５２６１．０１．２１４５２６
１．２５４５２６２．０１．４１４５２８．１．４２８
５２８４．０１．５１１５２８１．５２７５２８記録さ
れたスペクトルから、２％及び４％のトリ１・ン濃度で
血清と緩衝液とが実質的に同一であることが判明した。

２％の１−リトンを使用して、５８０ｎｍでのその後の
実験で記録した発色は、血漬及ひ緩衝液中での分析で同
しΔＡ／分を示した。

血清の干渉及びその変動を評価するため、トリトン及び
オキサミド酸の最適濃度で３６のヒト血清の５０μβの
存在及び不存在で比色読み取りによりＧ”６ＰＤＨの固
定濃度の活性を測定する最後の実験を実施した。

各試験管に下記のものを添加した： 緩衝液又は血清５０μ！ ０．５％のＢＳＡ、０．０５％のナトリウムアシド、Ａ
／２０分−１．３３３のＧ６ＰＤＨ，２０μｇのジアフ
ォラーゼ、３４ｍＭのオキサミド酸を含むｐｌ１７．９
の０．１Ｍ＋−リス−１１ＣＩ緩衝液５００μｌ及び ｐＨ５．７の３３ｍＭの鱗酸塩−クエン酸塩緩衝剤、７
ｇ／１００ｍｌの１−り１−ンＸ−１００、１８．７ｒ
ｒｔＭのＮＡＤ、６５ｍＭのＧ６Ｐ及び１．９ｍＭのＮ
ＢＴからなる基質／指示薬溶液２００ｐｆｆ混合物を室
温で２０分静置し、１％の１・リトンＸ−１００を含む
ＩＭＩＩｃＩ０．５ｍｌで反応を停止させた。第３表に
記録した結果は、血清の干渉が無視しうるちのであるこ
とを示す。

第３表 ′゛゜？？ｆ ブランク試料ブランク試料 Ｘ絶対値０．０２９５１．３３３８０．０３６６１．３
２８ＳＤ絶対値０．０００ｊ０．０１０００．００２３
０．０１３４ＣＶ１．７０．８２６．３１．Ｏ ｎ１０３６３６３６ ２．薬剤、代謝産物及び尿の干渉 若干の可能な干渉物質を酵素分析で試験した。

停止前に０．６５ｍｌの最終容量で第４表に示した物質
の濃度の溶液５０μｌを使用して標準方法で分析を実施
した。アスコルビン酸だけが強い干渉を生じたが、これ
は低濃度の酵素アスコルビン酸オキシダーゼの添加を含
めて種々の公知の手段によって排除することができる。

第４表 干渉のない最高 一ＪＥＪ÷ｒ素度ユ工Ｘ［？一 尿酸４０ 尿素４００ ビリルビン２０ アスコンビン酸２ グルコース１０００ 弗化ナトリウム４００ 蓚酸ナトリウム４００ クエン酸ナトリウム７６０ ヘバリン酸ナトリウム１５０ ＥＤＴＡ２００ アセチルサリチル酸１２ ゲンチジン酸１０ Ｌ−ドーパ０・５ 尿（正常）２５μｌ Ｂ．免疫反応の干渉 免疫反応に対する血清の作用を分析するため、３６のヒ
ト血清５０μβをＧ６ＰＤＨ一抗一Ｇ６ＰＤＨ反応の分
析に組み入れた。

各試験管に下記の物質を添加した： 一緩衝液又は血清５０μｌ −ＢＳＡ０．５％、ナトリウムアンド０．０５％及びオ
キサム酸３４ｍＭを含むｐＨ７．９の０．１Ｍ｝リス緩
衝液中の、７０％の酵素抑制を生じる濃度のＦａｂ抗−
Ｇ６ＰＤＨ−コルチゾール（下記の■部参照）接合体２
５０μβ 一ΔＡ／２０分＝２．６７０を生じるＧ６ＰＤＨ及び２
０μｇのジアフオラーゼを含むトリス緩衝液中のＧ６Ｐ
ＤＨ／ジアフオラーゼ混合物２５０μｅ ６０分間静置した後、ｌ−Ａ部（最後の実験）に示した
濃度及ひ条件の基質／指示薬Ｉ１８液２００μβを添加
した。

第５表にまとめたデータは、Ｇ６ＰＤＩ−１と抗−Ｇ６
ＰＤＨ−コルチヅール接合体との間の免疫反応に対する
血清の干渉の作用は低く、変動しうろことを示す。

第５表 」■Ａ？」ＬＬ一一 ＸΔＡ／２０分０．８０３６０．８２７６ＳＤΔＡ／２
０分０．００６２０．０１３１ＣＶＯ．７７１．５８ ｎ３’６３６ ■．安定性の試験 Ａ．酵素混合物（０６ＰＤＨ／シアフメラーセ）貯蔵温
度４゜Ｃ２５゜Ｃ４０゜Ｃ 日３５３５．５９２１ 残留活性％９５．２８５７１．６５４．５３０Ｂ．標識
接合体 ４℃で更に１５倍に濃縮し、５ケ月間貯蔵した後、免疫
活性の損失は検出されなかった。

Ｃ．基質／指示薬混合物 基質及び色原体（ＮＡＩ），Ｇ６Ｐ及びＮＢＴ）の混合
物を１ケ月、実験室用ヘンチで毎日４゜Ｃで１６日、２
２℃で８時間保持した。この溶液の吸光度は、酵素分析
の実施に影響することなく、５８０ｎｍで０．０１２か
ら０．０２５に増加した。

４℃で５ケ月間貯蔵した同じ溶液も安定であった（吸光
度は０．０１２から０．０２２に増加する）。

■．親和クロマ｝・グラフィーによる抗一Ｇ６ＰＤＩ」
の楕製 ０６ＰＤＨ（２７Ｉ７１ｇ＞に結合した免疫吸着剤であ
るセファロース４Ｂ（２ｇ）（スウェーデンのファルマ
シア）を製造者の指示により製造し、小さいカラムに充
填した。１０ｍｌのウサギの抗血清を４０％の最終飽和
率で（ＮＨ４）２５０４を用いて沈澱させた。沈殿した
ＩｇＧ（１００．９■）を遠心分離し、ｐ｝１８の０．
１Ｍ燐酸塩緩ｆｉ液に溶解し、同じ援衝液に対して透析
し、免疫吸着剤に通した。カラムを出発緩衝液（０．１
Ｍ鱗酸塩、ｐｌｌ８）、Ｈ２０、０．５ＭＮａＣｌを含
むｐ１１４の酢酸で洗浄し、特異性ＩｇＧ抗一〇６ＰＤ
Ｈを２工程で、ＮａＣＩ０．５Ｍを含むｐ１−１２．３
の酢酸及びｐ｝１２．３の酢酸で溶離した。

親和クロマトグラフィーで精製されたＩｇＧの量は４の
精製ファクターで９ｍｇであった。

■．高感度コルチゾール分析 Ａ．試薬 コルチゾールに対する抗体（抗一コルチゾール）をウサ
ギにおいてコルチゾール−３−カルボキシメチルーオキ
シム〜ＢＳＡＣイタリア国ミラノのアナリティカル・ア
ンティホディ（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＡｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ））に対して産生じた。

前記の■部からの精製した抗−Ｇ６ＰＤＨ。

コルチヅール−抗一Ｇ６ＰＤＨ接合体を下記のように製
造した： 混成無水物：コルチゾール−３−ＣＭ０５■（１１μｍ
ｏｌ）をＮ−メチルモルホリン２．５μβ（３５μｍｏ
ｌ）を含むジオキザン１．５ｍｌに室温で１８解させる
。冫容液を１２℃に冷却し、攪拌しながらクロロギ酸イ
ソブチルｌＯμＩ！（１３μｍｏｌ）を添加した。生成
した混成無水物の一部（５μβ）をｐＨ９．２の０．１
Ｍ炭酸塩一重炭酸塩緩衝液中の親和クロマトグラフィー
で精製されたＩｇＧ抗−０６ＰＤＨの溶液（０．５ｍｇ
／ｍｌ）’１．５ｍｌに添加した。

混成無水物を全部で８５μβ添加したところ、抗体は酵
素に対して最初の免疫活性の約３５％を失った。反応混
合物をセファデソクスＧ〜２５上でクロマトグラフィー
処理したところ、置換度はエルランガー法（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ，Ｃｈｅｍ．２２８：７１３（１９５７））により計
算して１３．２であった。

他の試薬はすべて、前記の１部に記載したとおりである
。

Ｂ，分析法 サリチル酸塩（血清蛋白質結合に対する遮断剤として）
１．３■、オキサミド酸塩３■及び１：４８に希釈した
コルチゾールー抗−０６ＰＤＨを含むｐＨ７．９のトリ
ス緩衝液３００μｎ，Ｇ６ＰＤＨ１３．３■、ジアフォ
ラーゼ２０μｇ及び１：９００に希釈した抗−コルチゾ
ールを含むｐｌ１７．９の１−リス緩ｔｈ液３００μ！
及び第５図の横座標に示した濃度のコーチゾル標準品５
０μｌを混合ずることによって反応混合物を製造した。

室温で６０分静置した後、基質／指示薬名液２００μβ
を添加した。基質／指示薬溶液をＩＩ−Ｂ部に記載した
とおりであった。反応混合物を更に２０分静置し、１Ｍ
ＨＣＩ０．５ｍｌを添加し゜ζ反応を停止させた。５８
０ｎＩＴＩでの吸光度を読み取った。標準曲線を第５図
に示す。

Ｃ．結果 この分析は、１０ｎｇ／ｍｌの範囲でコルチゾールに対
して鋭敏であることが観察された。標準ＲＩＡ法で相関
させて、下記の結果を得た：ｙ＝３６．５＋１．２６Ｘ
，ｒ＝０．９８５、ｎ−１７■．抗一Ｇ６ＰＤＨ標識と
してＦａｂフラグメン１・の使用 Ａ．Ｆａ．ｂの単離及び楕製 Ｉｇ．Ｇ抗−Ｇ６ＰＤＨの分解を、下記のように、実質
的にポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）によって記載された方法
（Ｂｉｏｃ’ｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９（１９５９）’
ｌによって実施した。

（Ｎｌｌ４）２ＳＯ４を４０％飽和して得られ、ｐｌ＋
６の０．１Ｍ燐酸塩緩衝液に対して透析したＩｇＧ３３
４■を、システイン１０ｍＭ及びＥＤＴＡ２ｍＭを含む
１３ｍｌの透析緩衝液の最終溶液中でパバイン（シグマ
、Ｅ．Ｃ．３．４．２２．２）３４０■と共に３７゜Ｃ
で一夜静置した。精製した消化液を水及び次にｐ１１８
の０．１Ｍ３Ａ酸塩緩衝液に対して透析した。透析した
１′ｇ液を遠心分離し、前記の■部に記載したようにセ
ファロースー０６ＰＤＨ免疫吸着剤上で親和クロマトグ
ラフィー処理した。純粋なＦａｂが７．４■得られ、第
６表から判るように、Ｆａｂは酵素を抑制する性質を保
有した。

第６表 精未９１ひｎυ｝ｔでのｉ’ｃ−Ｇ６ＰＤＨ町Ｖ″″′
−ガ捕一 ｎｇ／ｍｌ ＩｇＧ（Ｎｌ１４）２５０４１２５０ 消化した１８８０ 親和クロマトグラフィーで精製したＦａｂｌＯＯ力価は
、比色法を使用して、酵素（２２．４ｎｇ／ｍｌ）を９
０％だけ抑制するのに必要な抗−Ｇ６ＰＤＨの最終的濃
度（ｎｇ／ｍｌ）である。

Ｂ．ＩｇＧ抗−０６１）ＤＨのＦａｂフラクションに対
するコルチゾール３−ＣＭＯの接合 ＩｇＧ−コルチゾール接合体（前記の■−Ａ部参照）に
ついて記載したように、混成無水物法を使用して、Ｆａ
ｂ−コルチゾール接合体を好適に製造した。接合体Ｆａ
ｂは、未変性Ｆａｂの免疫活性の５７％を保有した。コ
ルチゾール／Ｆａｂモル比は１０．５であった。

Ｃ．コルチゾール分析に関する標準曲線標識としてＦａ
ｂを使用して、ＩｇＧ−コルチゾール接合体（前記の■
部参照）について記載したようにしてコルチゾール分析
に関する標準曲線（第６図）を作製した。種々の濃度の
試薬ば抗一コルチゾールを含み、■部と同じであった。

コーチゾル標準品の濃度だけがわずかに異なり、第６図
の水平軸に記録したものである。第７図は、垂直軸にＡ
／ＡｏＸＩＯＯ値を示す同じ標準曲線及び比較のため、
ＩｇＧ−コルチゾール接合体（前記の■部）の標準曲線
を示す。完全酵素標識に比べて、Ｆａｂ標識を使用した
ときに、一層良好な結果が得られたことが判る。

■．従来法との比較 本発明方法の性能特性を従来法〔ベルオキシダーゼ／抗
一ペルオキシダーゼ反応に基づく均質型抗一酵素標識免
疫分析を記載しているンゴ及びレンホフ著ＦＥＢＳＬｅ
ｔｔｅｒｓ１１’６（２）２８５（１９８０））のそれ
と比較する目的で下記のイ」加的実験を実施した。

Ａ．ＤＮＰ−抗−Ｇ６ＰＤＨ接合体によるＧ６ＰＤＨの
抑制 酵素Ｃ．６ＰＤＨ（０．１５７μｇ）を本発明のＤＮＰ
−抗一Ｇ６ＰＤＨ接合体を種々の濃度で含むｐｌ｛８の
Ｏ．ＩＭトリスー１１ＣＩ０．５ｍｌ中で２５℃で静置
した。５分後、基質／指示薬溶液０．５ｍｌを添加し、
最初の速度を測定した。基質／指示薬溶液は前記のｎ−
Ａと同様にＮＡＤ及びＧ６Ｐを含んでいた。抗体の不存
在では、０６Ｆ）ＤＨばΔＡ＝０．６４９／分を生じた
。分析混合物にＤＮＰ一抗−Ｇ６ＰＤＨ３２μｇが存在
すると、酵素が１００％抑制されることが判った。反対
に、ベルオキシターセ／抗−ベルオキシダーゼ系は、ン
コ及びレンホフによって報告されたとおり、最高７５％
の抑制を生じたにすぎない。

酵素を全体的に抑制しうるウサギにおける抗一〇６ＰＤ
Ｈの産生は本発明によれば正常であることが認められた
が（Ｇ６ＰＤＨで免疫した８匹のウサギはすべて、１０
週間後、１００％の抑制能及び高い力価を有する抗一血
清を生じたが、高い抑制能を有する抗一ペルオキシダー
セの産生は困難であることは知られている。文献は、ウ
サギ及びヤギをそれぞれ使用して最高７８％及び９０％
抑制する抗−ペルオキシダーゼの産生を報告している〔
ンゴ及びレンホフの前掲文献、及びマルソチ（Ｍａｒｕ
ｃｃｉ）．．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．１０：２７８〜２
８０（１９７３））。事実、ベルオキシダーゼ／抗一ペ
ルオキシダーゼ免疫複合体の予測される残留活性は残留
ベルオキシダーゼ活性自体を検出シグナルとして使用す
る免疫組織化学の分野に使用されている。しかし、均質
型抗一酵素標識免疫分析では、このような残留活性は系
の感受性容量を減少するハンクグラウンドシグナルに寄
与する。本発明は、感受性に影響するハソクグラウンド
を示さない酵素／抗一酵素系を使用する。

Ｂ．ＤＮＰ−リジンの分析の性能特性 ンゴ及びレンポフの前掲文献の分析条件での本発明によ
るＤＮＰ−リジン分析、即ち２５゜Ｃで５５〕の静置時
間後の速度分析について、標準曲線（第８図）を作製し
た。種々の濃度のＤＮＰ−リジン１０μ！の溶液をＤＮ
Ｐ〜抗−Ｇ６ＰＤＨ接合体１６μｇ，ｊｊｃ−ＤＮＰ１
００μｌ及びＧ６ＰＤＨ０．１５７μｇを含む溶液５０
０μｌに添加した。２５゜Ｃで５分静置した後、基質／
指示薬溶液０．５ｍｌを添加し、最初の速度を測定した
。

被分析物の不存在では応答を５％減少する免疫反応混合
物中のＤＮＰ−リジンの濃度として感受性を定義すると
、２５゜Ｃ、５分の動態法での本発明方法は０．３６μ
Ｍの感受性を示した。従来のベルオキシダーゼ／抗−ペ
ルオキシダーセ系の感受性は、ンゴ及びレンボフの文献
の第３図の横軸を免疫反応混合物中のａ度として、２μ
Ｍより良くはない。

前記の結果から、ベルオキシダーゼに基づく方法に比し
て本発明の付加的利点は明らかである。

５０％の酵素抑制を生しるのに必要な酵素に対する抗−
酵素標識のモル比は、本発明では３５．５であるにすぎ
ないのに比べて、ベルオキシダーゼに基づく系では２３
６である。更に、従来のべルオキシダーゼ系に基づ＜Ｄ
ＮＰ−リジン分析に使用する抗一酵素標識の量は２４０
μｇであり、本発明方法によれば著しく少量、即ち１６
μｇが必要であった。更に、血清試料（純枠な緩衝液試
料を使用したンゴ及びレンホフの研究）は蛋白質、例え
ば、殊に干渉性ベルオキシダーゼ活性を有するヘモグロ
ビン及びミオグロビンを含むことが予想される。しかし
、本発明においては、リューコノストック・メゼンテロ
イデスからのＧ６ＰＤＨに対する補助因子としてＮＡＤ
を使用すると、補助因子としてＮＡＤＰを必要とする血
ｌ＊０６ＰＤＨからのハソクグラウンド活性を生じる可
能性が排除される。前記の研究から判るように、一次安
定性の研究は、Ｇ６ＰＤＨが極めて低い濃度で安定であ
り、わずかに酸性のｐｌ＋の基質／指示薬溶液が数り一
月安定であることを示した。これとは異なり、ベルオキ
シダーゼは、酵素試薬が免疫分析に使用するため貯蔵さ
れる低い濃度で不安定であることは周知であり、ベルオ
キシダーゼ基質Ｈ２０２は、適切な色原体及び他のレド
ソクス指示薬と混合した場合には安定でない。

最後に、ンゴ及びレンホフは、分析の感受性及び実施可
能性を向上させるため比較的長い静置時間及び／又は高
い波長で吸収する色原体を使用する可能性を示していな
い。免疫反応及び酵素反応に対してそれぞれ６０分及び
２０分の静置時間及び５８０ｎｍで１回で読み取りうる
ジアフオラーゼとテトラゾリウム塩との反応の組合せ（
反応を停止した後）を使用することによって、本発明方
法は２．５ｎＭのビオチンの感受性を示した。蛋白質（
ヒトＩｇＧ）に関する分析を実施しうろことも証明され
た。更に、親和クロマトグラフイーによって精製された
抗一〇６ＰＤＨを使用することによって感受性の改良が
得られ、ビオチン０．３０ｎＭの感受性に達した。比色
法は、高度に感受性で、実施可能であることに比べて、
分析に５０μβ又は１００μｌの血清を組み入れる場合
に、干渉によって影響されない。事実、高い読み取り波
長（５’８０ｎｒｎ）は、血清の色を無視可能にする。

ヒト血清においてコーチゾルの実施可能の、均質比色酵
素免疫分析（前記の■部）を証明するためこれらの改良
をすべて使用した。例えば、酵素反応を発螢光団、例え
ばレサズリンで検出することによって感度を更に向上さ
せることができ、テｌ・ラゾリウム塩より２〜１０倍感
度を増加することができる。

本発明の思想及び範囲を逸脱することなく、前記の本発
明の他の多くの変更及び変化をなすことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＤＮＰ−リジンに関する紫外線吸収率分析の
標準曲線、第２図は、ビオチンに関する紫外線吸収率分
析の標準曲線、第３図は、ビオチンに関する比色終点分
析の標準曲線、第４図は、ヒ｝ＩｇＧに関する比色終点
分析の標準曲線、第５図はコルチゾール分析の標準曲線
、第６図は、Ｆａｂ標識を使用したコルチゾール分析の
標準曲線、第７図は、コルチゾール標準曲線の比較図、
第８図は、ＤＮＰ−リジンの２５゜Ｃ、５分の速度分析
の標準曲線を示す。 −４３１− 手続補正書 昭和６０年５月１７日 特許庁長官志賀学殿 ｌ．事件の表示 昭和６０年特許願第４４９６９号 ２．発明の名称 抗一酵素標識特異結合分析法、試薬系及び試験キット ３．補正をする者 事件との関係特許出願人 名称マイルス・イタリアーナ●ンシエタ●ペル●アチオ
一二 ４．代理人 住所〒１０７東京都港区赤坂２−ｔｏ−８第一信和くル
氏名弁理士（７８ｆｉＥｌ）津国肇Ｑ韓９ｔ響−｛ ，５蛮 ５．補正命令の日付自発 ６．補正の対象明細書の発明の詳細な説明の欄，？＼ ７．補正の内容明細書第４７頁１行目記載の「エモラト
化（ｅｍｏｌｉｚｅｄ）Ｊを「溶血」と補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）試験試料を酵素の触媒活性を抑制しうる抗−酵素
   を含む標識成分を有する標識接合体を含む分析試薬と混
   合し、これにより前記の標識接合体の結合種及び遊離種
   を有する反応混合物を形成させ、前記試験試料中の被分
   析物の量を前記の結合種又は前記の遊離種の標識接合体
   によって前記酵素を抑制する量の函数として測定するこ
   とからなる、試験試料中の被分析物を測定する抗〜酵素
   標識特異結合分析法において、前記酵素としてグルコー
   ス−６−ホスフエー１・デヒドロゲナーゼを使用し、前
   記標識成分として抗−（グルコース−６−ポスフェート
   デヒドロゲナーゼ）を使用する抗一酵素標識特異結合分
   析法。 （２）前記グルコース−６−ボスフェートデヒドロゲナ
   ーゼ酵素がリューコノストノク・メゼンテロイデス（Ｌ
   ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎＬｅｒｏｉｄｅｓ）（
   ＥＣ１．１．１．４９）から得られたものである特許請
   求の範囲第１項記載の分析法。 （３）前記の標識成分として使用する抗一酵素がグルコ
   ース−６−ボスフェ−１・デヒトロゲナーゼに対して産
   生じたＩｇＧ抗体又はそのフラグメン１一である特許請
   求の範囲第１項記載の分析法。 （４）前記の抗一酵素標識による前記の酵素活性の抑制
   が、前記標識接合体が前記の結合種である場合に、前記
   の遊離種である場合に比べて測定可能に異なり、前記の
   酵素活性か前記の反応混合物中で測定され、前記の試験
   試料中の被分析物の量の函数である均質型の特許請求の
   範囲第１項記載の分析法。 （５）前記の結合種及び遊離種を物理的に分離し、前記
   の酵素活性を前記の分離した種の一つで測定し、その酵
   素活性が前記の試験試料中の被分析物の量の函数である
   不均質型の特許請求の範囲第１項記載の分析法。 （６）前記の被分析物を抗原及びそれに対する抗体；ハ
   プテン及びそれに対する抗体；及びホルモン、ビタミン
   、代謝産物及び薬剤並びにそれらの結合相手からなる群
   から選択する特許請求の範囲第１項記載の分析法。 （７）（ａ）酵素に結合し、酵素の触媒活性を抑制しう
   る抗体又はそのフラグメントを含む標識成分に結合した
   前記被分析物又はその結合類縁体を含む標識接合体、（
   ｂ）前記被分析物を結合しうる抗体及び（ｃ）前記酵素
   を含む分析試薬と試験試料を混合することにより反応混
   合物を形成し、前記反応混合物中で前記の酵素活性を試
   験試料中の前記被分析物の量の函数として測定すること
   からなる試験試料中の被分析物を測定する均質免疫分析
   法において、前記酵素としてグルコース−６一ボスフェ
   ートデヒドロゲナーゼを使用し、前記゜標識成分として
   抗一（グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
   ）を使用する均質免疫分析法。 （８）前記のグルコース−６−ホスフェー１・デヒドロ
   ゲナーゼ酵素がりューコノストソク・メゼンテロイデス
   （ＥＣ１．１．１．４９）から得られたものである特許
   請求の範囲第７項記載の分析法。 （９）前記の被分析物が約１００〜約１５００の分子量
   のハプテンである特許請求の範囲第７項記載の分析法。 （１０）前記の被分析物が蛋白質又はポリペプチドであ
   る特許請求の範囲第７項記載の分析法。 （１１）前記の標識成分がＩｇＧ抗体のフラグメン１・
   である特許請求の範囲第１０項記載の分析法。 （１２）前記の試験試料が血液又は血液フラクションで
   あり、前記分析試薬が更に乳酸デヒドロゲナーゼ活性に
   対する抑制因子を含む特許請求の範囲第７項記載の分析
   法。 （ｌ３）前記の抑制因子がオキサミド酸である特許請求
   の範囲第１２項記載の分析法。 （１４）（１）酵素の触媒活性を抑制しうる抗一酵素を
   含む標識成分を有する標識接合体及び（２）前記酵素を
   含み、試験試料と共に、前記の標識接合体の結合種及び
   遊離種を有する反応混合物を形成し、その際、前記結合
   種又は前記遊離種において前記標識接合体によって生じ
   る前記酵素の抑制が前記試験試料中の前記被分析物の量
   の函数となる、前記試験試料中の被分析物の抗一酵素標
   識特異結合分析測定用の試薬系において、前記酵素とし
   てグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを使
   用し、前記標識成分として抗−（グルコース−６−ホス
   フェートデヒドロゲナーゼ）を使用する抗一酵素標識特
   異結合分析測定用の試薬系。 （１５）前記グルコースー６−ホスフェートデヒドロゲ
   ナーゼ酵素がりューコノストソク・メゼンテロイデス（
   ＥＣ１．１．１．４９）から得られたものである特許請
   求の範囲第１４項記載の試薬系。 （１６）前記の標識成分として使用する抗−酵素がグル
   コース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼに対して産
   生じたＩｇＧ酵素又はそのフラグメントである特許請求
   の範囲第１４項記載の試薬系。 （１７）前記の被分析物を抗原及びそれに対する抗体；
   ハプテン及びそれに対する抗体；及びホルモン、ビタミ
   ン、代謝産物及び薬剤並びにそれらの。結合相手からな
   る群から選択する特許請求め範囲第１４項記載の試薬系
   。 （１８）（ａ）グルコース−６−ポスフェートデヒドロ
   ゲナーゼに結合し、その触媒活性を抑制しうる抗体又ば
   そのフラグメントを含む標識成分に結合した前記被分析
   物又はその結合類縁体を含む標識接合体、 （ｂ）前記の被分析物を結合しうる抗体及び （Ｃ）グルコース−６−ボスフェ−１−テヒドロゲナー
   ゼ を含み、前記の標識接合体、抗体及びグルコース＝６−
   ホスフェートデヒドロゲナーゼが被分析物を測定しうる
   量で存在する試験試料中の被分析物を測定する試験キッ
   ト。 （１９）前記のグルコース−６−ボスフェ−１・デヒト
   ロゲナーゼ酵素がりューコノストノク・メゼンテロイデ
   ス（ＥＣ１、１．１．４９）から得られたものである特
   許請求の範囲第１８項記載の試験キット。 （２０）前記の被分析物が約１００〜約１５００の分子
   量のハプテンである特許請求の範囲第１８項記載の試験
   キット。 （２１）前記の被分析物が蛋白質又はポリペプチドであ
   る特許請求の範囲第１８項記載の試験キソト。 （２２）前記の標識成分がＩｇＧ抗体のフラグメントで
   ある特許請求の範囲第２１項記載の試験キソト。 （２３）前記の試験試料が血液又は血液フラクションで
   あり、前記分析試薬が更に乳酸デヒドロゲナーゼ活性に
   対する抑制因子を含む特許請求の範囲第１８項記載の試
   験キット。 （２４）前記の抑制因子がオキサミド酸である特許請求
   の範囲第２３項記載の試験キット。