JPS60218325A - 多価肺炎球菌ワクチン - Google Patents
多価肺炎球菌ワクチンInfo
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- JPS60218325A JPS60218325A JP59155729A JP15572984A JPS60218325A JP S60218325 A JPS60218325 A JP S60218325A JP 59155729 A JP59155729 A JP 59155729A JP 15572984 A JP15572984 A JP 15572984A JP S60218325 A JPS60218325 A JP S60218325A
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- Japan
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- polysaccharide
- alcohol
- volumes
- pneumococcal
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/831—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate
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- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、“°C”多糖が実質的に存在しない精製され
た肺炎球菌莢膜多糖(pneumococcat ca
psular polysaccharide)から成
る多価肺炎球菌ワクチンに関する。本発明は、また、デ
ンマーク表示によると、3.5.9V、IOA、IIA
、15B、17F、19A、22Fおよび33F型であ
るlOの肺炎球菌型の各々を特別に精製して1本発明の
精製された免疫原多糖を生成することに関する。
た肺炎球菌莢膜多糖(pneumococcat ca
psular polysaccharide)から成
る多価肺炎球菌ワクチンに関する。本発明は、また、デ
ンマーク表示によると、3.5.9V、IOA、IIA
、15B、17F、19A、22Fおよび33F型であ
るlOの肺炎球菌型の各々を特別に精製して1本発明の
精製された免疫原多糖を生成することに関する。
本発明の多価肺炎球菌ワクチン中に存在する他の肺炎球
菌型は、デンマーク表示よると、1.2.4.6A、6
B、7F、8.9N、12F、14.18C,19F、
20.23Fおよび33Fであり、これらは米国特許第
4,242,501号中に示されているようにして精製
することができる。
菌型は、デンマーク表示よると、1.2.4.6A、6
B、7F、8.9N、12F、14.18C,19F、
20.23Fおよび33Fであり、これらは米国特許第
4,242,501号中に示されているようにして精製
することができる。
本発明において有用な各型の肺炎球菌培養物は、多数の
培養研究所に貯蔵されておりかつ前記研究所から世界中
において入手することができる。アメリカン・タイプ・
カルチャーコレクション(ATCC)(The Ame
rican Type Cu1ture Co11ec
tin。
培養研究所に貯蔵されておりかつ前記研究所から世界中
において入手することができる。アメリカン・タイプ・
カルチャーコレクション(ATCC)(The Ame
rican Type Cu1ture Co11ec
tin。
12301 Parklawn Drive、Rock
vi lie、Maryland、U、S。
vi lie、Maryland、U、S。
A、20852)は、本発明の肺炎球菌型のすべてを自
由に入手可能であるとして記載している。
由に入手可能であるとして記載している。
1982年のATCCカタログは、これらの型を次のよ
うに表示している(表工参照)ニー人ユー デンマーク の型の命名 米国の命 カタログの番号汰−−−− 各
法−− t 1 6301 2 2 6302 3 3 6303 4 4 6304 5 5 6305 6A 6 6306 6B 26 6326 7F 51 10351 8 8 6308 9N 9 6309 9V 68 10368 10A 34 8334 11A 43 10343 12F 12 6312 14 14 6314 15B 54 10354 17F 17 6317 18C5610356 19A 57 10357 19F 19 6319 20 20 6320 22F 22 6322 23F 23 6323 25 25 6325 33F 70 10370 ワクチンの製造における重要な工程は、適当な抗体の生
産を起こす保持された物質の性質を損失しないで、異質
物質を除去するように、免疫原物質を精製することであ
る。多糖類のこのような性質は、多糖類の「自然状態の
立体配置(natve 5tate configur
ati。
うに表示している(表工参照)ニー人ユー デンマーク の型の命名 米国の命 カタログの番号汰−−−− 各
法−− t 1 6301 2 2 6302 3 3 6303 4 4 6304 5 5 6305 6A 6 6306 6B 26 6326 7F 51 10351 8 8 6308 9N 9 6309 9V 68 10368 10A 34 8334 11A 43 10343 12F 12 6312 14 14 6314 15B 54 10354 17F 17 6317 18C5610356 19A 57 10357 19F 19 6319 20 20 6320 22F 22 6322 23F 23 6323 25 25 6325 33F 70 10370 ワクチンの製造における重要な工程は、適当な抗体の生
産を起こす保持された物質の性質を損失しないで、異質
物質を除去するように、免疫原物質を精製することであ
る。多糖類のこのような性質は、多糖類の「自然状態の
立体配置(natve 5tate configur
ati。
n)」と呼ぶことができるものの保持にあるように思わ
れる。
れる。
多糖類から分離すべき材料のうちに、タンパク質、核酸
、および“C”多糖がある。“CII多糖は、デンマー
ク表示で肺炎球菌型4,7Fおよび14中に高濃度で存
在し、そして米国特許第4゜242.501号中に示さ
れているようにしてそれから分離することができる。
、および“C”多糖がある。“CII多糖は、デンマー
ク表示で肺炎球菌型4,7Fおよび14中に高濃度で存
在し、そして米国特許第4゜242.501号中に示さ
れているようにしてそれから分離することができる。
核酸類(260MUの光を吸収する)は肺炎球菌多糖類
の製造において満足すべきレベルに減少させることは困
難である。この問題は、免疫原性を保持しながら、より
容易に精製される髄膜炎菌多糖により提供される場合と
対照的である。骨髄脱炎多糖は、米国特許第3,636
,192号(Gotshlich)中に示されている比
較的過酷な方法である。85の特定の型の肺炎球菌が存
在する。これらの型は米国およびデンマークの両者の命
名系により表示される。ここに引用する型の表示はデン
マークの番号による。各型は汚染物質を排除する特定の
方法を必要とするように思われるが、単一の方法をすべ
ての型の肺炎球菌多糖類に適用することはできない。さ
らに、特定の適切な方法は予測不可能であるように思わ
れる。
の製造において満足すべきレベルに減少させることは困
難である。この問題は、免疫原性を保持しながら、より
容易に精製される髄膜炎菌多糖により提供される場合と
対照的である。骨髄脱炎多糖は、米国特許第3,636
,192号(Gotshlich)中に示されている比
較的過酷な方法である。85の特定の型の肺炎球菌が存
在する。これらの型は米国およびデンマークの両者の命
名系により表示される。ここに引用する型の表示はデン
マークの番号による。各型は汚染物質を排除する特定の
方法を必要とするように思われるが、単一の方法をすべ
ての型の肺炎球菌多糖類に適用することはできない。さ
らに、特定の適切な方法は予測不可能であるように思わ
れる。
種々の肺炎球菌多糖類を精製するために使用される異る
手順の例として、あるものは沈殿のために大量のエタノ
ールを必要とし、このアルコールは、核酸類が3Aアル
コールを用いて低級アルコールの範囲において沈殿する
ので、核酸類から部分的に分離することができる。3A
アルコール1よ5%の無水メタノールおよび95%の無
水エタノールである。無水エタノールは本質的に同一の
方法でふるまうであろうから、完全に同等であると考え
られる。この明細書を通じて、「アルコール」という用
語は、特記しないかぎり、3Aアルコールを表示する。
手順の例として、あるものは沈殿のために大量のエタノ
ールを必要とし、このアルコールは、核酸類が3Aアル
コールを用いて低級アルコールの範囲において沈殿する
ので、核酸類から部分的に分離することができる。3A
アルコール1よ5%の無水メタノールおよび95%の無
水エタノールである。無水エタノールは本質的に同一の
方法でふるまうであろうから、完全に同等であると考え
られる。この明細書を通じて、「アルコール」という用
語は、特記しないかぎり、3Aアルコールを表示する。
他の型では、多糖類は30〜50%の範囲において沈殿
し、こうしてアルコールは分離沈殿剤として有効ではな
い。対照的に、他の型は注意して調節された量の硫酸プ
ロタミンにより核酸類から分離することができる。これ
らの型では、硫酸プロタミンの最適濃度(0,02〜0
.20%)において、核酸類は沈殿し、高速遠心により
沈降させることができる。しかしながら、構成成分の核
酸を沈殿させるために要求される量を超える、この系に
おける過剰量の硫酸プロタミンは多糖類を追加的に沈殿
させる。他の型の肺炎球菌多糖の精製の例は、3ff!
!肺炎球菌にしばしば用いられる精製により提供され、
この多糖は核酸からの分離が困難である。酢酸カルシウ
ムを酢酸ナトリウムの代わりに3型肺炎球菌多糖の溶液
中の電解質として使用すると、多糖は最小量のアルコー
ル(1,0〜12%)で沈殿させることができる。しか
しながら、この方法は時には実質的な量の核酸を上澄み
相中に溶解させることがある。多糖−核酸混合物と硫酸
アンモニウムとの反応における種々の肺炎球菌多糖の型
の挙動は、また変動する。ある多糖類t*5o〜60%
において硫酸アンモニウムにより沈殿し、これに対して
他のものは沈殿しない。15多糖は硫酸アンモニウムで
沈殿せず、これに対して3型および4型は硫酸アンモニ
ウムで50%の飽和にすることにより核酸からある程度
分離することができる。上の解説および次の参考文献か
ら明らかなように、85以上の型の肺炎球菌が存在しか
つ実際的なワクチンの製造は多くの種の肺炎球菌からの
多糖分画からなる多価ワクチンを必要とし、各分画が比
較的自然状態の立体配 I置を保持するという事実を見
ると、すべての型に適用可能な肺炎球菌多糖から汚染物
質を除去する満足すべき方法は存在しない[Guy、R
,C。
し、こうしてアルコールは分離沈殿剤として有効ではな
い。対照的に、他の型は注意して調節された量の硫酸プ
ロタミンにより核酸類から分離することができる。これ
らの型では、硫酸プロタミンの最適濃度(0,02〜0
.20%)において、核酸類は沈殿し、高速遠心により
沈降させることができる。しかしながら、構成成分の核
酸を沈殿させるために要求される量を超える、この系に
おける過剰量の硫酸プロタミンは多糖類を追加的に沈殿
させる。他の型の肺炎球菌多糖の精製の例は、3ff!
!肺炎球菌にしばしば用いられる精製により提供され、
この多糖は核酸からの分離が困難である。酢酸カルシウ
ムを酢酸ナトリウムの代わりに3型肺炎球菌多糖の溶液
中の電解質として使用すると、多糖は最小量のアルコー
ル(1,0〜12%)で沈殿させることができる。しか
しながら、この方法は時には実質的な量の核酸を上澄み
相中に溶解させることがある。多糖−核酸混合物と硫酸
アンモニウムとの反応における種々の肺炎球菌多糖の型
の挙動は、また変動する。ある多糖類t*5o〜60%
において硫酸アンモニウムにより沈殿し、これに対して
他のものは沈殿しない。15多糖は硫酸アンモニウムで
沈殿せず、これに対して3型および4型は硫酸アンモニ
ウムで50%の飽和にすることにより核酸からある程度
分離することができる。上の解説および次の参考文献か
ら明らかなように、85以上の型の肺炎球菌が存在しか
つ実際的なワクチンの製造は多くの種の肺炎球菌からの
多糖分画からなる多価ワクチンを必要とし、各分画が比
較的自然状態の立体配 I置を保持するという事実を見
ると、すべての型に適用可能な肺炎球菌多糖から汚染物
質を除去する満足すべき方法は存在しない[Guy、R
,C。
W、、How、J、、5tacey、M、、Heide
lberger、M、、J、Biol、Chem、24
2:21 (1967);Brown 、R,、J 、
Immuno l 、37 : 445(1939);
Glaudemans、C,P。
lberger、M、、J、Biol、Chem、24
2:21 (1967);Brown 、R,、J 、
Immuno l 、37 : 445(1939);
Glaudemans、C,P。
J、、Treffers、H,P、、Carb。
hydrate Res、4.(1967);Kaba
t 、E、A、、Exp、Immunochemist
ry、Charles C,Thomas、publi
sher、pp、838−842(1967)。
t 、E、A、、Exp、Immunochemist
ry、Charles C,Thomas、publi
sher、pp、838−842(1967)。
肺炎球菌多糖の他の汚染物質はタンパク質である。アル
コールの沈殿はタンパク賀汚染物質のレベルの低下にお
いて有効であるが、この汚染を非経口的生成物のために
満足すべきレベルに低下させることは不可能である。タ
ンパク質のレベルを低下させるために普通に用いられる
1つの方法は、肺炎球菌多糖類とタンパク質との混合物
を有機溶媒に暴露することである。例えば、[セバグ(
Sevag)J(7)手順[Sevag 、M、G、。
コールの沈殿はタンパク賀汚染物質のレベルの低下にお
いて有効であるが、この汚染を非経口的生成物のために
満足すべきレベルに低下させることは不可能である。タ
ンパク質のレベルを低下させるために普通に用いられる
1つの方法は、肺炎球菌多糖類とタンパク質との混合物
を有機溶媒に暴露することである。例えば、[セバグ(
Sevag)J(7)手順[Sevag 、M、G、。
Biochem、Z、、2ヱ2:419(1934)]
は、クロロホルムとブタノールとの混合物とともに4〜
6時間激しく振盪することにより抽出し1次いで低速度
で遠心することからなる。界面に集まる変性したタンパ
ク質を、次いで水相から多糖類と分離することができる
。しかしながら、この手順は、抽出が肺炎球菌多糖類に
しばしば悪影響を及ぼし、肺炎球菌多糖類を破壊し、解
重合し、あるいは自然状態の立体配置を損失させるので
、不満足である。得られるものは、免疫原として有効で
ない多糖類である。他の手順、例えば、硫酸アンモニウ
ムの沈殿およびモレキュラーシーブを用いてタンパク質
の汚染を減少することができるが、このような手順は溶
液中の多くの異る大きさおよび型のタンパク質類のうち
の各群のタンパク質類およびペプチド類に対して特異的
である。ここで再び、多糖類の変動性は、菌株に依存し
て、用いる特定のタンパク質の分離工程の有効性を決定
する。さらに、1つの手順はすべての肺炎球菌莢膜多糖
類の精製において有効ではなく、かつ特定の肺炎球菌莢
膜多糖の挙動の予測は不可能であるように思われると結
論することができる。
は、クロロホルムとブタノールとの混合物とともに4〜
6時間激しく振盪することにより抽出し1次いで低速度
で遠心することからなる。界面に集まる変性したタンパ
ク質を、次いで水相から多糖類と分離することができる
。しかしながら、この手順は、抽出が肺炎球菌多糖類に
しばしば悪影響を及ぼし、肺炎球菌多糖類を破壊し、解
重合し、あるいは自然状態の立体配置を損失させるので
、不満足である。得られるものは、免疫原として有効で
ない多糖類である。他の手順、例えば、硫酸アンモニウ
ムの沈殿およびモレキュラーシーブを用いてタンパク質
の汚染を減少することができるが、このような手順は溶
液中の多くの異る大きさおよび型のタンパク質類のうち
の各群のタンパク質類およびペプチド類に対して特異的
である。ここで再び、多糖類の変動性は、菌株に依存し
て、用いる特定のタンパク質の分離工程の有効性を決定
する。さらに、1つの手順はすべての肺炎球菌莢膜多糖
類の精製において有効ではなく、かつ特定の肺炎球菌莢
膜多糖の挙動の予測は不可能であるように思われると結
論することができる。
しかしながら、高い純度でかつ免疫原性を保持して肺炎
球菌莢膜多糖を精製するある数の方法が今回発見された
。これらの精製は、特定的にはlOの型の肺炎球菌の精
製に関する。これらの型は、3,5.9v、IOA、I
IA、15B、17F、19A、22Fおよび33F型
(デンマーク表示)である。
球菌莢膜多糖を精製するある数の方法が今回発見された
。これらの精製は、特定的にはlOの型の肺炎球菌の精
製に関する。これらの型は、3,5.9v、IOA、I
IA、15B、17F、19A、22Fおよび33F型
(デンマーク表示)である。
本発明の主題は、デンマーク表示により、l、2.3.
4.5,6B、7F、8.9N、9V、10A、IIA
、12F、14.15B、17F、18c、19A、1
9F、20.22F、23Fおよび33F型と、6Aお
よび25型のθ〜1または両者との群から成り、かつ“
C11多糖が実質的に存在しない、有効免疫原量の肺炎
球菌莢膜多糖、および4.7Fおよび14型の主要汚染
物質の組み合わせの多価ワクチンである。この明細書に
おいて定義されているように、11 C11多糖が実質
的に存在しないとは0.5%より少ない°“C”多糖を
意味する。この多価ワクチンの調製に対する中心は、こ
のワクチンにおいて使用する10の型の各々の精製され
た莢膜多糖を調製する方法である。肺炎球菌バクテリア
が適当な発酵法により静止生長相に生長した後、有効量
のナトリウムデオキシコレートの添加してすべてのバク
テリア細胞を溶解しかつ細胞に関連する多糖を媒質中に
解放することにより停止する。細胞の破片を媒質から除
去し、1または2回のアルコール沈殿を行なう。この手
順は、タンパク質を含む汚染物質のきわめて多くを肺炎
球菌多糖類から除去する。
4.5,6B、7F、8.9N、9V、10A、IIA
、12F、14.15B、17F、18c、19A、1
9F、20.22F、23Fおよび33F型と、6Aお
よび25型のθ〜1または両者との群から成り、かつ“
C11多糖が実質的に存在しない、有効免疫原量の肺炎
球菌莢膜多糖、および4.7Fおよび14型の主要汚染
物質の組み合わせの多価ワクチンである。この明細書に
おいて定義されているように、11 C11多糖が実質
的に存在しないとは0.5%より少ない°“C”多糖を
意味する。この多価ワクチンの調製に対する中心は、こ
のワクチンにおいて使用する10の型の各々の精製され
た莢膜多糖を調製する方法である。肺炎球菌バクテリア
が適当な発酵法により静止生長相に生長した後、有効量
のナトリウムデオキシコレートの添加してすべてのバク
テリア細胞を溶解しかつ細胞に関連する多糖を媒質中に
解放することにより停止する。細胞の破片を媒質から除
去し、1または2回のアルコール沈殿を行なう。この手
順は、タンパク質を含む汚染物質のきわめて多くを肺炎
球菌多糖類から除去する。
注意して調節したアルコール沈殿は、本発明の方法にお
いてすべての多糖類の精製における主要工程であり、各
多糖をアルコールにより少なくとも5回沈殿させる。こ
れはより過酷なりロロホルムーブタノール抽出を回避す
る。
いてすべての多糖類の精製における主要工程であり、各
多糖をアルコールにより少なくとも5回沈殿させる。こ
れはより過酷なりロロホルムーブタノール抽出を回避す
る。
2つの型のアルコール沈殿を使用する。
第1に、十分なアルコールを試料に添加して多糖類を沈
殿させる。次いで、この沈降物を上澄みから遠心により
分離し、蒸留水中に再溶解させる。
殿させる。次いで、この沈降物を上澄みから遠心により
分離し、蒸留水中に再溶解させる。
第2の型は、分別アルコール沈殿である。多糖類を沈殿
させない最大量のアルコールを添加する。次いで汚染物
質の沈降物を遠心により除去し、十分量のアルコールを
上澄みへ添加して多糖類を沈殿させる。次いで多糖類の
沈降物を遠心により収穫し、そして多糖類を蒸留水中に
再溶解させる。
させない最大量のアルコールを添加する。次いで汚染物
質の沈降物を遠心により除去し、十分量のアルコールを
上澄みへ添加して多糖類を沈殿させる。次いで多糖類の
沈降物を遠心により収穫し、そして多糖類を蒸留水中に
再溶解させる。
両方の型の沈殿の終りにおいて、水中に解しない特定の
物質は多糖ではなく、遠心または濾過により除去される
。
物質は多糖ではなく、遠心または濾過により除去される
。
数回のアルコール沈殿を実施した後における、臭化ヘキ
サデシルトリメチルアンモニウム[セタブロン(cet
avlon)]の処理は最も有効であり、精製手順にお
ける初期の工程における使用よりも改良されている。
サデシルトリメチルアンモニウム[セタブロン(cet
avlon)]の処理は最も有効であり、精製手順にお
ける初期の工程における使用よりも改良されている。
セタブロンは、本発明の肺炎球菌型の大部分にとって、
重要な分離工程である。これらの型において、この工程
は注意して調節された条件下でタンパク質および核酸の
汚染物質よりも優先的に多糖類を沈殿させるか、あるい
は逆に、汚染物質を優先的に沈殿させる。次いで沈殿し
た多糖類を、塩化ナトリウム(通常0.25)中に可溶
化し。
重要な分離工程である。これらの型において、この工程
は注意して調節された条件下でタンパク質および核酸の
汚染物質よりも優先的に多糖類を沈殿させるか、あるい
は逆に、汚染物質を優先的に沈殿させる。次いで沈殿し
た多糖類を、塩化ナトリウム(通常0.25)中に可溶
化し。
遠心して、前記塩中に不溶性である汚染する高分子を除
去する。臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよ
び塩の濃度は多糖の精製に最適に変えることができるが
、この手順は沈殿する3、5、IIA、15B、17F
および22F型に有効であることが明らかにされた。
去する。臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよ
び塩の濃度は多糖の精製に最適に変えることができるが
、この手順は沈殿する3、5、IIA、15B、17F
および22F型に有効であることが明らかにされた。
4つの型(9V、19A、23Ftl:び33F)は臭
化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムにより沈殿しな
い。これらに4つの型の場合において、臭化ヘキサデシ
ルトリメチルアンモニウムを添加し、そして生ずる沈殿
を遠心分離し、廃棄する。臭化ヘキサデシルトリメチル
アンモニウムはアルコール中に可溶性であるので、引き
統〈アルコール沈殿はそれ以上の多糖の精製および残留
する臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムの除去の
両者において有効である。この一般的もくろみは、ある
数の肺炎球菌多糖の型に対して変動を伴なって適当な広
い手順である。IOA型は、セタブロンの使用により精
製されないといくことにおいて独特である。
化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムにより沈殿しな
い。これらに4つの型の場合において、臭化ヘキサデシ
ルトリメチルアンモニウムを添加し、そして生ずる沈殿
を遠心分離し、廃棄する。臭化ヘキサデシルトリメチル
アンモニウムはアルコール中に可溶性であるので、引き
統〈アルコール沈殿はそれ以上の多糖の精製および残留
する臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムの除去の
両者において有効である。この一般的もくろみは、ある
数の肺炎球菌多糖の型に対して変動を伴なって適当な広
い手順である。IOA型は、セタブロンの使用により精
製されないといくことにおいて独特である。
セタブロンを効果的に除去するアルコールの処理後、特
定の菌株に対して独特である汚染物質のために異る工程
を組み込むことができる。次いで、肺炎球菌多糖を透析
し、凍結乾燥し、そして−20℃以下において乾燥粉末
として貯蔵することができる。
定の菌株に対して独特である汚染物質のために異る工程
を組み込むことができる。次いで、肺炎球菌多糖を透析
し、凍結乾燥し、そして−20℃以下において乾燥粉末
として貯蔵することができる。
ワクチンは、防腐剤を含有する適当な緩衝液、例えば、
リン酸塩緩衝液中に多糖類を溶解し、次いで減菌濾過す
ることによってつくることができる。
リン酸塩緩衝液中に多糖類を溶解し、次いで減菌濾過す
ることによってつくることができる。
肺炎球菌多糖の普通の精製法は、次のように要約するこ
とができる: デオキシコレートにより溶解された培養物↓ 2回の分別アルコール沈殿 ↓ セタブロン処理 ↓ 3回のアルコール沈殿 ↓ 活性炭 ↓ 透析 裁 ↓ 1 凍結乾燥 本発明の目的は、“C”多糖汚染が実質的に存在しない
、l、2.3.4.5,6B、7F。
とができる: デオキシコレートにより溶解された培養物↓ 2回の分別アルコール沈殿 ↓ セタブロン処理 ↓ 3回のアルコール沈殿 ↓ 活性炭 ↓ 透析 裁 ↓ 1 凍結乾燥 本発明の目的は、“C”多糖汚染が実質的に存在しない
、l、2.3.4.5,6B、7F。
8、9N、 9V、IOA、IIA、12F、14、1
5B、17F、 18C119A、 19F。
5B、17F、 18C119A、 19F。
20.22F、23Fおよび33F型と、6Aおよび2
5型のO〜1つまたは両者についての、高度に精製され
た効果的に免疫原性の多価肺炎球菌多糖ワクチンを提供
することである。
5型のO〜1つまたは両者についての、高度に精製され
た効果的に免疫原性の多価肺炎球菌多糖ワクチンを提供
することである。
本発明の特定の目的は、°“C”′多糖汚染が実質的に
存在しない、l、?、3.4.5.6B、7F、8.9
N、9V、IOA、IIA、12F、14.15B、1
7F、18C,19A、19F、20.22F、23F
および33F5と、6Aおよび25型の0−1つまたは
両者についての、高度に免疫原性の肺炎球菌多糖ワクチ
ンを提供することである。
存在しない、l、?、3.4.5.6B、7F、8.9
N、9V、IOA、IIA、12F、14.15B、1
7F、18C,19A、19F、20.22F、23F
および33F5と、6Aおよび25型の0−1つまたは
両者についての、高度に免疫原性の肺炎球菌多糖ワクチ
ンを提供することである。
本発明の他の目的は、3.5.9■、IIA、15B、
17F、19A、22Fおよび33F型肺炎球菌の免疫
学的に活性な莢膜多糖を精製するりi汁を視(其するこ
)−〒ある一 ゛C”多糖が存在しない有効な多価肺炎球菌ワクチンは
、0.01%のシメロサル(themer o s a
1)の十分に凍結乾燥された免疫学的に活性な肺炎球
菌多糖を含有する0、1モルのリン酸塩緩衝剤の溶液に
添加して、約lOOミクログラム/ m l /型の最
終濃度を生成させることによって調製することができる
。免疫を提供するための多糖の精確な濃度が肺炎球菌の
型および免疫化すべき個体の両者とともに変動するので
、これは一般に有効量である。
17F、19A、22Fおよび33F型肺炎球菌の免疫
学的に活性な莢膜多糖を精製するりi汁を視(其するこ
)−〒ある一 ゛C”多糖が存在しない有効な多価肺炎球菌ワクチンは
、0.01%のシメロサル(themer o s a
1)の十分に凍結乾燥された免疫学的に活性な肺炎球
菌多糖を含有する0、1モルのリン酸塩緩衝剤の溶液に
添加して、約lOOミクログラム/ m l /型の最
終濃度を生成させることによって調製することができる
。免疫を提供するための多糖の精確な濃度が肺炎球菌の
型および免疫化すべき個体の両者とともに変動するので
、これは一般に有効量である。
この混合物を約4℃において約4時間かきまぜ、滅菌濾
過する。1つの実施態様において、1.2.3.4.5
.6A、6B、7F、8.9N、9V、IOA、IIA
、12F、14.15B、17F、18C,19A、1
9F、20.22F、23F、25および33F型の凍
結乾燥された肺炎球菌多糖の各々の1.0mgを0.0
1%のシメロサルを含有する0、1モルのリン酸塩緩衝
液と一緒にして1Occの最終体積とし、約4℃におい
て約4時間かきまぜる。4.7F、および14型を”C
11多糖を本質的に含まず(0゜5%より少ない存在す
る°“CII多糖)かつ有効な免疫原性を示す状態で添
加する。
過する。1つの実施態様において、1.2.3.4.5
.6A、6B、7F、8.9N、9V、IOA、IIA
、12F、14.15B、17F、18C,19A、1
9F、20.22F、23F、25および33F型の凍
結乾燥された肺炎球菌多糖の各々の1.0mgを0.0
1%のシメロサルを含有する0、1モルのリン酸塩緩衝
液と一緒にして1Occの最終体積とし、約4℃におい
て約4時間かきまぜる。4.7F、および14型を”C
11多糖を本質的に含まず(0゜5%より少ない存在す
る°“CII多糖)かつ有効な免疫原性を示す状態で添
加する。
好ましい実施態様において、上の手順を利用するが、2
3の肺炎球菌型のみを使用する。これらの型は1.2.
3.445.6B、7F、8.9N、9V、IOA、I
IA、12F、14,15B、17F、18C119A
、19F、20.22F、23F、25および33F型
である。自然状態の立体配置を損失せず、それゆえ有効
免疫原性を損失せずに、利用する各肺炎球菌型を精製す
ることは、上の有効な多価ワクチンの調製に対して重要
である。後の実施例において、lOは特定の炎球菌型か
ら純粋な免疫学的に活性な多糖を得る特定の方法を例示
する。これらの型は温血動物における特定の免疫原の応
答を生じさせるために利用することができ、あるいは多
価ワクチンとして組み合わせで利用することができる。
3の肺炎球菌型のみを使用する。これらの型は1.2.
3.445.6B、7F、8.9N、9V、IOA、I
IA、12F、14,15B、17F、18C119A
、19F、20.22F、23F、25および33F型
である。自然状態の立体配置を損失せず、それゆえ有効
免疫原性を損失せずに、利用する各肺炎球菌型を精製す
ることは、上の有効な多価ワクチンの調製に対して重要
である。後の実施例において、lOは特定の炎球菌型か
ら純粋な免疫学的に活性な多糖を得る特定の方法を例示
する。これらの型は温血動物における特定の免疫原の応
答を生じさせるために利用することができ、あるいは多
価ワクチンとして組み合わせで利用することができる。
前述の2種類の多価ワクチンは、本発明の25の精製さ
れた肺炎球菌莢膜多糖類を全体的にあるいは部分的に利
用して調製されうる多価ワクチンの多くの組み合わせを
単なる例示として理解されるであろう。
れた肺炎球菌莢膜多糖類を全体的にあるいは部分的に利
用して調製されうる多価ワクチンの多くの組み合わせを
単なる例示として理解されるであろう。
これらの実施例は1次の順序で配置される二火差潰 −
Lとたヨ」L −乙配U詠J二1 3 3 2 5 5 3 9V 68 4 10A 34 5 11A 43 6 15B 54 7 17F 17 8 19A 57 9 22F 22 10 33F 70 デンマ一ク表示により1.2,4.8,12F、25.
6A、6B、7F、9N、14.19F、20.23F
および18c型である炎球菌型は、引用によってここに
加える、米国特許第4゜242.501号に記載されて
いるように調製することができる。
Lとたヨ」L −乙配U詠J二1 3 3 2 5 5 3 9V 68 4 10A 34 5 11A 43 6 15B 54 7 17F 17 8 19A 57 9 22F 22 10 33F 70 デンマ一ク表示により1.2,4.8,12F、25.
6A、6B、7F、9N、14.19F、20.23F
および18c型である炎球菌型は、引用によってここに
加える、米国特許第4゜242.501号に記載されて
いるように調製することができる。
300〜5001の培地を使用して、3型肺炎球菌をこ
のよな肺炎球菌の生長の適する条件下で生長させて静止
相に到達させる。次いでバクテリアを適当な溶解剤(l
ysant)、ここではナトリウムデオキシコレートの
10%の滅菌濾過した溶液の添加により溶解する。他の
洗剤のような多くの溶解法および音波の破裂のような機
械的方法およびフランス(F r e n c h)圧
力細胞を使用することができる。すべては本発明の方法
において完全に同等の材料を生成するであろう。ナトリ
ウムデオキシコレートを使用するとき、適当な溶解濃度
は約(ml−0,2%であることがわかった。すべての
バクテリア細胞を溶解して、細胞に関連する多糖を培地
中に解放する。濁った培地を遠心により清浄にする。こ
こで、16f11シヤープレス(S h a r p
l e s)遠心機を16.00Orpmおよび36〜
40M/時の流速で使用すると同時に約2〜lO°Cの
温度を維持した。このようにして集められた細胞の破片
(debris)を廃棄する。多糖を含む上澄みをpH
約6.6に調節する。これらの実施例において、PHの
調節は通常8モルの酢酸の添加により達成された。予備
工程において表示された精確なpH値は一般的なもので
あり、好ましいモードを指示するだけであることに注意
すべきである。有用なPH範囲は、すべての炎球菌型と
ともに広く変動することを理解すべきである。セタブロ
ンを利用する沈殿工程のみは、高度に特定のPHの観測
を必要とする。同様に、酢酸は1種の酸性化剤の単なる
例示である。酢酸は付随する緩衝作用をもつ酢酸ナトリ
ウムの使用を可能とするが、他の酸類、塩基類および緩
衝剤類の他のpH調節系は当業者にとって明らかであろ
う。上の手順により、本発明の精製法のための原料の多
糖懸濁液が調製される。
のよな肺炎球菌の生長の適する条件下で生長させて静止
相に到達させる。次いでバクテリアを適当な溶解剤(l
ysant)、ここではナトリウムデオキシコレートの
10%の滅菌濾過した溶液の添加により溶解する。他の
洗剤のような多くの溶解法および音波の破裂のような機
械的方法およびフランス(F r e n c h)圧
力細胞を使用することができる。すべては本発明の方法
において完全に同等の材料を生成するであろう。ナトリ
ウムデオキシコレートを使用するとき、適当な溶解濃度
は約(ml−0,2%であることがわかった。すべての
バクテリア細胞を溶解して、細胞に関連する多糖を培地
中に解放する。濁った培地を遠心により清浄にする。こ
こで、16f11シヤープレス(S h a r p
l e s)遠心機を16.00Orpmおよび36〜
40M/時の流速で使用すると同時に約2〜lO°Cの
温度を維持した。このようにして集められた細胞の破片
(debris)を廃棄する。多糖を含む上澄みをpH
約6.6に調節する。これらの実施例において、PHの
調節は通常8モルの酢酸の添加により達成された。予備
工程において表示された精確なpH値は一般的なもので
あり、好ましいモードを指示するだけであることに注意
すべきである。有用なPH範囲は、すべての炎球菌型と
ともに広く変動することを理解すべきである。セタブロ
ンを利用する沈殿工程のみは、高度に特定のPHの観測
を必要とする。同様に、酢酸は1種の酸性化剤の単なる
例示である。酢酸は付随する緩衝作用をもつ酢酸ナトリ
ウムの使用を可能とするが、他の酸類、塩基類および緩
衝剤類の他のpH調節系は当業者にとって明らかであろ
う。上の手順により、本発明の精製法のための原料の多
糖懸濁液が調製される。
原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。PHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールをO,tS〜0.5容
量、好ましくは0゜25容量で、2〜6℃の温度におい
てかきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に
、好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で
調節する。多糖の沈殿はゆっくり形成し、この混合物を
一夜約16〜20時間静置し、そして遠心する。肺゛炎
球菌多糖類は不安定化する傾向があり、それらは低温に
おいて取扱われ、こうして16〜20時間の期間の間、
多糖の沈殿を冷時に、ここでは約4℃に保持すべきであ
る。多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約
100文の、4%の酢酸ナトリウム溶液中に溶解し、低
温、約4℃は好ましい、ブレンダー内の短時間の機械的
かきまぜ(4〜6秒)はこの溶解を促進する。濁りが存
在するとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約16
〜18JL/時の流速において、濾過または遠心により
清浄化することができる。
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。PHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールをO,tS〜0.5容
量、好ましくは0゜25容量で、2〜6℃の温度におい
てかきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に
、好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で
調節する。多糖の沈殿はゆっくり形成し、この混合物を
一夜約16〜20時間静置し、そして遠心する。肺゛炎
球菌多糖類は不安定化する傾向があり、それらは低温に
おいて取扱われ、こうして16〜20時間の期間の間、
多糖の沈殿を冷時に、ここでは約4℃に保持すべきであ
る。多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約
100文の、4%の酢酸ナトリウム溶液中に溶解し、低
温、約4℃は好ましい、ブレンダー内の短時間の機械的
かきまぜ(4〜6秒)はこの溶解を促進する。濁りが存
在するとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約16
〜18JL/時の流速において、濾過または遠心により
清浄化することができる。
(B)第11」≦し二配沈尉
これは第1アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し1.好ましいモードにおいて±0.1に達成す
る。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そし
てPHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のよう
に好ましい。
成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し1.好ましいモードにおいて±0.1に達成す
る。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そし
てPHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のよう
に好ましい。
約0.25〜0.6容量、好ましい実施態様にお (い
て0.4容量のアルコールを添加し、pH7に調節し、
第1アルコール沈殿において前述のように処理し、かき
まぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾過
または遠心により清浄化する。このように除去された多
糖沈殿を50文の水中に再溶解し、そして水を凍結乾燥
により除去する。乾燥粉末を2001の水中に再溶解し
、遠心して濁りを除去する。CPX IOcおよびCP
X 70Cパツド(AMF CUNO)tたは同等物を
装填したナイアグラ(Niagra)フィルタープレス
を使用して、上澄みを濾過する。部分的に精製された多
糖上澄み流体流体をPH約6.6に、好ましいモードに
おいて±0゜1に調節する。多糖を完全に沈殿させるた
めに、酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そ
してpHを第1アルコール沈殿において記載したように
約6.7に、好ましいモードにおいて±0.1に調節し
、そして約0.1〜0.5容量のアルコールを好ましい
実施態様において0.5容量の最終最小濃度に添加し、
そしてpHを7に調節する0次いで、静置し、第1アル
コール沈殿におけるように、沈殿し、遠心し、再び約2
00文の冷ピロゲン不合水中に、好ましい実施態様にお
いて約4℃において再溶解する。
て0.4容量のアルコールを添加し、pH7に調節し、
第1アルコール沈殿において前述のように処理し、かき
まぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾過
または遠心により清浄化する。このように除去された多
糖沈殿を50文の水中に再溶解し、そして水を凍結乾燥
により除去する。乾燥粉末を2001の水中に再溶解し
、遠心して濁りを除去する。CPX IOcおよびCP
X 70Cパツド(AMF CUNO)tたは同等物を
装填したナイアグラ(Niagra)フィルタープレス
を使用して、上澄みを濾過する。部分的に精製された多
糖上澄み流体流体をPH約6.6に、好ましいモードに
おいて±0゜1に調節する。多糖を完全に沈殿させるた
めに、酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そ
してpHを第1アルコール沈殿において記載したように
約6.7に、好ましいモードにおいて±0.1に調節し
、そして約0.1〜0.5容量のアルコールを好ましい
実施態様において0.5容量の最終最小濃度に添加し、
そしてpHを7に調節する0次いで、静置し、第1アル
コール沈殿におけるように、沈殿し、遠心し、再び約2
00文の冷ピロゲン不合水中に、好ましい実施態様にお
いて約4℃において再溶解する。
次いで多糖溶液を室温(21〜25℃)に加温し、そし
てpHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。
てpHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。
かきまぜながら、セタブロンの10%の溶液を0.1〜
0,5容量%:好ましくは0.3容量%にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約90分間、静置し
、この混合物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心に
より除去する。6〜8文/時の流速および7〜14°C
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、3型肺炎
球菌多糖は多少の不純物とともにセタズロンによす沈殿
する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、ここ
で6〜7文/時の流速および7〜12℃の温度を使用す
る。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の
不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順は、ア
ルコール沈殿後に残留する核酸およびタンパク質不純物
の大部分を除去する。
0,5容量%:好ましくは0.3容量%にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約90分間、静置し
、この混合物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心に
より除去する。6〜8文/時の流速および7〜14°C
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、3型肺炎
球菌多糖は多少の不純物とともにセタズロンによす沈殿
する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、ここ
で6〜7文/時の流速および7〜12℃の温度を使用す
る。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の
不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順は、ア
ルコール沈殿後に残留する核酸およびタンパク質不純物
の大部分を除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをPH約6゜6に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
pHを約6.7に上昇させ、約0.50容量のアルコー
ルを添加し、そしてPHを7に約4℃において16〜2
0時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合
水中に再溶解し、約40文は適当である。この手順をさ
らに2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブ
ロンを除去し、最後の沈殿を約201の水中に再溶解す
る。
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
pHを約6.7に上昇させ、約0.50容量のアルコー
ルを添加し、そしてPHを7に約4℃において16〜2
0時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合
水中に再溶解し、約40文は適当である。この手順をさ
らに2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブ
ロンを除去し、最後の沈殿を約201の水中に再溶解す
る。
この明細書を通じて、セタブロンの濃度は10%の溶液
に基づく%の値で表わす。セタブロン溶液の濃度の変更
は、同等の最終濃度に到達させるために添加するこのよ
うな溶液の量を相応して変更することを理解すべきであ
る。
に基づく%の値で表わす。セタブロン溶液の濃度の変更
は、同等の最終濃度に到達させるために添加するこのよ
うな溶液の量を相応して変更することを理解すべきであ
る。
(D) 面庄皮り精1
次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約6.1に
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、3〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4°Cに約30分間冷却静置する。この
混合物を濾過して活性炭を除去し、さらにl系列の遠心
機および/または膜フィルターに通過させることにより
清浄化する。好ましい実施態様において、cpx−1Q
C(AMF−CUNO)フィルターを使用し1次いで1
.2.0.65.0.45および0.22uミリポア(
Millipore)膜を使用する。この手順の間、2
60 m uにおける光学濃度を核酸濃度についての対
照標準として使用することができ、そしてLowry、
etal、の方法を使用してタンパク質含量を監視する
ことができる。
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、3〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4°Cに約30分間冷却静置する。この
混合物を濾過して活性炭を除去し、さらにl系列の遠心
機および/または膜フィルターに通過させることにより
清浄化する。好ましい実施態様において、cpx−1Q
C(AMF−CUNO)フィルターを使用し1次いで1
.2.0.65.0.45および0.22uミリポア(
Millipore)膜を使用する。この手順の間、2
60 m uにおける光学濃度を核酸濃度についての対
照標準として使用することができ、そしてLowry、
etal、の方法を使用してタンパク質含量を監視する
ことができる。
得られた濾液を、室温、はぼ21〜25℃に加温した後
、透析する。ここで、10,000の分子酸のカットオ
フ(cut off)の中空繊維のカートリッジを含有
するDC30型アミコン(Amicon)装置を使用し
、すべての残留す゛ る塩化ナトリウムを除去した。次
いで、透析濾過液(diafiltrate)を急速凍
結し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末
。
、透析する。ここで、10,000の分子酸のカットオ
フ(cut off)の中空繊維のカートリッジを含有
するDC30型アミコン(Amicon)装置を使用し
、すべての残留す゛ る塩化ナトリウムを除去した。次
いで、透析濾過液(diafiltrate)を急速凍
結し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末
。
ここで3型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん
中に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−
20℃以下が適当であることがわかった。
中に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−
20℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の99%よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
明細書を通じて、活性炭の濃度は20%の活性炭懸濁液
に基づく容量%で表わす。このような懸濁液の濃度の変
更は、同等の最終濃度に到達させるために必要とするこ
のような懸濁液の量に相応して変更することを理解すべ
きである。
に基づく容量%で表わす。このような懸濁液の濃度の変
更は、同等の最終濃度に到達させるために必要とするこ
のような懸濁液の量に相応して変更することを理解すべ
きである。
原料の多糖は、3型について実施例1に記載した方法に
おけるようにして、5型発酵肉汁のリゼイトから調製す
る。
おけるようにして、5型発酵肉汁のリゼイトから調製す
る。
原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。pHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.25〜0.8容
量、好ましくは0゜5容量で、2〜6℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に、
好ましいモードにおいて、±o、lに8モルの酢酸で調
節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約1
6〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われる
。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を冷
時に、ここでは約4℃に保持すべきである。前述の分別
の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿
工程の標準である。上の方法の他の型についての変動は
、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順
序に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿
した汚染物質は、遠心により、約16〜20文/時の波
速および低温、好ましくは約2〜約6°Cの温度におい
て均一 に排除されるであろう。
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。pHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.25〜0.8容
量、好ましくは0゜5容量で、2〜6℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に、
好ましいモードにおいて、±o、lに8モルの酢酸で調
節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約1
6〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われる
。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を冷
時に、ここでは約4℃に保持すべきである。前述の分別
の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿
工程の標準である。上の方法の他の型についての変動は
、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順
序に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿
した汚染物質は、遠心により、約16〜20文/時の波
速および低温、好ましくは約2〜約6°Cの温度におい
て均一 に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、PH約6
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6.7に調節する。5
型について、アルコールを最小的0.9〜1.4容量に
添加し、そしてPHを7に調節する。5型では、好まし
い最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約1.
25容量を超えなくてはならない。
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6.7に調節する。5
型について、アルコールを最小的0.9〜1.4容量に
添加し、そしてPHを7に調節する。5型では、好まし
い最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約1.
25容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第1アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約40
文の水中に溶解し、低温、約4℃は好ましい。濁りが存
在するとき、この溶液を低温、約2〜6℃において、濾
過または遠心により清浄化することができる。
文の水中に溶解し、低温、約4℃は好ましい。濁りが存
在するとき、この溶液を低温、約2〜6℃において、濾
過または遠心により清浄化することができる。
(B) 2)■アルコール
これは第1アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおtz%−1(f:°°”
[m*t6・##+ ) !J−2”14 1%の最終
濃度に添加し、そしてPHを約6.7に調節し、そして
±0.1は上のように好ましい。
成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおtz%−1(f:°°”
[m*t6・##+ ) !J−2”14 1%の最終
濃度に添加し、そしてPHを約6.7に調節し、そして
±0.1は上のように好ましい。
約0.25〜0.80容量、好ましい実施態様において
0.5容量のアルコールを添加し、pH7に調節し、第
1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、か
きまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾
過または遠心により清節化する。このように除去された
沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6.
6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。多
糖な完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約4%
の最終濃度に添加し、そしてpHを第1分別アルコール
沈殿において記載したように約6.7に、好ましいモー
ドにおいて±0.1に調節する。約0.9〜1.4容量
のアルコールを好ましい実施態様において1.25容量
の最終最小濃度に添加し、そしてpHを7に調節する。
0.5容量のアルコールを添加し、pH7に調節し、第
1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、か
きまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾
過または遠心により清節化する。このように除去された
沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6.
6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。多
糖な完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約4%
の最終濃度に添加し、そしてpHを第1分別アルコール
沈殿において記載したように約6.7に、好ましいモー
ドにおいて±0.1に調節する。約0.9〜1.4容量
のアルコールを好ましい実施態様において1.25容量
の最終最小濃度に添加し、そしてpHを7に調節する。
次いで、静置し、第1分別アルコール沈殿におけるよう
に、沈殿し、遠心し、再び約40文の冷ピロゲン不合水
中に、好ましい実施態様において約4℃において再溶解
する。
に、沈殿し、遠心し、再び約40文の冷ピロゲン不合水
中に、好ましい実施態様において約4℃において再溶解
する。
(C) 、ヒヘキサデシルトリメチルアンモ二次いで多
糖溶液を室温(21〜25℃)に加温し、モしてpHを
約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節する。0
.4%の炭醸ナトリウムt:r4度は、この調節溶液に
便利であることがわかった。
糖溶液を室温(21〜25℃)に加温し、モしてpHを
約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節する。0
.4%の炭醸ナトリウムt:r4度は、この調節溶液に
便利であることがわかった。
かきまぜながら、セタブロンの10%の溶液をt、o〜
5.0容量%、好ましくは2.00容量%にゆっくり添
力Uする。沈殿が形成するまで、ここで約90分間、静
置し、この混合物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠
心により除去する。6〜8文/時の流速および7〜14
°Cの温度を好ましい実施態様において使用するが、こ
れらの範囲は一般的である。この手順を用いると、5型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、
ここで6〜7見/時の流速および7〜12℃の温度を使
用する。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および
他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順は
、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質不
純物の大部分を除去する。
5.0容量%、好ましくは2.00容量%にゆっくり添
力Uする。沈殿が形成するまで、ここで約90分間、静
置し、この混合物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠
心により除去する。6〜8文/時の流速および7〜14
°Cの温度を好ましい実施態様において使用するが、こ
れらの範囲は一般的である。この手順を用いると、5型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、
ここで6〜7見/時の流速および7〜12℃の温度を使
用する。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および
他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順は
、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質不
純物の大部分を除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをpH約6゜6に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
pHを約667に上昇させ、約1.25容量のアルコー
ルを添加し、そしてpHを7に約4℃において16〜2
0時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合
水中に再溶解し、約40Jlは適当である。この手順を
さらに2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタ
ブロンを除去し、最後の沈殿を約20文の水中に再溶解
する。
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
pHを約667に上昇させ、約1.25容量のアルコー
ルを添加し、そしてpHを7に約4℃において16〜2
0時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合
水中に再溶解し、約40Jlは適当である。この手順を
さらに2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタ
ブロンを除去し、最後の沈殿を約20文の水中に再溶解
する。
(D) 面比炭辺趙1
次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約6.1に
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにl系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、CPX−10c(AMF
−CUNO)フィルターを使用し、次いテl 、 2.
0.65.0.45および0.22uミリボア(Mi
l l i p o r e) (293mm)膜を使
用する。この手順の間、260muにおける光学濃度を
核酸濃度についての対照標準として使用することができ
、そしてLowry 、e tal、の方法を使用して
タンパク質含量を監視することができる。
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにl系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、CPX−10c(AMF
−CUNO)フィルターを使用し、次いテl 、 2.
0.65.0.45および0.22uミリボア(Mi
l l i p o r e) (293mm)膜を使
用する。この手順の間、260muにおける光学濃度を
核酸濃度についての対照標準として使用することができ
、そしてLowry 、e tal、の方法を使用して
タンパク質含量を監視することができる。
得られた濾液な、室温、はぼ21〜25℃に加温した後
、透析濾過(diafiltrati。
、透析濾過(diafiltrati。
n)する、ここで、10,000の分子量のカットオフ
の中空繊維のカートリッジを含有するDC30型アミコ
ン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリウムを除
去した0次いで、透析濾過液を急速凍結し、そして凍結
乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで5型、が
残る。この粉末を低い湿度においてびん中に収穫し、次
いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−20℃以下が適
当であることがわかった。
の中空繊維のカートリッジを含有するDC30型アミコ
ン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリウムを除
去した0次いで、透析濾過液を急速凍結し、そして凍結
乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで5型、が
残る。この粉末を低い湿度においてびん中に収穫し、次
いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−20℃以下が適
当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質の90%より多くおよ
び汚染物質の核酸の99%より多くを除去すると同時に
、生成物の免疫原性を保持した。
び汚染物質の核酸の99%より多くを除去すると同時に
、生成物の免疫原性を保持した。
原料の多糖は、3型について実施例1に記載した方法に
おけるようにして、9■型発酵肉汁のリゼイトから調製
する。
おけるようにして、9■型発酵肉汁のリゼイトから調製
する。
原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。pHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.25〜0.8容
量、好ましくは0゜5容量で、2〜6℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に、
好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で調
節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約1
6〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われる
。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を冷
時に、ここでは約4℃に保持すべきである。前述の分別
の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿
工程の標準である。上の方法の他の型についての変動は
、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順
序に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿
した汚染物質は、遠心により、約16〜20又/時の流
速および低温、好ましくは約2〜約6℃の温度において
均一に排除されるであろ部分的に精製された多糖を含有
する上澄みは、pH約6.6に上のように調節し、次の
工程のアルコールを添加するときの最終体積に対して4
%の最終濃度に酢酸ナトリウムを添加し、次いでpHを
約6.7に調節する。9■型について、アルコールを最
小的1.25〜2.25容量に添加し、そしてpHを7
に調節する。9■型では、好ましい最終アルコール濃度
は合計の多糖沈殿について約1.75容量を超えなくて
はならない。
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。pHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.25〜0.8容
量、好ましくは0゜5容量で、2〜6℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に、
好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で調
節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約1
6〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われる
。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を冷
時に、ここでは約4℃に保持すべきである。前述の分別
の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿
工程の標準である。上の方法の他の型についての変動は
、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順
序に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿
した汚染物質は、遠心により、約16〜20又/時の流
速および低温、好ましくは約2〜約6℃の温度において
均一に排除されるであろ部分的に精製された多糖を含有
する上澄みは、pH約6.6に上のように調節し、次の
工程のアルコールを添加するときの最終体積に対して4
%の最終濃度に酢酸ナトリウムを添加し、次いでpHを
約6.7に調節する。9■型について、アルコールを最
小的1.25〜2.25容量に添加し、そしてpHを7
に調節する。9■型では、好ましい最終アルコール濃度
は合計の多糖沈殿について約1.75容量を超えなくて
はならない。
次いで、混合物を、第1アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約40
文の水中に溶解し、低温、約4℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温4約2〜6℃および約6〜7
fl/時において、濾過または遠心により清浄化するこ
とができる。
文の水中に溶解し、低温、約4℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温4約2〜6℃および約6〜7
fl/時において、濾過または遠心により清浄化するこ
とができる。
(B) −J2 lアルコール
これは第1アルコール分別沈殿におけるように、−ヒで
形成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢
酸で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成す
る。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、モし
てpHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のよう
に好ましい。
形成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢
酸で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成す
る。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、モし
てpHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のよう
に好ましい。
約0.15〜0.35容量、好ましい実施態様において
0.25容量のアルコールを添加し、PH7に調節し、
第1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、PHを調節し、静置し、モして
直通または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6
.6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。
0.25容量のアルコールを添加し、PH7に調節し、
第1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、PHを調節し、静置し、モして
直通または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6
.6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。
多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約4
%の最終濃度に添加し、そしてPHをtj4i分 11 別アルコール沈殿において記載したように約6゜7に、
好ましいモードにおいて±0.1に調節する。約1.2
5〜2.25容量のアルコールを好ましい実施態様にお
いて1.75容量の最終最小濃度に添加し、そしてpH
を7に調節する・次いで、静置し、第1分別アルコール
沈殿におけるように、沈殿し、遠心し、再び約40文の
冷ビロゲン不合水中に、好ましい実施態様において約4
℃において再溶解する。
%の最終濃度に添加し、そしてPHをtj4i分 11 別アルコール沈殿において記載したように約6゜7に、
好ましいモードにおいて±0.1に調節する。約1.2
5〜2.25容量のアルコールを好ましい実施態様にお
いて1.75容量の最終最小濃度に添加し、そしてpH
を7に調節する・次いで、静置し、第1分別アルコール
沈殿におけるように、沈殿し、遠心し、再び約40文の
冷ビロゲン不合水中に、好ましい実施態様において約4
℃において再溶解する。
次いで多糖溶液を室温(21〜25℃)に加温し、そし
てpHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。
てpHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。
塩化ナトリウムを0.15モルに添加し、かきまぜなが
ら、セタブロンの10%の溶液を0.05〜1.0容量
%、好ましくは0.2容量%にゆっくり添加する。沈殿
が形成するまで、ここで約90分間、静置し、この混合
物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除去す
る。6〜8交/時の流速および7〜14℃の温度を好ま
しい実施態様において使用するが、これらの範囲は一般
的である。この手順を用いると、9v型肺炎球菌多糖は
セタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。多糖は
ここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純物を廃
棄可能な遠心沈降物である。この手順は、アルコール分
別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大部分を
除去する。
ら、セタブロンの10%の溶液を0.05〜1.0容量
%、好ましくは0.2容量%にゆっくり添加する。沈殿
が形成するまで、ここで約90分間、静置し、この混合
物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除去す
る。6〜8交/時の流速および7〜14℃の温度を好ま
しい実施態様において使用するが、これらの範囲は一般
的である。この手順を用いると、9v型肺炎球菌多糖は
セタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。多糖は
ここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純物を廃
棄可能な遠心沈降物である。この手順は、アルコール分
別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大部分を
除去する。
次いで多糖を含有する上澄みを再沈殿させ、上澄みをp
H約6.6に調節し、そして酢酸ナトリウムを約4%に
添加する。次いでpHを約6.7に上昇させ、約1.7
5容量のアルコールを添加し、そしてpHを7に約4℃
において16〜20時間調節し、多糖を再び遠心し、多
糖をピロゲン不合水中に再溶解し、約40文は適当であ
る。この手順をさらに2回反復して多糖をさらに精製し
、痕跡量のセタブロンを除去し、最後の沈殿を約201
の水中に再溶解する。
H約6.6に調節し、そして酢酸ナトリウムを約4%に
添加する。次いでpHを約6.7に上昇させ、約1.7
5容量のアルコールを添加し、そしてpHを7に約4℃
において16〜20時間調節し、多糖を再び遠心し、多
糖をピロゲン不合水中に再溶解し、約40文は適当であ
る。この手順をさらに2回反復して多糖をさらに精製し
、痕跡量のセタブロンを除去し、最後の沈殿を約201
の水中に再溶解する。
(D) 危比皮辺趙1
次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約6.1に
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4°Cに約30分間冷却静置する。この
混合物を濾過して活性炭を除去し、さらに1系列のフィ
ルターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化す
る。好ましい実施態様において、CPX−10C(AM
F−CUNO)フィルターを使用し、次いで1.2.0
.65.0.45および0.22uミリポア(293m
m)膜を使用する。この手順の間、260 m uにお
ける光学濃度を核酸濃度についての対照標準として使用
することができ、そしてLowry、et al、(7
)方法を使用してタンパク質含量を監視することができ
る。
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4°Cに約30分間冷却静置する。この
混合物を濾過して活性炭を除去し、さらに1系列のフィ
ルターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化す
る。好ましい実施態様において、CPX−10C(AM
F−CUNO)フィルターを使用し、次いで1.2.0
.65.0.45および0.22uミリポア(293m
m)膜を使用する。この手順の間、260 m uにお
ける光学濃度を核酸濃度についての対照標準として使用
することができ、そしてLowry、et al、(7
)方法を使用してタンパク質含量を監視することができ
る。
得られた濾液を、室温、はぼ21〜25℃に加温した後
、透析濾過する。ここで、io、oo。
、透析濾過する。ここで、io、oo。
の分子量のカットオフの中空繊維のカートリッジを含有
するDC30型アミコン装置を使用し、すべての残留す
る塩化ナトリウムを除去した。次いで、透析濾過液を急
速凍結し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖
粉末、ここで9■型、が残る。この粉末を低い湿度にお
いてびん中に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵
するわ一20℃以下が適当であることがわかった。
するDC30型アミコン装置を使用し、すべての残留す
る塩化ナトリウムを除去した。次いで、透析濾過液を急
速凍結し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖
粉末、ここで9■型、が残る。この粉末を低い湿度にお
いてびん中に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵
するわ一20℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の99%よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
原料の多糖は、3型について実施例1に記載した方法に
おけるようにして、IOA型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、IOA型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
の゛ :lOAノ
(A)、1)1アルコール
原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。pHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.25〜0.8容
量、好ましくは0゜5容量で、2〜6℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。PHを約7.0に、
好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で調
節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約1
6〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われる
。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を冷
時に、ここでは約4℃に保持すべきである。前述の分別
の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿
工程の標準である。上の方法の他の型についての変動は
、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順
序に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿
した汚染物質は、遠心により、約16〜20立/時の流
速および低温、好ましくは約2〜約6℃の温度において
均一に排除されるであろう。
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。pHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.25〜0.8容
量、好ましくは0゜5容量で、2〜6℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。PHを約7.0に、
好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で調
節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約1
6〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われる
。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を冷
時に、ここでは約4℃に保持すべきである。前述の分別
の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿
工程の標準である。上の方法の他の型についての変動は
、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順
序に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿
した汚染物質は、遠心により、約16〜20立/時の流
速および低温、好ましくは約2〜約6℃の温度において
均一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約6
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6.7に調節する。I
OA型について、アルコールを最小的1.0〜1.5容
量に添加し、そしてpHを7に調節する。IOA型では
、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につい
て約1.50容量を超えなくてはならない。
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6.7に調節する。I
OA型について、アルコールを最小的1.0〜1.5容
量に添加し、そしてpHを7に調節する。IOA型では
、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につい
て約1.50容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第1アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常的40
5Lの水中に溶解し、低温、約4℃は好ましい。濁りが
見えるとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約6〜
7交/時において、濾過または遠心により清浄化するこ
とができる。
5Lの水中に溶解し、低温、約4℃は好ましい。濁りが
見えるとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約6〜
7交/時において、濾過または遠心により清浄化するこ
とができる。
(B) J2 1アルコール゛
これは第1アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成する
。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そして
PHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のように
好ましい。
成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成する
。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そして
PHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のように
好ましい。
約0,25〜0.8容量、好ましい実施態様において0
.5容量のアルコールを添加し、PH7に調節し、第1
分別アルコール沈殿において前述のように処理し、かき
まぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾過
または遠心により清浄化する。このように除去された沈
殿1部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6.6
に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。多糖
を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約4%の
最終濃度に添加し、そしてpHを第1分別アルコール沈
殿において記載したように約6.7に、好ましいモード
において±0.1に調節する。約1.0〜2.0容量の
アルコールを好ましい実施態様において1.5容量の最
終最小濃度に添加し、そしてpHを7に調節する。次い
で、静置し、第1分別アルコール沈殿におけるように、
沈殿し、遠心し、再び約40文の冷ビロゲン不合水中に
、好ましい実施態様において約4℃において再溶解する
。
.5容量のアルコールを添加し、PH7に調節し、第1
分別アルコール沈殿において前述のように処理し、かき
まぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾過
または遠心により清浄化する。このように除去された沈
殿1部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6.6
に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。多糖
を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約4%の
最終濃度に添加し、そしてpHを第1分別アルコール沈
殿において記載したように約6.7に、好ましいモード
において±0.1に調節する。約1.0〜2.0容量の
アルコールを好ましい実施態様において1.5容量の最
終最小濃度に添加し、そしてpHを7に調節する。次い
で、静置し、第1分別アルコール沈殿におけるように、
沈殿し、遠心し、再び約40文の冷ビロゲン不合水中に
、好ましい実施態様において約4℃において再溶解する
。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをPH約6゜6に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に松属する。次いで
pHを約6.7に1昇させ、約1.5容量のアルコール
を添加し、そしてpHを7に約4℃において16〜20
時間調節し、多糖を再び遠心し・多糖をピ0ゲ′不含水
中1再溶解 jし、約20又は適当である。
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に松属する。次いで
pHを約6.7に1昇させ、約1.5容量のアルコール
を添加し、そしてpHを7に約4℃において16〜20
時間調節し、多糖を再び遠心し・多糖をピ0ゲ′不含水
中1再溶解 jし、約20又は適当である。
(C) 固性炭五趙1
次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約6.1に
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらに1系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、CPX−10C(AMF
−CUNO)フィルターを使用し、次いで1.2.0.
65.0.45および0.22uミリボア(293mm
)膜を使用する。この手順の間、260muにおける光
学濃度を核酸濃度についての対照標準として使用するこ
とができ、そしてLowry、et al、(7)方法
を使用してタンパク質含量を監視することができる。
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらに1系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、CPX−10C(AMF
−CUNO)フィルターを使用し、次いで1.2.0.
65.0.45および0.22uミリボア(293mm
)膜を使用する。この手順の間、260muにおける光
学濃度を核酸濃度についての対照標準として使用するこ
とができ、そしてLowry、et al、(7)方法
を使用してタンパク質含量を監視することができる。
得られた濾液を、室温、はぼ21〜25℃に加温した後
、透析濾過する。ここで、10,000の分子量のカー
/ )オフの中空繊維のカートリッジを含有するDC3
0型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナト
リウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、
そして凍結乾燥して精製された舖炎球菌多糖粉末、ここ
でIOA型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん
中に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−
20℃以下が適当であることがわかった。
、透析濾過する。ここで、10,000の分子量のカー
/ )オフの中空繊維のカートリッジを含有するDC3
0型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナト
リウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、
そして凍結乾燥して精製された舖炎球菌多糖粉末、ここ
でIOA型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん
中に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−
20℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質の99%より多くおよ
び汚染物質の核酸の90%より多くを除去すると同時に
、生成物の免疫原性を保持した。
び汚染物質の核酸の90%より多くを除去すると同時に
、生成物の免疫原性を保持した。
原料の多糖は、3型について実施例1に記載した方法に
おけるようにして、11A型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、11A型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
の J
(A) l 1アルコール
原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。PHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.75〜1.25
容量、好ましくは1.0容量で、2〜6℃の温度におい
てかきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に
、好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で
調節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約
16〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化す
る傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われ
る。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を
冷時に、ここでは約4℃に保持すべきである。前述の分
別の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈
殿工程の標準である。上の方法の他の型についての変動
は、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の
順序に主として依存するが、それらに限定されない。沈
殿した汚染物質は、遠心により、約16〜20又/時の
流速および低温、好ましくは約2〜約6℃の温度におい
て均一に排除されるであろう。
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。PHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.75〜1.25
容量、好ましくは1.0容量で、2〜6℃の温度におい
てかきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に
、好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で
調節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約
16〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化す
る傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われ
る。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を
冷時に、ここでは約4℃に保持すべきである。前述の分
別の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈
殿工程の標準である。上の方法の他の型についての変動
は、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の
順序に主として依存するが、それらに限定されない。沈
殿した汚染物質は、遠心により、約16〜20又/時の
流速および低温、好ましくは約2〜約6℃の温度におい
て均一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約6
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6.7に調節する。I
IA型について、アルコールを最小的1.5〜2.25
容量に添加し、そしてpHを7に調節する。IIA型で
は、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につ
いて約2.0容量を超えなくてはならない。
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6.7に調節する。I
IA型について、アルコールを最小的1.5〜2.25
容量に添加し、そしてpHを7に調節する。IIA型で
は、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につ
いて約2.0容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第1アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約40
文の水中に溶解し。
文の水中に溶解し。
低温、約4℃は好ましい、濁りが見えるとき、この溶液
を低温、約2〜6℃および約6〜7立/時において、濾
過または遠心により清浄化することができる。
を低温、約2〜6℃および約6〜7立/時において、濾
過または遠心により清浄化することができる。
(B)lノ 1アルコール
これは第1アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、PH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成する
。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そして
pHを約6.7に調節し、そして±O6lは上のように
好ましい。
成した多糖含有上澄みを、PH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成する
。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そして
pHを約6.7に調節し、そして±O6lは上のように
好ましい。
約0.75〜1.25容量、好ましい実施態様において
1.00容量のアルコールを添加し、PH7に調節し、
第1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、PHを調節し、静置し、そして
濾過または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6
.6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。
1.00容量のアルコールを添加し、PH7に調節し、
第1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、PHを調節し、静置し、そして
濾過または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6
.6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。
多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約4
%の最終濃度に添加し、そしてPHを第1分別アルコー
ル沈殿において記載したように約6゜7に、好ましいモ
ードにおいて±0.1に調節する。約1.50〜2.2
5容量のアルコールを好ましい実施態様において2.0
0容量の最終最小濃度に添加し、そしてPHを7に調節
する。次いで、静置し、第1分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約40文の冷ピロゲン
不合水中に、好ましい実施態様において約4℃において
再溶解する。
%の最終濃度に添加し、そしてPHを第1分別アルコー
ル沈殿において記載したように約6゜7に、好ましいモ
ードにおいて±0.1に調節する。約1.50〜2.2
5容量のアルコールを好ましい実施態様において2.0
0容量の最終最小濃度に添加し、そしてPHを7に調節
する。次いで、静置し、第1分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約40文の冷ピロゲン
不合水中に、好ましい実施態様において約4℃において
再溶解する。
次いで多糖溶液を室温(21〜25℃)に加温し、そし
てPHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。
てPHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。
かきまぜながら、セタブロンの10%の溶液を1.5〜
5.0容星%、好ましくは3.0容量%にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約90分間、静置し
、この混合物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心に
より除去する。6〜89.7時の流速および7〜14℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、IIA型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。沈殿を401の約0.25モルの塩化ナトリ
ウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約4°Cに
、冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し
、ここで約6〜7!l/時の流速および7〜12℃の温
度を用いる6多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸お
よび他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手
順は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク
質不純物の大部分を除去する。
5.0容星%、好ましくは3.0容量%にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約90分間、静置し
、この混合物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心に
より除去する。6〜89.7時の流速および7〜14℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、IIA型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。沈殿を401の約0.25モルの塩化ナトリ
ウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約4°Cに
、冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し
、ここで約6〜7!l/時の流速および7〜12℃の温
度を用いる6多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸お
よび他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手
順は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク
質不純物の大部分を除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをpH約6゜6に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
PHを約6.7に上昇させ、約2容量のアルコールを添
加し、モしてpHを7に約4°Cにおいて16〜20時
間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合水中
に再溶解し、約409、は適当である。この手順をさら
に2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロ
ンを除去し、最後の沈殿を約20文の水中に再溶解する
。
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
PHを約6.7に上昇させ、約2容量のアルコールを添
加し、モしてpHを7に約4°Cにおいて16〜20時
間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合水中
に再溶解し、約409、は適当である。この手順をさら
に2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロ
ンを除去し、最後の沈殿を約20文の水中に再溶解する
。
CD) 固咀炭五精1
次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約6.1に
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらに1系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化す6
□。い¥1や43おいア、。1゜−0゜。 ]・(AM
F−CUNO)フィルターを使用し、次いテl 、 2
.0.65.0.45および0−22uミリポア(29
3mm)膜を使用する。この手順の間、260muにお
ける光学濃度を核酸濃度についての対照標準として使用
することができ、そしてLowry、et at、の方
法を使用してタンパク質含量を監視することができる。
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらに1系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化す6
□。い¥1や43おいア、。1゜−0゜。 ]・(AM
F−CUNO)フィルターを使用し、次いテl 、 2
.0.65.0.45および0−22uミリポア(29
3mm)膜を使用する。この手順の間、260muにお
ける光学濃度を核酸濃度についての対照標準として使用
することができ、そしてLowry、et at、の方
法を使用してタンパク質含量を監視することができる。
得られた濾液を、室温、はぼ21〜25°Cに加温した
後、透析濾過する。ここで、to、oo。
後、透析濾過する。ここで、to、oo。
の分子量のカットオフの中空繊維のカートリッジを含有
するDC30型アミコン装置を使用し、すべての残留す
る塩化ナトリウムを除去した。次いで、透析濾過液を急
速凍結し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖
粉末、ここでIIA型、が残る。この粉末を低い湿度に
おいてびん中に収穫し、次いでこれを密封し、冷詩に貯
蔵する。−20℃以下が適当であることがわかった。
するDC30型アミコン装置を使用し、すべての残留す
る塩化ナトリウムを除去した。次いで、透析濾過液を急
速凍結し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖
粉末、ここでIIA型、が残る。この粉末を低い湿度に
おいてびん中に収穫し、次いでこれを密封し、冷詩に貯
蔵する。−20℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の99%よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
災墓1J
原料の多糖は、3型について実施例1に記載した方法に
おけるようにして、15B型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、15B型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。pHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.4〜1.0容量
、好ましくは0.75容量で、2〜6℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に、
好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で調
節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約1
6〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われる
。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を冷
時に、ここでは約4℃に保持すべきである。前述の分別
の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿
工程の標準である。上の方法の他の型についての変動は
、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順
序に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿
した汚染物質は、遠心により、約16〜20文/時の流
速および低温、好ましくは約2〜約6°Cの温度におい
て均一に排除されるであろう。
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。pHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.4〜1.0容量
、好ましくは0.75容量で、2〜6℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に、
好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で調
節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約1
6〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われる
。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を冷
時に、ここでは約4℃に保持すべきである。前述の分別
の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿
工程の標準である。上の方法の他の型についての変動は
、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順
序に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿
した汚染物質は、遠心により、約16〜20文/時の流
速および低温、好ましくは約2〜約6°Cの温度におい
て均一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約6
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6,7に調節する。1
5B型について、アルコールを最小的1.5〜2.25
容量に添加し、そしてpHを7に調節する。15B型で
は、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につ
いて約1.75容量を超えなくてはならない。
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6,7に調節する。1
5B型について、アルコールを最小的1.5〜2.25
容量に添加し、そしてpHを7に調節する。15B型で
は、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につ
いて約1.75容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第1アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約40
文の水中に溶解し、低温、約4°Cは好ましい。濁りが
見えるとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約6〜
7!l/時において、濾過または遠心により清浄化する
ことができる。
文の水中に溶解し、低温、約4°Cは好ましい。濁りが
見えるとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約6〜
7!l/時において、濾過または遠心により清浄化する
ことができる。
(B) 2/ Iアルコール
これは第lアルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、PH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成する
。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そして
pHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のように
好ましい。
成した多糖含有上澄みを、PH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成する
。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そして
pHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のように
好ましい。
約0.4〜1.0容量、好ましい実施態様において0.
75容量のアルコールを添加し、pH7に調節し、第1
分別アルコール沈殿において前述のように処理し、かき
まぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾過
または遠心により清浄化する。このように除去された沈
殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6.6
に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。多糖
を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約4%の
最終濃度に添加し、そしてPHを第1分別アルコール沈
殿において記載したように約6.7に、好ましいモード
において±0.1に調節する。約1.5〜2.25容量
のアルコールを好ましい実施態様において1.75容量
の最終最小濃度に隋加し、そしてPHを7に調節する。
75容量のアルコールを添加し、pH7に調節し、第1
分別アルコール沈殿において前述のように処理し、かき
まぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾過
または遠心により清浄化する。このように除去された沈
殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6.6
に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。多糖
を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約4%の
最終濃度に添加し、そしてPHを第1分別アルコール沈
殿において記載したように約6.7に、好ましいモード
において±0.1に調節する。約1.5〜2.25容量
のアルコールを好ましい実施態様において1.75容量
の最終最小濃度に隋加し、そしてPHを7に調節する。
次いで、静置し、第1分別アルコール沈殿におけるよう
に、沈殿し、遠心し、再び約40fLの冷ピロゲン不合
水中に、好ましい実施態様において約4℃において再溶
解する。
に、沈殿し、遠心し、再び約40fLの冷ピロゲン不合
水中に、好ましい実施態様において約4℃において再溶
解する。
(C) ヒヘキサーシルトリメ ルアンモニウム セ
ブロン 1 次いで多糖溶液を室温(21〜25°C)に加温し、そ
してpHを約7,4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調
節する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節
溶液に便利であることがわかった。
ブロン 1 次いで多糖溶液を室温(21〜25°C)に加温し、そ
してpHを約7,4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調
節する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節
溶液に便利であることがわかった。
かきまぜながら、セタブロンの10%の溶液を2.0〜
5.0容量%、好ましくは3.0容量%にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約90分間、静置し
、この混合物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心に
より除去する。6〜8文/IF¥=の流速および7〜1
4℃の温度を好ましい実施態様において使用するが、こ
れらの範囲は一般的である。この手順を用いると、15
B型肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンに
より沈殿する。沈殿を40文の約0.25モルの塩化ナ
トリウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約4°
Cに、冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷
却し、ここで約6〜7文/時の流速および7〜12℃の
温度を用いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方接酸
および他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この
手順は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパ
ク質不純物の大部分を除去する。
5.0容量%、好ましくは3.0容量%にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約90分間、静置し
、この混合物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心に
より除去する。6〜8文/IF¥=の流速および7〜1
4℃の温度を好ましい実施態様において使用するが、こ
れらの範囲は一般的である。この手順を用いると、15
B型肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンに
より沈殿する。沈殿を40文の約0.25モルの塩化ナ
トリウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約4°
Cに、冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷
却し、ここで約6〜7文/時の流速および7〜12℃の
温度を用いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方接酸
および他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この
手順は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパ
ク質不純物の大部分を除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをpH約6゜6に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
PHを約6.7に上昇させ、約x、7Flffiのアル
コールを添加し、そしてpHを7に約4℃において16
〜20時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン
不合水中に再溶解し、約40文は適当である。この手順
をさらに2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセ
タブロンを除去し、最後の沈殿を約20文の水中に再溶
解する。濁りが見えるとき、この溶液を低温、約2〜6
℃および約6〜75L/時の流速において濾過または遠
心により清浄することができる。
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
PHを約6.7に上昇させ、約x、7Flffiのアル
コールを添加し、そしてpHを7に約4℃において16
〜20時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン
不合水中に再溶解し、約40文は適当である。この手順
をさらに2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセ
タブロンを除去し、最後の沈殿を約20文の水中に再溶
解する。濁りが見えるとき、この溶液を低温、約2〜6
℃および約6〜75L/時の流速において濾過または遠
心により清浄することができる。
(D) パび
得られた濾液を、室温、はぼ21〜25℃に加温した後
、透析濾過する。ここで、10,000の分子量のカッ
トオフの中空m#Iのカートリッジを含有するDC30
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
15B型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−2
0℃以下が適当であることがわかった。
、透析濾過する。ここで、10,000の分子量のカッ
トオフの中空m#Iのカートリッジを含有するDC30
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
15B型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−2
0℃以下が適当であることがわかった。
hの方法は汚染物質のタンパク賀の98%より多くおよ
び汚染物質の核酸の99%より多くを除去すると同時に
、生成物の免疫原性を保持した。
び汚染物質の核酸の99%より多くを除去すると同時に
、生成物の免疫原性を保持した。
原料の多糖は、3型について実施例1に記載した方法に
おけるようにして、17F型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、17F型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。PHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.25〜0.75
容量、好ましくは0.5容量で、2〜6℃の温度におい
てかきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に
、好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で
調節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約
16〜20時間約4℃において静置する。肺炎球菌多糖
類は不安定化する傾向があり、それらは低温において最
もよく取扱われる。こうして16〜20時間の期間の間
、多糖の沈殿を冷時に、ここでは約4℃に保持すべきで
ある。前述の分別の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけ
るアルコール沈殿工程の標準である。上の方法の他の型
についての変動は、アルコールの容量および特定の型に
使用する工程の順序に主として依存するが、それらに限
定されない。沈殿した汚染物質は、遠心により、約16
〜20文/時の流速および低温、好ましくは約2〜約6
℃の温度において均一に排除されるであろう。
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。PHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.25〜0.75
容量、好ましくは0.5容量で、2〜6℃の温度におい
てかきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に
、好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で
調節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約
16〜20時間約4℃において静置する。肺炎球菌多糖
類は不安定化する傾向があり、それらは低温において最
もよく取扱われる。こうして16〜20時間の期間の間
、多糖の沈殿を冷時に、ここでは約4℃に保持すべきで
ある。前述の分別の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけ
るアルコール沈殿工程の標準である。上の方法の他の型
についての変動は、アルコールの容量および特定の型に
使用する工程の順序に主として依存するが、それらに限
定されない。沈殿した汚染物質は、遠心により、約16
〜20文/時の流速および低温、好ましくは約2〜約6
℃の温度において均一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、PH約6
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでPHを約6.7に調節する。1
7F型について、アルコールを最小的1.0〜1.5容
量に添加し、そしてpHを7に調節する。17F型では
、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につい
て約1.25容量を超えなくてはならない。
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでPHを約6.7に調節する。1
7F型について、アルコールを最小的1.0〜1.5容
量に添加し、そしてpHを7に調節する。17F型では
、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につい
て約1.25容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第1アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約40
文の水中に溶解し、低温、約4℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約6〜7
2/時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
文の水中に溶解し、低温、約4℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約6〜7
2/時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
(B) 21アルコール゛′
これは第1アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成する
。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そして
PHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のように
好ましい。
成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成する
。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そして
PHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のように
好ましい。
約0.25〜0.75容量、好ましい実施態様において
0.50容量のアルコールを添加し、pH7に調節し、
第1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして
濾過または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をPH約6
.6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。
0.50容量のアルコールを添加し、pH7に調節し、
第1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして
濾過または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をPH約6
.6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。
多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約4
%の最終濃度に添加し、モしてpHfr:第1分別アル
コール沈殿において記載したように約6゜7に、好まし
いモードにおいて±0.1に調節する。約1.0〜1.
5容量のアルコールを好ましい実施態様において1.2
5容量の最終最小濃度に添加し、そしてPHを7に調節
する。次いで。
%の最終濃度に添加し、モしてpHfr:第1分別アル
コール沈殿において記載したように約6゜7に、好まし
いモードにおいて±0.1に調節する。約1.0〜1.
5容量のアルコールを好ましい実施態様において1.2
5容量の最終最小濃度に添加し、そしてPHを7に調節
する。次いで。
静置し、第1分別アルコール沈殿におけるように、沈殿
し、遠心し、再び約40文の冷ビロゲン不合水中に、好
ましい実施態様において約4°Cにおいて再溶解する。
し、遠心し、再び約40文の冷ビロゲン不合水中に、好
ましい実施態様において約4°Cにおいて再溶解する。
次いで多糖溶液を室温(21〜25℃)に加温し、そし
てpHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。
てpHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。
かきまぜながら、セタブロンの10%の溶液を2.0〜
5.0容量%、好ましくは3.0容量%にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約90分間、静置し
、この混合物を約4°Cに再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。6〜8文/時の流速および7〜14°
Cの温度を好ましい実施態様において使用するが、これ
らの範囲は一般的である。この手順を用いると、17F
型肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンによ
り沈殿する。沈殿を40文の約0.25モルの1h化ナ
トリウム中に再溶解し、かきまぜながら。
5.0容量%、好ましくは3.0容量%にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約90分間、静置し
、この混合物を約4°Cに再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。6〜8文/時の流速および7〜14°
Cの温度を好ましい実施態様において使用するが、これ
らの範囲は一般的である。この手順を用いると、17F
型肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンによ
り沈殿する。沈殿を40文の約0.25モルの1h化ナ
トリウム中に再溶解し、かきまぜながら。
ここで約4°Cに、冷却する。濁った懸濁液を濾過また
は遠心し、冷却し、ここで約6〜72/時の流速および
7〜12℃の温度を用いる。多糖はここで溶液中に存在
し、一方核酸および他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物
である。この手順は、アルコール分別後に@留する核酸
およびタンパク質不純物の大部分を除去する。
は遠心し、冷却し、ここで約6〜72/時の流速および
7〜12℃の温度を用いる。多糖はここで溶液中に存在
し、一方核酸および他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物
である。この手順は、アルコール分別後に@留する核酸
およびタンパク質不純物の大部分を除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをpH約6゜6に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
pHを約6.7に上昇させ、約1.25容量のアルコー
ルを添加し、そしてpHを7に約4°Cにおいて16〜
20時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不
合水中に再溶解し、約40又は適当である。この手順を
さらに2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタ
ブロンを除去し、最後の沈殿を約20文の水中に再溶解
する。
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
pHを約6.7に上昇させ、約1.25容量のアルコー
ルを添加し、そしてpHを7に約4°Cにおいて16〜
20時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不
合水中に再溶解し、約40又は適当である。この手順を
さらに2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタ
ブロンを除去し、最後の沈殿を約20文の水中に再溶解
する。
(D) 直江炭五星1
次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、PHを約6.1に
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにl系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、CPX−10C(AMF
−CUNO)フィルターを使用し、次いで1.2.0.
65.0.45および0.22uミリボア膜を使用する
。この手順の間、260muにおける光学濃度を核酸濃
度についての対照標準として使用することができ、そし
てLowry、et al、の方法を使用してタンパク
質含量を監視することができる。
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにl系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、CPX−10C(AMF
−CUNO)フィルターを使用し、次いで1.2.0.
65.0.45および0.22uミリボア膜を使用する
。この手順の間、260muにおける光学濃度を核酸濃
度についての対照標準として使用することができ、そし
てLowry、et al、の方法を使用してタンパク
質含量を監視することができる。
得られた濾液を、室温、はぼ21〜25℃に加温した後
、透析濾過する。ここで、10,000の分子量のカッ
トオフの中空繊維のカートリッジを含有するDC30型
アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリウ
ムを除去した。次いで、透析症過液を急速凍結し、そし
て凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで1
7F型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん中に
収穫し1次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−20
℃以下が適当であることがわがった。
、透析濾過する。ここで、10,000の分子量のカッ
トオフの中空繊維のカートリッジを含有するDC30型
アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリウ
ムを除去した。次いで、透析症過液を急速凍結し、そし
て凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで1
7F型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん中に
収穫し1次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−20
℃以下が適当であることがわがった。
一ヒの方法は汚染物質のタンパク質および核酸の99%
より多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持
した。
より多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持
した。
原料の多糖は、3型について実施例1に記載した方法に
おけるようにして、19A型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、19A型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。PHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.5〜1.0容量
、好ましくは0.7 1( 5容量で、2〜6℃の温度においてかきまぜながらゆっ
くり添加する。pHを約7.0に、好ましいモードにお
いて、±0.1に8モルの酢酸で調節する。沈殿はゆっ
くり形成し、この混合物を一夜約16〜20時間静置す
る。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾向があり、それら
は低温において最もよく取扱われる。こうして16〜2
0時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時に、ここでは約4
℃に保持すべきである。前述の分別の方法は、肺炎球菌
多糖の精製におけるアルコール沈殿工程の標準である。
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。PHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.5〜1.0容量
、好ましくは0.7 1( 5容量で、2〜6℃の温度においてかきまぜながらゆっ
くり添加する。pHを約7.0に、好ましいモードにお
いて、±0.1に8モルの酢酸で調節する。沈殿はゆっ
くり形成し、この混合物を一夜約16〜20時間静置す
る。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾向があり、それら
は低温において最もよく取扱われる。こうして16〜2
0時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時に、ここでは約4
℃に保持すべきである。前述の分別の方法は、肺炎球菌
多糖の精製におけるアルコール沈殿工程の標準である。
上の方法の他の型についての変動は、アルコールの容量
および特定の型に使用する工程の順序に主として依存す
るが、それらに限定されない。沈殿した汚染物質は、遠
心により、約6〜7又/時の流速および低温、好ましく
は約2〜約6℃の温度において均一に排除されるであろ
う。
および特定の型に使用する工程の順序に主として依存す
るが、それらに限定されない。沈殿した汚染物質は、遠
心により、約6〜7又/時の流速および低温、好ましく
は約2〜約6℃の温度において均一に排除されるであろ
う。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約6
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6.7に調節する。1
9A型について、アルコールを最小的1.5〜2.0容
量に添加し、そしてPHを7に調節する。19A型では
、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につい
て約1.75容量を超えなくてはならない。
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6.7に調節する。1
9A型について、アルコールを最小的1.5〜2.0容
量に添加し、そしてPHを7に調節する。19A型では
、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につい
て約1.75容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第1アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約40
文の水中に溶解し、低温、約4°Cは好ましい。濁りが
見えるとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約6〜
7又/時において、極過または遠心により清浄化するこ
とができる。
文の水中に溶解し、低温、約4°Cは好ましい。濁りが
見えるとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約6〜
7又/時において、極過または遠心により清浄化するこ
とができる。
(B)第21アルコール′
これは第1アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成する
。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そして
pHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のように
好ましい。
成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成する
。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そして
pHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のように
好ましい。
約0.75〜1.25容量、好ましい実施態様において
1.0容量のアルコールを添加し、PH7に調節し、第
1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、か
きまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾
過または遠心により清浄化する。このように除去された
沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6.
6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。多
糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約4%
の最終濃度に添加し、そしてPHを第1分別アルコール
沈殿において記載したように約6.7に、好ましいモー
ドにおいて±0.1に調節する。約1.5〜2.0容量
のアルコールを好ましい実施態様において1.75容量
の最終最小濃度に添加し、そしてPHを7に調節する。
1.0容量のアルコールを添加し、PH7に調節し、第
1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、か
きまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾
過または遠心により清浄化する。このように除去された
沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6.
6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。多
糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約4%
の最終濃度に添加し、そしてPHを第1分別アルコール
沈殿において記載したように約6.7に、好ましいモー
ドにおいて±0.1に調節する。約1.5〜2.0容量
のアルコールを好ましい実施態様において1.75容量
の最終最小濃度に添加し、そしてPHを7に調節する。
次いで、静置し、第1分別アルコール沈殿におけるよう
に、沈殿し、遠心し、再び約4(lの冷ピロゲン不合水
中に、好ましい実施態様において約4°Cにおいて再溶
解する。
に、沈殿し、遠心し、再び約4(lの冷ピロゲン不合水
中に、好ましい実施態様において約4°Cにおいて再溶
解する。
次いで多糖溶液を室温(21〜25℃)に加温し、そし
てpHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。
てpHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。
塩化ナトリウムを0.15モルにかきまぜながら添加し
、セタブロンの10%の溶液を0.05〜0.2容量%
、好ましくは0.075容量%にゆっくり添加する。沈
殿が形成するまで、ここで約90分間、静置し、この混
合物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除去
する。6〜8文/時の流速および7〜14℃の温度を好
ましい実施態様において使用するが、これらの範囲は一
般的である。この手順を用いると、19A型肺炎球菌多
糖はセタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。多
糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純物
を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順は、アルコー
ル分別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大部
分を除去する。
、セタブロンの10%の溶液を0.05〜0.2容量%
、好ましくは0.075容量%にゆっくり添加する。沈
殿が形成するまで、ここで約90分間、静置し、この混
合物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除去
する。6〜8文/時の流速および7〜14℃の温度を好
ましい実施態様において使用するが、これらの範囲は一
般的である。この手順を用いると、19A型肺炎球菌多
糖はセタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。多
糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純物
を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順は、アルコー
ル分別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大部
分を除去する。
次いで多糖を含有する上澄みを再沈殿させ、上澄みをp
H約6.6に調節し、そして酢酸ナトリウムを約4%に
添加する。次いでpHを約6.7に上昇させ、約1.7
5容量のアルコールを添加し、そしてpHを7に約4℃
において16〜20時間調節し、多糖を再び遠心し、多
糖をピロゲン不合水中に再溶解し、約40見は適当であ
る。この手順をさらに2回反復して多糖をさらに精製し
、朕跡量のセタブロンを除去し、最後の沈殿を約20!
;Lの水中に再溶解する。
H約6.6に調節し、そして酢酸ナトリウムを約4%に
添加する。次いでpHを約6.7に上昇させ、約1.7
5容量のアルコールを添加し、そしてpHを7に約4℃
において16〜20時間調節し、多糖を再び遠心し、多
糖をピロゲン不合水中に再溶解し、約40見は適当であ
る。この手順をさらに2回反復して多糖をさらに精製し
、朕跡量のセタブロンを除去し、最後の沈殿を約20!
;Lの水中に再溶解する。
(D) 固士皮五端1
次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約6.1に
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにl系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、CPX−10c(AMF
−CUNO)フィルターを使用し、次いで1.2.0.
65.0.45および0.22uミリボア膜を使用する
。この手順の間、260muにおける光学濃度を核酸濃
度についての対照標準として使用することができ、そし
てLowry、et al、の方法を使用してタンパク
質含量を監視することができる。
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにl系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、CPX−10c(AMF
−CUNO)フィルターを使用し、次いで1.2.0.
65.0.45および0.22uミリボア膜を使用する
。この手順の間、260muにおける光学濃度を核酸濃
度についての対照標準として使用することができ、そし
てLowry、et al、の方法を使用してタンパク
質含量を監視することができる。
得られた濾液を、室温、はぼ21〜25℃に加温した後
、透析濾過する。ここで、io、oo。
、透析濾過する。ここで、io、oo。
の分子量のカッ′トオフの中空繊維のカートリッジを含
有するDC30型アミコン装置を使用し、すべての残留
する塩化ナトリウムを除去した。次いで、透析濾過液を
急速凍結し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多
糖粉末、ここで19A型、が残る。凍結乾燥前に、0.
01%〜25%、好ましくは0.2%のグリシンを透析
濾過液に添加する。この粉末を低い湿度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−2
0℃以下が適当であることがわかった。
有するDC30型アミコン装置を使用し、すべての残留
する塩化ナトリウムを除去した。次いで、透析濾過液を
急速凍結し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多
糖粉末、ここで19A型、が残る。凍結乾燥前に、0.
01%〜25%、好ましくは0.2%のグリシンを透析
濾過液に添加する。この粉末を低い湿度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−2
0℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の99%よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
原料の多糖は、3型について実施例1に記載した方法に
おけるようにして、22F型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、22F型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
の°:22F1
(A) I Iアルコール
原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。PHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.25〜0.75
容量、好ましくは0.5容量で、2〜6℃の温度におい
てかきまぜなかもゆっくり添加する。pHを約7.0に
、好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で
調節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約
16〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化す
る傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われ
る。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を
冷時に、ここでは約4℃に保持すべきである。前述の分
別の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈
殿工程の標準である。上の方法の他の型についての変動
は、アルコールの容量および特定の型に使用する 東工
程の順序に主として依存するが、それらに限定されない
。沈殿した汚染物質は、遠心により、約16〜20fL
/時の流速および低温、好ましくは約2〜約6℃の温度
において均一に排除されるであろう。
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。PHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.25〜0.75
容量、好ましくは0.5容量で、2〜6℃の温度におい
てかきまぜなかもゆっくり添加する。pHを約7.0に
、好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢酸で
調節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約
16〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化す
る傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われ
る。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を
冷時に、ここでは約4℃に保持すべきである。前述の分
別の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈
殿工程の標準である。上の方法の他の型についての変動
は、アルコールの容量および特定の型に使用する 東工
程の順序に主として依存するが、それらに限定されない
。沈殿した汚染物質は、遠心により、約16〜20fL
/時の流速および低温、好ましくは約2〜約6℃の温度
において均一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約6
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6.7に調節する。2
2F型について、アルコールを最小的1.25〜1.7
5容量に添加し、そしてpHを7に調節する。22F型
では、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿に
ついて約1.50容量を超えなくてはならな(、X。
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6.7に調節する。2
2F型について、アルコールを最小的1.25〜1.7
5容量に添加し、そしてpHを7に調節する。22F型
では、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿に
ついて約1.50容量を超えなくてはならな(、X。
次いで、混合物を、第1アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約40
立の水中に溶解し、低温、約4℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約6〜7
見/時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
立の水中に溶解し、低温、約4℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約6〜7
見/時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
(B) 2 アルコール
これは第1アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成する
。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そして
pHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のように
好ましい。
成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±0.1に達成する
。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そして
pHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のように
好ましい。
約0.25〜0.75容量、好ましい実施態様において
0.50容量のアルコールを添加し、pH7に調節し、
第1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして
鹸過または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6
.6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。
0.50容量のアルコールを添加し、pH7に調節し、
第1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして
鹸過または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6
.6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。
多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約4
%の最終濃度に添加し、そしてpHを第1分別アルコー
ル沈殿において記載したように約6゜7に、好ましいモ
ードにおいて±0.1に調節する。約1.25〜1.7
5容量のアルコールを好ましい実施態様において1.5
0容量の最終最小濃度に添加し、そしてPHを7に調節
する。次いで、静置し、第1分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約401の冷ピロゲン
不合水中に、好ましい実施態様において約4℃において
再溶解する。
%の最終濃度に添加し、そしてpHを第1分別アルコー
ル沈殿において記載したように約6゜7に、好ましいモ
ードにおいて±0.1に調節する。約1.25〜1.7
5容量のアルコールを好ましい実施態様において1.5
0容量の最終最小濃度に添加し、そしてPHを7に調節
する。次いで、静置し、第1分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約401の冷ピロゲン
不合水中に、好ましい実施態様において約4℃において
再溶解する。
次いで多糖溶液を室温(21〜25℃)に加温し、そし
てPHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。
てPHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。
かきまぜながら、セタブロンの10%の溶液を2.0〜
5.0容量%、好ましくは3.0容量%にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約90分間、静置し
、この混合物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心に
より除去する。6〜8文/時の流速および7〜14℃の
温度を好ましい実施態様において使用するが、これらの
範囲は一般的である。この手順を用いると、22F型肺
炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより沈
殿する。沈殿を40文の約0.25モルの塩化ナトリウ
ム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約4℃に、冷
却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、こ
こで約6〜7立/時の流速および7〜12℃の温度を用
いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方接酸および他
の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順は、
アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質不純
物の大部分を除去する。
5.0容量%、好ましくは3.0容量%にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約90分間、静置し
、この混合物を約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心に
より除去する。6〜8文/時の流速および7〜14℃の
温度を好ましい実施態様において使用するが、これらの
範囲は一般的である。この手順を用いると、22F型肺
炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより沈
殿する。沈殿を40文の約0.25モルの塩化ナトリウ
ム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約4℃に、冷
却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、こ
こで約6〜7立/時の流速および7〜12℃の温度を用
いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方接酸および他
の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順は、
アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質不純
物の大部分を除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをpH約6゜6に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
PHを約6.7に上昇させ、約1.5容量のアルコール
を添加し、そしてpHを7に約4℃において16〜20
時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合水
中に再溶解し、約40sLは適当である。この手順をさ
らに2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブ
ロンを除去し、最後の沈殿を約20文の水中に再溶解す
る。
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
PHを約6.7に上昇させ、約1.5容量のアルコール
を添加し、そしてpHを7に約4℃において16〜20
時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合水
中に再溶解し、約40sLは適当である。この手順をさ
らに2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブ
ロンを除去し、最後の沈殿を約20文の水中に再溶解す
る。
(D) 盾仕皮ム精1
次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約6.1に
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにl系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、CPX−10C(AMF
−CUNO)フィルターを使用し、次いで1.2.0.
65.0.45および0.22uミリポア膜を使用する
。この手順の間、260muにおける光学濃度を核酸濃
度についての対照標準として使用することができ、そし
てLowry、et al、の方法を使用してタンパク
質含量を監視することができる。
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにl系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、CPX−10C(AMF
−CUNO)フィルターを使用し、次いで1.2.0.
65.0.45および0.22uミリポア膜を使用する
。この手順の間、260muにおける光学濃度を核酸濃
度についての対照標準として使用することができ、そし
てLowry、et al、の方法を使用してタンパク
質含量を監視することができる。
得られた濾液な、室温、はぼ21〜25°Cに加温した
後、透析濾過する。ここで、10,000の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するDC30
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
22F型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−2
0℃以下が適当であることがわかった。
後、透析濾過する。ここで、10,000の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するDC30
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
22F型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−2
0℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の99%よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
実[
原料の多糖は、3型について実施例1に記載した方法に
おけるようにして、33F型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、33F型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。pHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.25〜0.75
容量、好ましくは0.5容量で、2〜6℃の温度におい
てかきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に
、好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢縁で
調節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約
16〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化す
る傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われ
る。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を
冷時に、ここでは約4°Cに保持すべきである。前述の
分別の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール
沈殿工程の標準である。上の方法の他の型についての変
動は、アルコールの容量および特定の型に使用する工程
の順序に主として依存するが、それらに限定されない。
ルコールに対して約4%の最終濃度に添加する。pHを
約6.7に、好ましいモードにおいて、±0.1に8モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを0.25〜0.75
容量、好ましくは0.5容量で、2〜6℃の温度におい
てかきまぜながらゆっくり添加する。pHを約7.0に
、好ましいモードにおいて、±0.1に8モルの酢縁で
調節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約
16〜20時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化す
る傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われ
る。こうして16〜20時間の期間の間、多糖の沈殿を
冷時に、ここでは約4°Cに保持すべきである。前述の
分別の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール
沈殿工程の標準である。上の方法の他の型についての変
動は、アルコールの容量および特定の型に使用する工程
の順序に主として依存するが、それらに限定されない。
沈殿した汚染物質は、遠心により、約16〜201/時
の流速および低温、好ましくは約2〜約6℃の温度にお
いて均一に排除されるであろう。
の流速および低温、好ましくは約2〜約6℃の温度にお
いて均一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、PH約6
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6.7に調節する。3
3F型について、アルコールを最小的1.25〜1.7
5容量に添加5、おし−rpHを江調節する。33 F
yJi−7’ !は、好ましい最終アルコール濃度は合
計の多糖沈殿について約1.50容量を超えなくてはな
らない。
.6に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して4%の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでpHを約6.7に調節する。3
3F型について、アルコールを最小的1.25〜1.7
5容量に添加5、おし−rpHを江調節する。33 F
yJi−7’ !は、好ましい最終アルコール濃度は合
計の多糖沈殿について約1.50容量を超えなくてはな
らない。
次いで、混合物を、第1アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約40
交の水中に溶解し、低温、約4℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約6〜7
文/時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができるや (B) 2 1アルコール これは第1ア)fコール分別沈殿におけるように、上で
形成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢
酸で調節し、好ましいモードにおいて±O9lに達成す
る。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そし
てpHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のよう
に好ましい。
交の水中に溶解し、低温、約4℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約2〜6℃および約6〜7
文/時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができるや (B) 2 1アルコール これは第1ア)fコール分別沈殿におけるように、上で
形成した多糖含有上澄みを、pH約6゜6に8モルの酢
酸で調節し、好ましいモードにおいて±O9lに達成す
る。酢酸ナトリウムを約4%の最終濃度に添加し、そし
てpHを約6.7に調節し、そして±0.1は上のよう
に好ましい。
約0.25〜0.75容量、好ましい実施態様において
0.50容量のアルコールを添加し、PH7に調節し、
第1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、PHを調節し、静置し、そして
濾過または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6
.6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。
0.50容量のアルコールを添加し、PH7に調節し、
第1分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、PHを調節し、静置し、そして
濾過または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約6
.6に、好ましいモードにおいて±0.1に調節する。
多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約4
%の最終濃度に添加し、そしてpHを第1分別アルコー
ル沈殿において記載したように約6゜7に、好ましいモ
ードにおいて±0.1に調節する。約1.25〜1.7
5容量のアルコールを好ましい実施態様において1.5
0容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを7に調節
する9次いで、静置し、第1分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約405Lの冷ビロゲ
ン不合水中に、好ましい実施態様において約4℃におい
て再溶解する。
%の最終濃度に添加し、そしてpHを第1分別アルコー
ル沈殿において記載したように約6゜7に、好ましいモ
ードにおいて±0.1に調節する。約1.25〜1.7
5容量のアルコールを好ましい実施態様において1.5
0容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを7に調節
する9次いで、静置し、第1分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約405Lの冷ビロゲ
ン不合水中に、好ましい実施態様において約4℃におい
て再溶解する。
(c) M ヘキサーシルトリメチルアンモニラム セ
タブロン 1・ 次いで多糖溶液を室温(21〜25°C)に加温し、そ
してpHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調
節する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節
溶液に便利であることがわかった。
タブロン 1・ 次いで多糖溶液を室温(21〜25°C)に加温し、そ
してpHを約7.4±0.1に炭酸ナトリウム溶液で調
節する。0.4%の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節
溶液に便利であることがわかった。
塩化ナトリウムを0.15モルにかきまぜながら添加し
、セタブロンの10%の溶液を1.0〜5.0容量%、
好ましくは3.0容量%にゆっくり添加する。沈殿が形
成するまで、ここで約90分間、静置し、この混合物を
約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除去する。
、セタブロンの10%の溶液を1.0〜5.0容量%、
好ましくは3.0容量%にゆっくり添加する。沈殿が形
成するまで、ここで約90分間、静置し、この混合物を
約4℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除去する。
6〜8交/時の流速および7〜14°Cの温度を好まし
い実施態様において使用するが、これらの範囲は一般的
である。この手順を用いると、33F型肺炎球菌多糖は
セタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。多糖は
ここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純物を廃
棄可能な遠心沈降物である。この手順は、アルコール分
別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大部分を
除去する。
い実施態様において使用するが、これらの範囲は一般的
である。この手順を用いると、33F型肺炎球菌多糖は
セタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。多糖は
ここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純物を廃
棄可能な遠心沈降物である。この手順は、アルコール分
別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大部分を
除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをPH約6゜6に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
pHを約6.7に上昇させ、約1.5容量のアルコール
を添加し、そしてpHを7に約4℃において16〜20
時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合水
中に再溶解し、約40見は適当である。この手順をさら
に2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロ
ンを除去し、最後の沈殿を約20文の水中に再溶解する
。
し、そして酢酸ナトリウムを約4%に添加する。次いで
pHを約6.7に上昇させ、約1.5容量のアルコール
を添加し、そしてpHを7に約4℃において16〜20
時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合水
中に再溶解し、約40見は適当である。この手順をさら
に2回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロ
ンを除去し、最後の沈殿を約20文の水中に再溶解する
。
(D) 危性次り精1
次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約6.1に
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにl系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、CPX−10C(AMF
−CUNO)フィルターを使用し、次いテ1 、2.0
.65.0.45および0.22uミリボア膜を使用す
る。この手順の間、260muにおける光学濃度を核酸
濃度についての対照標準として使用することができ、そ
してLowry、et al、の方法を使用してタンパ
ク賀含量を監視することができる。
調節し、そして塩化ナトリウムを0.15モルの濃度に
する。活性炭の20%懸濁液をかきまぜながら添加して
、2〜7%、好ましくは5%の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約4℃に約30分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにl系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、CPX−10C(AMF
−CUNO)フィルターを使用し、次いテ1 、2.0
.65.0.45および0.22uミリボア膜を使用す
る。この手順の間、260muにおける光学濃度を核酸
濃度についての対照標準として使用することができ、そ
してLowry、et al、の方法を使用してタンパ
ク賀含量を監視することができる。
得られた濾液を、室温、はぼ21〜25℃に加温した後
、透析濾過する。ここで、10,000の分子量のカッ
トオフの中空繊維のカートリッジを含有するDC30型
アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリウ
ムを除去した0次いで、透析濾過液を急速凍結し、そし
て凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで3
3F型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん中に
収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−20
°C以下が適当であることがわがった。
、透析濾過する。ここで、10,000の分子量のカッ
トオフの中空繊維のカートリッジを含有するDC30型
アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリウ
ムを除去した0次いで、透析濾過液を急速凍結し、そし
て凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで3
3F型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん中に
収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−20
°C以下が適当であることがわがった。
上の方法は汚染物質のタンパク賀の97%より多くおよ
び汚染物質の核酸の99%より多くを除去すると同時に
、生成物の免疫原性を保持した。
び汚染物質の核酸の99%より多くを除去すると同時に
、生成物の免疫原性を保持した。
特許出願人 アメリカン・サイアナミド會カンパニー
第1頁の続き
0発 明 者 ジエイムズ・ディ・イ アングリツシュ
ム [相]発明者 ウエンリイ・リン °アル” メリカ合衆国ニュージャーシイ州07649オラデル・
エルストリート よ処 メリカ合衆国ニューヨーク州10956二二−シテイ・
ホーγベニュー 89
ム [相]発明者 ウエンリイ・リン °アル” メリカ合衆国ニュージャーシイ州07649オラデル・
エルストリート よ処 メリカ合衆国ニューヨーク州10956二二−シテイ・
ホーγベニュー 89
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖(
“C”′多糖が実質的に存在しない)からなり、前記肺
炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型(デンマーク表示)■、2
.3.4,5.6B、7F、8.9N、9■、IOA、
IIA、12F、14.15B、17F、18C119
A、19F、20.22F、23Fおよび33Fと、6
Aおよび25の0〜lまたは両者とから成る多価肺炎球
菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の3型肺炎球菌多
糖は清澄化された発酵リゼイト(Fermentati
on 1ysate)から精製され、前記精製は、(a
) 0 、15〜0 、5容量のアルコールで沈殿させ
、前記リゼイトはPH約6.7にあり、約4%の最終酢
酸ナトリウム濃度を有しかつ2〜6°Cの温度にあり、 (b)このような沈殿を再溶解させ、 (c)工程(a)を約0.25〜0.6容量のアルコー
ルで反復し、 (d)工程(b)を反復し、 (e)工程(a)を約0.1〜0.5容量のアルコール
で反復し、 (f)工程(b)を反復し、 (g)工程(f)の多糖からの不純物を、21〜25℃
の温度およびpH7,4±0.1、および10%のセタ
ブロン溶液に基づいて0.1〜0.5容量%のセタブロ
ン濃度において、セタブロンで分別沈殿させ、 (h)多糖をPH約6.7において約4%の酢酸ナトリ
ウムおよび約0.50容量のアルコールで再沈殿させ、
そしてピロゲン不合水中に再溶解させ、 (i)工程(h)を2回反復し、 (D工程(i)の多糖溶液を、PH6,1および0.1
5モルの塩化ナトリウム濃度において20%の活性炭懸
濁液に基づいて3〜7%の濃度に懸濁した活性炭を添加
するqとにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液を冷
時に約30分間静置し、そして前記活性炭を濾過し、 (k)前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして (1)得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 2、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖(
in C++多糖が実質的に存在しない)からなり、前
記肺炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型(デンマーク表示)1
.2.3.4.5.6B、7F、8.9N、9V、IO
A、IIA、12F、14.15B、17F、18C,
19A、19F、20.22F、23Fおよび33Fと
、6Aおよび25のθ〜1または両者とから成る多価肺
炎球菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の5型肺炎球
菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前記
精製は、 (a)0.25〜0.8容量のア)l/ D −)Iy
’t’分別沈殿させ、前記リゼイトはpH約6.7に
あり、約4%の最終酢酸ナトリウム濃度を有しかつ2〜
6℃の温度にあり、そしてそのように沈殿した汚染物質
を除去し、 (b)5型の多糖を約0.9〜約1.4容量のアルコー
ルでPH約6.7において沈殿させ、(C)このような
沈殿を集めかつ再溶解し、(d)工程(a)を約0.2
5〜0.80容量のアルコールで反復し、 (e)工程(b)を約0.7〜1.4容量のアルコール
で反復し、次いで工程(C)を反復し、(f)工程(’
e )の再溶解した沈殿を、21〜25℃の温度および
pH7,4±0.1、および10%のセタブロン溶液に
基ツいて1.0〜5゜0容量%のセタブロン濃度におい
て、セタブロンで分別沈殿させ、 (g)沈殿した多糖を除去し、そして前記多糖を約0.
25モルのNaC1中に冷却しながら再溶解し、 (h)多糖をpH約6.7において約4%の酢酸ナトリ
ウムおよび約1容量のアルコールで再沈殿させ、そして
ピロゲン不合水中に再溶解させ、(i)工程(h)を2
回反復し、 (j)工程(i)の多糖溶液を、pH6,1および0.
15モルの塩化ナトリウム濃度において、20%の活性
炭懸濁液に基づいて2〜7%の濃度に懸濁した活性炭を
添加することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液
を冷時に約30分間静置し、そして前記活性炭を濾過し
、 (k)前記溶液を蒸留水に対して透析錨過し、そして (1)得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 3、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖(
11CI+多糖が実質的に存在しない)からなり、前記
肺炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型(デンマーク表示)l、
2.3.4.5.6B、7F、8.9N、9V、IOA
、IIA、12F、14.15B、17F、18c、1
9A、19F、20.2−2F、23Fおよび33Fと
、6Aおよび25の0〜lまたは両者とから成る多価肺
炎球菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の9■型肺退
球菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前
記精製は、 (a)0.25〜0.8容量のアルコールテ分別沈殿さ
せ、前記リゼイトはpH約6.7にあり、約4%の最終
酢酸ナトリウム濃度を有しかつ2〜6℃の温度にあり、
そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 (b)9V型の多、糖を約1.25〜約2.25容量の
アルコールでpH約6.7において沈殿させ、 (C)このような沈殿を集めかつ再溶解し、(d)工程
(a)を約0.15〜0.35容量のアルコールで反復
し、 (e)工程(b)を反復しかつ工程(C)を反復し、 (f)工程(e)の多糖から不純物を、21〜25°C
の温度および0.15モルのNaClおよびpH7,4
±0.1、および10%のセタブロン溶液に基づいて0
.05〜1.0容量%のセタブロン濃度において、セタ
ブロンで分別沈殿させ(g)多糖をpH約6.7におい
て約4%の酢酸ナトリウムおよび約1.75容量のアル
コールで再沈殿させ、そしてピロゲン不合水中に再溶解
させ、 (h)工程(g)を2回反復し、 (i)工程(h)の多糖溶液を、pH6,1および0.
15モルの塩化ナトリウム濃度において、20%の活性
炭懸濁液に基づいて2〜6%の濃度に懸濁した活性炭を
添加することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液
を冷時に約30分間静置し、そして前記活性炭を濾過し
、 (j)前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして (、k)得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する。 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 4、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖(
“C11多糖が実質的に存在しない)からなり、前記肺
炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型(デンマーク表示)l、2
.3.4.5.6B、7F、8.9N、9V、IOA、
IIA、12F、14.15B、17F、18c、19
A、19F、2 10.22F、23Fおよび33Fと
、6Aおよび25の0〜1才たは両者とから成る多価肺
炎球菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源のIOA型肺
炎球菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、
前記精製は、 (a)0.25〜0.8容量のアルコールで分別沈殿さ
せ、前記リゼイトはpH約6.7にあり、約4%の最終
酢酸ナトリウム濃度を有しかつ2〜6℃の温度にあり、
そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 (b)IOA型の多糖を約1.0〜約1.5容量のアル
コールでpH約6.7において沈殿させ(C)このよう
な沈殿を集めかつ再溶解し、(d)工程(a)を約0.
25〜0.8容量のアルコールで反復し、 (e)工程(b)を約1.0〜2.0のアルコールで反
復しかつ工程(C)を反復し、(f)工程(、e)の多
糖溶液を、pH6,1および0.15モルの塩化ナトリ
ウム濃度において20%の活性炭懸濁液に基づいて2〜
6%の濃度に懸濁した活性炭を添加することにより、活
性炭で精製し、そしてこの溶液を冷時に約30分間静置
し、そして前記活性炭を濾過し、 (g)前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして (h)得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 5、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖(
“C゛多糖実質的に存在しない)からなり、前記肺炎球
菌莢膜多糖は肺炎球菌型(デンマーク表示)1.2.3
.4.5.6B、7F、8.9N、9v、IOA、II
A、12F、14.15B、17F、18C,19A、
19F、20.22F、23Fおよび33Fと、6Aお
よび25の0〜lまたは両者とから成る多価肺炎球菌ワ
クチンにおいて、効果的に免疫源のIIA型肺炎球菌多
糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前記精製
は、 (a)0.75〜1.25容量のアルコールで分別沈殿
させ、前記リゼイトはpH約6.7にあり、約4%の最
終酢酸ナトリウム濃度を有しかつ2〜6°Cの温度にあ
り、そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 (b)IIA型の多糖を約1.50〜約2.25容量の
アルコールでpH約6.7において沈殿させ、 (C)このような沈殿を集めかつ再溶解し、(d)工程
(a)を約0.75〜1.25容量のアルコールで反復
し、 (e)工程(c)を1.50〜約2.25容量のアルコ
ールで反復し、次いで工程(C)を反復し、 (f)工程(e)の再溶解した沈殿を、21〜25℃の
温度およびpH7,4±0.1、および10%のセタブ
ロン溶液に基づいて1.5〜5゜0容量%のセタブロン
濃度において、セタブロンで分別沈殿させ、 (g−)沈殿した多糖を取り出し、そして多糖を約0.
25モルのNaC1中に冷時に再溶解し、(h)多糖を
pH約6.7において約4%の酢酸ナトリウムおよび約
2.0容量のアルコールで再沈殿させ、そしてピロゲン
不合水中に再溶解させ、 (i)工程(h)を2回反復し、 (D工程(i)の多糖溶液を、pH6,1および0.1
5モルの塩化ナトリウム濃度において、20%の活性炭
懸濁液に基づいて2〜5%の濃度に懸濁した活性炭を添
加することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液を
冷時に約30分間静置し、そして前記活性炭を濾過し、 (k)前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し。 そして (1)得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 6、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖(
11C11多糖が実質的に存在しない)からなり、前記
肺炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型(デンマーク表示)l、
2.3.4.5.6B、7F、8.9N、9V、IOA
、IIA、12F、14.15B、17F、18G、1
9A、19F、20.22F、23Fおよび33Fと、
6Aおよび25のθ〜lまたは両者とから成る多価肺炎
球菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の15B型肺炎
球菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前
記精製は、 (a)0.4〜1.o容量のアルコールで沈殿させ、前
記リゼイトはpH約6.7にあり、約4%の最終酢酸ナ
トリウム濃度を有しかつ2〜6°Cの温度にあり、そし
て沈殿しない汚染物質を除去し、 (b)このような沈殿を集めかつ再溶解し、′(C)工
程(a)を約1.5〜2.25容量のアルコールで反復
し、 (d)工程(b)を反復し、 (e)工程(C)の溶解した多糖の分画を、21〜25
℃の温度およびpH7,4±0.1においてセタブロン
、およびセタブロン溶液で分別沈殿させ、 (f)沈殿した多糖を取り出し、そして多糖を約0.2
5モルのNaC1中に冷時に再溶解し、(g)多糖をp
H約6.7において約4%の酢酸ナトリウムおよび約0
.4〜1.0容量のアルコールで再沈殿させ、そしてピ
ロゲン不合水中に再溶解させ、 (h)工程(g)を2回反復し、 (i)前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして (j)得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 7、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖(
“C”多糖が実質的に存在しない)からなり、前記肺炎
球菌莢膜多糖は肺炎球菌型(デンマーク表示)l、2.
3.4.5.6B、7F、8.9N、9V、IOA、1
1A、12F、14.15B、17F、18C,19A
、19F、20.22F、23Fおよび33Fと、6A
および25の0〜lまたは両者とから成る多価肺炎球菌
ワクチンにおいて、効果的に免疫源の17F型肺炎球菌
多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前記精
製は、 (a)0.25〜0.75容量のアルコールで分別沈殿
させ、前記リゼイトはPH約6.7にあり、約4%の最
終酢酸ナトリウム濃度を有しかつ2〜6℃の温度にあり
、そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 (b)17F型の多糖を約1.0〜約1.5容量のアル
コールでpH約6.7において沈殿させ(C)このよう
な沈殿を集めかつ再溶解し、(d)工程(a)を約0.
25〜0.75容量のアルコールで反復し、 (e)工程(b)を1.0〜約1.5容量のアルコール
で反復し、次いで工程(C)を反復し、(f)工程(e
)の再溶解した沈殿を、21〜25℃の温度およびpH
7,4±o、i、および10%のセタブロン溶液に基づ
いて1.0〜3゜5容量%のセタブロン濃度において、
セタブロンで分別沈殿させ、 (g)沈殿した多糖を取り出し、そして多糖を約0.2
5モルのNaC1中に冷時に再溶解し、(h)多糖をP
H約6.7において約4%の酢 (酸ナトリウムおよび
約1.25容量のアルコールで再沈殿させ、そしてピロ
ゲン不合水中に再溶解させ、 (i)工程(h)を2回反復し、 (j)工程(i)の多糖溶液を、pH6,1および0.
14モルの塩化ナトリウム濃度において、20%の活性
炭懸濁液に基づいて3.0〜6゜0%の濃度に懸濁した
活性炭を添加することにより、活性炭で精製し、そして
この溶液を冷時に約30分間静置し、そして前記活性炭
を濾過し、(k)前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し
、そして (1)得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 8、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖(
“C11多糖が実質的に存在しない)からなり、前記肺
炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型(デンマーク表示)l、2
.3.4.5.6B、7F、8.9N、9■、IOA、
IIA、12F、14.15B、 17F、 18C,
19A、19F、 20.22F、23Fおよび33F
と、6Aおよび25の0〜lまたは両者とから成る多価
肺炎球菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の19A型
、mr炎球菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製
され、前記精製は、 (a)1.5〜1.0容量のアルコールで分別沈殿させ
、前記リゼイトはpH約6.7にあり、約4%の最終酢
酸ナトリウム濃度を有しかつ2〜6°Cの温度にあり、
そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 (b)19A型の多糖を約1.50〜約2.25容量の
アルコールでpH約6.7において沈殿させ、 (C)このような沈殿を集めかつ再溶解し、(d)工程
(a)を約0.5〜1.0容量のアルコールで反復し、 Ce)工程(b)を反復し、次いで工程(C)を反復し
、 (f)工程(e)を反復し、 (g)工程(f)の多糖から不純物を、21〜25℃の
温度、0.15モル(7)NaC1およびPH7,4±
0.1、および10%のセタブロン溶液に基づいて0.
05〜0.2容量%のセタブロン濃度において、セタブ
ロンで分別沈殿させ、(h)多糖をpH約6.7におい
て約4%の酢酸ナトリウムおよび約1.75容量のアル
コールで再沈殿させ、そしてピロゲン不合水中に再溶解
させ、 (i)工程(h)を2回反復し、 (j)工程(1)の多糖溶液を、pH6,1および0.
15モルの塩化ナトリウム濃度において、20%の活性
炭懸濁液に基づいて3〜7%の濃度に懸濁した活性炭を
添加することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液
を冷時に約30分間静置し、そして前記活性炭を濾過し
、 (k)前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして (1)得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 9、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖(
“C11多糖が実質的に存在しない)からなり、前記肺
炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型(デンマーク表示)l、2
.3.4.5.6B、7F、8.9N、9V、IOA、
IIA、12F、14.15B、17F、18C119
A、19F、20.22F、23Fおよび33Fと、6
Aおよび25のO〜1または両者とから成る多価肺炎球
菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の22F型肺炎球
菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前記
精製は、 (a)0.25〜0.75容量のアルコールで分別沈殿
させ、前記リゼイトはpH約6.7にあり、約4%の最
終酢酸ナトリウム濃度を有しかつ2〜6°Cの温度にあ
り、そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 (b)22F型の多糖を約1.25〜約1.7容量のア
ルコールでpH約6.7において沈殿させ1 、(C)このような沈殿を集めかつ再溶解し、(d)工
程(a)を約0.25〜0.75容量のアルコールで反
復し、 (e)工程(b)を1.25〜約1.75容量のアルコ
ールで反復し、次いで工程(C)を反復し、 (f)工程(e)の再溶解した沈殿を、21〜25℃の
温度およびpH7,4±0.1、および10%のセタブ
ロン溶液に基づいて2.0〜5゜0容量%のセタブロン
濃度において、セタブロンで分別沈殿させ、 (g)沈殿した多糖を除去し、そして多糖を約0.25
モルのNaC1中に冷時に再溶解し、(h)多糖をpH
約6.7において約4%の酢酸ナトリウムおよび約1.
5容量のアルコールで再沈殿させ、そしてピロゲン不合
水中に再溶解させ、 (i)工程(h)を2回反復し、 (j)工程(i)の多糖溶液を、pH6,1および0.
15モルの塩化ナトリウム濃度において、20%の活性
炭懸濁液に基づいて3〜7%の濃度に懸濁した活性炭を
添加することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液
を冷時に約30分間静置し、そして前記活性炭を濾過し
、 (k)前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして (1)得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴、とする
多価肺炎球菌ワクチン。 10、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖
(C11多糖が実質的に存在しない)からなり、前記肺
炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型(デンマーク表示)l、2
.3.4.5.6B、7F、8.9N、9V、IOA、
IIA、12F、14、15B、 17F、18C,1
9A、19F、20.22F、23Fおよび33Fと、
6Aおよび25のθ〜1または両者とから成る多価肺炎
球菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の33F型肺炎
球菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前
記精製は、 (a)0.25〜0.75容量のアルコールで分別沈殿
させ、前記リゼイトはPH約6.7にあり、約4%の最
終酢酸ナトリウム濃度を有しかつ2〜6℃の温度にあり
、そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 (b)33F型の多糖を約1.25〜約1.75容量の
アルコールでpH約6.7において沈殿させ、 (C)このような沈殿を集めかつ再溶解し、(d)工程
(a)を約0.25〜0.75容量のアルコールで反復
し、 (e)工程(b)を反復し、かつ工程(C)を反復し、 (f)工程(e)の多糖から不純物を、21〜25℃の
温度、O,15%ルのNaclおよびPH7,4±0.
1、およびo、i〜0.3容量%のセタブロン濃度にお
いて、セタブロンで分別沈殿させ、 (g)多糖をpH約6.7において約4%の酢酸ナトリ
ウムおよび約1.5容量のアルコールで再沈殿させ、そ
してピロゲン不合水中に再溶解させ、 (h)工程(g)を2回反復し、 (i)工程(h)の多糖溶液を、pH6,1および0,
15モルの塩化ナトリウム濃度において、20%の活性
炭懸濁液に基づいて2〜6%の濃度に懸濁した活性炭を
添加することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液
を冷時に約30分間静置し、そして前記活性炭を濾過し
、 ](k)前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そ
して (j)得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。
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