CN116693706A - 一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法，由如下步骤组成：向肺炎链球菌菌液中加入脱氧胆酸钠杀菌，调pH至酸性沉淀得到上清液，超滤后加入CTAB沉淀，取上清液或收集沉淀加入盐溶液得重悬液，再加入碘化钠沉淀去除残余CTAB，超滤后获得纯化多糖。本发明方法步骤精减，多糖回收率高，杂质含量低，纯化效果优异，环境友好，适于产业化，具有很好的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法。
背景技术
肺炎链球菌(Streptococcus pneumococcus)简称肺炎球菌，是引起肺炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症等疾病的主要病原菌，是导致婴幼儿和老年人死亡的重要原因之一，肺炎链球菌感染严重威胁着人们的健康。然而滥用抗生素会使肺炎球菌产生耐药性，给临床治疗带来困难，而接种疫苗已成为预防肺炎球菌相关性疾病最有效的手段。
细菌多糖广泛分布于细胞的内部及其表面，具有丰富的结构及生物学功能，在食品、医药及工业领域都具有重要价值。目前，大分子多糖按照其分布位置的不同大致分为三种类型：细菌表面多糖、细胞壁多糖、胞外多糖。其中，细菌表面多糖在部分致病菌中又称荚膜多糖(capsular polysaccharides,CPS)，能与肽聚糖层共价相连覆盖在细菌细胞壁的外层，形成一层荚膜保护屏障，该特异性多糖层可以作为抗原物质发挥作用。肺炎链球菌的CPS是其主要的毒力因子，根据抗原特性可将肺炎链球菌的荚膜多糖分为48个血清群，93个血清型。其中，23种血清型引发约90％的侵袭性疾病，包括1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，23F型等，目前以上述血清型的肺炎链球菌荚膜多糖为抗原的疫苗已获广泛使用。
但是，由于作为疫苗的荚膜多糖需要通过各种血清型的肺炎链球菌在培养基中生长培养后，杀死细菌再进一步分离纯化获得，如何实现肺炎链球菌荚膜多糖的高效纯化和制备，缩短工艺步骤，降低成本，同时保持环境友好，是疫苗产业化生产过程中的关键。
目前，进行肺炎链球菌荚膜多糖生产纯化的现有技术中，有部分采用苯酚进行杀菌(王剑虹等人.肺炎链球菌培养及其荚膜多糖的制备[J].甘肃科学学报,2004(03):40-44.)，虽然工艺相对简单，但其使用的苯酚对人体健康及环境均不友好，有较大的改进空间。
中国专利CN101663327B公开了一种产生肺炎链球菌荚膜多糖的缩短的纯化方法，采用脱氧胆酸钠(DOC)杀菌，过滤并超滤上清后，利用蛋白在等电点处溶解度降低而调节酸性条件，是蛋白沉淀后离心去除，再进一步活性炭吸附的方法制备1，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，23F型共12个血清型的肺炎链球菌荚膜多糖，但方法的制备步骤仍较长，操作繁琐，且血清型覆盖量不够广，而且所用活性炭吸附的方法不具有对蛋白质等杂质吸附的特异性，从结果来看其部分血清型(如4型)的多糖损失较大，回收率低，且批间差异也较大，品质不稳定。
中国专利CN101180079B公开了一种肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物组合物，并在说明书部分公开了肺炎链球菌纯化的方法。包括使用脱氧胆酸钠在特定温度(7～13℃)下持续搅拌裂解细胞，调酸(pH 4.5～6.8)和静置(15～25℃)沉淀的步骤，以及加CTAB沉淀的步骤；然而，该专利公开的纯化工艺后续还需要多次采用磷酸盐缓冲液或氯化钠溶液超滤、0.2μm过滤和活性炭吸附、羟基磷灰石柱层析等步骤，不但工艺步骤漫长繁琐，而且采用磷酸盐缓冲液、氯化钠溶液超滤成本高昂，不利于放大到工艺生产中。
因此，提供一种工艺步骤简单、成本低、环境友好的高效纯化肺炎链球菌荚膜多糖的方法，具有非常重要的产业意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种步骤精减、成本低、环境友好的高效纯化肺炎链球菌荚膜多糖的方法。
本发明提供了一种纯化肺炎链球菌荚膜多糖的方法，由如下步骤组成：
(1)向肺炎链球菌菌液中加入脱氧胆酸钠杀菌，再降温并调节pH至不高于4.5，在2～8℃静置沉淀后除去沉淀得上清液，超滤得超滤液；所述加入脱氧胆酸钠的终浓度为0.1～0.5％w/v；
(2)向超滤液中加入中性磷酸盐缓冲液及CTAB反应产生沉淀后，收集上清液得到待处理混合液，或收集沉淀加入盐溶液重悬后获取上清液得到待处理混合液；
(3)向待处理混合液中加入碘化钠产生沉淀，除去沉淀，超滤后即得纯化的肺炎链球菌荚膜多糖溶液。
进一步地，上述步骤(1)、步骤(3)中的超滤均是用注射用水超滤。
进一步地，上述肺炎链球菌为7F型、14型或23F型肺炎链球菌时，步骤(2)所述待处理混合液为收集的上清液；
或，所述肺炎链球菌为1型、3型、4型、5型、6A型、6B型、9V型、18C型、19A型或19F型时，步骤(2)所述待处理混合液为：沉淀加入盐溶液重悬后获取的上清液。
进一步地，上述步骤(1)所述加入脱氧胆酸钠杀菌是在：20～30℃静置1h～24h，优选为1～15h；
所述降温为降温至不超过15℃，优选为不超过12℃；
所述静置沉淀的时间是1～24h；
所述调节pH是调节pH为3.5～4.5。
更进一步地，上述肺炎链球菌为1型、3型、5型、6A型、6B型、9V型、19A型、19F型或23F型时，步骤(1)所述加入脱氧胆酸钠的终浓度为0.1～0.2％w/v；
或，所述肺炎链球菌为4型、7F型、14型或18C型，步骤(1)所述加入脱氧胆酸钠的终浓度为0.3～0.5％w/v。
更进一步地，上述肺炎链球菌为1型、3型或6A型时，所述调节pH是调节pH至4.5；
或，所述肺炎链球菌为6B型、7F型、9V型、14型、18C型、19A型、19F型或23F型时，所述调节pH是调节pH至4.4；
或，所述肺炎链球菌为4型或5型时，所述调节pH是调节pH至4.2。
更进一步地，上述肺炎链球菌为1型、5型、6A型、6B型、7F型、9V型、14型、19A型、19F型或23F型时，所述静置沉淀是在2～8℃下静置1～5h；
或，所述肺炎链球菌为3型、4型、18C型时，所述静置沉淀是在2～8℃下静置5～24h。
更进一步地，上述步骤(2)所述中性磷酸盐缓冲液为：pH为6.0～8.0的磷酸盐缓冲液；所述加入磷酸盐缓冲液的终浓度为0.01～0.10mol/L；所述加入CTAB的终浓度为0.2～2.0％w/v；所述反应时间为60～180分钟；所述盐溶液为浓度为0.1～0.5mol/L的氯化钠水溶液。
更进一步地，上述肺炎链球菌为1型、3型、6A型、7F型、9V型、14型或18C型时，步骤(2)所述中性磷酸盐缓冲液为：pH为6.0～7.0的磷酸盐缓冲液；
或，所述肺炎链球菌为4型、5型、6B型、19A型、23F型时，步骤(2)所述中性磷酸盐缓冲液为：pH为7.0～8.0的磷酸盐缓冲液；
或，所述肺炎链球菌为19F型时，步骤(2)所述中性磷酸盐缓冲液为：pH为6.6～7.4的磷酸盐缓冲液。
更进一步地，上述肺炎链球菌为1型、4型、5型、6A型、6B型、9V型、18C型、19A型或19F型，步骤(2)所述盐溶液为浓度为0.1～0.3mol/L的氯化钠水溶液；
或，所述肺炎链球菌为3型，步骤(2)所述盐溶液为浓度为0.3～0.5mol/L的氯化钠水溶液。
更进一步地，上述步骤(3)所述加入碘化钠的终浓度为0.1～1.0％w/v。
本发明的有益效果在于：
现有的诸多纯化工艺中，通过沉淀核酸等杂质的过程所直接得到的多糖，往往难以达到监管部门要求的质量标准，必须后续增加堆叠更多工艺步骤(例如进一步进行超滤、吸附、柱层析等等)来弥补这一缺陷，但工艺步骤增加势必降低多糖收率，且大幅提高各类成本，工艺稳定性等也受到挑战。不仅如此，引入更多的纯化步骤可能引入更多的外源物质，增加产品风险，且对外源物质的残留量进行检测也会增加大量成本。而本发明在使用DOC杀菌后直接调节杀菌液pH至特定的酸性pH范围，利用DOC在酸性条件下与蛋白结合沉淀的原理沉淀去除蛋白，步骤精减的同时，成功避免了在杀菌液成分复杂的情况下，沉淀蛋白的同时引起多糖沉淀而造成多糖的大规模损失，保证了产率；同时，本发明通过合理的制备方法和参数设计优化，通过DOC和CTAB的沉淀处理即显著降低了料液中蛋白质和核酸等杂质的含量，得到符合质量标准的多糖，无需进一步进行吸附、层析等纯化工艺，大大缩减了纯化步骤；此外，本发明的超滤步骤均采用注射用水超滤，无需使用磷酸盐缓冲液或盐溶液，成本低。
因此，本发明纯化肺炎链球菌荚膜多糖的方法步骤精减，流程和工时短，成本低，工艺可控性和稳定性强；得到的多糖回收率高、质量优异，适于放大生产，有非常好的工业化应用前景。
本发明CTAB是指十六烷基三甲基溴化铵。
本发明所述除去沉淀或收集沉淀的方法是离心、过滤。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为1型肺炎球菌荚膜多糖20181207批纯化过程多糖蛋白及核酸回收率。
图2为3型肺炎球菌荚膜多糖20201001批纯化过程多糖蛋白及核酸回收率。
图3为4型肺炎球菌荚膜多糖20190903批纯化过程多糖蛋白及核酸回收率。
图4为5型肺炎球菌荚膜多糖20200801批纯化过程多糖蛋白及核酸回收率。
图5为6A型肺炎球菌荚膜多糖20190101批纯化过程多糖蛋白及核酸回收率。
图6为6B型肺炎球菌荚膜多糖20190101批纯化过程多糖蛋白及核酸回收率。
图7为7F型肺炎球菌荚膜多糖20190903批纯化过程多糖蛋白及核酸回收率。
图8为9V型肺炎球菌荚膜多糖20190501批纯化过程多糖蛋白及核酸回收率。
图9为14型肺炎球菌荚膜多糖20190201批纯化过程多糖蛋白及核酸回收率。
图10为18C型肺炎球菌荚膜多糖20190904批纯化过程多糖蛋白及核酸回收率。
图11为19A型肺炎球菌荚膜多糖20190301批纯化过程多糖蛋白及核酸回收率。
图12为19F型肺炎球菌荚膜多糖20190301批纯化过程多糖蛋白及核酸回收率。
图13为23F型肺炎球菌荚膜多糖20190701批纯化过程多糖蛋白及核酸回收率。
具体实施方式
1、本发明所用菌种来自中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，菌株编号如下：
2、种子培养
开启工作种子批菌种，接种于肺炎球菌无动物源培养基，在35～38℃、5～15％CO2、100～250rpm条件下培养至对数生长期，此为一级种子液。将一级种子液转种至肺炎球菌无动物源培养基，在相同条件下培养得到二级种子液，重复上述传代方法，培养得到三级和四级种子液用于发酵培养。
3、发酵
培养过程监测培养温度、pH、搅拌速度、通气量、补料、溶氧；取样检测菌液浓度和葡萄糖浓度。
培养温度：35～38℃；pH：用5mol/L氢氧化钠溶液维持发酵液pH；搅拌速度：根据菌液浓度动态调节；溶氧：表层通氮气控制；补料：发酵过程中根据发酵液中葡萄糖浓度连续补料，葡萄糖浓度以50mmol/L～90mmol/L为宜。发酵至光密度值没有明显增加或开始降低时结束发酵，获得发酵液。
4、纯化
下面通过实施例说明本发明肺炎链球菌荚膜多糖纯化过程
实施例1、1型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
肺炎链球菌荚膜多糖的纯化主要由沉淀、离心/过滤、超滤浓缩、解离步骤组成，除另外指出，所有步骤均在室温下进行。
1.1杀菌液获得
于1型肺炎链球菌发酵液中加入脱氧胆酸钠，终浓度0.2％(w/v)，混匀后室温静置15小时，裂解细胞，释放荚膜多糖，此为杀菌液。
1.2杀菌液澄清及调酸超滤液制备
将杀菌液降温至5～15℃。边搅拌边加入冰醋酸调节pH值至4.5，然后置于2～8℃环境下静置4小时。静置结束后，离心收集上清液，用注射用水超滤，获得调酸超滤液。该步骤利用脱氧胆酸钠在酸性条件下沉淀蛋白、超滤等手段去除了大部分蛋白、核酸、菌体和低分子量的培养基组分。
1.3CTAB处理
加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液，终浓度0.02mol/L，缓慢加入CTAB溶液，终浓度1.0％(w/v)，室温下搅拌反应约180分钟，离心收集沉淀。用浓度0.3mol/L的氯化钠水溶液重悬沉淀，室温下搅拌解离沉淀，解离完毕后，将氯化钠解离液离心并收获上清，此为氯化钠解离上清。在该步骤核酸杂质被显著地去除。
1.4NaI超滤液制备
向氯化钠解离上清中加入碘化钠固体，NaI终浓度1.0％(w/v)，搅拌反应后离心并过滤，收集滤出液。用注射用水超滤，浓缩，此为NaI超滤液。此时即获得符合质量要求的纯化多糖溶液，冻干后可长期保存。
纯化过程各步骤中多糖、蛋白和核酸的回收结果如表1、图1所示：
表1 1型20181207批纯化过程检测结果
多糖回收及质量分析结果如表2所示，1型多糖纯化工艺稳定性良好。
表2三批1型肺炎链球菌荚膜多糖检定结果
实施例2、3型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
肺炎链球菌荚膜多糖的纯化主要由沉淀、离心/过滤、超滤浓缩、解离步骤组成，除另外指出，所有步骤均在室温下进行。
1.1杀菌液获得
于3型肺炎链球菌发酵液中加入脱氧胆酸钠，终浓度0.2％(w/v)，混匀后室温静置15小时，裂解细胞，释放荚膜多糖，此为杀菌液。
1.2杀菌液澄清及调酸超滤液制备
将杀菌液降温至5～15℃。边搅拌边加入冰醋酸调节pH值至4.5，然后置于2～8℃环境下静置14小时。静置结束后，离心收集上清液，用注射用水超滤，获得调酸超滤液。该步骤利用脱氧胆酸钠在酸性条件下沉淀蛋白、超滤等手段去除了大部分蛋白、核酸、菌体和低分子量的培养基组分。
1.3CTAB处理
加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液，终浓度0.02mol/L，缓慢加入CTAB溶液，终浓度1.0％(w/v)，室温下搅拌反应约180分钟，离心收集沉淀。用浓度0.4mol/L的氯化钠水溶液重悬沉淀，室温下搅拌解离沉淀，解离完毕后，将氯化钠解离液离心并收获上清，此为氯化钠解离上清。在该步骤核酸杂质被显著地去除。
1.4NaI超滤液制备
向氯化钠解离上清中加入碘化钠固体，NaI终浓度1.0％(w/v)，搅拌反应后离心并过滤，收集滤出液。用注射用水超滤，浓缩，此为NaI超滤液。此时即获得符合质量要求的纯化多糖溶液，冻干后可长期保存。
纯化过程各步骤中多糖、蛋白和核酸的回收结果如表3、图2所示：
表3 3型20201001批纯化过程检测结果
多糖回收及质量分析结果如表4所示，3型多糖纯化工艺稳定性良好。
表4三批3型肺炎链球菌荚膜多糖检定结果
实施例3、4型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
肺炎链球菌荚膜多糖的纯化主要由沉淀、离心/过滤、超滤浓缩、解离步骤组成，除另外指出，所有步骤均在室温下进行。
1.1杀菌液获得
于4型肺炎链球菌发酵液中加入脱氧胆酸钠，终浓度0.4％(w/v)，混匀后室温静置15小时，裂解细胞，释放荚膜多糖，此为杀菌液。
1.2杀菌液澄清及调酸超滤液制备
将杀菌液降温至5～15℃。边搅拌边加入冰醋酸调节pH值至4.2，然后置于2～8℃环境下静置20小时。静置结束后，离心收集上清液，用注射用水超滤，获得调酸超滤液。该步骤利用脱氧胆酸钠在酸性条件下沉淀蛋白、超滤等手段去除了大部分蛋白、核酸、菌体和低分子量的培养基组分。
1.3CTAB处理
加入pH为7.8的磷酸盐缓冲液，终浓度0.02mol/L，缓慢加入CTAB溶液，终浓度1.0％(w/v)，室温下搅拌反应约180分钟，离心收集沉淀。用浓度0.3mol/L的氯化钠水溶液重悬沉淀，室温下搅拌解离沉淀，解离完毕后，将氯化钠解离液离心并收获上清，此为氯化钠解离上清。在该步骤核酸杂质被显著地去除。
1.4NaI超滤液制备
向氯化钠解离上清中加入碘化钠固体，NaI终浓度1.0％(w/v)，搅拌反应后离心并过滤，收集滤出液。用注射用水超滤，浓缩，此为NaI超滤液。此时即获得符合质量要求的纯化多糖溶液，冻干后可长期保存。
纯化过程各步骤中多糖、蛋白和核酸的回收结果如表5、图3所示：
表5 4型20190903批纯化过程检测结果
多糖回收及质量分析结果如表6所示，4型多糖纯化工艺稳定性良好。
表6三批4型肺炎链球菌荚膜多糖检定结果
实施例4、5型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
肺炎链球菌荚膜多糖的纯化主要由沉淀、离心/过滤、超滤浓缩、解离步骤组成，除另外指出，所有步骤均在室温下进行。
1.1杀菌液获得
于5型肺炎链球菌发酵液中加入脱氧胆酸钠，终浓度0.2％(w/v)，混匀后室温静置15小时，裂解细胞，释放荚膜多糖，此为杀菌液。
1.2杀菌液澄清及调酸超滤液制备
将杀菌液降温至5～15℃。边搅拌边加入冰醋酸调节pH值至4.2，然后置于2～8℃环境下静置4小时。静置结束后，离心收集上清液，用注射用水超滤，获得调酸超滤液。该步骤利用脱氧胆酸钠在酸性条件下沉淀蛋白、超滤等手段去除了大部分蛋白、核酸、菌体和低分子量的培养基组分。
1.3CTAB处理
加入pH为7.8的磷酸盐缓冲液，终浓度0.02mol/L，缓慢加入CTAB溶液，终浓度1.0％(w/v)，室温下搅拌反应约180分钟，离心收集沉淀。用浓度0.3mol/L的氯化钠水溶液重悬沉淀，室温下搅拌解离沉淀，解离完毕后，将氯化钠解离液离心并收获上清，此为氯化钠解离上清。在该步骤核酸杂质被显著地去除。
1.4NaI超滤液制备
向氯化钠解离上清中加入碘化钠固体，NaI终浓度1.0％(w/v)，搅拌反应后离心并过滤，收集滤出液。用注射用水超滤，浓缩，此为NaI超滤液。此时即获得符合质量要求的纯化多糖溶液，冻干后可长期保存。
纯化过程各步骤中多糖、蛋白和核酸的回收结果如表7、图4所示：
表7 5型20200801批纯化过程检测结果
多糖回收及质量分析结果如表8所示，5型多糖纯化工艺稳定性良好
表8三批5型肺炎链球菌荚膜多糖检定结果
实施例5、6A型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
肺炎链球菌荚膜多糖的纯化主要由沉淀、离心/过滤、超滤浓缩、解离步骤组成，除另外指出，所有步骤均在室温下进行。
1.1杀菌液获得
于6A型肺炎链球菌发酵液中加入脱氧胆酸钠，终浓度0.2％(w/v)，混匀后室温静置15小时，裂解细胞，释放荚膜多糖，此为杀菌液。
1.2杀菌液澄清及调酸超滤液制备
将杀菌液降温至5～15℃。边搅拌边加入冰醋酸调节pH值至4.5，然后置于2～8℃环境下静置4小时。静置结束后，离心收集上清液，用注射用水超滤，获得调酸超滤液。该步骤利用脱氧胆酸钠在酸性条件下沉淀蛋白、超滤等手段去除了大部分蛋白、核酸、菌体和低分子量的培养基组分。
1.3CTAB处理
加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液，终浓度0.02mol/L，缓慢加入CTAB溶液，终浓度1.0％(w/v)，室温下搅拌反应约180分钟，离心收集沉淀。用浓度0.3mol/L的氯化钠水溶液重悬沉淀，室温下搅拌解离沉淀，解离完毕后，将氯化钠解离液离心并收获上清，此为氯化钠解离上清。在该步骤核酸杂质被显著地去除。
1.4NaI超滤液制备
向氯化钠解离上清中加入碘化钠固体，NaI终浓度1.0％(w/v)，搅拌反应后离心并过滤，收集滤出液。用注射用水超滤，浓缩，此为NaI超滤液。此时即获得符合质量要求的纯化多糖溶液，冻干后可长期保存。
纯化过程各步骤中多糖、蛋白和核酸的回收结果如表9、图5所示：
表9 6A型20190101批纯化过程检测结果
多糖回收及质量分析结果如表10所示，6A型多糖纯化工艺稳定性良好
表10三批6A型肺炎链球菌荚膜多糖检定结果
实施例6、6B型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
肺炎链球菌荚膜多糖的纯化主要由沉淀、离心/过滤、超滤浓缩、解离步骤组成，除另外指出，所有步骤均在室温下进行。
1.1杀菌液获得
于6B型肺炎链球菌发酵液中加入脱氧胆酸钠，终浓度0.2％(w/v)，混匀后室温静置15小时，裂解细胞，释放荚膜多糖，此为杀菌液。
1.2杀菌液澄清及调酸超滤液制备
将杀菌液降温至5～15℃。边搅拌边加入冰醋酸调节pH值至4.4，然后置于2～8℃环境下静置4小时。静置结束后，离心收集上清液，用注射用水超滤，获得调酸超滤液。该步骤利用脱氧胆酸钠在酸性条件下沉淀蛋白、超滤等手段去除了大部分蛋白、核酸、菌体和低分子量的培养基组分。
1.3CTAB处理
加入pH为7.8的磷酸盐缓冲液，终浓度0.02mol/L，缓慢加入CTAB溶液，终浓度1.0％(w/v)，室温下搅拌反应约180分钟，离心收集沉淀。用浓度0.3mol/L的氯化钠水溶液重悬沉淀，室温下搅拌解离沉淀，解离完毕后，将氯化钠解离液离心并收获上清，此为氯化钠解离上清。在该步骤核酸杂质被显著地去除。
1.4NaI超滤液制备
向氯化钠解离上清中加入碘化钠固体，NaI终浓度1.0％(w/v)，搅拌反应后离心并过滤，收集滤出液。用注射用水超滤，浓缩，此为NaI超滤液。此时即获得符合质量要求的纯化多糖溶液，冻干后可长期保存。
纯化过程各步骤中多糖、蛋白和核酸的回收结果如表11、图6所示：
表11 6B型20190101批纯化过程检测结果
多糖回收及质量分析结果如表12所示，6B型多糖纯化工艺稳定性良好。
表12三批6B型肺炎链球菌荚膜多糖检定结果
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实施例7、7F型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
7F型肺炎荚膜多糖的纯化主要由沉淀、离心/过滤、超滤浓缩组成，除另外指出，所有步骤均在室温下进行。
1.1杀菌液获得
于7F型肺炎链球菌发酵液中加入脱氧胆酸钠，终浓度0.4％(w/v)，混匀后室温静置15小时，裂解细胞，释放荚膜多糖，此为杀菌液。
1.2杀菌液澄清及调酸超滤液制备
将杀菌液降温至5～15℃。边搅拌边加入冰醋酸调节pH值至4.4，然后置于2～8℃环境下静置4小时。静置结束后，离心收集上清液，用注射用水超滤，获得调酸超滤液。该步骤利用脱氧胆酸钠在酸性条件下沉淀蛋白、超滤等手段去除了大部分蛋白、核酸、菌体和低分子量的培养基组分。
1.3CTAB处理
加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液，终浓度约0.05mol/L，缓慢加入CTAB溶液，终浓度约1.0％(w/v)，室温下搅拌反应180分钟，离心收集上清，此为CTAB上清。在该步骤核酸杂质被显著的去除。
1.4NaI超滤液制备
向CTAB上清中加入碘化钠固体，NaI终浓度约1.0％(w/v)，搅拌反应后离心并过滤，收集滤出液。用注射用水超滤，浓缩，此为NaI超滤液。此时即获得符合质量要求的纯化多糖溶液，冻干后可长期保存。
纯化过程各步骤中多糖、蛋白和核酸的回收结果如表13、图7所示：
表13 7F型20190903批纯化过程检测结果
多糖回收及质量分析结果如表14所示，7F型多糖纯化工艺稳定性良好。
表14三批7F型肺炎链球菌荚膜多糖检定结果
实施例8、9V型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
肺炎链球菌荚膜多糖的纯化主要由沉淀、离心/过滤、超滤浓缩、解离步骤组成，除另外指出，所有步骤均在室温下进行。
1.1杀菌液获得
于9V型肺炎链球菌发酵液中加入脱氧胆酸钠，终浓度0.2％(w/v)，混匀后室温静置15小时，裂解细胞，释放荚膜多糖，此为杀菌液。
1.2杀菌液澄清及调酸超滤液制备
将杀菌液降温至5～15℃。边搅拌边加入冰醋酸调节pH值至4.4，然后置于2～8℃环境下静置4小时。静置结束后，离心收集上清液，用注射用水超滤，获得调酸超滤液。该步骤利用脱氧胆酸钠在酸性条件下沉淀蛋白、超滤等手段去除了大部分蛋白、核酸、菌体和低分子量的培养基组分。
1.3CTAB处理
加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液，终浓度0.02mol/L，缓慢加入CTAB溶液，终浓度1.0％(w/v)，室温下搅拌反应约180分钟，离心收集沉淀。用浓度0.3mol/L的氯化钠水溶液重悬沉淀，室温下搅拌解离沉淀，解离完毕后，将氯化钠解离液离心并收获上清，此为氯化钠解离上清。在该步骤核酸杂质被显著地去除。
1.4NaI超滤液制备
向氯化钠解离上清中加入碘化钠固体，NaI终浓度1.0％(w/v)，搅拌反应后离心并过滤，收集滤出液。用注射用水超滤，浓缩，此为NaI超滤液。此时即获得符合质量要求的纯化多糖溶液，冻干后可长期保存。
纯化过程各步骤中多糖、蛋白和核酸的回收结果如表15、图8所示：
表15 9V型20190501批纯化过程检测结果
多糖回收及质量分析结果如表16所示，9V型多糖纯化工艺稳定性良好。
表16三批9V型肺炎链球菌荚膜多糖检定结果
实施例9、14型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
14型肺炎荚膜多糖的纯化主要由沉淀、离心/过滤、超滤浓缩组成，除另外指出，所有步骤均在室温下进行。
1.1杀菌液获得
于14型肺炎链球菌发酵液中加入脱氧胆酸钠，终浓度0.4％(w/v)，混匀后室温静置15小时，裂解细胞，释放荚膜多糖，此为杀菌液。
1.2杀菌液澄清及调酸超滤液制备
将杀菌液降温至5～15℃。边搅拌边加入冰醋酸调节pH值至4.4，然后置于2～8℃环境下静置4小时。静置结束后，离心收集上清液，用注射用水超滤，获得调酸超滤液。该步骤利用脱氧胆酸钠在酸性条件下沉淀蛋白、超滤等手段去除了大部分蛋白、核酸、菌体和低分子量的培养基组分。
1.3CTAB处理
加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液，终浓度约0.05mol/L，缓慢加入CTAB溶液，终浓度约1.0％(w/v)，室温下搅拌反应180分钟，离心收集上清，此为CTAB上清。在该步骤核酸杂质被显著的去除。
1.4NaI超滤液制备
向CTAB上清中加入碘化钠固体，NaI终浓度约1.0％(w/v)，搅拌反应后离心并过滤，收集滤出液。用注射用水超滤，浓缩，此为NaI超滤液。此时即获得符合质量要求的纯化多糖溶液，冻干后可长期保存。
纯化过程各步骤中多糖、蛋白和核酸的回收结果如表17、图9所示：
表17 14型20190201批纯化过程检测结果
多糖回收及质量分析结果如表18所示，14型多糖纯化工艺稳定性良好。
表18三批14型肺炎链球菌荚膜多糖检定结果
实施例10、18C型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
肺炎链球菌荚膜多糖的纯化主要由沉淀、离心/过滤、超滤浓缩、解离步骤组成，除另外指出，所有步骤均在室温下进行。
1.1杀菌液获得
于18C型肺炎链球菌发酵液中加入脱氧胆酸钠，终浓度0.4％(w/v)，混匀后室温静置15小时，裂解细胞，释放荚膜多糖，此为杀菌液。
1.2杀菌液澄清及调酸超滤液制备
将杀菌液降温至5～15℃。边搅拌边加入冰醋酸调节pH值至4.4，然后置于2～8℃环境下静置14小时。静置结束后，离心收集上清液，用注射用水超滤，获得调酸超滤液。该步骤利用脱氧胆酸钠在酸性条件下沉淀蛋白、超滤等手段去除了大部分蛋白、核酸、菌体和低分子量的培养基组分。
1.3CTAB处理
加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液，终浓度0.02mol/L，缓慢加入CTAB溶液，终浓度1.0％(w/v)，室温下搅拌反应约180分钟，离心收集沉淀。用浓度0.3mol/L的氯化钠水溶液重悬沉淀，室温下搅拌解离沉淀，解离完毕后，将氯化钠解离液离心并收获上清，此为氯化钠解离上清。在该步骤核酸杂质被显著地去除。
1.4NaI超滤液制备
向氯化钠解离上清中加入碘化钠固体，NaI终浓度1.0％(w/v)，搅拌反应后离心并过滤，收集滤出液。用注射用水超滤，浓缩，此为NaI超滤液。此时即获得符合质量要求的纯化多糖溶液，冻干后可长期保存。
纯化过程各步骤中多糖、蛋白和核酸的回收结果如表19、图10所示：
表19 18C型20190904批纯化过程检测结果
多糖回收及质量分析结果如表20所示，18C型多糖纯化工艺稳定性良好。
表20三批18C型肺炎链球菌荚膜多糖检定结果
实施例11、19A型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
肺炎链球菌荚膜多糖的纯化主要由沉淀、离心/过滤、超滤浓缩、解离步骤组成，除另外指出，所有步骤均在室温下进行。
1.1杀菌液获得
于19A型肺炎链球菌发酵液中加入脱氧胆酸钠，终浓度0.2％(w/v)，混匀后室温静置15小时，裂解细胞，释放荚膜多糖，此为杀菌液。
1.2杀菌液澄清及调酸超滤液制备
将杀菌液降温至5～15℃。边搅拌边加入冰醋酸调节pH值至4.4，然后置于2～8℃环境下静置4小时。静置结束后，离心收集上清液，用注射用水超滤，获得调酸超滤液。该步骤利用脱氧胆酸钠在酸性条件下沉淀蛋白、超滤等手段去除了大部分蛋白、核酸、菌体和低分子量的培养基组分。
1.3CTAB处理
加入pH为7.8的磷酸盐缓冲液，终浓度0.02mol/L，缓慢加入CTAB溶液，终浓度1.0％(w/v)，室温下搅拌反应约180分钟，离心收集沉淀。用浓度0.3mol/L的氯化钠水溶液重悬沉淀，室温下搅拌解离沉淀，解离完毕后，将氯化钠解离液离心并收获上清，此为氯化钠解离上清。在该步骤核酸杂质被显著地去除。
1.4NaI超滤液制备
向氯化钠解离上清中加入碘化钠固体，NaI终浓度1.0％(w/v)，搅拌反应后离心并过滤，收集滤出液。用注射用水超滤，浓缩，此为NaI超滤液。此时即获得符合质量要求的纯化多糖溶液，冻干后可长期保存。
纯化过程各步骤中多糖、蛋白和核酸的回收结果如表21、图11所示：
表21 19A型20190301批纯化过程检测结果
多糖回收及质量分析结果如表22所示，19A型多糖纯化工艺稳定性良好。
表22三批19A型肺炎链球菌荚膜多糖检定结果
实施例12、19F型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
肺炎链球菌荚膜多糖的纯化主要由沉淀、离心/过滤、超滤浓缩、解离步骤组成，除另外指出，所有步骤均在室温下进行。
1.1杀菌液获得
于19F型肺炎链球菌发酵液中加入脱氧胆酸钠，终浓度0.2％(w/v)，混匀后室温静置15小时，裂解细胞，释放荚膜多糖，此为杀菌液。
1.2杀菌液澄清及调酸超滤液制备
将杀菌液降温至5～15℃。边搅拌边加入冰醋酸调节pH值至4.4，然后置于2～8℃环境下静置4小时。静置结束后，离心收集上清液，用注射用水超滤，获得调酸超滤液。该步骤利用脱氧胆酸钠在酸性条件下沉淀蛋白、超滤等手段去除了大部分蛋白、核酸、菌体和低分子量的培养基组分。
1.3CTAB处理
加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液，终浓度0.02mol/L，缓慢加入CTAB溶液，终浓度1.0％(w/v)，室温下搅拌反应约180分钟，离心收集沉淀。用浓度0.3mol/L的氯化钠水溶液重悬沉淀，室温下搅拌解离沉淀，解离完毕后，将氯化钠解离液离心并收获上清，此为氯化钠解离上清。在该步骤核酸杂质被显著地去除。
1.4NaI超滤液制备
向氯化钠解离上清中加入碘化钠固体，NaI终浓度1.0％(w/v)，搅拌反应后离心并过滤，收集滤出液。用注射用水超滤，浓缩，此为NaI超滤液。此时即获得符合质量要求的纯化多糖溶液，冻干后可长期保存。
纯化过程各步骤中多糖、蛋白和核酸的回收结果如表23、图12所示：
表23 19F型20190301批纯化过程检测结果
多糖回收及质量分析结果如表24所示，19F型多糖纯化工艺稳定性良好。
表24三批19F型肺炎链球菌荚膜多糖检定结果
实施例13、23F型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化
23F型肺炎荚膜多糖的纯化主要由沉淀、离心/过滤、超滤浓缩组成，除另外指出，所有步骤均在室温下进行。
1.1杀菌液获得
于23F型肺炎链球菌发酵液中加入脱氧胆酸钠，终浓度0.2％(w/v)，混匀后室温静置15小时，裂解细胞，释放荚膜多糖，此为杀菌液。
1.2杀菌液澄清及调酸超滤液制备
将杀菌液降温至5～15℃。边搅拌边加入冰醋酸调节pH值至4.4，然后置于2～8℃环境下静置4小时。静置结束后，离心收集上清液，用注射用水超滤，获得调酸超滤液。该步骤利用脱氧胆酸钠在酸性条件下沉淀蛋白、超滤等手段去除了大部分蛋白、核酸、菌体和低分子量的培养基组分。
1.3CTAB处理
加入pH为7.8的磷酸盐缓冲液，终浓度约0.05mol/L，缓慢加入CTAB溶液，终浓度约1.0％(w/v)，室温下搅拌反应180分钟，离心收集上清，此为CTAB上清。在该步骤核酸杂质被显著的去除。
1.4NaI超滤液制备
向CTAB上清中加入碘化钠固体，NaI终浓度约1.0％(w/v)，搅拌反应后离心并过滤，收集滤出液。用注射用水超滤，浓缩，此为NaI超滤液。此时即获得符合质量要求的纯化多糖溶液，冻干后可长期保存。
纯化过程各步骤中多糖、蛋白和核酸的回收结果如表25、图13所示：
表25 23F型20190701批纯化过程检测结果
多糖回收及质量分析结果如表26所示，23F型多糖纯化工艺稳定性良好。
表26三批23F型肺炎链球菌荚膜多糖检定结果
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、脱氧胆酸钠用量的优化
发明人针对不同血清型的肺炎链球菌，对脱氧胆酸钠优选的用量进行了筛选，发现脱氧胆酸钠用量对纯化后结果产生了明显影响，以7F型及14型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化为例，如表27所示，当采用终浓度0.2％的DOC杀菌时，纯化后多糖的蛋白质含量相对较高，增加DOC终浓度至0.4％后，纯化多糖的蛋白质含量能进一步显著降低。
表27 7F型和14型肺炎链球菌荚膜多糖采用不同浓度脱氧胆酸钠杀菌及纯化后结果
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实验例2、调酸沉淀工艺参数优化
发明人针对不同血清型的肺炎链球菌，对DOC杀菌和调酸沉淀过程的工艺参数进行了筛选，发现除了DOC用量外，其与pH值、静置沉淀时间等参数的结合对纯化结果也有明显影响。此处以4型肺炎链球菌荚膜多糖为例，展示DOC杀菌并调酸沉淀的工艺中不同参数组合的纯化效果，如表28所示。可见，对4型肺炎链球菌荚膜多糖而言，在DOC用量为终浓度0.4％w/v的基础上，在pH为4.2，静置沉淀时间20小时的情况下，能够同时取得较高的多糖回收率和显著降低的杂质含量。可见，调酸沉淀工艺步骤的参数优化中，单个因素的调整有时无法取得理想效果，需要多个因素同时进行调整，形成优化后的参数组合，以取得良好纯化效果。相应的，发明人对其它血清型的肺炎链球菌荚膜多糖的纯化参数均进行了筛选优化，最终得到的最优方案(多糖回收率高且杂质含量低，质量优异)在实施例记载。
表28 4型肺炎链球菌荚膜多糖调酸超滤液制备参数对比
特别需要说明的是，与对比文件专利CN101180079B中记载的实施例13(同样是对4型肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法)可以看到，该工艺的相应参数(DOC终浓度0.12％，pH6.4～6.8)和本发明的方案完全不同，会导致其用DOC处理的步骤纯化效果不足，因此需要后续活性炭吸附过滤和羟基磷灰石柱层析等步骤进一步进行纯化。
实验例3、23F型肺炎链球菌荚膜多糖CTAB处理参数的优化
本发明的工艺在开发中发现较低的CTAB浓度无法理想的沉淀多糖，提高浓度可相对提高沉淀效率，例如专利CN101180079B中的实施例13公开的对23F型肺炎链球菌荚膜多糖纯化的CTAB处理步骤中，CTAB的终浓度和其他血清型不同，需提高到3％。
然而，CTAB浓度过高不利于反应体系的稳定，首先，CTAB溶解度较低，提高浓度必然增加母液用量从而增加整体反应体积，此外在高浓度下CTAB本身容易以沉淀形式析出，不利于分离多糖沉淀，因此本发明另辟蹊径，以1.0％CTAB的终浓度沉淀杂质，从表29可以看到，23F型多糖存在于反应液上清中，未与CTAB形成多糖沉淀，进而省去了氯化钠溶液复溶沉淀和离心等步骤，意外获得了优异的纯化效果。相比于专利CN101180079B公开的纯化方法，缩短了工艺流程，节约了大量人力物料成本，总体上具备显著优势。
表29 23F型CTAB处理结果
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实验例4、3型NaCl解离参数的优化
3型在CTAB沉淀后，用于重悬沉淀的NaCl溶液浓度进行了调整，发现不同浓度的NaCl可从沉淀中解离出不同的物质，从而影响杂质和目标多糖的分离效果，如表30所示，使用0.2mol/L的NaCl溶液重悬沉淀，悬浊液离心后上清中核酸浓度相对较高，产品存在不合格的风险，经过微调NaCl溶液浓度后，核酸含量明显下降。
表30 3型NaCl解离上清结果
实验例5、本发明工艺稳定性验证
表31为19A型3批相同工艺相同规模的纯化多糖检定结果以及和专利CN101663327B公开的纯化方法所得的数据(L29276-116、L29276-143)的对比。
表31 19A型肺炎球菌多糖制备工艺确认
上表可见，专利CN101663327B公开的工艺稳定性不强，产品质量批间差异较大。而本发明各批次间差异小，工艺可控性和稳定性强。
综上，本发明提供了一种纯化肺炎链球菌荚膜多糖的方法，步骤精减，流程和工时短，成本低，工艺可控性和稳定性强，得到的多糖回收率高、质量优异，适于放大生产，有非常好的工业化应用前景。
Claims (10)
1.一种纯化肺炎链球菌荚膜多糖的方法，其特征在于，由如下步骤组成：
(1)向肺炎链球菌菌液中加入脱氧胆酸钠杀菌，再降温并调节pH至不高于4.5，在2～8℃静置沉淀后除去沉淀得上清液，超滤得超滤液；所述加入脱氧胆酸钠的终浓度为0.1～0.5％w/v；
(2)向超滤液中加入中性磷酸盐缓冲液及CTAB反应产生沉淀后，收集上清液得到待处理混合液，或收集沉淀加入盐溶液重悬后获取上清液得到待处理混合液；
(3)向待处理混合液中加入碘化钠产生沉淀，除去沉淀，超滤后即得纯化的肺炎链球菌荚膜多糖溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肺炎链球菌为7F型、14型或23F型肺炎链球菌，步骤(2)所述待处理混合液为收集的上清液；
或，所述肺炎链球菌为1型、3型、4型、5型、6A型、6B型、9V型、18C型、19A型或19F型，步骤(2)所述待处理混合液为：沉淀加入盐溶液重悬后获取的上清液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述加入脱氧胆酸钠杀菌是在：20～30℃静置1h～24h，优选为1～15h；
所述降温为降温至不超过15℃，优选为不超过12℃；
所述静置沉淀的时间是1～24h；
所述调节pH是调节pH为3.5～4.5；
和/或所述超滤为用注射用水超滤。
4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述肺炎链球菌为1型、3型、5型、6A型、6B型、9V型、19A型、19F型或23F型，步骤(1)所述加入脱氧胆酸钠的终浓度为0.1～0.2％w/v；
或，所述肺炎链球菌为4型、7F型、14型或18C型，步骤(1)所述加入脱氧胆酸钠的终浓度为0.3～0.5％w/v。
5.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述肺炎链球菌为1型、3型或6A型，所述调节pH是调节pH至4.5；
或，所述肺炎链球菌为6B型、7F型、9V型、14型、18C型、19A型、19F型或23F型，所述调节pH是调节pH至4.4；
或，所述肺炎链球菌为4型或5型，所述调节pH是调节pH至4.2。
6.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述肺炎链球菌为1型、5型、6A型、6B型、7F型、9V型、14型、19A型、19F型或23F型，所述静置沉淀是在2～8℃下静置1～5h；
或，所述肺炎链球菌为3型、4型、18C型，所述静置沉淀是在2～8℃下静置5～24h。
7.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述中性磷酸盐缓冲液为：pH为6.0～8.0的磷酸盐缓冲液；所述加入磷酸盐缓冲液的终浓度为0.01～0.10mol/L；所述加入CTAB的终浓度为0.2～2.0％w/v；所述反应时间为60～180分钟；所述盐溶液为浓度为0.1～0.5mol/L的氯化钠水溶液。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述肺炎链球菌为1型、3型、6A型、7F型、9V型、14型或18C型，步骤(2)所述中性磷酸盐缓冲液为：pH为6.0～7.0的磷酸盐缓冲液；
或，所述肺炎链球菌为4型、5型、6B型、19A型、23F型，步骤(2)所述中性磷酸盐缓冲液为：pH为7.0～8.0的磷酸盐缓冲液；
或，所述肺炎链球菌为19F型，步骤(2)所述中性磷酸盐缓冲液为：pH为6.6～7.4的磷酸盐缓冲液。
9.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述肺炎链球菌为1型、4型、5型、6A型、6B型、9V型、18C型、19A型或19F型，步骤(2)所述盐溶液为浓度为0.1～0.3mol/L的氯化钠水溶液；
或，所述肺炎链球菌为3型，步骤(2)所述盐溶液为浓度为0.3～0.5mol/L的氯化钠水溶液。
10.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述加入碘化钠的终浓度为0.1～1.0％w/v；和/或所述超滤为用注射用水超滤。
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