JPS6020149A - 免疫化学的測定方法及びその試薬 - Google Patents
免疫化学的測定方法及びその試薬Info
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- JPS6020149A JPS6020149A JP12773183A JP12773183A JPS6020149A JP S6020149 A JPS6020149 A JP S6020149A JP 12773183 A JP12773183 A JP 12773183A JP 12773183 A JP12773183 A JP 12773183A JP S6020149 A JPS6020149 A JP S6020149A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、ハプテンの新しいタイプの免疫化学的測定方
法及びその方法に利用するのに適した新しいタイプの測
定試朶に関する。 とくに、本発明は例えば血液、[せその他の体液や体液
成分などの如き被検体中の微量なハブテンを免疫化学的
に測定する沖]定方法及びその試桑に関し、侃れプξな
i′(′実性、信61度、精度、敏感EL及び高い特異
性をもって、偽反応生起のトラブルを伴うことなしに、
再現性良く安定且つ容易な操作で、短時間に被検体中の
IR−r:、なハプテンを免ずC日ヒ学的に測冗できる
新しいタイプの辿1定方法及びその方法に利用するに適
した新しいタイプの測定試ゼ;憔に関する。 更に詳しくは、本発明は、− L4) ハプテン又はその化学的変性物を、化学的に結
合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフィン系
高分子化合物、若しくは該結合物が約0.01〜約2ミ
クロンの粒径の高分子ラテックス担体に化学的に結合し
て成るハゾデン担(・1担体 及び CB) 上記ハプテンに対する単一種のモノクロナル抗
体担持担体 を用い、被検体中のノ・ブテンによる上記(A)及び(
13)両試薬成分の凝集阻止反応を測定することを特徴
とする上記イ、皮検体中のノ・ブテンの免疫化学的測定
方法に関する。本発明はまた、(A) ハプテン又はそ
の化学的変141ミ物を、化学的に結合せしめたカルボ
キシル、J、(;含有水溶性モノオレフィン系高分子化
合物、へしくけ該結合物が約0.01〜約2ミクロンの
粒径の高分子ラテックスJ’TI体に化学的に結合して
成るハプテン担持担体 及び (13) 上記ハシテンに対する単−計重のモノクロナ
ル抗体Jl[] J寺担体 から成ることを特徴とするノ・ブテンの免疫化学的測定
試薬にも関する。 従来、例えば血液、尿その他の体液や体液成分などの如
き検体中に存在する生物学的活性を有する微用物グ・T
を、免疫化学的手段で測定する方法は古くから知られて
いる。かかる免抑化学的測定法として、例えば赤血球を
担体として用い、これを抗原又は抗体で感作し、これオ
被恢戒中の抗体又は抗原と反応させ、その際、免疫化学
的凝集又は凝集阻止反応を生起させて、該機上)4物質
を測定する方法も既に知られている。また、担体として
寿血球の代り(・(、非生物学的粒子として例えば合成
樹脂ラテックス、ベントナイト、Jロジオン、コレステ
ロール結晶、水晶等を免疫化学反応における固体jLJ
体として用いることも知られている(以上例えば%開明
50−82230 号公開公!4 )。 このような抗原抗体反応を利用した免疫化学的手法によ
って伎検体中の抗原の存在(定性)もしくはその;H:
゛> K (定置)を測定検出するのに従来もつとも普
通に利用されてきた抗体感作担体は、ハ?リクロナル抗
体感作担体であった。 1975年C、kfilsteinらがマウスのミエロ
ーマ#ill l1iqと牌絃中の抗体産生細胞とをI
?lil I!i・IFl?It合し、該、I’ll+
胞からモノクロナル抗体の産生に成功して以来、細胞θ
11(合技術分野における著るしい技術の進歩に伴って
、モノクロナル抗体産生#lII Iii、1株の形成
、それを利用したモノクロナル抗体の産生が容易となシ
、このようなモノクロナル抗体を利用した抗原の免疫化
学的測定方法に関する提案がなされるようになった。 このような提案として、特開昭57−86051号の提
案が知られている。この提案に於ては、2個又はそれ以
上の異f=n Fのモノクロナル抗体が同一の抗原に対
応[7て用いられることを特FI(とじ、少くとも2個
の抗体分子に抗原をh″i合させる免疫化学的反応を利
用した抗原穴1:1−法が提3Sされている。そして、
この提案には、従来の抗体すなわちポリクロナル抗体が
対応抗原と反応して沈殿物を生ずる公知現象とは全く異
なって、モノクロナル抗体は対応抗原と結合して沈殿物
を生成することがなく、モノクロナル抗体で被キ]qさ
れた例えば赤血球、ラテックス球、全屈粒子などの如き
担体粒子が対応抗原の存在下で凝集しないことが記載さ
れている。 この提案に於ては、従来公知の知見とは異って、モノク
ロナル抗体は対応抗原と結合して沈殿物を生成し々いと
いう事実があるにも拘わらず、複数種の異種モノクロナ
ル抗体を使用すると抗原と結合して沈殿物を生成できる
という新しい知見が得られたことを記載し、それゆえに
、この提案においては、上述のとおり、少なくとも二種
のbl Ijltモノクロナル抗体の使用を必須とする
抗原定量法に特定されている。 更に、この提案には、このような複数種の異種モノクロ
ナル抗体のイU:用に上ってもなセ、(1・I[−iの
感度と!1ヶ異性に閂[7て必ずしも好結果が得られる
わけではなく、全く効果的ではないことさえあり得るた
め、可能な限りの結合の仕方を試1トた上で(發削謂塾
1尺しなけれ(r−1:ならないことを記j71i L
、ている。 このようなr′、を数種の!A種モノクロナル抗体の使
用を必キf■とする州似の提案として、!1−〒開昭5
7−118159号の提案も知られている。 そして、これらモノクロナル抗体を利用する抗原の免疫
化学的測定方法に門する従来提案に於ては、従来のポリ
クロナル抗体の±−)合とは異なって、単−利iのモノ
クロナル抗体は対応抗体抗原と結合して沈殿物を生成せ
ず、ネ1す、’(< ilの異F、−rモノクロナル抗
体の使用によっては、しめて沈殿物を生成できるという
事実から当然のことながら、祝数秤の5!秤モノクロナ
ル抗体の使用が必須であるという点で共通している。 しかし力から、前者の提案に記載嘔れているように、キ
ノクロナル抗体と対応抗原との凝集を生じさせるために
複数種の異種モノクロナル抗体を担体に感作[7、その
感作押体を使用し7てもなお、測定の感度と特異性に関
して必ず[7も好結果が達成できるとはかぎらない欠陥
があり、更には、利用し得るよう外凝集さえ生ぜず、全
く効果的でないことさえあるという重大な技術的欠点が
あった。 そして、満足すべき凝集性を与えるだめに、例えばより
多種の異種モノクロナル抗体を使用すればするほど、当
然のことながら、モノクロナル抗体の利用による高い特
異性の利点はより多く失われていく不都合を伴うことが
Fη避できないという両立し難い技術的課題が生じてい
た。 すなわち、モノクロナル抗体は抗原分子中の一つの!特
定部位を特異的に認識する能力を有する抗体であるが、
二種以上よシ多がのモノクロナル抗体を利用すればする
ほど、二種以上より多種の特定部位を同時にN5 n6
する結果となり、モノクロナル抗体の利用による高い7
行異性の利点がより多く失われていくという両立し解い
技術的課題をf′t′う。 更に又、抗原分子の多数の部位を1z−元弁できる従来
のポリクロナル抗体利用の場合と(牝γなって、−上述
したように、モノクロナル抗イ・トハ一つの!1テ定部
位17か認説しないので 、Hqリクロナル抗汁利用の
場合に比して、凝集反応におけるI’44jt 4i1
、il、〒、;るしく弱いことが予7!、+Jされ、事
実、上述したよりに、モノクロナル抗体利用の従31′
、、、tξΣ案においては甲一種のモノクロナル抗体の
利用では対11−抗原と結合して沈殿物をイ]二成し0
いので朽シ吋市の!?、 Jiliモノクロナル抗体の
利用が必須てを・ることを教え、更に、前述した前者の
提案においては、7U′4種の異■゛11モノクロナル
抗体を利用しでもなお、凝集を生じない場合があるとい
う技’0:’I的欠陥のあることを開示している。 本発明者等は、モノクロナル抗体を免疫化学的な抗原測
定法に利用する際の上述の如き両立し煎。 い技術的課題ないし技術的欠陥を解決できる方法を開発
すべく研究を行ってきた。 その結果、モノクロナル抗体利用における前記従来知見
とは全く異なって、ノ・ブテンを担体にtu持させたハ
プテン担持担体の場合には、該ノ・ブテンに対する単一
種のモノクロナル抗体を担体に担持させた単一種のモノ
クロナル抗体感作担体との間に、11而足すべき凝集反
応が生起し、斯くて、モノクロナル抗体利用における従
来知見に必須であった複数種の異種モノクロナル抗体を
利用する必要が全くないという予想外の新しい知見を得
た。 このモノクロナル抗体利用における全く新しい知見に基
いて更に研究を進めた結果、 (A) ハプテン又はその化学的変性物を、化学的に結
合せしめたカルボキシ)し基含有水溶性モノオレフィン
系高分子化合物、若しくは該結合物が約001〜約2ミ
クロンσ)粒径の高分子ラテックス押体に化学的に鈷合
しC成るノ・ブテン担持担体 及び (B) 上Be ノ・ブテンに対するJ4’+、種のモ
ノクロナル抗体JEJ持JU体 の組み合わせから成る新[7いタイプの試ソ、19を用
い、:t!!x 検体中の)・ブテンによる−に記(A
)及び(13)両試J、1≦成分のm1反応に対する凝
集阻止反応を測定するという新しいタイプ0の免qry
化学的な上記イウ検体中のノ・ブテンの測定方法が提]
J1.でき、顕著に優れた確実性、信頼度、J’+1度
、感度及び顕著に高い抗原!1“ソ異性をもって、偽反
応牛起のトラフ゛ルを伴うことなしに、優れだP5現性
、安定性月つ容易な操作で、短時間に被検体中の微量な
ノ・ブテンを免疫化学的に測定できることを見い出しだ
。 更に又、上記の顕著に優れた作用効果は、対象とするハ
プテンに対するモノクロナル抗体の種類に実質的な彩管
を受けない利点を有し、斯くて広汎な任意のノ・ブテン
の免疫化学的測定方法に適用可能であることがわかった
。 従って、本発明の目的はモノクロナル抗体を利用したノ
・ブテンの新しいタイプの免疫化学的測定方法及びその
方法に利用するのに適した新しいタイプの測定試す;1
ミを提供するにある。 本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記i・(から一層明らかとなるであろう。 本発明に於いて)・ブテン(不完全抗原)とは、生体内
に於てそれ自体で抗体敷産生能を有する抗原すなわち全
光抗原を除外する意味であって、低分子化合物で、それ
自体は抗原性を有しないが、抗yy、性を有する物り′
1、例えt [、”;白′j”j、多わ1゛1類の如き
抗原性を有する高分子化合物と結合
法及びその方法に利用するのに適した新しいタイプの測
定試朶に関する。 とくに、本発明は例えば血液、[せその他の体液や体液
成分などの如き被検体中の微量なハブテンを免疫化学的
に測定する沖]定方法及びその試桑に関し、侃れプξな
i′(′実性、信61度、精度、敏感EL及び高い特異
性をもって、偽反応生起のトラブルを伴うことなしに、
再現性良く安定且つ容易な操作で、短時間に被検体中の
IR−r:、なハプテンを免ずC日ヒ学的に測冗できる
新しいタイプの辿1定方法及びその方法に利用するに適
した新しいタイプの測定試ゼ;憔に関する。 更に詳しくは、本発明は、− L4) ハプテン又はその化学的変性物を、化学的に結
合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフィン系
高分子化合物、若しくは該結合物が約0.01〜約2ミ
クロンの粒径の高分子ラテックス担体に化学的に結合し
て成るハゾデン担(・1担体 及び CB) 上記ハプテンに対する単一種のモノクロナル抗
体担持担体 を用い、被検体中のノ・ブテンによる上記(A)及び(
13)両試薬成分の凝集阻止反応を測定することを特徴
とする上記イ、皮検体中のノ・ブテンの免疫化学的測定
方法に関する。本発明はまた、(A) ハプテン又はそ
の化学的変141ミ物を、化学的に結合せしめたカルボ
キシル、J、(;含有水溶性モノオレフィン系高分子化
合物、へしくけ該結合物が約0.01〜約2ミクロンの
粒径の高分子ラテックスJ’TI体に化学的に結合して
成るハプテン担持担体 及び (13) 上記ハシテンに対する単−計重のモノクロナ
ル抗体Jl[] J寺担体 から成ることを特徴とするノ・ブテンの免疫化学的測定
試薬にも関する。 従来、例えば血液、尿その他の体液や体液成分などの如
き検体中に存在する生物学的活性を有する微用物グ・T
を、免疫化学的手段で測定する方法は古くから知られて
いる。かかる免抑化学的測定法として、例えば赤血球を
担体として用い、これを抗原又は抗体で感作し、これオ
被恢戒中の抗体又は抗原と反応させ、その際、免疫化学
的凝集又は凝集阻止反応を生起させて、該機上)4物質
を測定する方法も既に知られている。また、担体として
寿血球の代り(・(、非生物学的粒子として例えば合成
樹脂ラテックス、ベントナイト、Jロジオン、コレステ
ロール結晶、水晶等を免疫化学反応における固体jLJ
体として用いることも知られている(以上例えば%開明
50−82230 号公開公!4 )。 このような抗原抗体反応を利用した免疫化学的手法によ
って伎検体中の抗原の存在(定性)もしくはその;H:
゛> K (定置)を測定検出するのに従来もつとも普
通に利用されてきた抗体感作担体は、ハ?リクロナル抗
体感作担体であった。 1975年C、kfilsteinらがマウスのミエロ
ーマ#ill l1iqと牌絃中の抗体産生細胞とをI
?lil I!i・IFl?It合し、該、I’ll+
胞からモノクロナル抗体の産生に成功して以来、細胞θ
11(合技術分野における著るしい技術の進歩に伴って
、モノクロナル抗体産生#lII Iii、1株の形成
、それを利用したモノクロナル抗体の産生が容易となシ
、このようなモノクロナル抗体を利用した抗原の免疫化
学的測定方法に関する提案がなされるようになった。 このような提案として、特開昭57−86051号の提
案が知られている。この提案に於ては、2個又はそれ以
上の異f=n Fのモノクロナル抗体が同一の抗原に対
応[7て用いられることを特FI(とじ、少くとも2個
の抗体分子に抗原をh″i合させる免疫化学的反応を利
用した抗原穴1:1−法が提3Sされている。そして、
この提案には、従来の抗体すなわちポリクロナル抗体が
対応抗原と反応して沈殿物を生ずる公知現象とは全く異
なって、モノクロナル抗体は対応抗原と結合して沈殿物
を生成することがなく、モノクロナル抗体で被キ]qさ
れた例えば赤血球、ラテックス球、全屈粒子などの如き
担体粒子が対応抗原の存在下で凝集しないことが記載さ
れている。 この提案に於ては、従来公知の知見とは異って、モノク
ロナル抗体は対応抗原と結合して沈殿物を生成し々いと
いう事実があるにも拘わらず、複数種の異種モノクロナ
ル抗体を使用すると抗原と結合して沈殿物を生成できる
という新しい知見が得られたことを記載し、それゆえに
、この提案においては、上述のとおり、少なくとも二種
のbl Ijltモノクロナル抗体の使用を必須とする
抗原定量法に特定されている。 更に、この提案には、このような複数種の異種モノクロ
ナル抗体のイU:用に上ってもなセ、(1・I[−iの
感度と!1ヶ異性に閂[7て必ずしも好結果が得られる
わけではなく、全く効果的ではないことさえあり得るた
め、可能な限りの結合の仕方を試1トた上で(發削謂塾
1尺しなけれ(r−1:ならないことを記j71i L
、ている。 このようなr′、を数種の!A種モノクロナル抗体の使
用を必キf■とする州似の提案として、!1−〒開昭5
7−118159号の提案も知られている。 そして、これらモノクロナル抗体を利用する抗原の免疫
化学的測定方法に門する従来提案に於ては、従来のポリ
クロナル抗体の±−)合とは異なって、単−利iのモノ
クロナル抗体は対応抗体抗原と結合して沈殿物を生成せ
ず、ネ1す、’(< ilの異F、−rモノクロナル抗
体の使用によっては、しめて沈殿物を生成できるという
事実から当然のことながら、祝数秤の5!秤モノクロナ
ル抗体の使用が必須であるという点で共通している。 しかし力から、前者の提案に記載嘔れているように、キ
ノクロナル抗体と対応抗原との凝集を生じさせるために
複数種の異種モノクロナル抗体を担体に感作[7、その
感作押体を使用し7てもなお、測定の感度と特異性に関
して必ず[7も好結果が達成できるとはかぎらない欠陥
があり、更には、利用し得るよう外凝集さえ生ぜず、全
く効果的でないことさえあるという重大な技術的欠点が
あった。 そして、満足すべき凝集性を与えるだめに、例えばより
多種の異種モノクロナル抗体を使用すればするほど、当
然のことながら、モノクロナル抗体の利用による高い特
異性の利点はより多く失われていく不都合を伴うことが
Fη避できないという両立し難い技術的課題が生じてい
た。 すなわち、モノクロナル抗体は抗原分子中の一つの!特
定部位を特異的に認識する能力を有する抗体であるが、
二種以上よシ多がのモノクロナル抗体を利用すればする
ほど、二種以上より多種の特定部位を同時にN5 n6
する結果となり、モノクロナル抗体の利用による高い7
行異性の利点がより多く失われていくという両立し解い
技術的課題をf′t′う。 更に又、抗原分子の多数の部位を1z−元弁できる従来
のポリクロナル抗体利用の場合と(牝γなって、−上述
したように、モノクロナル抗イ・トハ一つの!1テ定部
位17か認説しないので 、Hqリクロナル抗汁利用の
場合に比して、凝集反応におけるI’44jt 4i1
、il、〒、;るしく弱いことが予7!、+Jされ、事
実、上述したよりに、モノクロナル抗体利用の従31′
、、、tξΣ案においては甲一種のモノクロナル抗体の
利用では対11−抗原と結合して沈殿物をイ]二成し0
いので朽シ吋市の!?、 Jiliモノクロナル抗体の
利用が必須てを・ることを教え、更に、前述した前者の
提案においては、7U′4種の異■゛11モノクロナル
抗体を利用しでもなお、凝集を生じない場合があるとい
う技’0:’I的欠陥のあることを開示している。 本発明者等は、モノクロナル抗体を免疫化学的な抗原測
定法に利用する際の上述の如き両立し煎。 い技術的課題ないし技術的欠陥を解決できる方法を開発
すべく研究を行ってきた。 その結果、モノクロナル抗体利用における前記従来知見
とは全く異なって、ノ・ブテンを担体にtu持させたハ
プテン担持担体の場合には、該ノ・ブテンに対する単一
種のモノクロナル抗体を担体に担持させた単一種のモノ
クロナル抗体感作担体との間に、11而足すべき凝集反
応が生起し、斯くて、モノクロナル抗体利用における従
来知見に必須であった複数種の異種モノクロナル抗体を
利用する必要が全くないという予想外の新しい知見を得
た。 このモノクロナル抗体利用における全く新しい知見に基
いて更に研究を進めた結果、 (A) ハプテン又はその化学的変性物を、化学的に結
合せしめたカルボキシ)し基含有水溶性モノオレフィン
系高分子化合物、若しくは該結合物が約001〜約2ミ
クロンσ)粒径の高分子ラテックス押体に化学的に鈷合
しC成るノ・ブテン担持担体 及び (B) 上Be ノ・ブテンに対するJ4’+、種のモ
ノクロナル抗体JEJ持JU体 の組み合わせから成る新[7いタイプの試ソ、19を用
い、:t!!x 検体中の)・ブテンによる−に記(A
)及び(13)両試J、1≦成分のm1反応に対する凝
集阻止反応を測定するという新しいタイプ0の免qry
化学的な上記イウ検体中のノ・ブテンの測定方法が提]
J1.でき、顕著に優れた確実性、信頼度、J’+1度
、感度及び顕著に高い抗原!1“ソ異性をもって、偽反
応牛起のトラフ゛ルを伴うことなしに、優れだP5現性
、安定性月つ容易な操作で、短時間に被検体中の微量な
ノ・ブテンを免疫化学的に測定できることを見い出しだ
。 更に又、上記の顕著に優れた作用効果は、対象とするハ
プテンに対するモノクロナル抗体の種類に実質的な彩管
を受けない利点を有し、斯くて広汎な任意のノ・ブテン
の免疫化学的測定方法に適用可能であることがわかった
。 従って、本発明の目的はモノクロナル抗体を利用したノ
・ブテンの新しいタイプの免疫化学的測定方法及びその
方法に利用するのに適した新しいタイプの測定試す;1
ミを提供するにある。 本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記i・(から一層明らかとなるであろう。 本発明に於いて)・ブテン(不完全抗原)とは、生体内
に於てそれ自体で抗体敷産生能を有する抗原すなわち全
光抗原を除外する意味であって、低分子化合物で、それ
自体は抗原性を有しないが、抗yy、性を有する物り′
1、例えt [、”;白′j”j、多わ1゛1類の如き
抗原性を有する高分子化合物と結合
【7ヤ抗原性を示し
、このような抗原性物質で1・II物を免疫して生成し
た抗体と反応性を有するものをいり。かかるハプテンと
して、’l”Jに、生体内に存在する成分(生理活性成
分およびその代、111産物を含む)および生体に投与
された系物訃よびその化1q1産物が本発明の対象とす
るノ・ブテンとして升要である。 同−山ル((人の出願に係わるI庁開昭55−5294
5及び特開昭55−52946号には、(σ)ハプテン
又はその化学的変性物を化学的に結合せしめたカルボキ
シル基イ3有水i’1’i性モノオレフィン系高分子化
合物が、約(1,Ql〜約2ミクロンの粒径の1、−ち
分子ラテックスに化!!74的に結合していることを1
1)包とする辛i ノ:i、な(テ已疫化学的測定試祭
、及び該(α)ノ・フ0テンJ’Q !−’+ラテック
スと、 (/J) ・・ブテン抗体を約001〜約2ミクロンの
粒径の高分子ラテックスにE・;(作し又は化q的に結
合しまた抗体:lr!、l=〒ラデツクス或はハプテン
抗体(抗血清) とから成ることを特徴とする・・ブテンの免疫化学的測
定方法(特開昭55−52945号)又は(C)ハシテ
ンまたはその化学的変性物を化学的に結合せ17めだカ
ルボキシル基含有7J<溶性モノオレフィン系高分子化
合M:Jと、 (の ハプテン抗体を担体に化学的に結合させるか゛ま
たは感作させたハプテン相持」1体とから在るハシテン
の免疫化学的測定状Jj≦(特開昭55−52946号
)、更には、上記(a)及び(b)、もしくは(C)及
び(カを用い、被検体中の)・ブテンによる上記(a)
、(b)あるいは(C)、(の両試票のδ″・召集阻止
反応を測定することを特徴とする)・ブテンの免疫化学
的測定方法が提案されている。この42案に於ては、上
記(b)及び(のにおける抗体としてモノクロナル抗体
を除外はしていないが、該モノクロナル抗体利用につい
ては、とくにはも及しておらず、亥だその具体例も示さ
れていない。 本発明においては、上記提、;j=における該(b)及
び(のとして、該提案が具体的に開示しておらず且つま
た前述したモノクロナル抗体利用の従来提案とは異なっ
て、(B)上記ハシテンに対する単−柿のモノクロナル
抗体相持4u体を厖択利用することによって、顕著に代
れた確実性、イ1j頼度、棺鹿、感度及び顕著に高い抗
原11♀具性をもって、偽反応生起のトラズルを伴うこ
となしに、優れだP]現性、安定性且つ容易な掃作で、
短時間に71・ν塗体中の微量なハプテンを免疫化学的
に測定できる。 本発明で用いる(、()ハプテン又はその化学的変性物
を、化学的に結合ぜしめたカルボキシルノ1与含有水溶
性モノオレフィン系高分子化合物、若しくは該結合物が
約0.O1〜約2ミクロンの粒径の高分子ラテックス担
体に化学的に結合して成るハプテン担持」1休に利用す
るハプテン又はその化学的変性物ならびに変性手法、該
ハプテン又はその化学的変性物を化学的に結合させるカ
ルボキシル基含有水溶性モノオレフィン系高分子化合物
(便宜上、CWpと呼ぶことがちる)、該CI?” p
への該ハシテン又はその化学的変性物の化学的結合方法
及び結合物、更に、該結合物と高分子ラテックス担体と
の化学的結合手段ならびに斯くて形成されたハプテン4
11持担体などについては、同−出紙(人の出願に係わ
る上記特開昭55−52945号に詳にlflに記載さ
れており、本うa明において利用できる。 利用するハプテンの例としては、以下の如きものが例示
できる。 (1) ステロイド系ハプテンニー (i) 例エバエストロン、エストラジオール、エスト
リオール、エステトロール、エクイリン、エクイレニン
等の卵胞ホルモン、 (ii) 例えば、プログ9ステロン;ゾレグナンジオ
ール;プレグナントリオール;19−ツルーエチステロ
ンおよび酢6タクロルマジノン等の合成黄体ホルモンへ
9の黄体ホルモン、(iii) 例えば、テストステロ
ン、デヒドロエピアンドロステロン、ソヒドロテストス
テロン、アンドロスゾロン、エチオコラノロンイγの男
性ホルモン、 (1v)例えば、コルチゾール、コルチゾン、デオキシ
コルテコステロン、アルドステロン、テトラヒドロアル
ドステロン、テトラヒドロコルチゾール等の副腎皮質ホ
ルモン、 (v) ビタミンJ)類;コレステロール;例えi・′
:I:コール酸、デスオキシコール酸、ケノコール酸等
の胆汁r;:?:強心性ステロイド;サポニン;ザポケ
゛ニンウ、テのその他のステロイド類。 (n) 生理活性アミン類ニー (i) エピネフリン、ノルエピネフリン、ド・ぐミン
、エフェドリン等のカテコールアミンおよびそれらの代
謝産物; (ii) モルフイン、コディン、ヘロイン、モルフイ
ングルクロナイド、コカイン、メスカリン、ノぐノぐペ
リン、ナルコチン、ヨヒンビン、レセルピン、エルゴタ
ミン、ストリキニーネ等ノ生理活性アルカロイド類; (iii) L S I) 、アンフェタミン、メゾロ
ノ々メート、メタアンフェタミン等。 (m) その他のノ・ブテン類ニー T I?il 、 Lll −R11の如き抗原性を有
しない低分子ペグチド辺;ソヨードサイロニン、トリヨ
ードサイロニン、サイロキシン等の甲状片?ホルモン;
プロスタグランソンE2、プロスタグランジンE3、ブ
ロスタグランソンp′lα〜覇)プロスクダジンソ7
p;fi、 ;ビタミンA1 ビタミンBグ511()
ワ1jえ(・じビタミン73.。 B2 、Bo 、IJ、2等)、ビタミンE1 ビタミ
ンに等のビタミン用;ペニシリン、アクチノマイシン、
クロロマイセチン、テトラサイクリン等の抗性物質。 利用するハプテンの例と[7ては、」1謁例示の如き生
体内に存在する成分、生体内に投Ljされたト2、物お
よびそのイい■産物などC角(、(多くのハプテン類を
あげることン%できるが、’4V ’j’i’i l叫
でいうハゲテンit、+iは上記例示のハノテンツ(1
1にト:・髭定されるものではない。 本発明においては、上記例示の如きハプテン&」″、そ
のままで或はそれを化学的に変性した化学的ψ:性物と
してCFPと化学的に結合せしめる。このようなハプテ
ンの化学的変性法として従来種々の方法が知られており
、本発明で利用できる。ノ・ブテンがCWpの有する官
能基たとえばカルボキシル基や水酸基と化学的に結合し
得るように該ノ・ブテンを化学的に変性する如何なる変
性法を採用してもよい。かかるハゲテンの変性法として
は、特にハプテンにカルボキシル基、第1級又は第2級
アミノ基又は水酸基、就中カルボキシル基又は第1級ア
ミン基を導入する化学的変性法が好適である。かかる方
法として例えば以下の如き変性法があげられる。 カルボニル基を有するハプテンに関しては、カルボキシ
ルメチルオキシムに変換することによってカルがキシル
基を導入することができ(例:Journal of
Biological Chemistry、 Vol
。 234.1090−1094頁(1959、) )、或
は、例えばブロム化したのちチオグ、リコール酸と反応
せしめて、カルボキシル基を持たせる(例:5tero
ids、 L 9巻357−375頁(1972))こ
ともできる。 カルボニル化合物のオキシムを57元すると一級アミノ
化合物になることは周知であるが、これもハシテンとし
て利用できる。 まだ水[V夕基を有する)・ブテンは、例えt」:モノ
クロル酢酸と反応させて、カルホキ・/メチルエーテル
化する方法(例: 5cience、168巻。 1347−1348頁(1970))、或は無水コハク
酸と反応させてヘミザクシネートとする方法(例;Jo
nブnal of C11nical Jln、doc
rinology。 33巻、775−782頁(1971))肴がある。 フェノール性水酸基を有するノ・プアンではその水酸基
のオルト又はパラ位に例えば・ξラカルボキシベンゼン
ソアゾニウム塩をジアゾカツプリングさせて、カルづζ
キシル基を導入する(例: 5te−roids、 l
8巻、555−563頁(1971))ことも可能で
ある。 さらにまだステロイド類の代謝物であるグルクロナイド
は、そのカルボキシル基を利用することができるしく例
: Journal of 5teroid、 Bio
−chemistry 、3巻、275−288頁(1
972))、そのカルボキシル基を直接利用できなけれ
ば、適当なソアミン誘導体と反応させて、アミン化合物
に変換することもできる。 二級アミノ基をもつノ・ブテンに於ては、例えばそのア
ミン基をN−保護アミノアルキルノ・ログン化合物でア
ルキル化したのち保護基を説キIFすれば一級アミン誘
尋体に変えることができ(例:FE13 S Lett
ers、36巻、339−342頁(19,73))、
或いは例えUブロム酢酸エステルと反応させたのち加水
分解することによυ、カルg キ’/ ル基をもプコ伊
る(例: Chemicrtl a、n、dpjr、a
、rmacev、ticat )Jtr、1lalゝi
n、、 2 5 巻 + 3 3 8 −840頁(1
977))こともできる。 適当な官1′1μ基を持たないハプテンは寸ず例えば倣
生物による水酸化反応のよう庁手段をj+1’)じ、つ
いで」二連の方法によって請求むる官能基に久4・′1
することもできる。 更に、上記例示の如きハプテンン又はその化学的変性物
を化学的に結合ぜしめるのに利用するカルボキシル基含
有水溶性モノオレフィン系高分子化合物(CJVp)と
しては、カルボキシル基を含(jする水浴性モノオレフ
ィン系高分子化合物の如何なるものでもよい。ここで「
ス1、品+’llとは該病勺子化合物の少くともl爪量
部を1000重口2部の蒸留水に添加した1局舎にi、
L91]な!f′〜1りを形成することをいう。該高分
子化−8物の清+fT度がJ、’:pli:下限庖ン1
j〜足する限り、その俗解Pyはいくら大てあってもよ
い。また該高分子化合物の平均M量分子量に3、約10
8〜107又はそれ以上であってもよく、通常数万乃至
数百万のものが好適に使用できる。またかかる高分子化
合物は、官能基としてカルボキシル基の他に水酸基(−
01#)を有していてもよく、之等の官能基は、ノ・ブ
テン又はその化学的変性物の官能基および後述する高分
子ラテックス担体の有する官能基との化学的結合に関与
すると共に、法高分子化合物に水溶性をも付−りする。 本兆明で使用するかかる高分子化合物は、生理的には不
活性物質と見られるものであって、一般に抗原性をイ〕
しないものである。 壕だ、かかる高分子化合物としては、例えば、アクリル
酸又はメタアクリル酸のホモ−又はコーポリマー;マレ
イン酸と酢酸ビニルとの共重合体又はぞのケン化物、マ
レイン酸と例えばビニルアルコール、低級アルキルビニ
ルエーテル、アクリル酸又はその低級アルキルエステル
、メタアクリル酸又はその低級アルキルエステルとの共
重合体又は所望によりそれらの加水分フ宜物があげられ
る。 之等の高分子化合物は1だ、例えばアクリル酸又はメタ
アクリルr、tと、例えばアクリル前のβ−ヒドロキシ
エチルエステル又tよアクリルアミドとの共重合物、或
は前記のモノマーを構成単位として含有する三元重合体
であってもよい。 本発明に於て、前記例示の如きノ・ブテン又はその化学
的変性物と、上記例示の如き高分子化合物との化学的結
合は、アミド結合又はエステル結合によって行うことが
できる。アミド結合反応を利用するのが好ましい。この
ようなアミド結合反応もしくはエステル結合反応は、そ
れ自体公知の手法を利用して行うことができる。 例えげ、ハプテン又はその化学的変性物をノ・ブテンで
代表して説明すると、ノ・ブテンが例えばアミノ基を有
しそしてCU7 pがカルボキシル基を有する場合、又
はその反対の場合、ハゲテンとCWpとを下記の如き方
法によりアミド結合にょシ化学的に結合することができ
る。 アミド結合でハプテンとc ny pとを結合する方法
ニー(1) カルボジイミド法 アミン基とカルボキシル基との間で脱水縮合によりアミ
ド結合を形成させる方法で、両成分の溶液中に等モルも
しくは僅かに過剰のカルボジイミド化合物を加えて室温
又は水冷下に反応させることによシ目的を達することが
できる。カルボソイミド自身は尿素誘導体に変換する。 −Ni12+−COOII + R−N =C=N−R
−+ 、−NJI−CO−十R−NIICON11−R
反応溶媒としてはそれ自身が反応にあづかる官能基を有
しない限り特に限定されることはなく、例えば酢酸エチ
ル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ツメチルホルム
アミド、クロロポルム等が使用できる。珠だ任意の割合
で水を含有する系であってもよく、水溶液中で反応させ
ることもできる。用いるカルボジイミド化合物としては
、有イ六溶1!I; 中の反応にはジシクロへキシルカ
ルボソイミドが最もよく用いられ、含水不溶がI−中で
の反応には例え←じ1−エチル−3−(3−ツメチルア
ミンプロピル)カルボジイミド塩酸塩等のような水溶性
カルボジイミドを用いることができる。 (2) カルボニルソイミダゾーノ+−v6カルyf
Jイミド法と全く同様にアミン基とカルボキシル基との
間の脱水翁11合を起させる方法で、両成分の溶液中に
必要号のカルボニルジイミダゾールを加えればよい。こ
の試・j14は水分に敏感で、水で直ちに分)5了する
ので、フ1、を含有しない溶111(を用いるのが好ま
しい。 (3)混合酸無水物法 カルボキシル基はクロル蟻酸エステルと、布石1−塩基
の存在下、いわゆる混合酸無水物を形成し、これはアミ
ノ基と容易に反応して、アミド結合を形成する。 −CONJI− クロル蟻酸エステルとしては例えはエチル、イソプロピ
ル、イソブチルのよう力低級アルキルエステル、!侍に
クロル蟻酸イソブチルがよく用いられ、有様塩基として
はトリエチルアミン、N−メチルモルホリン等のような
第三級アミンが利用できる。 反応溶媒にはカルボジイミド法に述べたものをそのまま
用いることができるが、混合酸無水物は水に不安定であ
るので、混合酸無水物を形成する際には含水したものを
用いないよう注意するのがよい。反応温度としては、先
ず例えば−10°〜−20°(、位の低温で混合【;?
炒、水りを形成せしめ1ついでアミノ成分を加えてから
室ン1完にて反応をつづける温度条件で1−好ましく例
示できる。アミン成分を加えるときには水もり、 <
11.を水を自んブr″、fiQ’l:’を使用しても
か捷わない。 (4)活性エステル法 カルボキシル基)1;を′n)、子吸引性の大きい化合
物のエステルにすると、そのカルボニル糸上の電子密度
が八り、ぞの結果アミノ基のような塩基性の大きい官能
基を攻撃してアミド結合を形成することになる。これが
活性エステル法の原理で、活性ニスデルとしては例えば
、パラニトロフェノール、2.4−ジニトロフェノール
、ペンタクロロフェノール、チオフェノール、ナフトー
ル、8−ノーイドロキシキノリン等のフェノール?+’
34体;例えば、N−ハイドロキシコハク「1!2イミ
ド、N−ノ・イ)′口キシピペリリン等のN−ハイドロ
キシ化合物;例えば、シアノメチルのようなアルキルエ
ステル等を用いることができる。溶媒としてはカルボソ
イミド法で述べたものが利用できる。 (5)アミド法 カルボキシル化合物をエステルに変え、ヒドラジンと反
応させると酸ヒドラジドになるが、これは亜硝酉・20
作用により酸アミドになり、アミノ基と反応してアミド
結合を形成する。 ヒドラジド ヒドラジドを稀塩酸中皿硝酸ナトリウムと反応せしめて
生成した酸アジドを−だん単FBシて、ついで適肖な有
機溶媒中アミン成分と反応させる古典的な方法も利用で
きるが、ヒドラジドを有機溶媒(含水したものでもよい
)中、塩化水ネ存在下亜硝酸アルキルエステル例えh+
H亜硝酸t−ブチル、亜硝酸i−アミル等で処理して市
アジドとし、単t’;i!、することなくアミン成分と
反応せしめることによりアミド結合を形成することがで
きる。 (6) 酸クロリド法 カルがキシル化合物を酸クロリドに変え、アミノ化合物
と反応させてアミド結合を生成するItも一般的な方法
も採用することができる。酸クロリドにするにはカルボ
キシル化合物を五塩化リン、塩化チオニル、オキシ塩化
リン等と反応させる直接法と、例えばシュウ酸クロリド
と反応させる交換反応法があげられる。アミン化合物と
の反応忙は水の中でアルカリを加えながら行なういわゆ
る「ショツテン−バウマン法」、必要に応じて例えばベ
ンゼンなどの不活性溶媒中で、例えばピリジン、トリエ
チルアミン等の有43i塩基存在下に反応する方法、女
どがあり、本発明で利用できる。 +7) D I) P A法 カルボキシル化合物とアミン化合物との溶液中にソフェ
ニルホスホリルアジド(DPPA)、ついで例えばトリ
エチルアミン、或はN−メチルモルホリン等の有機塩基
を加えてアミド結合を形成する方法も採用できる。この
際、溶媒としては例えばヅメチルホルムアミドが好辿に
用いられ、温度は水冷から室温でよい。 以上の例えば(11〜(7)の如きアミド結合でハプテ
ンとc tv pとを結合する化学的結合法のいづれを
もってしても目的を達することができるが、本発明に応
用する際にはハゲテンが有する他の置換基などによって
は不安定なものもあり得るので、あまυ檄しい条件を必
要とするものは避けるべきである。最も好ましく利用で
きるのは0)カルボジイミド法、(7) D P P
A法である。CIV pと、導入すべき適尚す1.のハ
プテンの溶液中にハプテンニ対シ等モル又はイ^’iy
I>K過剰のカルボソイミド、もしく1tDPPAを加
えJ) P P 、40〃ろ合には有仁塩基を加えて反
応せしめることができる。反応後は全反応液をセロファ
ンチューブ内にて水に対しj℃析すれば、未反応のハプ
テン、状態、副成物などは外液に逃げるので内液を/l
管縮、或はン東結乾47トすることにより目的のハゲテ
ン又はその変性物−Clr’p結合物を得るととがてき
る。 更に、ハシテン又はその化学的変性物とCTrI p高
分子化合物との化学的結合は、ハプテン又はその化学的
変性物が:+じ1当な反応性水r%Q基を有しそし一’
(CIVpがカルボキシル基を有する場合又はその反対
の場合、ハプテンとCI7;’ Pとをエステル結合で
化学的に結合することにより行うこともできる。 エステル結合でハプテンとc n″pとを結合する方法
:一 エステル1,17合法の場合、ハプテン又はその化学的
変性物が水6だ基を有し、cr:’pがカルボキシル基
を有する場合には、カルボキシル基を例えば塩化チオニ
ルを作用させて酸クロリドに変え、或はCI?−pが例
えば無水マレイン酸を含む共重合体ならばそのt−tで
、ハゲテンと反応させて、エステル結合によるハプテン
−c n〕” p結合物を得ることができる。その反対
即ちハフ0テン又はその化学的変性物がカルボキシル基
を有し、CIVPが水酸基をもつ場合には、ハプテンの
性質によっては反応性B馴尋体例えば酸クロリドに変換
し得る程充分な安定性を有しない場合もあシ、この場合
エステル結合せしめるのは困難である。 かくして得られるハプテン−C117p結合物としては
、数多くのハプテンとCWPの組合せからなる結合物を
得ることができるが、之等の代表例を具体的に示せば、
例えば下記の如き結合物を例示できる。 17−アミノ−] 、3.5(10)−エストラトリエ
ン−3−オール結合ポリアクリル酸、17−アミノ−!
、3.5(10)−エストラトリエン−3−オール結合
ビニルメチルエーテル無水マレインri共重合体、 エストリオール−16−グルクロナイド結合ポリアクリ
ル酸、 エストリオール−16−グルクロナイド結合ビニルメチ
ルエーテル無水マレイン酸共重合体、エストリオール−
16,17−ソヘミザクシネート結合ポリアクリル酸、 プレグナンジオール−3−グルクロナイド結合ポリアク
リル酊、 プレグナンジオール−3−グルクロナイド結合ビニルメ
チルエーテル無水マレインr〉共重合体、プレグナント
リオールー3−グルクロナイド4″11i合ポリアクリ
ル酸、 プレグナントリオールー3−グルクロナイド結合ビニル
メチルエーテル無水マレイン酸共重合体、3α、11β
、17α、21−テトラヒドロキシプレグナン−20−
オン−3−グルクロナイド結合ポリアクリル酸、 3α、11β+17α、21−テトラヒドロキシプレグ
ナン−20−オン−3−グルクロナイド結合ビニルメチ
ルエーテル無水マレイン酸共重合体、 カルd?ギシメチルモルフィンに古’cl’F ;re
IJアクリル酸、 カルボキシメチルモルフイン結合ビニルメチルエーテル
無水マレイン酸共重合体、 エチオコラノロン−3−ヘミサクシネート結合ポリアク
リル酸、 サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸
共重合体、 ザイロキシン結合ポ・リアクリル「1夕、メタネフイリ
ン結合ポリアクリル酸、 メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン
酸共爪合体 等々をあげることができる。 本発明における( A )ハプテン4工l持担体tj1
、j−述のようにして得ることのできるハプテン又ti
tその化学的変性物を化学的に結合せしめ/こCI!’
/lを反応性高分子ラテックス担体とさらに化!1′
的にシ′、“1合することによシ得ることができる。か
かる高分子ラテックスとしては、平均粒径が約001〜
約2ミクロンのものでろ、つて、眩スペーザーと反応し
得る官能基を有するものが用いられる。平均私′i径が
約0.05〜約1.5ミクロンのものが!寺に!JJ′
1.’fi’である。 また、かかる反応性高分子ラテックス担体としては、官
能基としてカルボキシル基、第1級アミン基又はカルボ
アミド基(−CONII2 ) 含有L、且つ基体が例
えばポリスチレン、スチレン−ブタツエン共重合体、ス
チレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリビニルトルエ
ン、ビニルトルエン−ターシャリブチルスチレン等から
成る高分子ラテックス担体が例示ス、きる。このような
ラテックス担体は種々の商品名で市販されており、之等
の高分子ラテックス担体のいずれも使用することができ
る。高分子ラテックス担体の基体は勿論上記例示の如き
重合体又は共重合体に何部限定されない。 高分子ラテックス担体が官能基として第1級アミツガ;
を有している場合は、之等の高分子ラテックス担体をそ
のま咬前記CH7pの有するカルボキシル基と反応せし
めて、アミド結合によってctrtpと化学的に結合す
ることができる。かかるアミド結合の形成は、ハプテン
又はその変性物とcvpとの反応について14℃に説明
したと同様々反応手段を用いて行うことができる。 また高分子ラテックス」°1体とCFpの双方が官能基
としてカルボキシル基j:を有する場合には、該ラテッ
クスの有するカルボキシル基を下記の如き方法によって
化学的に要件して、第1級アミノ基を41人した後、c
n:”pとアミド゛結合によって結合することもできる
。例えばカルボキシル基1(含有ラテックスを水溶性カ
ルボソイミド存在下へブタメチレンジアミンの株なンj
?リメチレンジアミンと反応せしめて第一級アミン基を
増大する方法(例:Journal of Ca1l
niolngy、 64老、 75〜88頁(1,,9
75) )等がある。 本発明では、まだ、例えばN−ε−第3級ブトキシカル
ボニルノンメチルエステル又はN−フタロイル−N′−
メチルトリメチレンジアミンの如き片方のアミノ基をイ
?も′りしたアルキレンツアミン誘導体をカルボキシル
基を有する高分子ラテックス担体と反応させることがで
きる。この反応はノ・ブテンとCWPとの結合に使用さ
れるアミド結合形成反応の中から選択することができる
が、例えば高分子ラテックスの粒径の如き物理的性質を
かえないで反応を行なう必要がある。そのだめには水を
含んだ系で行なうことが望ましく、殖に水浴性カルボジ
イミドを用いる水中でのカルTl?ソイミド法が望まし
い。反応を行々つだ後アミン保護基を除去するとアミン
基を反応基として有する反応性高分子ラテックスが得ら
れる。この様にして得られた反応性高分子ラテックスを
カルボキシル基を有するハプテン又はその変性物とCW
Pとの結合物と前述のアミド結合形成反応により反応さ
せると本発明の測定試薬を得ることができる。この変更
態様については、前記特開昭55−52945号に詳し
く説明されており、本発明において利用できる。 上述のようにして得ることのできるCA)ノ・ブテン又
はその化学曲技11物を、化学的に結合−亡しめんカル
ボキシル基含有水溶性モノオレフ・イン系高分子化合物
(C1l’P)が、約0.01〜約2ミクロンの粒径の
高分子ラテックス担体に化学的1c Fir合して成る
ノ1ゾテン担持担体の例として社、す、下の如きノ・ブ
テン担持担体を例示することができる。 エストリオール−16−グルクロナイドリアクリル酸結
合ラテックス、 エストリオール−16.17−ジヘミサクシネート結合
ポリアクリルげ2結合ラテックス、17−アミノ−1,
3.5(10)−エストラトリエン−3−オール結合ポ
リアクリノb nl結合ラテックス、 17−アミノ−1,3.5(10)−エストラトリエン
−3−オール結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸
共重合体結合ラテックス、エストリオール−16−グル
クロナイド結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共
重合体結合ラテックス、 エストリオール−t6.i7−ノへミサクシネート結合
ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテ
ックス、 プレグデンソオール−3−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸結合ラテックス、 グレグナンソオールー3−グルクロナイド結合ビニルメ
チルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテックス、 3α、11β、17α、21−テトラヒドロキシプレグ
ナン−20−オン−3−グルクロナイド結合ポリアクリ
ル酸結合ラテックス、 3α、11β、17α+21−テトラヒドロキシプレグ
ナン−20−オン−3−グルクロナイド結合ビニルメチ
ルエーテル無水マレイン酌共」(合体結合ラテックス、 カルボキシメチルモルツイン危゛i合ポリアクリル酸結
合ラテックス、 カルボキシメチルモルフイン結合ビニルメチルエーテル
無水マレイン酸共亘合体結合うデックス、エチオコラノ
ロン−3−へミザクシネート4i′i合ポリアクリル鼠
結合ラテックス、 サイロキシン結合ポリアクリル酸結合ラテックス、 サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸
共亜合体結合ラテックス、 メタネフィリン結合ポリアクリル1.t’12結合ラテ
ックス、 メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン
酸共正合体結合ラテックス、 等々をあけることができる。 本発明に於ては、」二連の如き(A)ハゲテン担持担体
におけるハプテンに’1′?異的に反応するモノクロナ
ル抗体を利用して、(B)上記ハゲテンに対する単一〇
11のモノクロナル抗体感作担体を調製する。 本発明で利用する前述の如きハプテンに対するモノクロ
ナル抗体は、細胞a(合技術分野においてそれ自体公知
の手法を適宜に選択組み合わせてモノクロナル抗体産生
融合細胞株を形成し、該細11ii株を利用して産生、
取得することができる。 その−態様によれば、ハプテン又はその化学的変性物を
、抗原性を有する物質と結合させ、このようにして抗原
性を賦与したハシテン結合物を用いて、これを適当な動
物たとえばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウ
シなどの如き動物に、投与たとえばアジュバントと共に
皮下注射の如き手法で投与して、該動物を免J(トじた
のち、この免疫動物たとえば免疫マウスの該ハゲテンに
対する抗体産生細胞たとえば胛X’、lil胞、ル’!
lIl’i! +t!II胞、リンA節細胞および/ま
だは末梢血ffl+胞の如き細胞を採取し、該#ltl
fJ〜と自己増殖性を有するが抗体産生能を実質的に
有しない適当な株化イ(u胞たとえばマウス骨髄肺株化
細胞とを、それ自体公知の手法によシ細l1f8I融合
処理する。 ハシテンに抗原性を賦与するのに利用する抗原性を有す
る物質の例としては、牛血清アルブミン(BSA)、家
兎血清アルブミン(R5Δ)、卵白アルブミン、ヒト血
清アルブミン、牛γ−グロブリン、家兎r−グロブリン
、ヒトγ−グロブリン、破傷a毒素、肺炎球菌多糖体等
の如き物質を例示できる。 更に、ハゲテン又はその化学的変性物と上記例示の如き
抗原性を有する物質との結合は、公知の方法により行う
ことができる(例えば、山村堆−1石板公成編隼、免疫
化学294〜302頁、利金書店発行)。 ハシテンに対するモノクロナル抗体をKrJるだめの、
ミエローマR)11胞と抗体産生細胞との組合せは、各
細胞が融合して増殖しつつ抗体を産生ずることが可能で
あれシ」:、それぞれの細胞の由来する動物の種類は限
定されず、任意の組合せでよい。 使用されるミエローマ細r11には特に限定は々く、多
くのマウス、ラツl−、ウサギ、ヒトなどの動物の細胞
株を使用することができる。好ましい株化細胞は薬剤抵
抗性のものであシ、かつ未融合のミエローマ細胞が選択
培地で生存せず、一方融合細胞のみが生存するようなも
のが良い。最も普通に用いられるものは8−アザグアニ
ジン抵抗性の株化#l1lltelで、これはヒボキサ
ンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラー
ゼに欠tAし、ヒボキサンチン・アミノグチリン・チミ
ジン(IJAT)培地に育生でき女い性質を有している
。さらに使用する株化trill胞は「非分泌型」のも
のであることが好1[7い。例えばマウスミエローマB
opC−214未由来のP3/ X 63− A (7
8UH(7’sU+)、p3/×63−AClB・6・
5・3、p3/N5I−1−Ag4−1、Sp210−
Ag14、ラットミエローマ210・RCY 3・Ag
1・2・3などが好適に用いられる。 該イ(11胞副1合処理しLl例えば、通常イーグ/L
最少基本培地(M八“M )、RPMJ−1640など
の培地中で上記免疫マウスのF’ li“1胞1〜5X
10”個と上記マウス骨髄腫株化細1iiq l〜5X
10’個とを、混合して行なうことができる。l’71
1.合併;+ff4剤としては、平均分子f3.1.
(100〜6.000のポリエチレングリコール(pl
ζG)が好4L、<、他の融合促進剤、例え(・、六ポ
リビニルアルコール、ウィルスなどを使用することがで
きる。PEGの使用L[は約30〜50%で用いること
ができる。 上述のようにして得ることのできるhl・11合細胞1
含有系から1独合、1fll ll1Jを、それ自体公
知の手法を利用【7て、選別処理、抗体活性スクリーニ
ング処理及びクローニング処理して、免し′コマウスの
形成に用いプこハプテンに対するモノクロナル抗体産生
能を・汀し且つ自己増殖能を持つ1.独合Ivml抱株
を取得することができる。 上記f:独合イ(1胞の選別処理は、例えば、20%ウ
シ胎児血清含有RpJ(1−1640培地々どで細胞融
合を終えた細胞を適当に希釈し、96穴マイクログレー
トに10’〜106/ウ工ル程度に分注し、各ウェルに
選択培地(たとえばHA T培地)を加え、以後選択培
地交換を行いながら、5タロC02(培養器(37℃)
で培養を続けることによシ行うことができる。ミエロー
マ17i11 、ll1uとして8一アザグアニン抵抗
性株を用いれば、未融合のミニ0− マgel ll「
・JはHA T培」tlcで死滅17、寸だ抗体産生細
胞は正常細胞なので i n、 tr i、 t r
o培炭では長期間生育でき女い。(7たがって培養後1
0〜140ぐらいから生育してくる4i11 月f・L
IIよ全てρ合細111・1である。 上述のように1〜で得ることのできるρ!1合8111
胞株の抗体活1」゛スクリーニング処理及びクローニン
グ処理は、常法によシ行つことができるが例えV11以
下のようにして行うことができる。 融合A′用胞の化1°工し2だウェルの培養土ntの一
部を採取し1、一定置の標識)・ブテンとインキュベー
ションし ’ 47 F、、jeノ・ブテンとの、t、
l;金倉1已をち州庁することによム 目的とする抗体
を1I)NXt、ているウェルを検索することができる
。即ち、3HX12+!7. +31 Iなどのラジオ
アイソトープあるいは醪素などで標識したハプテンと培
養上着“fを反応させた後、各反応液についてノ・ブテ
ン−抗(1、l’、”、合′吻を分F+′i t、、(
↑識量を測定することによシ、目的とする抗体の存在お
よび結合能を検索することができる。 目的とする抗体活性の認められる各ウェル中には2種以
上の融合細胞が生育している可能性があるので、限界希
釈法や軟寒天によるコロニー形成法によりクローニング
を行い、ハシテンに対するモノクロナル抗体産生融合細
胞株を得ることができる(このようなモノクロナル抗体
産生融合細胞株は微工研の寄託受託拒否対象である)。 上述のようにして得ることのできるモノクロナル抗体産
生細胞株を用いて、前記免疫動物の形成に用いたハプテ
ンに対するモノクロナル抗体を取得するには、該モノク
ロナル抗体産生細胞株を、例えば適当な培地に培養し、
培地からモノクロナル抗体を採取する方法、ミエローマ
細胞由来動物と同系の動物に該細胞株を移植し腹水中の
モノクロナル抗体を採取する方法など、それ自体公知の
手法を利用して取得することができる。 上記前者の態様によれば、例えば、モノクロナル抗体産
生り1合6」tl 1li1株を10%ウシ胎児血清含
有RPMIIG40培地役どの培善液で培πGし、その
培養」−清液を硫安分画、抗原を結合させたセファロー
ス4Bなどのアフィニティークロマトグラフィーなどに
よって8Tj 製することにより目的とするハプテンに
対するモノクロナル抗体を採取することができる。 又、上記後者の左1シ様によれば、例えば、同系動物に
プリスタン(2,6,10,14−テトラメチルペンタ
デカン)などの鉱物油を腹腔内投与した後、融合細胞を
腹腔内投与することによりinυivoで融合細胞を大
量に増殖させる。その結果、形成される腹水には高71
“1度のモノクロナル抗体が含まれている。この腹水か
ら硫安分画及び必要に応じて前記アフィニティークロマ
トグラフィーなどによシ、目的とするハプテンに対する
モノクロナル抗体を取得することができる。 上述のようにして取イl)できるようなモノクロナル抗
体は市販品として人手することも可能であり、利用でき
る。 本発明に於ては、上述のようにして得ることのできるハ
プテンに対するモノクロナル抗体の単一種を担体に相持
させて、(B)ハプテンに対する単一種のモノクロナル
抗体担持担体を得ることができる。 このような感作担体の調製に利用する担体としては、従
来よシ免疫化学的凝集反応および凝集阻止反応において
一般的に用いられる微粒子の担体を使用することができ
、例えばヒト、羊、ウザギなどの赤血球、π■[菌の細
胞などの生物学的粒子、高分子ラテックス、ベントナイ
ト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリ
ンなどの非生物学的粒子などの如き担体を)γ゛げるこ
とかできる。 このよりな]1!体の中で、高分子ラテックス担体のf
i’11としては1.J?リスチレンラテックス、メチ
1/ンープタソエンコフI9リマーラテツクス、ポリビ
ニルトルエンラアックス、ビニルトルエン・t−プチル
スチレンコホリマーラテックス、スチレン−メタアクリ
レ−トコポリマージデックスなどおよび官能基とL7て
カル7+?キシル7!−!j、J I L’lアミノ基
又はカルボアミド基(−CONJI2)を有し、■1つ
基体が前記ラテックスから成る反応1テ1ユ高分子ラテ
ックス寿どを挙げることができる。 」二記例示の如き高分子ジテックス用体の才′l了サイ
ズは’9 ’Ff:に遮択できるが、例えば、平均粒径
が約001〜約2ミクロンのものが使用でき、躬゛に平
均粒径が約0.05〜約15ミクロンのものが好ましい
。又、他の非生物学的担体についても上こ己高分子ラテ
ックス相体と同様に平均粒径約0.01〜約2ミクロン
のものが使用できる。 上記例示の如きJ’t1体に、ハゲテンに対するモノク
ロナル抗体を担持さぜる手法は従来公知の完全抗原に対
する抗体を相体に担持させる手法において、該抗体の代
シに、ハゲテンに対するモノクロナル抗体を用いるほか
は同様にして行うことができる。その手法は程々知られ
ておシ、本〉し明において適宜に選択利用できる。この
ような相持手法としては、担体にこれらを吸着させる手
r′ン及び化学的に結合させる手法のいずれの手法も利
用することができ、本発明に於て、ノ・ブテンに対する
単一9.のモノクロナル抗体担掲担体と称するのは、こ
れらの任)えよの手法を適宜に辺択利用して担体にハゲ
テンに対する単一種のモノクロナル抗体を担持させたす
べての担持担体を意味する。 以下、その故態様について更に詳しく説明する。 ハプテンに対するモノクロナル抗体担持担体の調製態様
ニー ハプテンに対するモノクロナル抗体を吸着によυ担体に
て感作するには、モノクロナル抗体の溶液と担体の懸1
%液を混合することにより、容易にモノクロナル抗体相
持相体を得ることができる。 モノクロナル抗体は多くの場合カルボキシル基と第1級
アミン基の双方を有する。モノクロナル抗体を化学的に
担体にf’i′i合させるには、例え1−、+:前記官
能基を有する反応性高分子ラテックスとモノクロナル抗
体をカルボジイミド法、カルボニルジイミダゾール法、
混合酸無水物法、活性エステル法などの一つを適宜選択
して用い、結合することによりモノクロナル抗体担持担
体を得ることができる。 また赤血球を担体として用い、モノクロナル抗体を担持
するには、例えば赤皿球をホルマリン、グルタルアルデ
ヒド又はピルビンアルデヒド等の適切なもので固定化し
フヒ固定赤血球を用い、必要に応じタンニン酸あるいケ
J、ビスジアゾベンジジン(B l) B )やグルタ
ルアルデヒド等の縮合剤を用いて担持させ、モノクロナ
ル抗体担持血球を得ることができる。 上述のようにして調製できる(A)ノ・ブテン又はその
化学的変性物を化学的に結合せしめたカルがキシル基含
有水浴性モノオレフィン系高分子化合物、若しくは該結
合物をラテックス担体に結合したハシテン担持担体とC
B)上記ノ・ブテンに対する単一種のモノクロナル抗体
担持担体の組み合わせから成る本発明の免疫化学的ll
す定試セI≦としては、下記の如き測定試桑を例示する
ことができる。 1、 エツトロケ9ンの測定試Jにとしては、(イ)A
:エストリオールー16−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸結合ラテックスと n:抗エストリオールー16−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体相持ラテックスよりなる免J42化学的測定試
荏、 (ロ)A:エストリオールー16.17−ヅへシリ−ク
シネート結合ポリアクリルI’i’?#、lB合シラテ
ックス B:抗エストリオールー16.37−ソヘミーリークシ
ネートモノクロナル抗体相持ラテックスよりなる免疫化
学的1111定試薬、(ハ)A:エストリオール−16
−グA・クロナイド結合ビニルメチルエーテル無水マレ
イン【イ1ヨ重合体結合ラテックスと B:抗エストリオールモノクロナル抗体41月1ラデツ
クスより疫る免疫化学的測定試県、に)A:エストリオ
ールー16.17−ジヘミサクシネー トff+’r
合e =ノしメチルニーデル;fm; 7J′−yレイ
ン酸共重合体と B:抗エストリオールモノクロナル抗体相持ラテックス
よりなる免疫化学的測定試薬。 (ホ)A:エストリオールー16−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸結合ラテックスと 13 : 抗xストリオールー16−グルクロナイドモ
ノクロナル抗体感作血球よりなる免疫化学的b’lll
定試ジζが、 (へ)A:エストリオールー16.17一ソヘ汁ナクシ
ネート結合ポリアクリル酸と B:抗エストリオール−16+’ 17一ジヘ汁ナクシ
ネートモノクロナル抗体感作血球よりなる免疫化学的測
定試薬、 (ト)A:17−7ミ/−1,3,5(10)−エスト
ラトリエン−3−オール結合ポリアクリル酸結合ラテッ
クスと B:抗エストリオールー16−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体相持ラテックスよシなる免に化′O1と的ii
、’l ′、llπ・い1′5等々。 2 プレグナンソオール;則定i・−(′1sとしてt
土、(イ)A:プレグデンソオール−3−グルク11ナ
イビシ吉合ポリアクリル1′g2結合ラデツクスとB:
抗ゾレグナンヅオールー3−グツしクロナイドモノクロ
ナル抗体Ju4−′jラテックスよりなる免疫化学的測
定試ジーS1 (ロ)Δ:グレグナンソオールー3−グルクロナイド結
合ピニノしメチルエーテル” 無ノ’マレインiT’i
共重合体と B:抗グレグナンソオールー3−グルクロナイドモノク
ロナル抗体和J<ラテックスよりなる免疫化学的測定試
薬、 (ハ)A:プレグナシソオール−3−グルクロナイド結
合ポリアクリル戯と B:抗ゾレグナンノオールー3−グルクロナ・fドモノ
クロナル抗体相持ラテックスよりなる免疫化学的測定試
薬、 に)A:プレグデンソオール−3−グルクロナイド結合
ン1?リアクリル酸結合ラテックスとB:抗プレグナン
ジオールー3−グルクロナイドモノクロナル抗体感作血
球よりなる免疫化学的測定試薬、 (ホ)A::76レグナンジオール−3−ダルクロナイ
ド結合−ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体
と B:抗ン0レグナンソオールー3−グルクロナイドモノ
クロナル抗体感作血球よシなる免疫化学的測定試薬、 等々。 3、 1’l−011C5測定試築としては、(イ)A
:3α、11β、17α、21−テトラヒドロキシプレ
グナン−20−オン−3−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸結合ラテックスと B:抗3α、11β、17α、21−テトラヒドロキシ
ゾレグナンー20−オン−3−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体」11持ラテツクスよりなる免J′ε化学的i
1:l定試イ5、(ロ)A:3α、11β、17α、2
1−テトラヒドロキシプレグナン−20−オン−3−グ
ルクロナイド結合ビニルメチルエーテル外水マレイン酸
共重合体と B:抗3α、11β、17α、21−デトラヒドロキシ
プレグナン−20−オン−3−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体Jμ持うデツクスよりなる免疫化学的測定試4
’+z N(ハ)ノi:3α、11β、17α、21−
テトラヒドロキンプレグナン−20−オン−3−グルク
ロナイド結合ポリアクリル酸結合ラテックスと I3:抗3α、11β、17α、21−テトラヒドロギ
シプレグナン−20&−オン−3−グルクロナイドモノ
クロナル抗体相持血球よりなる免疫化学的測定拭払(≦
、 に)A;3α、11β、17α、21−テトジヒドロキ
シグレグナン−20−オン−3−グルクロナイド結合ビ
ニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテッ
クスと B:抗3α、11β、17α、21−テトラヒドロギシ
プレグナン−20−オン−3−ダルクロナイドモノクロ
ナル抗体担持ラテックス よりなる免疫化学的測定試薬、 等々。 4、 モルフインの測定試薬としては、(イ)A:カル
ボキシメチルモルフイン結合ポリアクリル酸結合ラテッ
クスと B:J几カルボキシメチルモルフインモノクロナル抗(
4、’jH!’j寺ラテックス よりなる免疫化学的8(l所ゴ・(桑、(C1)A:カ
ルフ〕?キシメチルモルフイン結合ビニルメチルエーテ
ル無水マレイン酸、I(重合体とB:抗カルボキシメチ
ルモルフインモノクロナル抗体担持ラテックス よりなる免疫化学的測定状A11;、 等々。 5、 17− J(5(7)l、il定試沓5、(イ)
A:エチオコラノロン−3−へミーリクンネー1−結合
、 、j5リアクリル酸結合ラテックスとB:抗エチオ
コラノロン−3−へミザクシネートモノクロナル抗体J
旧−ケラテックスよりなる免疫化学j杓測定試帛、 (ロ)A:エチオコラノロン−3−へSザク7ネー)結
合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共届−合体r1
1合ラケラテック ス:抗エアオコラノロンー3−ヘミサクシネートモノク
ロナル抗体m’tl血球 よりなる免疫化学的測定試薬、 (ハ)A:エチオコラノロン−3−ヘミサクシネート結
合νj?リアクリルr(χと B:抗エチオコラノロン−3−へ汗ナクンネートーEノ
クロナル抗体」U持血球 よシなる免疫化学的測定試薬、 等々。 6 サイロキシン(T、)測定試薬としては、(イ)A
:サイロキシン結合号?リアクリル酸結合ラテックスと B:抗サイロキシンモノクロナル抗体相持ラテックス よりなる免疫化学的測定状4:1、 (ロ)A:サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水
マレイン6′2共重合体と ” : 抗−!J−イロキシンモノクロナル抗体JII
J?ラテックス よりなる免疫化学的1411定試セ、1シ、(ハ)A:
ザイロキシン結合ポリアクリル酸結合ラテックスと B:抗サイロキシンモノクロナル抗体担持血球よυ安る
免疫化学的i!η1定試塾、 等々。 7、 カテコールアミンの1fjlj定試桑としてt」
2.0)A:メタネフイリン結合ポリアクリル酸結合ラ
テックスと B:抗メタネフイリンモノクロナル抗体担j“rラテッ
クス よりなる化5′:召ヒ学的1Tjll定試ゼit≦、(
ロ)A:メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無水
マレイン「H’5.共重合体と B:抗メタネフィリンモノクロナル抗体相持ラテックス よシなる免疫化学的測定試薬 等々をあげることができる。しかし、本発明の試薬は上
記に掲げる具体例の例示に限定されるものではない。 本発明によれば、上述の如き新しいタイプの測定試薬を
利用したハプテンの新しいタイプの免疫化学的測定方法
が提供できる。この測定方法によれば、前記(A)ハゲ
テン又はその化学的変性物を化学的に結合せしめたカル
ボキシル基含有水浴性モノオレフィン系高分子化合物、
若しくは該化合物をラテックス担体に結合したハプテン
担持担体及び(B)上記ハゲテンに対する単一種のモノ
クロナル抗体担持担体の組み合わせを用い、被検体中の
該抗原による上記CA)及び(B)両試築成分の凝集を
阻止する凝集阻止反応を測定するととにより、上記・・
ブテンを免疫化学的にi!’!11定することができる
。測定は、被検体中の7・ブテンの存在を測定検出する
定性的1 i+111定及び被検体中の抗原の名゛′”
1度をj[!II定イ・(出する定量的な測定のいずれ
の態様によっても行なうことができる。″11jB検体
の例としては、尿、血n’f % 血漿、羊水などの如
き体液もしく l:T、体液成分を例示することができ
る。以下、本発明の免疫化学的測定方法について更に詳
しく説明する。 血液、尿その他の体液中に存在する微量物質は前記試薬
を用いて凝集阻止反応により定7.することができる。 具体的な測定法は実施例として示したが、一般的な測定
法は次に述べる通りである。 原〃!1的にはハプテン−CIV P結合物又は〕・ブ
テン担担持体と該ハシテンに対するモノクロナル抗体感
作担体の凝集反応系を用いた凝イ1′−阻止反応である
。すなわち、(1)例え−”、、Irr浄なスライド板
上に1滴の試験検体(適宜希釈)を置き、その上に1滴
の前記モノクロナル抗体感作ラテックスを滴下し、次い
でハゲテン担持ラテックス11(、<1を滴下した後、
三者を混合し、2分間揺動することにより、試験の結果
が観察され、凝集像を陰性、凝シ1ミ阻止像(非凝集像
)を陽性と判定する。 (2)清浄な丸底試験管に検体(適宜希釈)の一定量を
入れ、これにモノクロナル抗体感作血球懸濁液の一定量
を加えて振・パ・λ混和後、ノ・ブテン−crr=’p
結合物懸濁結合−懸濁液加えて振γ才混和し、ミラー付
スタンドに静置し、2時間後に管底像を観察する。この
場合、凝集阻止像(陽性像)は沈降リングを形成し、凝
集像(陰性仰)はマット状を呈する。 検体中のハプテン感)現は、検体を適宜希釈して試験を
行い、陽性像を呈する最高希釈倍数に測定感度を乗する
ことによ請求めることができる。 本発明の(、()ハプテン又はその化学的変性物を化学
的に結合せしめたカル)】?キシル基つ有水11r性モ
ノオレフィン系高分子化合物、若しくしよ該化合物をラ
テックス、111体に結合したハプテン担持担体及び(
1))上記ハプテンに対する一IQ−4JHのモノクロ
ナル抗体担持担体のfJlみ合わせから汝る該ハゲテン
の免疫化学的ηill定試己“5及びこれを用いた該ハ
プテンの免疫化学的11jil定方法によれば、モノク
ロナル抗体利用の従来J々術においては、乍−+・(の
モノクロナル抗体の利用によっては対応抗原と結合して
沈殿物を生成し、ないので二以上TijJQ J+ij
の色釉モノクロナル抗体の1更用が必須でま)っだにも
拘わらず、全くλ丁、外なことに1.l二Re (A)
及び(1; )両試ケjコの同には/N1足すべき?4
具反応が生ずる。lji↑〈て、本う11明によれt六
ハグデン分子中の−っの特定部位孕憤依的に認l;哉す
る能JJを有するモノクロナル抗体の4’ N・i7と
ハプテンとのt′1み合わせによる凝集反応であるため
、顕著に高い特異性が達成できる特色がある。更に、上
記(A)及び(H)両試薬の間の凝集反応で形成される
凝集像は、予想外なことにも、従来のポリクロナル抗体
を用いたものよりも強いル】し集性を示す鮮明な凝年像
と力る特色がある。又更に、モノクロナル抗体利用の従
来技術においては、二以上の異種モノクロナル抗体を使
用してもなお、全く効果的でないことさえあるというト
ラン゛ルがあったにも拘わらず、本発明によればそのよ
うなトラブルから解放され、広汎な任意のノ・アミンの
免疫学的測定方法に適用可能となる特色を有する。 本発明によれば、上述の如き特色を持ったモノクロナル
抗体利用の新しいクイズの免疫化学的測定試薬及び測定
方法が提供でき、顕著に侵れた確実性、信頼度、精度、
感度及び顕著に高い特異性をもって、偽反応生起のトラ
ブルを伴うことなしに、V−れた賞現性、安定性で月っ
容上口なt’:作で、煙時間に被検体中の01シ川のハ
ゲテンを免ブ′ζ化学的に測定することができる。 以下、実施例により木ブ!;明の数実施態析について「
グに詳しく説明する。 実M1」例1 尿中エストロケ゛ンの1jilj定 (a)抗エストリオールー16−グルクロナイドモノク
ロナル抗体4I!持ラテックスの11″I造((Z−1
)エストリオール−16−グルクロナイド(Es16G
)−BSAの製造 エストリオール−16−グルクロナイド(/?、16G
)40m9をN、N−ジメチルホルムアミド溶液1.。 rrteK溶角了し、これに4℃す、下でトリーn−フ
゛デル7 ミン20.6μlを添加したのち、イソブチ
ルクロロカーボネート11.2μlを加え30分間イτ
jl′l’した。これに予めB、SA、(牛血清アルブ
ミン)117I’9を2.8 m(!の水((訂ツノ・
fしプCものにIN水酸化ナトリウム液1” Q /l
lを加えたのちジメチルホルムアミド20πlを加え、
8℃に保たれた液を混合した。次いでこれを8℃で撹拌
し、1時間後にIN水酸化ナトリウム液16,6μlを
加え、さらに35時間橙押したのち、セファデックスa
−25で未反応のエストリオール−16−グルクロナイ
ド及びトリー?2、−ブチルアミン等の低分子試薬を分
F4Fした。さらにこれを’)”’M析(鞘製氷に対し
)したのち凍結乾燥すると、エストリオール−16−グ
ルクロナイド−1) S Aが得られた。この抗原の凍
乾末についてのコーベル反応により、B571モル当シ
エストリオールー16−グルクロナイド27〜30モル
の結合が確認されていた。 (a−Z)抗E316Gモノクロナル抗体の製造」−1
記(a)で製造したE 316 G−B 、5 A 2
5 μりCマウス(6〜8趙令)に3yJ間おきに皮下
投−1jし、収穀に50μ7をMj’注した。 t、’、L、 fy、免疫から3日後にマウスのJl’
l! hW、i4を払j出して、肘A、:++胞を採取
し、デルベコのモディファイドr反少基本培地(以下/
)/ME、’+1と称す)で3回わ1[、?’、f+
Lだ彼、#、t+l 1]己7我を37ンiして、その
2X10’イ同をマウスミ”ローマ411111P3−
A’S−1/ l −A g 4−1(以−トN5−
1と栃\ず) I X 107f17Jと混合してン玄
、心し;rfllh”Lを集めた。このペレソ[・に3
7°Cに温めておいたポリエチレングリコ−” i+、
’; ii’i (PEG−100: 4.25%、J
〕At SO:1.5 j6含有1ノ’J/ EM )
f 1 mll加え、1分間遠心?1−1をゆっくり
回転させて細胞融合を行つ/こ。37°Cのり ’Af
E“Mを30秒ごとに2mrずつ10回加えたのち”
hs’+j分t’;in L、ペレットを20九′ウシ
胎児血清含イ〕RPlfl−1640培K11−CA’
S −tとL テ5 X l O’ 1121ロブレー
トに0.2ゴずつ分注し、5%CO2培プこ器で培養し
た。24時間後6ウェルの上清の半量をすて、HAT培
地(ヒポキサンチン・アミツブゾリン・チミジン、10
%′ウシ胎児血清含有RpMl−1640培地)を0.
1 +nl加え、その後3〜4日ごとに半」−:をli
A T培池交換を行いながら2週間培養しだのち j
ij7殖したウェル中の培y二上ネrjの抗体活性を測
定した。 活性の認められたウェルの細胞を#ALJ3/Cマウス
胸腺錫1ii:i、を含む10%ウシ胎児血消含有RP
Jfl −1640培地で希収【−1限界希釈法により
クローニングを行って10株のモノクロナル抗体産生i
iN’i合細胞を得た。これを大最培徴し、その培養上
清からE3G−1?SAを結合させたセファロース4B
を用いたアフイニテイークロマトダラフイーに伺[2、
モノクロナル抗体を得た。また2X10’個以−Hの細
胞をプリスタン0.5 rrreを予め投与したB、A
LB/Cマウスに腹腔内税Jグし、腹水肺癌を作ぜてハ
「L水を得たのち、この腹水をE316G−R5Aを結
合させたセファロース4Bを用いたアフイニディークロ
マトグラフイーによりモノクロナル抗体を初だ。 (a−3)抗E、、16Gモノクロナル抗体JII持ラ
テックスの製造 抗E 316 (y モ/ りoナル抗体0.2 my
を5*rのグリシン緩イ4j化食塩液(7+H13,2
)に溶O’r ly、これに10%ポリスチレンラテッ
クス1 mpを加えて混合し、56℃で30分間処理し
た。次いで遠心公印して得た沈殿をグリシン緩(□17
1化食塩液にてS−;(心洗浄し、沈殿を0059σに
B S Aを含むグリシン緩衝化食塩液20m1:にて
懸洞さぜ、抗E316Gモノクロナル抗体感作ポリスチ
レンラテックスを製造[7た。 (b) エストリオール−16−グルクロナイド#l’
i ’fjポリアクリル酸結合ラテックスの製造 (/1−1)リソン・ラテックス カルボキシルモディファイドポリスチレンラテックスの
109σlJi泊液5mrにε−第三ブチルオキシカル
ボニルリノンメチルエステル260myeツメチルホル
ムアミド(J)JIfF ) 3 m/に溶かした液を
加え、0℃に冷却したのち攪拌しつつ水溶性カルボジイ
ミド、〔1−エチル−a−(3−ツメチルアミノプロピ
ル)カルボジイミド塩酸塩〕243myを加える。0℃
にて1時間、室温にて3時間撹拌をつづけたのち室MA
に一夜放置し、遠心分子・iiする。上清を捨て、沈降
物を50%DMF水溶液、ついで水で洗浄する。 これに氷冷した濃塩酸5mlを加え、ときどきふり1ぜ
つつ0℃に15分間放置したのち氷水で約倍量にうすめ
遠心する。沈降物を洗液が中性になるまで洗浄し、つい
でトリエチルアミンの10%水溶液10 n・?、を加
えて室温で153)4:p4拌rs、= ;、:、を心
12、洗’l+Lが中性に介る1で水洗をくり返す。)
’j、、′□ξに10タロ)旨濁液になるノ;うに1.
′!度を調整し所望のりシン・ラテックスを得る。4く
品t、1、ニンヒドリン反応陽性である。 生成物の4νj債は 八11/2 ■ (C’H2)4 にて表わされる。 (b−2)エストリオール−16−グルクロナイド^′
711合、19リアクリルr戊の一製造(イ) エスト
リオール−16−ゲルクロナイドーヘキザメチレンジア
ミン誘’?f’ 体エストリオール−16−グルクロナ
イド93r9と、N−ノ・イドロキシコノ・り酸イミド
25 +11B、l <cDM F 1.5 meに溶
かし、水冷下撹拌しつつncc41m9を加える。30
分後モノベンジルオキシカルポニルへキサメチレンジア
ミン塩酸塩” 5 wり、トリエチルアミン0.03
veをDMF1rp/に溶かした溶液を加え、水冷下で
2時間、室温で12時間攪拌ケつづける。全体を減圧乾
固し、残渣をブレ・ぐラテイブ薄層クロマトに付して目
的の村記化合物、 82m9(対理論収率55タロ)を得た。 本市はシリカゲルの薄層クロマトでRf=0.42(ク
ロロホルム−メタノール5:1)を示した。 (ロ)上記(イ)で得たエストリオール−16−グルク
ロナイド・ベキ1ノメチレンジアミン;、宣、・’;体
50何ノをメタノール3πt゛に7亡かし、・ぐラジウ
ム黒10rsgを加え、常’jliA常圧で7J%:
CI’;気rr11.中テ化(打する。2時間で反応は
終了(7触ケ1、をむ−・別し、炉液を減圧可縮し、残
渣にエーテルを加えると、カルボベンジルオキシ基が脱
Nしたl]的物3,5mgを粉末としてイ↓)だ。 この生成物1oTRノをポリアクリル酸toomyとと
もにI) M F2 pr(:に溶かし、1)CC4鮪
を加え、室1品に50時間放置する。反応液を1ノー析
し、内液を濾過後凍結乾赴)へすると、エストリオール
−16−グルクロナイド結合ポリアクリル酸95 rn
9を白色粉末として得た。 (/+−3)エストリオール−16−グルクロナイド結
イ]′シj?リアクリル酸結合ラテックスの製造 前記(b−1)で製造したリジンラテックス0.12を
1 meの蒸留水にて懸濁さぜ、これに前記(b−2)
で製造したエストリオール−16−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸水溶液1 rye (エストリオール−
16−グルクロナイド0.311V相当量)を加えて混
合し、ついで1−エチル−3−(3−ツメチルアミノプ
ロピル)カルボジイミド−塩酸塩10m2を加え PH
,押下−夜反応を行なう。 反応終了後遠心分P、a l、て得た沈殿をグリシン緩
衝化食塩液10rneで3回洗浄後、沈殿を0.059
0に1? SA (ウザギ血清アルブミン)を含むグリ
シン緩衝化食塩液30 rniにて懸濁させて、エスト
リオール−16−グルクロナイド結合ポリアクリル酸結
合ラテックスを製造した。 (C) 尿中ニストロダンの測定 月経周期の各時期に採尿した正常婦人尿各3例について
、それぞれをグリシン緩衝化食塩液で2倍、3倍、5倍
、7.5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍
、60倍および80倍に希釈し、各希釈液の1.盲(0
,03+rre )を反応スライド板上にr+gj下し
、これに前記(a)でlid造しだ抗E、 16 Gモ
ノクロナル抗体担持ラテックスを121冷ずつ、)、N
″j下し、ついで前記(b)で製造したエストリオール
−16−グルクロナイド結合ポリアクリルr・ぐ枯イ干
ラテックスを1 i+i’4ずつ滴下する。この三者を
均一に混合し、2分間揺動後肉眼でさ:(:、(i’4
像、7’l’jl:ガユ[f−を止トイ;を1・見察し
だ。 なお、本実施例においてO゛よ測定/+’、:’& f
I)′lを2ng/lnlに調整しであるので各尿中エ
ストロケ゛ンイ1“ll′(は第1表に示すごとくであ
った。 実施例2 尿中ゾレグナンソオールの測定 ((Z) 抗プレグナンジオールー3−グルクロナイド
モノクロナル抗体担持ラデツクスの製造((Z−1)7
’レグナンソオール−3−グルクロナイド−BSAの製
造 プレグナシソオール−3−ダルクロナイドとB SAを
用いて実施例1(a−1)と同様の方法でグレダナンソ
オールー3−グルクロナイド−BSAを製造した。 (a:2 ) 抗プレグナンジオールー3−グルクロナ
イド抗体の製造 上記(a−1)で製造したプレグナンジオール−3−グ
ルクロナイドBSAを用い、実施例1(+1−2)と同
様な方法で4株の抗プレグナンジオールー3−グルクロ
ナイド抗体産生融合細胞t)ミを得た。モノクロナル抗
体は、2X10’個の細胞を予めシリスタン(15mC
腹肘−内J″トLブた13Δ7L 11/Cマウスの腹
腔に移殖して腹/1(を1釆取し、その脱水の硫、安5
0タロ′飽和分画を抗プレグナンジオールー3−グルク
ロナイドモノクロナル抗体としてイ奮だ。 (α−3)抗グレグナンソオールー3−グルクロナイド
抗体」μ持うテックスの製造 上記(a−2)でぶr造した抗グレダナンジオールー3
−グルクロナイドモノクロナル抗体を用い、実施例1(
α−3)と同様な方法で、抗グレグナンジオールー3−
グルクロナイドモノクロナル抗体担4!J、I?リスチ
レンラデックスを製造した。 (b) グレダナンソオールー3−グルクロナイド結合
ビニルメチルエーテル無水マし・インr1夕共重合体(
pVMAfΔ)の製造 (b−r)グレグナンソオールー3−グルクロナイドリ
ジンN#j e:す、休 プレグナンジオール−3−グルクロナイド99ffJ9
、ε−ベンジルオキシカルがニルリソンメチルエステル
・トルエンスルポン酸34I 140ワヲ/□)//F
12 meに溶か[2氷冷下][1,拌しつつソフェ
ニルホスホリルアミド65弥つぃでトリエチルアミン0
、056)〃lを加えたのち、実施例1(b−2)と同
43於((シて下n:j ’1丁G造式で表わされる目
的のりジン誘尋体toomy(対理論収率”8X)を得
た。 (b−2)プレグナシソオール−3−グルクロナイド結
合p /7 jτ/、Mイの製造」二6己(b−t)で
イ)だフ0レグナンソオールー3−グルクロナイド−リ
ジン誘尋体33 nIgを実施例x(b−2)と同様に
して接f:’jI’jJLL元した生成物をpHMMA
100 mgとともに)) M F 6 meに力旧
゛昌n了解したのち、室温に4日間放置した。反応液を
実施例z(b−2)と同様に10理し、プレグナンシ。 オール含[J O−46+I+!// me (9i(
19発色にヨル定F]−)のプレグナンジオール−3−
グルクロナイド結合i合pvMrhΔのm液30グlを
得た。 (C)尿中プレグナンジメールの測定 妊婦尿5例をダリシン緩杓化食塩液で500倍、100
0倍、2000倍、4000倍および8000倍に希釈
し、各希釈液の1 イ’lJi (0,03r−/ )
を反応スライド板上に部下[7、これに(σ)で製造し
た抗グレダナンヅオールー3−ダルクロナイドモノクロ
ナル抗体相持ラテックスをl 7i!’i闇’つ、つい
で(b)で製造したプレグナンジオ−/1.−3−グル
クロナイド結合P V M A−I Aのグリシン緩衝
化食塩液の清液を1f:・□・:Jずつirl’j下し
1、この三者イじ均一に混合し2分間揺動後肉眠でイ疑
集体、凝集阻止像を観察した。 力お、この実施例においては、試5%%の感度を5n
17 / rviに訓コ整しであるので各妊婦Di芝の
ゾレグナンジオールr弓度は第2表に示す値であった。 実施例3 尿中17−Of−JC5の測定 (σ)抗3α、11β、17α、21−テトラヒドロキ
シプレグナン−20−オン(TJIF)−3−グルクロ
ナイドモノクロナル抗体感作血球の製造 (a−1)TIIF−3−グルクロナイド−,13S
Aの製造 Ti1F−3−グルクロナイドとB 、5 Aを用い、
実施例1(a−1)と同様な方法でTIIF−3−グル
クロナイド−BSΔを製造した。 (a−2)抗THF−3−グルクロナイドモノクロナル
抗体の製造 上記(c−t)で製造したTl1F−’3−グルりロナ
イド−BSAを用い、実施例1(α−2)と同様な方法
で6株の抗TIIF−3−グルクロナイド抗体江生融合
細胞株をイJ)、実施例2(a−2)と同様な操作によ
り、抗TJIF−3−グルクロナイドモノクロナル抗体
を得だ。 (α−3)抗T11F −3−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体感作血球の芽こ(造 ホルマリン固定羊血球の49に懸濁液(リンlI:でド
(tj化化成塩液pH6,4)に等41の0.01%タ
ンニン酸溶液を加えて56°G 30分反応させた後、
リン酸緩衝化食ハX液にて血球をfft: rD後、8
26懸バ宵色とする。ついで上記(α−2)で製造しだ
抗1’1lF−3−グルクロナイドモノクロナル抗体の
0.0005%俗液をi:F 石−加え56°Gで2時
間反応させる。反応終了後、リンrf?緩衝化食塩液に
て血殊を遠心洗7子し、0.2%にN RS (正′帛
写:児血清)5%に乳糖を含むリンr波緩画化食ゼ賃1
1:にて15ン(1血球υ′1度に希釈1.、 0.1
nreずつアンプルに分注し、次いで凍h’j 乾j
’!”ユして抗T−II’ F−グルクロナイドモノク
ロナル抗体感作血球を製造した。 (/+) TRF −3−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸の製造 (b−t)7°lf 、1’ −3−グルクロナイド−
リジン誘導体 実倫例2 (/) −2)に従い、i’1lF−3−グ
ルクロナイド5’3++y、ε−ペンツルオキ7カルン
ヒニルリノンメチルエステル・トルエンスルホンRJ’
m59mp、ソフエニルポスホリルアジド331−7g
、トリエチルアミン(1,027m(とから所望のリジ
ンii;#導体57 ry (対理論収率7196)を
得た。 (b−2)TffF−3−グルクロナイドA′占合、I
Eリアクリル酸の製造 り記(b−1)で得たリジン誘導体40m9を実施例1
(−)と同様にして接触還元後DC014mgおよびポ
リアクリル酸100?5と反応せしめ、後処理し、TH
F−3−グルクロナイド結合ボリア り’) ル?l+
’l溶液15m(!(T、IIF含有L1°0.96π
y/me)を得だ。 (C)尿中1T−0,110Sのjllll定正常男子
床及び正常女子尿各々3検体について、それぞれをリン
【:汀(衝化食堵液で100倍、150倍、20041
′?、250倍、300倍および400倍に4釈し、各
希釈酸を丸底小試H−q管に0.1 rnIずつ分注し
、ついで前記(a)で狙!;宣しだ抗TJ/F−3−グ
ルクロナイドモノクロナル抗体感作血球1アングルをリ
ン酸緩ゼ・I化成j(1を液0.3 mrで懸濁させ/
こ全量を、それぞれに添加し混合tV、!、’押抜、上
記(1))で製造しだTIIF−3−グルクロナイド結
合11?リアクリル帥のリン酸鋒(どi化成塩液0.1
mcを加え、よく17、ξ押抜、ミラー付スタンドに
21′I′l′間静置したのちン¥・Iニガ8争、7+
+ご:S lIt 、IL、イ象を(で見察しだ。与本
実施例においてはill、!ll高感度20 n Q
/’rneに調整L テ4) ル(7) f各床中17
−0 、// CS i”、:n”lIt、I、第3表
に示すととくであつブこ。 実施例4 サイロキシン(T4)の測定 (a)抗すイロキシンモノクロナル抗体世持ラテックス
の製造 (Q、 −1)サイロキシン−B S Aの製造B S
、45’ Q mqを25*rの蒸留水に、宕角厘7
、この(r;fil K !5 +pe (7) l)
N Fに俗1’R’ シ’;’Cサイロキシンを加え
、4謂′lミ下30 m9の1−シクロへキシル−3−
(2−モル・ポリニル−4−エチル)カルボソイミドメ
1p−)ルエンスルフォネートを加え、室温にて一夜反
応を行なった。反応液をノに留水に幻して辺析後、用5
結乾燥を行なってサイロキシン・B S Aを製造した
。 (a、 −2)抗ツイロキシンモノクロナル抗体の[F
]′I造 上記(a)で−1・4 hしたサイロキシン・U 、5
A f Jll イ、実施例1 (a、 −2)とト
旧゛りな方法で抗−リーイロギンンモノクロナル抗体産
生融合細胞株を得、実施例2(a−2)と同様にして抗
ザイロキシンモノクロナル抗体を得だ。 (a、 −3)抗すイロキシンモノクロナル抗体相」も
ラテックスの製造 Jm記(a−2)でU+;!造した抗ザイロキシンモノ
クロナル抗体0,2h・ノを5力、eの2へ留水に溶i
’47k、これにカルボキシルモディファイドラテック
スの10%懸潔液1r戸を混合し、次いで、10m9の
1−エチル−3−(3−ツメチルアミノゾロビル)カル
ボソイミド塩酸塩を加えtTht拌下−夜反応を行なっ
た。反応終了後、遠心分i’!して得た沈殿をグリシン
緩衝化食塩液で洗浄し、沈殿を008%にヤギ血清アル
フゝミンを含むグリシン緩動化食塩yk10 r!Ie
にてjl、+、p 渇させて、抗サイロキシンモノクロ
ナル抗体結合ラテックスを製造した。 (b)ザイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水マレ
イン酸共爪合体(P VJiAfA )結合ラテックス
の製造 (b−1)サイロキシン結合P V 71f M 、4
の製造実施例2(b)と全く同様にしてP L’ 、A
f i(/lとサイロキシンとから製造し、ンf析内l
戊を坤紅i乾1;7j L、て白色粉末として得た。 (b −2)サイロキシン結合P I/ MMΔf’i
合ラテックスのル・」造 前記(b−1)で5目造したサイロキシン結合p V
fifAi yiと実施(3’lJ 1 (b −1)
で釡′1造し/こリジンラテックスを用いて実施例1(
1)−3)と同様な方法でサイロキシン結合P )”
M 、+/ΔA1″f合ラテックス全ラテックス。 (’) T4の測足 正常男子血清4例について、8−アニリノ−1−ナフク
レンースルフオン酸を添加後、生理食塩水で2倍、3倍
、4倍、5倍、8倍及び10倍に希釈し、実施例1(c
)と同様な操作にょシT4を測定した。本実施例におけ
る試薬の測定感度は1゜n g / Tn(! VC調
整しであるので、測定値は第4表に示す通りでを)つた
。
、このような抗原性物質で1・II物を免疫して生成し
た抗体と反応性を有するものをいり。かかるハプテンと
して、’l”Jに、生体内に存在する成分(生理活性成
分およびその代、111産物を含む)および生体に投与
された系物訃よびその化1q1産物が本発明の対象とす
るノ・ブテンとして升要である。 同−山ル((人の出願に係わるI庁開昭55−5294
5及び特開昭55−52946号には、(σ)ハプテン
又はその化学的変性物を化学的に結合せしめたカルボキ
シル基イ3有水i’1’i性モノオレフィン系高分子化
合物が、約(1,Ql〜約2ミクロンの粒径の1、−ち
分子ラテックスに化!!74的に結合していることを1
1)包とする辛i ノ:i、な(テ已疫化学的測定試祭
、及び該(α)ノ・フ0テンJ’Q !−’+ラテック
スと、 (/J) ・・ブテン抗体を約001〜約2ミクロンの
粒径の高分子ラテックスにE・;(作し又は化q的に結
合しまた抗体:lr!、l=〒ラデツクス或はハプテン
抗体(抗血清) とから成ることを特徴とする・・ブテンの免疫化学的測
定方法(特開昭55−52945号)又は(C)ハシテ
ンまたはその化学的変性物を化学的に結合せ17めだカ
ルボキシル基含有7J<溶性モノオレフィン系高分子化
合M:Jと、 (の ハプテン抗体を担体に化学的に結合させるか゛ま
たは感作させたハプテン相持」1体とから在るハシテン
の免疫化学的測定状Jj≦(特開昭55−52946号
)、更には、上記(a)及び(b)、もしくは(C)及
び(カを用い、被検体中の)・ブテンによる上記(a)
、(b)あるいは(C)、(の両試票のδ″・召集阻止
反応を測定することを特徴とする)・ブテンの免疫化学
的測定方法が提案されている。この42案に於ては、上
記(b)及び(のにおける抗体としてモノクロナル抗体
を除外はしていないが、該モノクロナル抗体利用につい
ては、とくにはも及しておらず、亥だその具体例も示さ
れていない。 本発明においては、上記提、;j=における該(b)及
び(のとして、該提案が具体的に開示しておらず且つま
た前述したモノクロナル抗体利用の従来提案とは異なっ
て、(B)上記ハシテンに対する単−柿のモノクロナル
抗体相持4u体を厖択利用することによって、顕著に代
れた確実性、イ1j頼度、棺鹿、感度及び顕著に高い抗
原11♀具性をもって、偽反応生起のトラズルを伴うこ
となしに、優れだP]現性、安定性且つ容易な掃作で、
短時間に71・ν塗体中の微量なハプテンを免疫化学的
に測定できる。 本発明で用いる(、()ハプテン又はその化学的変性物
を、化学的に結合ぜしめたカルボキシルノ1与含有水溶
性モノオレフィン系高分子化合物、若しくは該結合物が
約0.O1〜約2ミクロンの粒径の高分子ラテックス担
体に化学的に結合して成るハプテン担持」1休に利用す
るハプテン又はその化学的変性物ならびに変性手法、該
ハプテン又はその化学的変性物を化学的に結合させるカ
ルボキシル基含有水溶性モノオレフィン系高分子化合物
(便宜上、CWpと呼ぶことがちる)、該CI?” p
への該ハシテン又はその化学的変性物の化学的結合方法
及び結合物、更に、該結合物と高分子ラテックス担体と
の化学的結合手段ならびに斯くて形成されたハプテン4
11持担体などについては、同−出紙(人の出願に係わ
る上記特開昭55−52945号に詳にlflに記載さ
れており、本うa明において利用できる。 利用するハプテンの例としては、以下の如きものが例示
できる。 (1) ステロイド系ハプテンニー (i) 例エバエストロン、エストラジオール、エスト
リオール、エステトロール、エクイリン、エクイレニン
等の卵胞ホルモン、 (ii) 例えば、プログ9ステロン;ゾレグナンジオ
ール;プレグナントリオール;19−ツルーエチステロ
ンおよび酢6タクロルマジノン等の合成黄体ホルモンへ
9の黄体ホルモン、(iii) 例えば、テストステロ
ン、デヒドロエピアンドロステロン、ソヒドロテストス
テロン、アンドロスゾロン、エチオコラノロンイγの男
性ホルモン、 (1v)例えば、コルチゾール、コルチゾン、デオキシ
コルテコステロン、アルドステロン、テトラヒドロアル
ドステロン、テトラヒドロコルチゾール等の副腎皮質ホ
ルモン、 (v) ビタミンJ)類;コレステロール;例えi・′
:I:コール酸、デスオキシコール酸、ケノコール酸等
の胆汁r;:?:強心性ステロイド;サポニン;ザポケ
゛ニンウ、テのその他のステロイド類。 (n) 生理活性アミン類ニー (i) エピネフリン、ノルエピネフリン、ド・ぐミン
、エフェドリン等のカテコールアミンおよびそれらの代
謝産物; (ii) モルフイン、コディン、ヘロイン、モルフイ
ングルクロナイド、コカイン、メスカリン、ノぐノぐペ
リン、ナルコチン、ヨヒンビン、レセルピン、エルゴタ
ミン、ストリキニーネ等ノ生理活性アルカロイド類; (iii) L S I) 、アンフェタミン、メゾロ
ノ々メート、メタアンフェタミン等。 (m) その他のノ・ブテン類ニー T I?il 、 Lll −R11の如き抗原性を有
しない低分子ペグチド辺;ソヨードサイロニン、トリヨ
ードサイロニン、サイロキシン等の甲状片?ホルモン;
プロスタグランソンE2、プロスタグランジンE3、ブ
ロスタグランソンp′lα〜覇)プロスクダジンソ7
p;fi、 ;ビタミンA1 ビタミンBグ511()
ワ1jえ(・じビタミン73.。 B2 、Bo 、IJ、2等)、ビタミンE1 ビタミ
ンに等のビタミン用;ペニシリン、アクチノマイシン、
クロロマイセチン、テトラサイクリン等の抗性物質。 利用するハプテンの例と[7ては、」1謁例示の如き生
体内に存在する成分、生体内に投Ljされたト2、物お
よびそのイい■産物などC角(、(多くのハプテン類を
あげることン%できるが、’4V ’j’i’i l叫
でいうハゲテンit、+iは上記例示のハノテンツ(1
1にト:・髭定されるものではない。 本発明においては、上記例示の如きハプテン&」″、そ
のままで或はそれを化学的に変性した化学的ψ:性物と
してCFPと化学的に結合せしめる。このようなハプテ
ンの化学的変性法として従来種々の方法が知られており
、本発明で利用できる。ノ・ブテンがCWpの有する官
能基たとえばカルボキシル基や水酸基と化学的に結合し
得るように該ノ・ブテンを化学的に変性する如何なる変
性法を採用してもよい。かかるハゲテンの変性法として
は、特にハプテンにカルボキシル基、第1級又は第2級
アミノ基又は水酸基、就中カルボキシル基又は第1級ア
ミン基を導入する化学的変性法が好適である。かかる方
法として例えば以下の如き変性法があげられる。 カルボニル基を有するハプテンに関しては、カルボキシ
ルメチルオキシムに変換することによってカルがキシル
基を導入することができ(例:Journal of
Biological Chemistry、 Vol
。 234.1090−1094頁(1959、) )、或
は、例えばブロム化したのちチオグ、リコール酸と反応
せしめて、カルボキシル基を持たせる(例:5tero
ids、 L 9巻357−375頁(1972))こ
ともできる。 カルボニル化合物のオキシムを57元すると一級アミノ
化合物になることは周知であるが、これもハシテンとし
て利用できる。 まだ水[V夕基を有する)・ブテンは、例えt」:モノ
クロル酢酸と反応させて、カルホキ・/メチルエーテル
化する方法(例: 5cience、168巻。 1347−1348頁(1970))、或は無水コハク
酸と反応させてヘミザクシネートとする方法(例;Jo
nブnal of C11nical Jln、doc
rinology。 33巻、775−782頁(1971))肴がある。 フェノール性水酸基を有するノ・プアンではその水酸基
のオルト又はパラ位に例えば・ξラカルボキシベンゼン
ソアゾニウム塩をジアゾカツプリングさせて、カルづζ
キシル基を導入する(例: 5te−roids、 l
8巻、555−563頁(1971))ことも可能で
ある。 さらにまだステロイド類の代謝物であるグルクロナイド
は、そのカルボキシル基を利用することができるしく例
: Journal of 5teroid、 Bio
−chemistry 、3巻、275−288頁(1
972))、そのカルボキシル基を直接利用できなけれ
ば、適当なソアミン誘導体と反応させて、アミン化合物
に変換することもできる。 二級アミノ基をもつノ・ブテンに於ては、例えばそのア
ミン基をN−保護アミノアルキルノ・ログン化合物でア
ルキル化したのち保護基を説キIFすれば一級アミン誘
尋体に変えることができ(例:FE13 S Lett
ers、36巻、339−342頁(19,73))、
或いは例えUブロム酢酸エステルと反応させたのち加水
分解することによυ、カルg キ’/ ル基をもプコ伊
る(例: Chemicrtl a、n、dpjr、a
、rmacev、ticat )Jtr、1lalゝi
n、、 2 5 巻 + 3 3 8 −840頁(1
977))こともできる。 適当な官1′1μ基を持たないハプテンは寸ず例えば倣
生物による水酸化反応のよう庁手段をj+1’)じ、つ
いで」二連の方法によって請求むる官能基に久4・′1
することもできる。 更に、上記例示の如きハプテンン又はその化学的変性物
を化学的に結合ぜしめるのに利用するカルボキシル基含
有水溶性モノオレフィン系高分子化合物(CJVp)と
しては、カルボキシル基を含(jする水浴性モノオレフ
ィン系高分子化合物の如何なるものでもよい。ここで「
ス1、品+’llとは該病勺子化合物の少くともl爪量
部を1000重口2部の蒸留水に添加した1局舎にi、
L91]な!f′〜1りを形成することをいう。該高分
子化−8物の清+fT度がJ、’:pli:下限庖ン1
j〜足する限り、その俗解Pyはいくら大てあってもよ
い。また該高分子化合物の平均M量分子量に3、約10
8〜107又はそれ以上であってもよく、通常数万乃至
数百万のものが好適に使用できる。またかかる高分子化
合物は、官能基としてカルボキシル基の他に水酸基(−
01#)を有していてもよく、之等の官能基は、ノ・ブ
テン又はその化学的変性物の官能基および後述する高分
子ラテックス担体の有する官能基との化学的結合に関与
すると共に、法高分子化合物に水溶性をも付−りする。 本兆明で使用するかかる高分子化合物は、生理的には不
活性物質と見られるものであって、一般に抗原性をイ〕
しないものである。 壕だ、かかる高分子化合物としては、例えば、アクリル
酸又はメタアクリル酸のホモ−又はコーポリマー;マレ
イン酸と酢酸ビニルとの共重合体又はぞのケン化物、マ
レイン酸と例えばビニルアルコール、低級アルキルビニ
ルエーテル、アクリル酸又はその低級アルキルエステル
、メタアクリル酸又はその低級アルキルエステルとの共
重合体又は所望によりそれらの加水分フ宜物があげられ
る。 之等の高分子化合物は1だ、例えばアクリル酸又はメタ
アクリルr、tと、例えばアクリル前のβ−ヒドロキシ
エチルエステル又tよアクリルアミドとの共重合物、或
は前記のモノマーを構成単位として含有する三元重合体
であってもよい。 本発明に於て、前記例示の如きノ・ブテン又はその化学
的変性物と、上記例示の如き高分子化合物との化学的結
合は、アミド結合又はエステル結合によって行うことが
できる。アミド結合反応を利用するのが好ましい。この
ようなアミド結合反応もしくはエステル結合反応は、そ
れ自体公知の手法を利用して行うことができる。 例えげ、ハプテン又はその化学的変性物をノ・ブテンで
代表して説明すると、ノ・ブテンが例えばアミノ基を有
しそしてCU7 pがカルボキシル基を有する場合、又
はその反対の場合、ハゲテンとCWpとを下記の如き方
法によりアミド結合にょシ化学的に結合することができ
る。 アミド結合でハプテンとc ny pとを結合する方法
ニー(1) カルボジイミド法 アミン基とカルボキシル基との間で脱水縮合によりアミ
ド結合を形成させる方法で、両成分の溶液中に等モルも
しくは僅かに過剰のカルボジイミド化合物を加えて室温
又は水冷下に反応させることによシ目的を達することが
できる。カルボソイミド自身は尿素誘導体に変換する。 −Ni12+−COOII + R−N =C=N−R
−+ 、−NJI−CO−十R−NIICON11−R
反応溶媒としてはそれ自身が反応にあづかる官能基を有
しない限り特に限定されることはなく、例えば酢酸エチ
ル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ツメチルホルム
アミド、クロロポルム等が使用できる。珠だ任意の割合
で水を含有する系であってもよく、水溶液中で反応させ
ることもできる。用いるカルボジイミド化合物としては
、有イ六溶1!I; 中の反応にはジシクロへキシルカ
ルボソイミドが最もよく用いられ、含水不溶がI−中で
の反応には例え←じ1−エチル−3−(3−ツメチルア
ミンプロピル)カルボジイミド塩酸塩等のような水溶性
カルボジイミドを用いることができる。 (2) カルボニルソイミダゾーノ+−v6カルyf
Jイミド法と全く同様にアミン基とカルボキシル基との
間の脱水翁11合を起させる方法で、両成分の溶液中に
必要号のカルボニルジイミダゾールを加えればよい。こ
の試・j14は水分に敏感で、水で直ちに分)5了する
ので、フ1、を含有しない溶111(を用いるのが好ま
しい。 (3)混合酸無水物法 カルボキシル基はクロル蟻酸エステルと、布石1−塩基
の存在下、いわゆる混合酸無水物を形成し、これはアミ
ノ基と容易に反応して、アミド結合を形成する。 −CONJI− クロル蟻酸エステルとしては例えはエチル、イソプロピ
ル、イソブチルのよう力低級アルキルエステル、!侍に
クロル蟻酸イソブチルがよく用いられ、有様塩基として
はトリエチルアミン、N−メチルモルホリン等のような
第三級アミンが利用できる。 反応溶媒にはカルボジイミド法に述べたものをそのまま
用いることができるが、混合酸無水物は水に不安定であ
るので、混合酸無水物を形成する際には含水したものを
用いないよう注意するのがよい。反応温度としては、先
ず例えば−10°〜−20°(、位の低温で混合【;?
炒、水りを形成せしめ1ついでアミノ成分を加えてから
室ン1完にて反応をつづける温度条件で1−好ましく例
示できる。アミン成分を加えるときには水もり、 <
11.を水を自んブr″、fiQ’l:’を使用しても
か捷わない。 (4)活性エステル法 カルボキシル基)1;を′n)、子吸引性の大きい化合
物のエステルにすると、そのカルボニル糸上の電子密度
が八り、ぞの結果アミノ基のような塩基性の大きい官能
基を攻撃してアミド結合を形成することになる。これが
活性エステル法の原理で、活性ニスデルとしては例えば
、パラニトロフェノール、2.4−ジニトロフェノール
、ペンタクロロフェノール、チオフェノール、ナフトー
ル、8−ノーイドロキシキノリン等のフェノール?+’
34体;例えば、N−ハイドロキシコハク「1!2イミ
ド、N−ノ・イ)′口キシピペリリン等のN−ハイドロ
キシ化合物;例えば、シアノメチルのようなアルキルエ
ステル等を用いることができる。溶媒としてはカルボソ
イミド法で述べたものが利用できる。 (5)アミド法 カルボキシル化合物をエステルに変え、ヒドラジンと反
応させると酸ヒドラジドになるが、これは亜硝酉・20
作用により酸アミドになり、アミノ基と反応してアミド
結合を形成する。 ヒドラジド ヒドラジドを稀塩酸中皿硝酸ナトリウムと反応せしめて
生成した酸アジドを−だん単FBシて、ついで適肖な有
機溶媒中アミン成分と反応させる古典的な方法も利用で
きるが、ヒドラジドを有機溶媒(含水したものでもよい
)中、塩化水ネ存在下亜硝酸アルキルエステル例えh+
H亜硝酸t−ブチル、亜硝酸i−アミル等で処理して市
アジドとし、単t’;i!、することなくアミン成分と
反応せしめることによりアミド結合を形成することがで
きる。 (6) 酸クロリド法 カルがキシル化合物を酸クロリドに変え、アミノ化合物
と反応させてアミド結合を生成するItも一般的な方法
も採用することができる。酸クロリドにするにはカルボ
キシル化合物を五塩化リン、塩化チオニル、オキシ塩化
リン等と反応させる直接法と、例えばシュウ酸クロリド
と反応させる交換反応法があげられる。アミン化合物と
の反応忙は水の中でアルカリを加えながら行なういわゆ
る「ショツテン−バウマン法」、必要に応じて例えばベ
ンゼンなどの不活性溶媒中で、例えばピリジン、トリエ
チルアミン等の有43i塩基存在下に反応する方法、女
どがあり、本発明で利用できる。 +7) D I) P A法 カルボキシル化合物とアミン化合物との溶液中にソフェ
ニルホスホリルアジド(DPPA)、ついで例えばトリ
エチルアミン、或はN−メチルモルホリン等の有機塩基
を加えてアミド結合を形成する方法も採用できる。この
際、溶媒としては例えばヅメチルホルムアミドが好辿に
用いられ、温度は水冷から室温でよい。 以上の例えば(11〜(7)の如きアミド結合でハプテ
ンとc tv pとを結合する化学的結合法のいづれを
もってしても目的を達することができるが、本発明に応
用する際にはハゲテンが有する他の置換基などによって
は不安定なものもあり得るので、あまυ檄しい条件を必
要とするものは避けるべきである。最も好ましく利用で
きるのは0)カルボジイミド法、(7) D P P
A法である。CIV pと、導入すべき適尚す1.のハ
プテンの溶液中にハプテンニ対シ等モル又はイ^’iy
I>K過剰のカルボソイミド、もしく1tDPPAを加
えJ) P P 、40〃ろ合には有仁塩基を加えて反
応せしめることができる。反応後は全反応液をセロファ
ンチューブ内にて水に対しj℃析すれば、未反応のハプ
テン、状態、副成物などは外液に逃げるので内液を/l
管縮、或はン東結乾47トすることにより目的のハゲテ
ン又はその変性物−Clr’p結合物を得るととがてき
る。 更に、ハシテン又はその化学的変性物とCTrI p高
分子化合物との化学的結合は、ハプテン又はその化学的
変性物が:+じ1当な反応性水r%Q基を有しそし一’
(CIVpがカルボキシル基を有する場合又はその反対
の場合、ハプテンとCI7;’ Pとをエステル結合で
化学的に結合することにより行うこともできる。 エステル結合でハプテンとc n″pとを結合する方法
:一 エステル1,17合法の場合、ハプテン又はその化学的
変性物が水6だ基を有し、cr:’pがカルボキシル基
を有する場合には、カルボキシル基を例えば塩化チオニ
ルを作用させて酸クロリドに変え、或はCI?−pが例
えば無水マレイン酸を含む共重合体ならばそのt−tで
、ハゲテンと反応させて、エステル結合によるハプテン
−c n〕” p結合物を得ることができる。その反対
即ちハフ0テン又はその化学的変性物がカルボキシル基
を有し、CIVPが水酸基をもつ場合には、ハプテンの
性質によっては反応性B馴尋体例えば酸クロリドに変換
し得る程充分な安定性を有しない場合もあシ、この場合
エステル結合せしめるのは困難である。 かくして得られるハプテン−C117p結合物としては
、数多くのハプテンとCWPの組合せからなる結合物を
得ることができるが、之等の代表例を具体的に示せば、
例えば下記の如き結合物を例示できる。 17−アミノ−] 、3.5(10)−エストラトリエ
ン−3−オール結合ポリアクリル酸、17−アミノ−!
、3.5(10)−エストラトリエン−3−オール結合
ビニルメチルエーテル無水マレインri共重合体、 エストリオール−16−グルクロナイド結合ポリアクリ
ル酸、 エストリオール−16−グルクロナイド結合ビニルメチ
ルエーテル無水マレイン酸共重合体、エストリオール−
16,17−ソヘミザクシネート結合ポリアクリル酸、 プレグナンジオール−3−グルクロナイド結合ポリアク
リル酊、 プレグナンジオール−3−グルクロナイド結合ビニルメ
チルエーテル無水マレインr〉共重合体、プレグナント
リオールー3−グルクロナイド4″11i合ポリアクリ
ル酸、 プレグナントリオールー3−グルクロナイド結合ビニル
メチルエーテル無水マレイン酸共重合体、3α、11β
、17α、21−テトラヒドロキシプレグナン−20−
オン−3−グルクロナイド結合ポリアクリル酸、 3α、11β+17α、21−テトラヒドロキシプレグ
ナン−20−オン−3−グルクロナイド結合ビニルメチ
ルエーテル無水マレイン酸共重合体、 カルd?ギシメチルモルフィンに古’cl’F ;re
IJアクリル酸、 カルボキシメチルモルフイン結合ビニルメチルエーテル
無水マレイン酸共重合体、 エチオコラノロン−3−ヘミサクシネート結合ポリアク
リル酸、 サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸
共重合体、 ザイロキシン結合ポ・リアクリル「1夕、メタネフイリ
ン結合ポリアクリル酸、 メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン
酸共爪合体 等々をあげることができる。 本発明における( A )ハプテン4工l持担体tj1
、j−述のようにして得ることのできるハプテン又ti
tその化学的変性物を化学的に結合せしめ/こCI!’
/lを反応性高分子ラテックス担体とさらに化!1′
的にシ′、“1合することによシ得ることができる。か
かる高分子ラテックスとしては、平均粒径が約001〜
約2ミクロンのものでろ、つて、眩スペーザーと反応し
得る官能基を有するものが用いられる。平均私′i径が
約0.05〜約1.5ミクロンのものが!寺に!JJ′
1.’fi’である。 また、かかる反応性高分子ラテックス担体としては、官
能基としてカルボキシル基、第1級アミン基又はカルボ
アミド基(−CONII2 ) 含有L、且つ基体が例
えばポリスチレン、スチレン−ブタツエン共重合体、ス
チレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリビニルトルエ
ン、ビニルトルエン−ターシャリブチルスチレン等から
成る高分子ラテックス担体が例示ス、きる。このような
ラテックス担体は種々の商品名で市販されており、之等
の高分子ラテックス担体のいずれも使用することができ
る。高分子ラテックス担体の基体は勿論上記例示の如き
重合体又は共重合体に何部限定されない。 高分子ラテックス担体が官能基として第1級アミツガ;
を有している場合は、之等の高分子ラテックス担体をそ
のま咬前記CH7pの有するカルボキシル基と反応せし
めて、アミド結合によってctrtpと化学的に結合す
ることができる。かかるアミド結合の形成は、ハプテン
又はその変性物とcvpとの反応について14℃に説明
したと同様々反応手段を用いて行うことができる。 また高分子ラテックス」°1体とCFpの双方が官能基
としてカルボキシル基j:を有する場合には、該ラテッ
クスの有するカルボキシル基を下記の如き方法によって
化学的に要件して、第1級アミノ基を41人した後、c
n:”pとアミド゛結合によって結合することもできる
。例えばカルボキシル基1(含有ラテックスを水溶性カ
ルボソイミド存在下へブタメチレンジアミンの株なンj
?リメチレンジアミンと反応せしめて第一級アミン基を
増大する方法(例:Journal of Ca1l
niolngy、 64老、 75〜88頁(1,,9
75) )等がある。 本発明では、まだ、例えばN−ε−第3級ブトキシカル
ボニルノンメチルエステル又はN−フタロイル−N′−
メチルトリメチレンジアミンの如き片方のアミノ基をイ
?も′りしたアルキレンツアミン誘導体をカルボキシル
基を有する高分子ラテックス担体と反応させることがで
きる。この反応はノ・ブテンとCWPとの結合に使用さ
れるアミド結合形成反応の中から選択することができる
が、例えば高分子ラテックスの粒径の如き物理的性質を
かえないで反応を行なう必要がある。そのだめには水を
含んだ系で行なうことが望ましく、殖に水浴性カルボジ
イミドを用いる水中でのカルTl?ソイミド法が望まし
い。反応を行々つだ後アミン保護基を除去するとアミン
基を反応基として有する反応性高分子ラテックスが得ら
れる。この様にして得られた反応性高分子ラテックスを
カルボキシル基を有するハプテン又はその変性物とCW
Pとの結合物と前述のアミド結合形成反応により反応さ
せると本発明の測定試薬を得ることができる。この変更
態様については、前記特開昭55−52945号に詳し
く説明されており、本発明において利用できる。 上述のようにして得ることのできるCA)ノ・ブテン又
はその化学曲技11物を、化学的に結合−亡しめんカル
ボキシル基含有水溶性モノオレフ・イン系高分子化合物
(C1l’P)が、約0.01〜約2ミクロンの粒径の
高分子ラテックス担体に化学的1c Fir合して成る
ノ1ゾテン担持担体の例として社、す、下の如きノ・ブ
テン担持担体を例示することができる。 エストリオール−16−グルクロナイドリアクリル酸結
合ラテックス、 エストリオール−16.17−ジヘミサクシネート結合
ポリアクリルげ2結合ラテックス、17−アミノ−1,
3.5(10)−エストラトリエン−3−オール結合ポ
リアクリノb nl結合ラテックス、 17−アミノ−1,3.5(10)−エストラトリエン
−3−オール結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸
共重合体結合ラテックス、エストリオール−16−グル
クロナイド結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共
重合体結合ラテックス、 エストリオール−t6.i7−ノへミサクシネート結合
ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテ
ックス、 プレグデンソオール−3−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸結合ラテックス、 グレグナンソオールー3−グルクロナイド結合ビニルメ
チルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテックス、 3α、11β、17α、21−テトラヒドロキシプレグ
ナン−20−オン−3−グルクロナイド結合ポリアクリ
ル酸結合ラテックス、 3α、11β、17α+21−テトラヒドロキシプレグ
ナン−20−オン−3−グルクロナイド結合ビニルメチ
ルエーテル無水マレイン酌共」(合体結合ラテックス、 カルボキシメチルモルツイン危゛i合ポリアクリル酸結
合ラテックス、 カルボキシメチルモルフイン結合ビニルメチルエーテル
無水マレイン酸共亘合体結合うデックス、エチオコラノ
ロン−3−へミザクシネート4i′i合ポリアクリル鼠
結合ラテックス、 サイロキシン結合ポリアクリル酸結合ラテックス、 サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸
共亜合体結合ラテックス、 メタネフィリン結合ポリアクリル1.t’12結合ラテ
ックス、 メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン
酸共正合体結合ラテックス、 等々をあけることができる。 本発明に於ては、」二連の如き(A)ハゲテン担持担体
におけるハプテンに’1′?異的に反応するモノクロナ
ル抗体を利用して、(B)上記ハゲテンに対する単一〇
11のモノクロナル抗体感作担体を調製する。 本発明で利用する前述の如きハプテンに対するモノクロ
ナル抗体は、細胞a(合技術分野においてそれ自体公知
の手法を適宜に選択組み合わせてモノクロナル抗体産生
融合細胞株を形成し、該細11ii株を利用して産生、
取得することができる。 その−態様によれば、ハプテン又はその化学的変性物を
、抗原性を有する物質と結合させ、このようにして抗原
性を賦与したハシテン結合物を用いて、これを適当な動
物たとえばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウ
シなどの如き動物に、投与たとえばアジュバントと共に
皮下注射の如き手法で投与して、該動物を免J(トじた
のち、この免疫動物たとえば免疫マウスの該ハゲテンに
対する抗体産生細胞たとえば胛X’、lil胞、ル’!
lIl’i! +t!II胞、リンA節細胞および/ま
だは末梢血ffl+胞の如き細胞を採取し、該#ltl
fJ〜と自己増殖性を有するが抗体産生能を実質的に
有しない適当な株化イ(u胞たとえばマウス骨髄肺株化
細胞とを、それ自体公知の手法によシ細l1f8I融合
処理する。 ハシテンに抗原性を賦与するのに利用する抗原性を有す
る物質の例としては、牛血清アルブミン(BSA)、家
兎血清アルブミン(R5Δ)、卵白アルブミン、ヒト血
清アルブミン、牛γ−グロブリン、家兎r−グロブリン
、ヒトγ−グロブリン、破傷a毒素、肺炎球菌多糖体等
の如き物質を例示できる。 更に、ハゲテン又はその化学的変性物と上記例示の如き
抗原性を有する物質との結合は、公知の方法により行う
ことができる(例えば、山村堆−1石板公成編隼、免疫
化学294〜302頁、利金書店発行)。 ハシテンに対するモノクロナル抗体をKrJるだめの、
ミエローマR)11胞と抗体産生細胞との組合せは、各
細胞が融合して増殖しつつ抗体を産生ずることが可能で
あれシ」:、それぞれの細胞の由来する動物の種類は限
定されず、任意の組合せでよい。 使用されるミエローマ細r11には特に限定は々く、多
くのマウス、ラツl−、ウサギ、ヒトなどの動物の細胞
株を使用することができる。好ましい株化細胞は薬剤抵
抗性のものであシ、かつ未融合のミエローマ細胞が選択
培地で生存せず、一方融合細胞のみが生存するようなも
のが良い。最も普通に用いられるものは8−アザグアニ
ジン抵抗性の株化#l1lltelで、これはヒボキサ
ンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラー
ゼに欠tAし、ヒボキサンチン・アミノグチリン・チミ
ジン(IJAT)培地に育生でき女い性質を有している
。さらに使用する株化trill胞は「非分泌型」のも
のであることが好1[7い。例えばマウスミエローマB
opC−214未由来のP3/ X 63− A (7
8UH(7’sU+)、p3/×63−AClB・6・
5・3、p3/N5I−1−Ag4−1、Sp210−
Ag14、ラットミエローマ210・RCY 3・Ag
1・2・3などが好適に用いられる。 該イ(11胞副1合処理しLl例えば、通常イーグ/L
最少基本培地(M八“M )、RPMJ−1640など
の培地中で上記免疫マウスのF’ li“1胞1〜5X
10”個と上記マウス骨髄腫株化細1iiq l〜5X
10’個とを、混合して行なうことができる。l’71
1.合併;+ff4剤としては、平均分子f3.1.
(100〜6.000のポリエチレングリコール(pl
ζG)が好4L、<、他の融合促進剤、例え(・、六ポ
リビニルアルコール、ウィルスなどを使用することがで
きる。PEGの使用L[は約30〜50%で用いること
ができる。 上述のようにして得ることのできるhl・11合細胞1
含有系から1独合、1fll ll1Jを、それ自体公
知の手法を利用【7て、選別処理、抗体活性スクリーニ
ング処理及びクローニング処理して、免し′コマウスの
形成に用いプこハプテンに対するモノクロナル抗体産生
能を・汀し且つ自己増殖能を持つ1.独合Ivml抱株
を取得することができる。 上記f:独合イ(1胞の選別処理は、例えば、20%ウ
シ胎児血清含有RpJ(1−1640培地々どで細胞融
合を終えた細胞を適当に希釈し、96穴マイクログレー
トに10’〜106/ウ工ル程度に分注し、各ウェルに
選択培地(たとえばHA T培地)を加え、以後選択培
地交換を行いながら、5タロC02(培養器(37℃)
で培養を続けることによシ行うことができる。ミエロー
マ17i11 、ll1uとして8一アザグアニン抵抗
性株を用いれば、未融合のミニ0− マgel ll「
・JはHA T培」tlcで死滅17、寸だ抗体産生細
胞は正常細胞なので i n、 tr i、 t r
o培炭では長期間生育でき女い。(7たがって培養後1
0〜140ぐらいから生育してくる4i11 月f・L
IIよ全てρ合細111・1である。 上述のように1〜で得ることのできるρ!1合8111
胞株の抗体活1」゛スクリーニング処理及びクローニン
グ処理は、常法によシ行つことができるが例えV11以
下のようにして行うことができる。 融合A′用胞の化1°工し2だウェルの培養土ntの一
部を採取し1、一定置の標識)・ブテンとインキュベー
ションし ’ 47 F、、jeノ・ブテンとの、t、
l;金倉1已をち州庁することによム 目的とする抗体
を1I)NXt、ているウェルを検索することができる
。即ち、3HX12+!7. +31 Iなどのラジオ
アイソトープあるいは醪素などで標識したハプテンと培
養上着“fを反応させた後、各反応液についてノ・ブテ
ン−抗(1、l’、”、合′吻を分F+′i t、、(
↑識量を測定することによシ、目的とする抗体の存在お
よび結合能を検索することができる。 目的とする抗体活性の認められる各ウェル中には2種以
上の融合細胞が生育している可能性があるので、限界希
釈法や軟寒天によるコロニー形成法によりクローニング
を行い、ハシテンに対するモノクロナル抗体産生融合細
胞株を得ることができる(このようなモノクロナル抗体
産生融合細胞株は微工研の寄託受託拒否対象である)。 上述のようにして得ることのできるモノクロナル抗体産
生細胞株を用いて、前記免疫動物の形成に用いたハプテ
ンに対するモノクロナル抗体を取得するには、該モノク
ロナル抗体産生細胞株を、例えば適当な培地に培養し、
培地からモノクロナル抗体を採取する方法、ミエローマ
細胞由来動物と同系の動物に該細胞株を移植し腹水中の
モノクロナル抗体を採取する方法など、それ自体公知の
手法を利用して取得することができる。 上記前者の態様によれば、例えば、モノクロナル抗体産
生り1合6」tl 1li1株を10%ウシ胎児血清含
有RPMIIG40培地役どの培善液で培πGし、その
培養」−清液を硫安分画、抗原を結合させたセファロー
ス4Bなどのアフィニティークロマトグラフィーなどに
よって8Tj 製することにより目的とするハプテンに
対するモノクロナル抗体を採取することができる。 又、上記後者の左1シ様によれば、例えば、同系動物に
プリスタン(2,6,10,14−テトラメチルペンタ
デカン)などの鉱物油を腹腔内投与した後、融合細胞を
腹腔内投与することによりinυivoで融合細胞を大
量に増殖させる。その結果、形成される腹水には高71
“1度のモノクロナル抗体が含まれている。この腹水か
ら硫安分画及び必要に応じて前記アフィニティークロマ
トグラフィーなどによシ、目的とするハプテンに対する
モノクロナル抗体を取得することができる。 上述のようにして取イl)できるようなモノクロナル抗
体は市販品として人手することも可能であり、利用でき
る。 本発明に於ては、上述のようにして得ることのできるハ
プテンに対するモノクロナル抗体の単一種を担体に相持
させて、(B)ハプテンに対する単一種のモノクロナル
抗体担持担体を得ることができる。 このような感作担体の調製に利用する担体としては、従
来よシ免疫化学的凝集反応および凝集阻止反応において
一般的に用いられる微粒子の担体を使用することができ
、例えばヒト、羊、ウザギなどの赤血球、π■[菌の細
胞などの生物学的粒子、高分子ラテックス、ベントナイ
ト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリ
ンなどの非生物学的粒子などの如き担体を)γ゛げるこ
とかできる。 このよりな]1!体の中で、高分子ラテックス担体のf
i’11としては1.J?リスチレンラテックス、メチ
1/ンープタソエンコフI9リマーラテツクス、ポリビ
ニルトルエンラアックス、ビニルトルエン・t−プチル
スチレンコホリマーラテックス、スチレン−メタアクリ
レ−トコポリマージデックスなどおよび官能基とL7て
カル7+?キシル7!−!j、J I L’lアミノ基
又はカルボアミド基(−CONJI2)を有し、■1つ
基体が前記ラテックスから成る反応1テ1ユ高分子ラテ
ックス寿どを挙げることができる。 」二記例示の如き高分子ジテックス用体の才′l了サイ
ズは’9 ’Ff:に遮択できるが、例えば、平均粒径
が約001〜約2ミクロンのものが使用でき、躬゛に平
均粒径が約0.05〜約15ミクロンのものが好ましい
。又、他の非生物学的担体についても上こ己高分子ラテ
ックス相体と同様に平均粒径約0.01〜約2ミクロン
のものが使用できる。 上記例示の如きJ’t1体に、ハゲテンに対するモノク
ロナル抗体を担持さぜる手法は従来公知の完全抗原に対
する抗体を相体に担持させる手法において、該抗体の代
シに、ハゲテンに対するモノクロナル抗体を用いるほか
は同様にして行うことができる。その手法は程々知られ
ておシ、本〉し明において適宜に選択利用できる。この
ような相持手法としては、担体にこれらを吸着させる手
r′ン及び化学的に結合させる手法のいずれの手法も利
用することができ、本発明に於て、ノ・ブテンに対する
単一9.のモノクロナル抗体担掲担体と称するのは、こ
れらの任)えよの手法を適宜に辺択利用して担体にハゲ
テンに対する単一種のモノクロナル抗体を担持させたす
べての担持担体を意味する。 以下、その故態様について更に詳しく説明する。 ハプテンに対するモノクロナル抗体担持担体の調製態様
ニー ハプテンに対するモノクロナル抗体を吸着によυ担体に
て感作するには、モノクロナル抗体の溶液と担体の懸1
%液を混合することにより、容易にモノクロナル抗体相
持相体を得ることができる。 モノクロナル抗体は多くの場合カルボキシル基と第1級
アミン基の双方を有する。モノクロナル抗体を化学的に
担体にf’i′i合させるには、例え1−、+:前記官
能基を有する反応性高分子ラテックスとモノクロナル抗
体をカルボジイミド法、カルボニルジイミダゾール法、
混合酸無水物法、活性エステル法などの一つを適宜選択
して用い、結合することによりモノクロナル抗体担持担
体を得ることができる。 また赤血球を担体として用い、モノクロナル抗体を担持
するには、例えば赤皿球をホルマリン、グルタルアルデ
ヒド又はピルビンアルデヒド等の適切なもので固定化し
フヒ固定赤血球を用い、必要に応じタンニン酸あるいケ
J、ビスジアゾベンジジン(B l) B )やグルタ
ルアルデヒド等の縮合剤を用いて担持させ、モノクロナ
ル抗体担持血球を得ることができる。 上述のようにして調製できる(A)ノ・ブテン又はその
化学的変性物を化学的に結合せしめたカルがキシル基含
有水浴性モノオレフィン系高分子化合物、若しくは該結
合物をラテックス担体に結合したハシテン担持担体とC
B)上記ノ・ブテンに対する単一種のモノクロナル抗体
担持担体の組み合わせから成る本発明の免疫化学的ll
す定試セI≦としては、下記の如き測定試桑を例示する
ことができる。 1、 エツトロケ9ンの測定試Jにとしては、(イ)A
:エストリオールー16−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸結合ラテックスと n:抗エストリオールー16−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体相持ラテックスよりなる免J42化学的測定試
荏、 (ロ)A:エストリオールー16.17−ヅへシリ−ク
シネート結合ポリアクリルI’i’?#、lB合シラテ
ックス B:抗エストリオールー16.37−ソヘミーリークシ
ネートモノクロナル抗体相持ラテックスよりなる免疫化
学的1111定試薬、(ハ)A:エストリオール−16
−グA・クロナイド結合ビニルメチルエーテル無水マレ
イン【イ1ヨ重合体結合ラテックスと B:抗エストリオールモノクロナル抗体41月1ラデツ
クスより疫る免疫化学的測定試県、に)A:エストリオ
ールー16.17−ジヘミサクシネー トff+’r
合e =ノしメチルニーデル;fm; 7J′−yレイ
ン酸共重合体と B:抗エストリオールモノクロナル抗体相持ラテックス
よりなる免疫化学的測定試薬。 (ホ)A:エストリオールー16−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸結合ラテックスと 13 : 抗xストリオールー16−グルクロナイドモ
ノクロナル抗体感作血球よりなる免疫化学的b’lll
定試ジζが、 (へ)A:エストリオールー16.17一ソヘ汁ナクシ
ネート結合ポリアクリル酸と B:抗エストリオール−16+’ 17一ジヘ汁ナクシ
ネートモノクロナル抗体感作血球よりなる免疫化学的測
定試薬、 (ト)A:17−7ミ/−1,3,5(10)−エスト
ラトリエン−3−オール結合ポリアクリル酸結合ラテッ
クスと B:抗エストリオールー16−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体相持ラテックスよシなる免に化′O1と的ii
、’l ′、llπ・い1′5等々。 2 プレグナンソオール;則定i・−(′1sとしてt
土、(イ)A:プレグデンソオール−3−グルク11ナ
イビシ吉合ポリアクリル1′g2結合ラデツクスとB:
抗ゾレグナンヅオールー3−グツしクロナイドモノクロ
ナル抗体Ju4−′jラテックスよりなる免疫化学的測
定試ジーS1 (ロ)Δ:グレグナンソオールー3−グルクロナイド結
合ピニノしメチルエーテル” 無ノ’マレインiT’i
共重合体と B:抗グレグナンソオールー3−グルクロナイドモノク
ロナル抗体和J<ラテックスよりなる免疫化学的測定試
薬、 (ハ)A:プレグナシソオール−3−グルクロナイド結
合ポリアクリル戯と B:抗ゾレグナンノオールー3−グルクロナ・fドモノ
クロナル抗体相持ラテックスよりなる免疫化学的測定試
薬、 に)A:プレグデンソオール−3−グルクロナイド結合
ン1?リアクリル酸結合ラテックスとB:抗プレグナン
ジオールー3−グルクロナイドモノクロナル抗体感作血
球よりなる免疫化学的測定試薬、 (ホ)A::76レグナンジオール−3−ダルクロナイ
ド結合−ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体
と B:抗ン0レグナンソオールー3−グルクロナイドモノ
クロナル抗体感作血球よシなる免疫化学的測定試薬、 等々。 3、 1’l−011C5測定試築としては、(イ)A
:3α、11β、17α、21−テトラヒドロキシプレ
グナン−20−オン−3−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸結合ラテックスと B:抗3α、11β、17α、21−テトラヒドロキシ
ゾレグナンー20−オン−3−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体」11持ラテツクスよりなる免J′ε化学的i
1:l定試イ5、(ロ)A:3α、11β、17α、2
1−テトラヒドロキシプレグナン−20−オン−3−グ
ルクロナイド結合ビニルメチルエーテル外水マレイン酸
共重合体と B:抗3α、11β、17α、21−デトラヒドロキシ
プレグナン−20−オン−3−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体Jμ持うデツクスよりなる免疫化学的測定試4
’+z N(ハ)ノi:3α、11β、17α、21−
テトラヒドロキンプレグナン−20−オン−3−グルク
ロナイド結合ポリアクリル酸結合ラテックスと I3:抗3α、11β、17α、21−テトラヒドロギ
シプレグナン−20&−オン−3−グルクロナイドモノ
クロナル抗体相持血球よりなる免疫化学的測定拭払(≦
、 に)A;3α、11β、17α、21−テトジヒドロキ
シグレグナン−20−オン−3−グルクロナイド結合ビ
ニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテッ
クスと B:抗3α、11β、17α、21−テトラヒドロギシ
プレグナン−20−オン−3−ダルクロナイドモノクロ
ナル抗体担持ラテックス よりなる免疫化学的測定試薬、 等々。 4、 モルフインの測定試薬としては、(イ)A:カル
ボキシメチルモルフイン結合ポリアクリル酸結合ラテッ
クスと B:J几カルボキシメチルモルフインモノクロナル抗(
4、’jH!’j寺ラテックス よりなる免疫化学的8(l所ゴ・(桑、(C1)A:カ
ルフ〕?キシメチルモルフイン結合ビニルメチルエーテ
ル無水マレイン酸、I(重合体とB:抗カルボキシメチ
ルモルフインモノクロナル抗体担持ラテックス よりなる免疫化学的測定状A11;、 等々。 5、 17− J(5(7)l、il定試沓5、(イ)
A:エチオコラノロン−3−へミーリクンネー1−結合
、 、j5リアクリル酸結合ラテックスとB:抗エチオ
コラノロン−3−へミザクシネートモノクロナル抗体J
旧−ケラテックスよりなる免疫化学j杓測定試帛、 (ロ)A:エチオコラノロン−3−へSザク7ネー)結
合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共届−合体r1
1合ラケラテック ス:抗エアオコラノロンー3−ヘミサクシネートモノク
ロナル抗体m’tl血球 よりなる免疫化学的測定試薬、 (ハ)A:エチオコラノロン−3−ヘミサクシネート結
合νj?リアクリルr(χと B:抗エチオコラノロン−3−へ汗ナクンネートーEノ
クロナル抗体」U持血球 よシなる免疫化学的測定試薬、 等々。 6 サイロキシン(T、)測定試薬としては、(イ)A
:サイロキシン結合号?リアクリル酸結合ラテックスと B:抗サイロキシンモノクロナル抗体相持ラテックス よりなる免疫化学的測定状4:1、 (ロ)A:サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水
マレイン6′2共重合体と ” : 抗−!J−イロキシンモノクロナル抗体JII
J?ラテックス よりなる免疫化学的1411定試セ、1シ、(ハ)A:
ザイロキシン結合ポリアクリル酸結合ラテックスと B:抗サイロキシンモノクロナル抗体担持血球よυ安る
免疫化学的i!η1定試塾、 等々。 7、 カテコールアミンの1fjlj定試桑としてt」
2.0)A:メタネフイリン結合ポリアクリル酸結合ラ
テックスと B:抗メタネフイリンモノクロナル抗体担j“rラテッ
クス よりなる化5′:召ヒ学的1Tjll定試ゼit≦、(
ロ)A:メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無水
マレイン「H’5.共重合体と B:抗メタネフィリンモノクロナル抗体相持ラテックス よシなる免疫化学的測定試薬 等々をあげることができる。しかし、本発明の試薬は上
記に掲げる具体例の例示に限定されるものではない。 本発明によれば、上述の如き新しいタイプの測定試薬を
利用したハプテンの新しいタイプの免疫化学的測定方法
が提供できる。この測定方法によれば、前記(A)ハゲ
テン又はその化学的変性物を化学的に結合せしめたカル
ボキシル基含有水浴性モノオレフィン系高分子化合物、
若しくは該化合物をラテックス担体に結合したハプテン
担持担体及び(B)上記ハゲテンに対する単一種のモノ
クロナル抗体担持担体の組み合わせを用い、被検体中の
該抗原による上記CA)及び(B)両試築成分の凝集を
阻止する凝集阻止反応を測定するととにより、上記・・
ブテンを免疫化学的にi!’!11定することができる
。測定は、被検体中の7・ブテンの存在を測定検出する
定性的1 i+111定及び被検体中の抗原の名゛′”
1度をj[!II定イ・(出する定量的な測定のいずれ
の態様によっても行なうことができる。″11jB検体
の例としては、尿、血n’f % 血漿、羊水などの如
き体液もしく l:T、体液成分を例示することができ
る。以下、本発明の免疫化学的測定方法について更に詳
しく説明する。 血液、尿その他の体液中に存在する微量物質は前記試薬
を用いて凝集阻止反応により定7.することができる。 具体的な測定法は実施例として示したが、一般的な測定
法は次に述べる通りである。 原〃!1的にはハプテン−CIV P結合物又は〕・ブ
テン担担持体と該ハシテンに対するモノクロナル抗体感
作担体の凝集反応系を用いた凝イ1′−阻止反応である
。すなわち、(1)例え−”、、Irr浄なスライド板
上に1滴の試験検体(適宜希釈)を置き、その上に1滴
の前記モノクロナル抗体感作ラテックスを滴下し、次い
でハゲテン担持ラテックス11(、<1を滴下した後、
三者を混合し、2分間揺動することにより、試験の結果
が観察され、凝集像を陰性、凝シ1ミ阻止像(非凝集像
)を陽性と判定する。 (2)清浄な丸底試験管に検体(適宜希釈)の一定量を
入れ、これにモノクロナル抗体感作血球懸濁液の一定量
を加えて振・パ・λ混和後、ノ・ブテン−crr=’p
結合物懸濁結合−懸濁液加えて振γ才混和し、ミラー付
スタンドに静置し、2時間後に管底像を観察する。この
場合、凝集阻止像(陽性像)は沈降リングを形成し、凝
集像(陰性仰)はマット状を呈する。 検体中のハプテン感)現は、検体を適宜希釈して試験を
行い、陽性像を呈する最高希釈倍数に測定感度を乗する
ことによ請求めることができる。 本発明の(、()ハプテン又はその化学的変性物を化学
的に結合せしめたカル)】?キシル基つ有水11r性モ
ノオレフィン系高分子化合物、若しくしよ該化合物をラ
テックス、111体に結合したハプテン担持担体及び(
1))上記ハプテンに対する一IQ−4JHのモノクロ
ナル抗体担持担体のfJlみ合わせから汝る該ハゲテン
の免疫化学的ηill定試己“5及びこれを用いた該ハ
プテンの免疫化学的11jil定方法によれば、モノク
ロナル抗体利用の従来J々術においては、乍−+・(の
モノクロナル抗体の利用によっては対応抗原と結合して
沈殿物を生成し、ないので二以上TijJQ J+ij
の色釉モノクロナル抗体の1更用が必須でま)っだにも
拘わらず、全くλ丁、外なことに1.l二Re (A)
及び(1; )両試ケjコの同には/N1足すべき?4
具反応が生ずる。lji↑〈て、本う11明によれt六
ハグデン分子中の−っの特定部位孕憤依的に認l;哉す
る能JJを有するモノクロナル抗体の4’ N・i7と
ハプテンとのt′1み合わせによる凝集反応であるため
、顕著に高い特異性が達成できる特色がある。更に、上
記(A)及び(H)両試薬の間の凝集反応で形成される
凝集像は、予想外なことにも、従来のポリクロナル抗体
を用いたものよりも強いル】し集性を示す鮮明な凝年像
と力る特色がある。又更に、モノクロナル抗体利用の従
来技術においては、二以上の異種モノクロナル抗体を使
用してもなお、全く効果的でないことさえあるというト
ラン゛ルがあったにも拘わらず、本発明によればそのよ
うなトラブルから解放され、広汎な任意のノ・アミンの
免疫学的測定方法に適用可能となる特色を有する。 本発明によれば、上述の如き特色を持ったモノクロナル
抗体利用の新しいクイズの免疫化学的測定試薬及び測定
方法が提供でき、顕著に侵れた確実性、信頼度、精度、
感度及び顕著に高い特異性をもって、偽反応生起のトラ
ブルを伴うことなしに、V−れた賞現性、安定性で月っ
容上口なt’:作で、煙時間に被検体中の01シ川のハ
ゲテンを免ブ′ζ化学的に測定することができる。 以下、実施例により木ブ!;明の数実施態析について「
グに詳しく説明する。 実M1」例1 尿中エストロケ゛ンの1jilj定 (a)抗エストリオールー16−グルクロナイドモノク
ロナル抗体4I!持ラテックスの11″I造((Z−1
)エストリオール−16−グルクロナイド(Es16G
)−BSAの製造 エストリオール−16−グルクロナイド(/?、16G
)40m9をN、N−ジメチルホルムアミド溶液1.。 rrteK溶角了し、これに4℃す、下でトリーn−フ
゛デル7 ミン20.6μlを添加したのち、イソブチ
ルクロロカーボネート11.2μlを加え30分間イτ
jl′l’した。これに予めB、SA、(牛血清アルブ
ミン)117I’9を2.8 m(!の水((訂ツノ・
fしプCものにIN水酸化ナトリウム液1” Q /l
lを加えたのちジメチルホルムアミド20πlを加え、
8℃に保たれた液を混合した。次いでこれを8℃で撹拌
し、1時間後にIN水酸化ナトリウム液16,6μlを
加え、さらに35時間橙押したのち、セファデックスa
−25で未反応のエストリオール−16−グルクロナイ
ド及びトリー?2、−ブチルアミン等の低分子試薬を分
F4Fした。さらにこれを’)”’M析(鞘製氷に対し
)したのち凍結乾燥すると、エストリオール−16−グ
ルクロナイド−1) S Aが得られた。この抗原の凍
乾末についてのコーベル反応により、B571モル当シ
エストリオールー16−グルクロナイド27〜30モル
の結合が確認されていた。 (a−Z)抗E316Gモノクロナル抗体の製造」−1
記(a)で製造したE 316 G−B 、5 A 2
5 μりCマウス(6〜8趙令)に3yJ間おきに皮下
投−1jし、収穀に50μ7をMj’注した。 t、’、L、 fy、免疫から3日後にマウスのJl’
l! hW、i4を払j出して、肘A、:++胞を採取
し、デルベコのモディファイドr反少基本培地(以下/
)/ME、’+1と称す)で3回わ1[、?’、f+
Lだ彼、#、t+l 1]己7我を37ンiして、その
2X10’イ同をマウスミ”ローマ411111P3−
A’S−1/ l −A g 4−1(以−トN5−
1と栃\ず) I X 107f17Jと混合してン玄
、心し;rfllh”Lを集めた。このペレソ[・に3
7°Cに温めておいたポリエチレングリコ−” i+、
’; ii’i (PEG−100: 4.25%、J
〕At SO:1.5 j6含有1ノ’J/ EM )
f 1 mll加え、1分間遠心?1−1をゆっくり
回転させて細胞融合を行つ/こ。37°Cのり ’Af
E“Mを30秒ごとに2mrずつ10回加えたのち”
hs’+j分t’;in L、ペレットを20九′ウシ
胎児血清含イ〕RPlfl−1640培K11−CA’
S −tとL テ5 X l O’ 1121ロブレー
トに0.2ゴずつ分注し、5%CO2培プこ器で培養し
た。24時間後6ウェルの上清の半量をすて、HAT培
地(ヒポキサンチン・アミツブゾリン・チミジン、10
%′ウシ胎児血清含有RpMl−1640培地)を0.
1 +nl加え、その後3〜4日ごとに半」−:をli
A T培池交換を行いながら2週間培養しだのち j
ij7殖したウェル中の培y二上ネrjの抗体活性を測
定した。 活性の認められたウェルの細胞を#ALJ3/Cマウス
胸腺錫1ii:i、を含む10%ウシ胎児血消含有RP
Jfl −1640培地で希収【−1限界希釈法により
クローニングを行って10株のモノクロナル抗体産生i
iN’i合細胞を得た。これを大最培徴し、その培養上
清からE3G−1?SAを結合させたセファロース4B
を用いたアフイニテイークロマトダラフイーに伺[2、
モノクロナル抗体を得た。また2X10’個以−Hの細
胞をプリスタン0.5 rrreを予め投与したB、A
LB/Cマウスに腹腔内税Jグし、腹水肺癌を作ぜてハ
「L水を得たのち、この腹水をE316G−R5Aを結
合させたセファロース4Bを用いたアフイニディークロ
マトグラフイーによりモノクロナル抗体を初だ。 (a−3)抗E、、16Gモノクロナル抗体JII持ラ
テックスの製造 抗E 316 (y モ/ りoナル抗体0.2 my
を5*rのグリシン緩イ4j化食塩液(7+H13,2
)に溶O’r ly、これに10%ポリスチレンラテッ
クス1 mpを加えて混合し、56℃で30分間処理し
た。次いで遠心公印して得た沈殿をグリシン緩(□17
1化食塩液にてS−;(心洗浄し、沈殿を0059σに
B S Aを含むグリシン緩衝化食塩液20m1:にて
懸洞さぜ、抗E316Gモノクロナル抗体感作ポリスチ
レンラテックスを製造[7た。 (b) エストリオール−16−グルクロナイド#l’
i ’fjポリアクリル酸結合ラテックスの製造 (/1−1)リソン・ラテックス カルボキシルモディファイドポリスチレンラテックスの
109σlJi泊液5mrにε−第三ブチルオキシカル
ボニルリノンメチルエステル260myeツメチルホル
ムアミド(J)JIfF ) 3 m/に溶かした液を
加え、0℃に冷却したのち攪拌しつつ水溶性カルボジイ
ミド、〔1−エチル−a−(3−ツメチルアミノプロピ
ル)カルボジイミド塩酸塩〕243myを加える。0℃
にて1時間、室温にて3時間撹拌をつづけたのち室MA
に一夜放置し、遠心分子・iiする。上清を捨て、沈降
物を50%DMF水溶液、ついで水で洗浄する。 これに氷冷した濃塩酸5mlを加え、ときどきふり1ぜ
つつ0℃に15分間放置したのち氷水で約倍量にうすめ
遠心する。沈降物を洗液が中性になるまで洗浄し、つい
でトリエチルアミンの10%水溶液10 n・?、を加
えて室温で153)4:p4拌rs、= ;、:、を心
12、洗’l+Lが中性に介る1で水洗をくり返す。)
’j、、′□ξに10タロ)旨濁液になるノ;うに1.
′!度を調整し所望のりシン・ラテックスを得る。4く
品t、1、ニンヒドリン反応陽性である。 生成物の4νj債は 八11/2 ■ (C’H2)4 にて表わされる。 (b−2)エストリオール−16−グルクロナイド^′
711合、19リアクリルr戊の一製造(イ) エスト
リオール−16−ゲルクロナイドーヘキザメチレンジア
ミン誘’?f’ 体エストリオール−16−グルクロナ
イド93r9と、N−ノ・イドロキシコノ・り酸イミド
25 +11B、l <cDM F 1.5 meに溶
かし、水冷下撹拌しつつncc41m9を加える。30
分後モノベンジルオキシカルポニルへキサメチレンジア
ミン塩酸塩” 5 wり、トリエチルアミン0.03
veをDMF1rp/に溶かした溶液を加え、水冷下で
2時間、室温で12時間攪拌ケつづける。全体を減圧乾
固し、残渣をブレ・ぐラテイブ薄層クロマトに付して目
的の村記化合物、 82m9(対理論収率55タロ)を得た。 本市はシリカゲルの薄層クロマトでRf=0.42(ク
ロロホルム−メタノール5:1)を示した。 (ロ)上記(イ)で得たエストリオール−16−グルク
ロナイド・ベキ1ノメチレンジアミン;、宣、・’;体
50何ノをメタノール3πt゛に7亡かし、・ぐラジウ
ム黒10rsgを加え、常’jliA常圧で7J%:
CI’;気rr11.中テ化(打する。2時間で反応は
終了(7触ケ1、をむ−・別し、炉液を減圧可縮し、残
渣にエーテルを加えると、カルボベンジルオキシ基が脱
Nしたl]的物3,5mgを粉末としてイ↓)だ。 この生成物1oTRノをポリアクリル酸toomyとと
もにI) M F2 pr(:に溶かし、1)CC4鮪
を加え、室1品に50時間放置する。反応液を1ノー析
し、内液を濾過後凍結乾赴)へすると、エストリオール
−16−グルクロナイド結合ポリアクリル酸95 rn
9を白色粉末として得た。 (/+−3)エストリオール−16−グルクロナイド結
イ]′シj?リアクリル酸結合ラテックスの製造 前記(b−1)で製造したリジンラテックス0.12を
1 meの蒸留水にて懸濁さぜ、これに前記(b−2)
で製造したエストリオール−16−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸水溶液1 rye (エストリオール−
16−グルクロナイド0.311V相当量)を加えて混
合し、ついで1−エチル−3−(3−ツメチルアミノプ
ロピル)カルボジイミド−塩酸塩10m2を加え PH
,押下−夜反応を行なう。 反応終了後遠心分P、a l、て得た沈殿をグリシン緩
衝化食塩液10rneで3回洗浄後、沈殿を0.059
0に1? SA (ウザギ血清アルブミン)を含むグリ
シン緩衝化食塩液30 rniにて懸濁させて、エスト
リオール−16−グルクロナイド結合ポリアクリル酸結
合ラテックスを製造した。 (C) 尿中ニストロダンの測定 月経周期の各時期に採尿した正常婦人尿各3例について
、それぞれをグリシン緩衝化食塩液で2倍、3倍、5倍
、7.5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍
、60倍および80倍に希釈し、各希釈液の1.盲(0
,03+rre )を反応スライド板上にr+gj下し
、これに前記(a)でlid造しだ抗E、 16 Gモ
ノクロナル抗体担持ラテックスを121冷ずつ、)、N
″j下し、ついで前記(b)で製造したエストリオール
−16−グルクロナイド結合ポリアクリルr・ぐ枯イ干
ラテックスを1 i+i’4ずつ滴下する。この三者を
均一に混合し、2分間揺動後肉眼でさ:(:、(i’4
像、7’l’jl:ガユ[f−を止トイ;を1・見察し
だ。 なお、本実施例においてO゛よ測定/+’、:’& f
I)′lを2ng/lnlに調整しであるので各尿中エ
ストロケ゛ンイ1“ll′(は第1表に示すごとくであ
った。 実施例2 尿中ゾレグナンソオールの測定 ((Z) 抗プレグナンジオールー3−グルクロナイド
モノクロナル抗体担持ラデツクスの製造((Z−1)7
’レグナンソオール−3−グルクロナイド−BSAの製
造 プレグナシソオール−3−ダルクロナイドとB SAを
用いて実施例1(a−1)と同様の方法でグレダナンソ
オールー3−グルクロナイド−BSAを製造した。 (a:2 ) 抗プレグナンジオールー3−グルクロナ
イド抗体の製造 上記(a−1)で製造したプレグナンジオール−3−グ
ルクロナイドBSAを用い、実施例1(+1−2)と同
様な方法で4株の抗プレグナンジオールー3−グルクロ
ナイド抗体産生融合細胞t)ミを得た。モノクロナル抗
体は、2X10’個の細胞を予めシリスタン(15mC
腹肘−内J″トLブた13Δ7L 11/Cマウスの腹
腔に移殖して腹/1(を1釆取し、その脱水の硫、安5
0タロ′飽和分画を抗プレグナンジオールー3−グルク
ロナイドモノクロナル抗体としてイ奮だ。 (α−3)抗グレグナンソオールー3−グルクロナイド
抗体」μ持うテックスの製造 上記(a−2)でぶr造した抗グレダナンジオールー3
−グルクロナイドモノクロナル抗体を用い、実施例1(
α−3)と同様な方法で、抗グレグナンジオールー3−
グルクロナイドモノクロナル抗体担4!J、I?リスチ
レンラデックスを製造した。 (b) グレダナンソオールー3−グルクロナイド結合
ビニルメチルエーテル無水マし・インr1夕共重合体(
pVMAfΔ)の製造 (b−r)グレグナンソオールー3−グルクロナイドリ
ジンN#j e:す、休 プレグナンジオール−3−グルクロナイド99ffJ9
、ε−ベンジルオキシカルがニルリソンメチルエステル
・トルエンスルポン酸34I 140ワヲ/□)//F
12 meに溶か[2氷冷下][1,拌しつつソフェ
ニルホスホリルアミド65弥つぃでトリエチルアミン0
、056)〃lを加えたのち、実施例1(b−2)と同
43於((シて下n:j ’1丁G造式で表わされる目
的のりジン誘尋体toomy(対理論収率”8X)を得
た。 (b−2)プレグナシソオール−3−グルクロナイド結
合p /7 jτ/、Mイの製造」二6己(b−t)で
イ)だフ0レグナンソオールー3−グルクロナイド−リ
ジン誘尋体33 nIgを実施例x(b−2)と同様に
して接f:’jI’jJLL元した生成物をpHMMA
100 mgとともに)) M F 6 meに力旧
゛昌n了解したのち、室温に4日間放置した。反応液を
実施例z(b−2)と同様に10理し、プレグナンシ。 オール含[J O−46+I+!// me (9i(
19発色にヨル定F]−)のプレグナンジオール−3−
グルクロナイド結合i合pvMrhΔのm液30グlを
得た。 (C)尿中プレグナンジメールの測定 妊婦尿5例をダリシン緩杓化食塩液で500倍、100
0倍、2000倍、4000倍および8000倍に希釈
し、各希釈液の1 イ’lJi (0,03r−/ )
を反応スライド板上に部下[7、これに(σ)で製造し
た抗グレダナンヅオールー3−ダルクロナイドモノクロ
ナル抗体相持ラテックスをl 7i!’i闇’つ、つい
で(b)で製造したプレグナンジオ−/1.−3−グル
クロナイド結合P V M A−I Aのグリシン緩衝
化食塩液の清液を1f:・□・:Jずつirl’j下し
1、この三者イじ均一に混合し2分間揺動後肉眠でイ疑
集体、凝集阻止像を観察した。 力お、この実施例においては、試5%%の感度を5n
17 / rviに訓コ整しであるので各妊婦Di芝の
ゾレグナンジオールr弓度は第2表に示す値であった。 実施例3 尿中17−Of−JC5の測定 (σ)抗3α、11β、17α、21−テトラヒドロキ
シプレグナン−20−オン(TJIF)−3−グルクロ
ナイドモノクロナル抗体感作血球の製造 (a−1)TIIF−3−グルクロナイド−,13S
Aの製造 Ti1F−3−グルクロナイドとB 、5 Aを用い、
実施例1(a−1)と同様な方法でTIIF−3−グル
クロナイド−BSΔを製造した。 (a−2)抗THF−3−グルクロナイドモノクロナル
抗体の製造 上記(c−t)で製造したTl1F−’3−グルりロナ
イド−BSAを用い、実施例1(α−2)と同様な方法
で6株の抗TIIF−3−グルクロナイド抗体江生融合
細胞株をイJ)、実施例2(a−2)と同様な操作によ
り、抗TJIF−3−グルクロナイドモノクロナル抗体
を得だ。 (α−3)抗T11F −3−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体感作血球の芽こ(造 ホルマリン固定羊血球の49に懸濁液(リンlI:でド
(tj化化成塩液pH6,4)に等41の0.01%タ
ンニン酸溶液を加えて56°G 30分反応させた後、
リン酸緩衝化食ハX液にて血球をfft: rD後、8
26懸バ宵色とする。ついで上記(α−2)で製造しだ
抗1’1lF−3−グルクロナイドモノクロナル抗体の
0.0005%俗液をi:F 石−加え56°Gで2時
間反応させる。反応終了後、リンrf?緩衝化食塩液に
て血殊を遠心洗7子し、0.2%にN RS (正′帛
写:児血清)5%に乳糖を含むリンr波緩画化食ゼ賃1
1:にて15ン(1血球υ′1度に希釈1.、 0.1
nreずつアンプルに分注し、次いで凍h’j 乾j
’!”ユして抗T−II’ F−グルクロナイドモノク
ロナル抗体感作血球を製造した。 (/+) TRF −3−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸の製造 (b−t)7°lf 、1’ −3−グルクロナイド−
リジン誘導体 実倫例2 (/) −2)に従い、i’1lF−3−グ
ルクロナイド5’3++y、ε−ペンツルオキ7カルン
ヒニルリノンメチルエステル・トルエンスルホンRJ’
m59mp、ソフエニルポスホリルアジド331−7g
、トリエチルアミン(1,027m(とから所望のリジ
ンii;#導体57 ry (対理論収率7196)を
得た。 (b−2)TffF−3−グルクロナイドA′占合、I
Eリアクリル酸の製造 り記(b−1)で得たリジン誘導体40m9を実施例1
(−)と同様にして接触還元後DC014mgおよびポ
リアクリル酸100?5と反応せしめ、後処理し、TH
F−3−グルクロナイド結合ボリア り’) ル?l+
’l溶液15m(!(T、IIF含有L1°0.96π
y/me)を得だ。 (C)尿中1T−0,110Sのjllll定正常男子
床及び正常女子尿各々3検体について、それぞれをリン
【:汀(衝化食堵液で100倍、150倍、20041
′?、250倍、300倍および400倍に4釈し、各
希釈酸を丸底小試H−q管に0.1 rnIずつ分注し
、ついで前記(a)で狙!;宣しだ抗TJ/F−3−グ
ルクロナイドモノクロナル抗体感作血球1アングルをリ
ン酸緩ゼ・I化成j(1を液0.3 mrで懸濁させ/
こ全量を、それぞれに添加し混合tV、!、’押抜、上
記(1))で製造しだTIIF−3−グルクロナイド結
合11?リアクリル帥のリン酸鋒(どi化成塩液0.1
mcを加え、よく17、ξ押抜、ミラー付スタンドに
21′I′l′間静置したのちン¥・Iニガ8争、7+
+ご:S lIt 、IL、イ象を(で見察しだ。与本
実施例においてはill、!ll高感度20 n Q
/’rneに調整L テ4) ル(7) f各床中17
−0 、// CS i”、:n”lIt、I、第3表
に示すととくであつブこ。 実施例4 サイロキシン(T4)の測定 (a)抗すイロキシンモノクロナル抗体世持ラテックス
の製造 (Q、 −1)サイロキシン−B S Aの製造B S
、45’ Q mqを25*rの蒸留水に、宕角厘7
、この(r;fil K !5 +pe (7) l)
N Fに俗1’R’ シ’;’Cサイロキシンを加え
、4謂′lミ下30 m9の1−シクロへキシル−3−
(2−モル・ポリニル−4−エチル)カルボソイミドメ
1p−)ルエンスルフォネートを加え、室温にて一夜反
応を行なった。反応液をノに留水に幻して辺析後、用5
結乾燥を行なってサイロキシン・B S Aを製造した
。 (a、 −2)抗ツイロキシンモノクロナル抗体の[F
]′I造 上記(a)で−1・4 hしたサイロキシン・U 、5
A f Jll イ、実施例1 (a、 −2)とト
旧゛りな方法で抗−リーイロギンンモノクロナル抗体産
生融合細胞株を得、実施例2(a−2)と同様にして抗
ザイロキシンモノクロナル抗体を得だ。 (a、 −3)抗すイロキシンモノクロナル抗体相」も
ラテックスの製造 Jm記(a−2)でU+;!造した抗ザイロキシンモノ
クロナル抗体0,2h・ノを5力、eの2へ留水に溶i
’47k、これにカルボキシルモディファイドラテック
スの10%懸潔液1r戸を混合し、次いで、10m9の
1−エチル−3−(3−ツメチルアミノゾロビル)カル
ボソイミド塩酸塩を加えtTht拌下−夜反応を行なっ
た。反応終了後、遠心分i’!して得た沈殿をグリシン
緩衝化食塩液で洗浄し、沈殿を008%にヤギ血清アル
フゝミンを含むグリシン緩動化食塩yk10 r!Ie
にてjl、+、p 渇させて、抗サイロキシンモノクロ
ナル抗体結合ラテックスを製造した。 (b)ザイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水マレ
イン酸共爪合体(P VJiAfA )結合ラテックス
の製造 (b−1)サイロキシン結合P V 71f M 、4
の製造実施例2(b)と全く同様にしてP L’ 、A
f i(/lとサイロキシンとから製造し、ンf析内l
戊を坤紅i乾1;7j L、て白色粉末として得た。 (b −2)サイロキシン結合P I/ MMΔf’i
合ラテックスのル・」造 前記(b−1)で5目造したサイロキシン結合p V
fifAi yiと実施(3’lJ 1 (b −1)
で釡′1造し/こリジンラテックスを用いて実施例1(
1)−3)と同様な方法でサイロキシン結合P )”
M 、+/ΔA1″f合ラテックス全ラテックス。 (’) T4の測足 正常男子血清4例について、8−アニリノ−1−ナフク
レンースルフオン酸を添加後、生理食塩水で2倍、3倍
、4倍、5倍、8倍及び10倍に希釈し、実施例1(c
)と同様な操作にょシT4を測定した。本実施例におけ
る試薬の測定感度は1゜n g / Tn(! VC調
整しであるので、測定値は第4表に示す通りでを)つた
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、(/f)ノ・ブテン又はその化学的変性物を、化学
的に結合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフ
ィン系高分子化合物、若しくは該結合物が約0.01〜
約2ミクロンの粒径の高分子ラテックス担体に化学的に
結合して成るノ・ブテン担持担体及び CB)上記ハプテンに対する単一種のモノクロナル抗体
担持担体 を用い、被検体中のノ・ブテンによる上記(J)及び(
B)両試薬成分の凝集阻止反応を測定することを特徴と
する上記被検体中のノ・ブテンの免疫化学的z11)定
力法。 Z (,4)ハプテン又はその化学的変性物を、化学的
に結合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフィ
ン系高分子化合物、若しくは該結合物が約0.01〜約
2ミクロンの粒径の高分子ラテックス4u体に化学的に
結合して成るノ・ブテン担持4u体及び (/?)上記ハシテンに対する早一種のモノクロナル抗
体担持担体 から成ることを特徴とするハプテンの免qi=化学的測
定試桑。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP12773183A JPS6020149A (ja) | 1983-07-15 | 1983-07-15 | 免疫化学的測定方法及びその試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP12773183A JPS6020149A (ja) | 1983-07-15 | 1983-07-15 | 免疫化学的測定方法及びその試薬 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6020149A true JPS6020149A (ja) | 1985-02-01 |
Family
ID=14967295
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP12773183A Pending JPS6020149A (ja) | 1983-07-15 | 1983-07-15 | 免疫化学的測定方法及びその試薬 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6020149A (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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-
1983
- 1983-07-15 JP JP12773183A patent/JPS6020149A/ja active Pending
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