JP4458622B2

JP4458622B2 - 免疫学的測定方法及び測定用試薬

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Publication number: JP4458622B2
Application number: JP2000156265A
Authority: JP
Inventors: 弘至高橋; 弘和矢後; 要司林
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2010-04-28
Anticipated expiration: 2020-05-26
Also published as: JP2001337092A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的粒子凝集阻止法を利用して、簡便、迅速かつ特異的に試料中の抗原を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
病院、検査センター等においては、人員及び経費の削減に伴い、臨床検査の自動化、簡便化、測定時間の短縮化が図られている。ここで用いられる抗原抗体反応に基づく免疫学的測定法のうち、免疫比濁法と称される測定方法は、測定対象抗原を該抗原に対する特異抗体と反応させて生じる免疫学的凝集形成の度合いを光学的に測定する方法である。とりわけ不溶性担体粒子を利用して免疫学的粒子凝集又は凝集阻止反応を生起させ、被検物質を定性、定量する方法は、高感度化が可能な方法であり、またＢ／Ｆ分離が必要なＥＬＩＳＡ法やＲＩＡ法に比べて反応ステップが少なく、自動化に適しており、早くから種々の測定原理に基づいた専用の測定装置が商品化されている。また最近では、酵素反応などに基づく他の測定項目とともに、汎用の自動分析装置を利用して測定されるようになってきた。
【０００３】
免疫学的粒子凝集法は、分析対象抗原に対する特異抗体を不溶性担体粒子に物理吸着又は共有結合により固定化し、これと血清や尿などの被検試料を混合し、対応する抗原との抗原−抗体反応に基づく免疫凝集反応を生起させることにより、被検試料中の抗原を測定する方法で、幅広い成分が測定対象として採用されるようになっている。しかしながら、これら測定対象成分のうち、炎症マーカーであるＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）や血清アミロイドＡ、アレルギー症状の指標となるＩｇＥ、腎障害の指標となる尿中のアルブミン等の通常低濃度であるが異常時には非常に高濃度まで広く濃度範囲が変動するダイナミックレンジの広い成分の測定においては、被検試料中の測定対象抗原の濃度が試薬の測定濃度範囲を大きく上回っている場合、抗原過剰により凝集形成が抑制され、見かけ上の測定値が低くなり、その濃度が正常値の範囲内であるような誤った測定値を与えることがある。この現象はフック現象又はプロゾーン現象と称され、免疫学的粒子凝集法の原理を用いた測定系においては大きな問題になっている。
【０００４】
一方、免疫比濁法のうち免疫学的粒子凝集阻止法として知られる測定方法は、被検試料と、測定対象抗原と同様の抗原を予め固定化した不溶性担体粒子及び該抗原に対する特異抗体とを混合し、被検試料中に存在する遊離状態の測定対象抗原が、不溶性担体粒子上の固定化抗原と該抗原に対する特異抗体との抗原抗体反応に競合し、免疫学的凝集の形成が阻害されることにより被検試料中の測定対象抗原を測定する方法である。免疫学的粒子凝集阻止法はその測定原理から、仮に被検試料中に含まれる測定対象抗原の濃度が測定上限濃度を大きく超過した場合でも凝集形成阻害が減弱されないため、高い抗原濃度が低値であるかのような誤った測定値を与えることがないという特徴を有している。
【０００５】
また、被検試料中の遊離状態の測定対象抗原と担体粒子上に固定化された特異抗体との抗原抗体反応に基づく粒子凝集形成を測定の本質とする免疫学的粒子凝集法においては、測定対象抗原の種類によっては測定が不可能であり、さらに利用抗体に関しても様々な制約が存在するのに対し、免疫学的粒子凝集阻止法においては、それらは何ら障害とならずに適用することができる。すなわち、測定対象抗原がハプテンのような低分子の一価抗原の場合には、遊離状態のハプテンは抗体により架橋されないため凝集形成が不可能であり、被検試料中の抗原を抗体固定化担体粒子で凝集させる免疫学的粒子凝集法では測定ができない。また近年、より抗原特異性が高く均一な性能が得られるモノクローナル抗体が種々の免疫学的測定試薬に使用されているが、免疫学的粒子凝集法での利用に関しては、抗原上の一つの抗原決定基のみと結合するというモノクローナル抗体の性質上、特殊な抗原（分子上に同一の抗原決定基が複数存在する抗原、例えばＣＲＰ、フェリチン、Ｌｐ(a)等の多価抗原）を除いては１種類のモノクローナル抗体では凝集の形成が不可能で適用できないため、通常、ポリクローナル抗体との併用という補助的な意味合いでの利用や、多数の異種モノクローナル抗体の併用といった抗原特異性・均一性といったモノクローナル抗体本来の利点が失われる条件下での利用に留まっている。
【０００６】
一方、粒子凝集形成を被検試料中に存在する遊離状態の測定対象抗原が阻止することにより、被検試料中の抗原を測定する免疫学的粒子凝集阻止法において、担体粒子の凝集形成は粒子表面上に均一に固定化された抗原と特異抗体との免疫反応により担体粒子間が架橋されることによって惹起され、測定法の本質である凝集阻止は被検試料中の測定対象抗原により固定化抗原と特異抗体との反応が阻止され、その結果凝集形成が減弱されるという原理に基づく。従って、測定対象となる抗原及び特異抗体の遊離状態での凝集形成能の有無は、免疫学的粒子凝集阻止法においては全く障害とならないため、ハプテンを含め抗原性を有している物質であれば測定対象としての適用が可能であり、また抗体の種類に対してもモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでも使用することができる。実際、血中の薬物等のハプテンの測定には、モノクローナル抗体を利用した免疫学的粒子凝集阻止法を原理とする測定法が汎用されている。
【０００７】
以上の事実から、免疫学的粒子凝集阻止法を原理とする測定法は、広範なダイナミックレンジを有する抗原の測定に好適であるのみならず、様々な抗原に適用可能であり、またモノクローナル抗体単独の利用が容易であることから、より特異性に優れた有用な測定法である。
【０００８】
しかして、免疫学的粒子凝集阻止法においては、測定適用への前提条件として、抗原固定化担体粒子と遊離状態の特異抗体を混和した際に、十分な粒子凝集が生起されなければならないという問題がある。この粒子凝集形成が不十分だと、測定に適用しても被検試料中の抗原による感度変化が小さいため、正確な測定値が得られない。特に、特異抗体にモノクローナル抗体を用いた場合、ポリクローナル抗体よりも凝集を生じ難いことから、この傾向はより顕著であり、大量の非特異的凝集剤を添加しなければならない。
【０００９】
例えば、特開昭57-206859号公報には、ハプテン抗原の測定にＲＦ、Ｃｌｑ、マウス血清又は腹水等の典型的な非特異的凝集剤を利用する粒子凝集阻止法が提案されている。ここで用いられている凝集剤は、遊離状態の抗原−抗体複合体との親和性が低いのに対し、抗原固定化担体粒子−抗体複合体の状態、すなわち担体粒子上に固定化抗原−抗体複合体が密に分布する状態にある場合に初めて親和性が顕在化し、凝集形成を促進するという特徴を有していることから、その作用は免疫学的凝集形成の促進ではなく、非特異的な作用であるといえる。このような非特異的凝集剤は、免疫学的凝集形成に相乗的に作用するため、凝集状態、非凝集状態の担体粒子の判別を容易にし、例えば非凝集状態の担体粒子の直接計数により測定対象抗原を測定するような方法においては利用が可能である。しかしながら、抗原−抗体反応に基づく免疫学的凝集形成の度合いから測定対象抗原を光学的に測定する免疫比濁法においては、誤った測定値を与える可能性が高く、このような非特異的凝集剤を利用することはできない。
【００１０】
また、特開昭59-173760号公報には、特異抗体として用いる単一種のモノクローナル抗体を担体に担持して使用することにより、凝集形成を促進する測定方法が提案されている。しかしながら、特許第2840852号に示されるように、モノクローナル抗体を担体に担持する際には、抗体の抗原上の認識部位や担体への結合の方式によっては、立体障害などの理由から、該抗体が遊離状態で示す抗原に対する特異性や反応性が消失、変質する可能性があるという問題があり、簡便に利用することは困難である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、免疫学的粒子凝集阻止法を原理とする測定法において、前記のような問題がなく、簡便、迅速かつ特異的に試料中の抗原を測定する方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、免疫学的粒子凝集阻止法において、抗原を固定化した不溶性担体粒子と特異抗体との凝集形成の際に、特定のレセプターを用いれば、十分な凝集反応が起こり、試料中の抗原による感度変化が大きく、当該抗原を正確に測定できることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、測定対象である抗原を含む試料と、
(A)抗原を固定化した不溶性担体粒子、
(B)前記抗原と反応する遊離状態の特異抗体、及び
(C)前記特異抗体における(A)との結合部位以外の部位をリガンドとするレセプター
を混合し、試料中の遊離の測定対象抗原によって生じる免疫学的凝集阻止反応を、光学的に測定することを特徴とする免疫学的測定方法を提供するものである。
【００１４】
また、本発明は、試料中の遊離の測定対象抗原によって生じる免疫学的凝集阻止反応を測定するために試料と混合して用いる試薬であって、
(A)抗原を固定化した不溶性担体粒子、
(B)前記抗原と反応する遊離状態の特異抗体、及び
(C)前記特異抗体における(A)との結合部位以外の部位をリガンドとするレセプター
を含有することを特徴とする免疫学的測定用試薬を提供するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明において、測定の対象となる抗原物質を含む試料としては、ヒト又は動物の体液、例えば血清、唾液、尿等が挙げられる。これらに含まれる抗原物質としては、抗原決定基の価数に限定されず、一価のハプテンの測定にも特に有用である。ハプテンとしては、例えばテオフィリン、バルビトン、フェニルヒダントイン、ジゴキシン、ジギトキシン、ゲンタマイシン等の薬物及び薬物代謝物；サイクリック−ＡＭＰ、サイクリック−ＧＭＰ、プロスタグランジン、プロスタグランジン代謝物等の細胞内伝達物質；向甲状腺ホルモン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ソマトスタチン、メラトニン、サブスタンス−Ｐ、脳下垂体ホルモン（オキシトシン、バゾプレッシン等）、甲状腺ホルモン（サイロキシン、トリヨードチロニン等）、消化管系ホルモン（ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、セロトニン等）、膵臓ホルモン（グルカゴン等）、ステロイドホルモン（エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、コルチゾール等）等のホルモン類；Ｂ₁₂、葉酸、ビタミンＤ代謝物等のビタミン類；白血病ウイルスの糖脂質等の細菌又はウイルス起源のハプテンなどが挙げられる。また、広範なダイナミックレンジを有することから通常の免疫学的粒子凝集法では誤った測定値を与える可能性の高い抗原、例えばＣＲＰ、血清アミロイドＡ、ＩｇＥ等の血清中成分；アルブミン等の尿中成分などの測定にも好適である。
【００１６】
本発明で用いられる不溶性担体粒子の材質は特に制限されず、従来用いられている物質であればいずれでも良く、有機高分子物質、無機物質、細胞膜、血球、微生物等が挙げられる。有機高分子物質としては、ラテックス粒子が好ましく、特にアクリル酸重合体、スチレン重合体、メタクリル酸重合体等の樹脂の微粉末が１種又は２種以上均一に懸濁したラテックス粒子が好ましい。また、無機物質としては、シリカ、アルミナ等の微粒子が好ましい。
これらの不溶性担体粒子は、平均粒径が１．６μm以下のものが好ましく、特に平均粒径０．０５〜１μm、更に０．０５〜０．５μmのものが、免疫凝集体を直接光学的に測定する上で好ましい。
【００１７】
このような不溶性担体粒子に予め固定化させる抗原としては、特異抗体に対して測定対象抗原と同質の抗原性を有するものであればいずれでも良く、例えば単離精製された抗原、遺伝子組換によって得られるリコンビナント抗原、抗原の断片又は構造が類似した物質等を使用することができる。これらの抗原を不溶性担体粒子に担持させる方法は特に制限されず、公知の物理吸着や化学結合法による方法等を用いることができ、特に化学結合法を用いるのが、より安定な試薬を得ることができるので好ましい。
【００１８】
本発明で用いる(B)特異抗体は、(A)の抗原を固定化した不溶性担体粒子と免疫反応により凝集を形成するものである。かかる特異抗体としては、測定対象である抗原と特異的に結合し得るもので、遊離状態であればいずれでも良く、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等を、それぞれ単独又は組み合せて用いることができる。特に、モノクローナル抗体のみを用いるのであれば、１種類の使用でも良い。また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体いずれの場合にも、遊離状態の抗原と反応した際に免疫凝集物を形成しないものが好ましい。これらは、市販品を好適に使用することができる。
【００１９】
本発明で用いられる(C)前記特異抗体における(A)との結合部位以外の部位をリガンドとするレセプターは、前記(A)及び(B)による凝集を促進させる作用を有するもので、(B)と特異的に結合するものである。かかるレセプターとしては、遊離状態のものであれば特に限定されないが、当該リガンドと反応して凝集を形成しないものが好ましく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、プロテインＡ、プロテインＧが特に好ましい。これらのレセプターは市販品を用いることができ、またモノクローナル抗体は、常法により調製することができる（G. Kohler and C. Milstein, Nature, 1975, 256, Yarmush M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2899-, 1980）。
【００２０】
すなわち、レセプターとして用いるモノクローナル抗体は、(1)抗原物質に対する抗体がポリクローナル抗体の場合には、ポリクローナル抗体由来の免疫動物のイムノグロブリンを免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞を融合したハイブリドーマから調製できる。(2)抗原物質に対する抗体がマウス由来のモノクローナル抗体の場合には、マウスイムノグロブリンを免疫したラット脾臓細胞とラットのミエローマ細胞を融合したハイブリドーマ、又はマウスイムノグロブリンを免疫したラット、ラビット等の異種動物の脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞を融合したヘテロハイブリドーマから調製できる。(3)抗原物質に対する抗体がラット、ラビット等のヘテロハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体の場合には、(1)と同様に調製できる。得られたハイブリドーマのうち、目的とする抗体を産生するものをクローニングし、細胞を樹立する。モノクローナル抗体の大量調製は、ハイブリドーマを培養した培養上清を回収して、あるいは動物の腹腔内にハイブリドーマを接種して増殖させた後、腹水を回収して、これに含まれるモノクローナル抗体を塩析法、吸着クロマトグラフィー法等により濃縮、精製することができる。なお、動物の腹腔内に接種する場合、ヘテロハイブリドーマではヌードマウス又はヌードラットを用いるのが好ましい。
【００２１】
本発明において、不溶性担体の懸濁液、被検試料の希釈液等としては、特に制限されず、通常用いられる緩衝液、例えば酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グリシン、ホウ酸、炭酸、グッドの緩衝液等を使用することができ、反応におけるｐＨは５〜１０、特にｐＨ６〜９が好ましい。
【００２２】
本発明の測定方法は、前記(A)、(B)及び(C)による凝集体の形成を、試料中の測定対象抗原が阻止することにより、試料中の抗原を測定できるものであり、その凝集の程度を、光学的に測定する。
凝集体を光学的に測定する方法は、通常行われている方法であれば特に制限されず、汎用の分光光度計、分光光度測定を測定原理とした生化学用自動分析装置、近赤外を測定波長とした装置、積分球濁度を測定原理とした装置、散乱光強度を測定する装置等の光学的測定機器などを用いることができる。
【００２３】
本発明において、被検試料と特異抗体の反応は、抗原固定化担体粒子及びレセプターのいずれか、又は両者の共存下で行なっても良いし、抗原固定化担体粒子及びレセプター非共存下で反応させた後に両者を反応させても良い。
【００２４】
本発明の測定試薬は、前記(A)、(B)及び(C)を含有するものである。試薬は２剤以上の構成にすることができ、(C)は(A)又は(B)のいずれに添加しておいても良い。
【００２５】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制限されるものではない。
【００２６】
実施例１
（１）ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡ）固定化担体粒子−プロテインＡ溶液の調製：
ポリスチレンラテックス（平均粒径０．２μm、セキスイ化学社製）２００μLに、８００μLの２０mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を添加して希釈したのち、ＨＳＡ（シグマ社製）を２．５mg／mLの濃度で上記ＭＥＳ緩衝液に溶解した溶液１mLを加え、４℃で２時間反応させた。次いで、２mg／mLのウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）水溶液２mLを加え、４℃で１時間反応させた。この溶液に、１．５％のポリエチレングリコール２００００、０．１％のＢＳＡを含有する水溶液９６mLを加えて攪拌し、ＨＳＡ固定化担体粒子溶液を得た。この溶液にプロテインＡ（シグマ社製）を最終濃度１０μg／mLとなるように添加し、ＨＳＡ固定化担体粒子−プロテインＡ溶液を得た。
【００２７】
（２）抗ＨＳＡモノクローナル抗体の製造：
（ａ）免疫；
マウスの免疫には１回当たり市販のＨＳＡ１００μgを使用した。初回免疫はフロインドの完全アジュバントを用い、追加免疫ではフロインドの不完全アジュバントを使用した。具体的にはＨＳＡ１００μLとフロインドのアジュバント１００μLを混合し、得られたエマルジョン２００μLを１回の免疫につき１匹のＢＡＬＢ／Ｃ雄性マウスの腹腔に注射し、免疫を２週間間隔で４回繰り返した。マウスの眼底静脈から採血し、抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定して、抗体価の高いマウスを選んで細胞融合に使用した。
【００２８】
（ｂ）細胞融合；
４回目の免疫から２週間後に、生理食塩水２００μLに希釈したＨＳＡ１００μgをマウス腹腔に注射し、その３日後にマウスから脾臓を摘出した。摘出した脾臓をＲＰＭＩ１６４０培地中でピンセット及びスライドグラスの磨りの部分でよくほぐし、脾細胞を回収した。これを１５００rpmで５分間遠心して脾細胞を集め、更に同培地で洗浄、遠心した。最終的に１５％牛胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含む同培地２mLを加え、脾細胞懸濁液を調製した。生きた脾細胞数は、アクリジンオレンジ／臭化エチジュウム溶液（各０．１mgをＰＢＳ１mLに溶解）と懸濁液を１：１で混ぜ蛍光顕微鏡下でカウントした。生きた脾細胞１０⁸個と予め培養しておいた対数増殖期のマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４の１０⁷個を混合した後に１５００rpmで５分遠心した。上清を除去し、細胞をよく解きほぐした後、ＧＫＮ溶液（ＮａＣｌ：８ｇ，ＫＣｌ：０．４ｇ，グルコース：２ｇ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄：１．４１ｇ，ＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ：０．７８ｇを精製水１Ｌに溶解）にて懸濁し、１５００rpmで５分間遠心を行い、細胞の洗浄を行なった。同洗浄を繰り返した後、５０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール１５４０を含むＧＫＮ溶液０．５mLを徐々に加え、静かに１分間攪拌した。これにＧＫＮ溶液１０mLを徐々に静かに加えて反応を停止させ、１５００rpmで５分間遠心した。得られた細胞について、１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地３０mLに浮遊させ、フィーダー細胞１０⁶個を含むＨＡＴ培地（１０^-4Ｍヒポキサンチン、４×１０^-7Ｍアミノプテリン、１．５×１０^-5Ｍチミジン及び１５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地）を予め１ウエル当たり２００μL分注した９６穴マイクロカルチャープレート３枚に１ウエル当たり１００μLづつ分注して、３７℃５％炭酸ガス培養器中で培養した。１０日後に全てのウエルで融合細胞の増殖を確認した。
【００２９】
（ｃ）抗ＨＳＡ抗体産生細胞の選択とクローン化；
培養上清中の抗ＨＳＡ抗体の存在をＥＬＩＳＡ法で確認した。すなわち、ＨＳＡ（２μg／mL）を固相化した９６穴マイクロプレートを用いてスクリーニングを行なった。
具体的には、ＨＳＡを０．７２％ＮａＣｌを含む１３mMリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳｐＨ７．４）で２μg／mLに希釈し、５０μL／ウエルの割合で９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放置した。これを１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳｐＨ７．４（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３回洗浄した。対照とするプレートは１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳｐＨ７．４（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３回洗浄した。プレートの各ウエルに培養上清５０μLを加え、３７℃で１時間保温した。次いでＰＢＳで３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異的，ヤギ由来：第一化学薬品社製）を５０μL加え、３７℃で１時間保温した。これをＰＢＳで５回洗浄後、０．２％オルトフェニレンジアミン、０．０２％過酸化水素水を含むクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ５．０を５０μL／ウエル加えて室温で３０分反応後、４．５Ｍ硫酸を５０μL／ウエル加えて反応を停止させた。５５０nmの波長で測定し、対照のプレートと比較して吸光度の高いウエルを選択した。
単クローン化は限界希釈法で行なった。すなわち、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細胞を１ウエル当たり１０⁶個／２００μLづつ分注した９６穴マイクロカルチャープレートに、特異抗体陽性ウエル中のハイブリドーマを１０個／mLとなるように希釈したものを１００μLづつ分注した。培地は初回にはＨＴ培地を、２回目以降は１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い、３７℃５％炭酸ガス培養器中で１０日間培養した。
ＥＬＩＳＡ法による特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈法による単クローン化操作を各３回繰り返して、抗ＨＳＡモノクローナル抗体産生細胞を得た。
【００３０】
（ｄ）抗ＨＳＡモノクローナル抗体の分離及び精製
前項の方法によって得た抗ＨＳＡモノクローナル抗体産生細胞を、マウス腹腔内で培養してモノクローナル抗体を作らせた。前処理として８週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に０．５mLのプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を投与した。８日後、０．５mLのＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊した細胞４〜１５×１０⁵個をこのマウスの腹腔内に投与した。投与後９日目から腹水を繰り返し採取してプールした。集めた腹水は３，０００rpmで１０分間遠心分離を行い、細胞等の不溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸アンモニウム溶液を攪拌しながら加え、一夜４℃に放置して得られた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を２０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解、透析した。同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液中のＮａＣｌ０〜０．３Ｍの濃度勾配で溶出させ、精製抗体を得た。
【００３１】
（３）抗ＨＳＡモノクローナル抗体溶液の調製：
（２）で製造したＨＳＡモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ）を１mg／mLの濃度になるように精製水で希釈した。次いで抗体濃度が６０μｇ／mLとなるように、１．５％のポリエチレングリコール２００００、０．１％ＢＳＡを含有する水溶液で希釈し、抗ＨＳＡモノクローナル抗体溶液を得た。
【００３２】
（４）感度測定方法：
汎用型の日立７１７０型自動分析装置を用いて感度を測定した。具体的には第１試薬として（３）で調製した抗ＨＳＡモノクローナル抗体溶液を用い、その１００μLに、ＨＳＡを１０、１００又は２５０μg／mL含有する試料液５μLを加えて３７℃で５分間加温後、第２試薬として（１）で調製したＨＳＡ固定化担体粒子−プロテインＡ溶液１００μLを加えて攪拌した。その後１〜５分間の主波長３４０nm副波長８００nmにおける吸光度変化を感度として測定した。
【００３３】
（５）測定結果：
生理食塩水を試料として用いたときの感度をゼロとして、ＨＳＡ含有試料を測定した際の感度変化を図１に示した。
【００３４】
比較例１
（１）ＨＳＡ固定化担体粒子溶液の調製：
プロテインＡを添加しない以外は実施例１−（１）と同様にして、ＨＳＡ固定化担体粒子溶液を得た。
【００３５】
（２）感度測定方法：
第２試薬を（１）で調製したＨＳＡ固定化担体粒子溶液に変更した以外は実施例１と同様に行なった。
【００３６】
（３）測定結果：
生理食塩水を試料として用いたときの感度をゼロとして、ＨＳＡ含有試料を測定した際の感度変化を図１に示した。
【００３７】
図１に示したように、プロテインＡをレセプターとして使用した実施例１では、ＨＳＡ濃度２５０μｇ／mLまでＨＳＡの濃度に依存した十分な感度変化が認められた。これに対し、レセプターを用いない比較例１ではＨＳＡ含有試料測定による感度変化は小さくＨＳＡ濃度１００μｇ／mLで頭打ちになった。
【００３８】
実施例２
（１）ＨＳＡ固定化担体粒子溶液の調製：
ポリスチレンラテックス（平均粒径０．１μm、セキスイ化学社製）２００μLに、８００μLの２０mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を添加して希釈したのち、ＨＳＡ（シグマ社製）を３mg／mLの濃度で上記ＭＥＳ緩衝液に溶解した溶液１．０mLを加え、４℃で２時間反応させた。次いで、２mg／mLのＢＳＡ水溶液２．０mLを加え、４℃で１時間反応させた。この溶液に２％のポリエチレングリコール２００００、０．１％のＢＳＡを含有する水溶液１１６mLを加えて攪拌し、ＨＳＡ固定化担体粒子溶液を得た。
【００３９】
（２）抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体の製造：
（ａ）免疫；
ラットへの免疫には１回当たり市販の正常マウスＩｇＧ１００μgを使用した。初回免疫はフロインドの完全アジュバントを用い、追加免疫ではフロインドの不完全アジュバントを使用した。具体的には市販の正常マウスＩｇＧ１００μLとフロインドのアジュバント１００μLを混合し、得られたエマルジョン２００μLを１回の免疫につき１匹のＳＤ雄性ラットの腹腔に注射を行い、免疫を２週間間隔で４回繰り返した。ラットの尾静脈から採血し、抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定して、抗体価の高いラットを選んで細胞融合に使用した。
【００４０】
（ｂ）細胞融合；
４回目の免疫から２週間後に、生理食塩水の２００μLに希釈した正常マウスＩｇＧ１００ｇをラット腹腔に注射し、その３日後にラットから脾臓を摘出した。摘出した脾臓をＲＰＭＩ１６４０培地中でピンセット及びスライドグラスの磨りの部分でよくほぐし、脾細胞を回収した。これを１５００rpmで５分間遠心して脾細胞を集め、更に同培地で洗浄、遠心した。最終的に１５％ＦＣＳを含む同培地２mLを加え、脾細胞懸濁液を調製した。生きた脾細胞数は、アクリジンオレンジ／臭化エチジュウム溶液（各０．１mgをＰＢＳ１mLに溶解）と懸濁液を１：１で混ぜ蛍光顕微鏡下でカウントした。生きた脾細胞１０⁸個と予め培養しておいた対数増殖期のマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４の１０⁷個を混合した後に１５００rpmで５分遠心した。上清を除去し、細胞をよく解きほぐした後、ＧＫＮ溶液（ＮａＣｌ：８ｇ，ＫＣｌ：０．４ｇ，グルコース：２ｇ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄：１．４１ｇ，ＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ：０．７８ｇを精製水１Ｌに溶解）にて懸濁し、１５００rpmで５分間遠心を行い、細胞の洗浄を行なった。同洗浄を繰り返した後、５０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール１５４０を含むＧＫＮ溶液０．５mLを徐々に加え静かに１分攪拌した。これにＧＫＮ溶液１０mLを徐々に静かに加えて反応を停止させ、１５００rpmで５分間遠心した。得られた細胞を１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地３０mLに浮遊し、フィーダー細胞１０⁶個を含むＨＡＴ培地（１０^-4Ｍヒポキサンチン、４．０×１０^-7Ｍアミノプテリン、１．５×１０^-5Ｍチミジン及び１５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地）を予め１ウエル当たり２００μL分注した９６穴マイクロカルチャープレート３枚に１ウエル当たり１００μLづつ分注して３７℃５％炭酸ガス培養器中で培養した。１０日後に全てのウエルで融合細胞の増殖を確認した。
【００４１】
（ｃ）抗マウスＩｇＧ抗体産生細胞の選択とクローン化；
培養上清中の抗マウスＩｇＧ抗体の存在をＥＬＩＳＡ法で確認した。すなわち、マウスＩｇＧ（２μg／mL）を固相化した９６穴マイクロプレートを用いてスクリーニングを行なった。
具体的には、正常マウスＩｇＧを０．７２％ＮａＣｌを含むＰＢＳｐＨ７．４で２μg／mLに希釈し、５０μL／ウエルの割合で９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放置した。これらを１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳｐＨ７．４（ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３回洗浄した。プレートの各ウエルに培養上清５０μLを加え、３７℃で１時間保温した。次いでＰＢＳで３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異的，ヤギ由来：バイオソース社製）を５０μL加え、３７℃で１時間保温した。これをＰＢＳで５回洗浄後、０．２％オルトフェニレンジアミン、０．０２％過酸化水素水を含むクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ５．０を５０μL／ウエル加えて室温で３０分反応後、４．５Ｍ硫酸を５０μL／ウエル加えて反応を停止させた。５５０nmの波長で測定し、対照のプレートと比較して吸光度の高いウエルを選択した。
単クローン化は限界希釈法で行なった。すなわち、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細胞を１ウエル当たり１０⁶個／２００μLづつ分注した９６穴マイクロカルチャープレートに、特異抗体陽性ウエル中のハイブリドーマを１０個／mLとなるように希釈したものを１００μLづつ分注した。培地は初回にはＨＴ培地を、２回目以降は１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い、３７℃５％炭酸ガス培養器中で１０日間培養した。
ＥＬＩＳＡ法による特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈法による単クローン化操作を各３回繰り返して、抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体産生細胞を得た。
【００４２】
（ｄ）抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体の分離及び精製；
前項の方法によって得た抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体産生細胞を、ヌードラット腹腔内で培養してモノクローナル抗体を作らせた。前処理として４週齢のヌードラット（Ｆ３４４／njcl-rnu）の腹腔内に２．５mLのプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を投与した。１０日後、１．０mLのＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊した細胞１×１０⁶個をこのヌードラットの腹腔内に投与した。投与後９日目から腹水を繰り返し採取してプールした。集めた腹水は３，０００rpmで１０分間遠心分離を行い、細胞等の不溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸アンモニウム溶液を攪拌しながら加え、一夜４℃に放置して得られた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解、透析した。同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液中のＮａＣｌ０〜０．３Ｍの濃度勾配で溶出させ、精製抗体を得た。
【００４３】
（３）抗ＨＳＡモノクローナル抗体−抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体混和溶液の調製：
実施例１−（３）で製造した抗ＨＳＡモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ）を１mg／mLの濃度になるように精製水で希釈した。次に（２）で調製した抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体を０．５mg／mLの濃度なるように精製水で希釈し、両者を液量１：１で混和した。その後、混和抗体濃度が４５μg／mL（抗ＨＳＡモノクローナル抗体濃度３０μg／mL、抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体濃度１５μg／mL）となるように、０．１％のＢＳＡ、２％のポリエチレングリコール２００００を含有する水溶液で希釈し、抗ＨＳＡモノクローナル抗体−抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体混和溶液を得た。
【００４４】
（４）感度測定方法：
汎用型の日立７１７０型自動分析装置を用いて感度を測定した。具体的には第１試薬として（３）で調製した抗ＨＳＡモノクローナル抗体−抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体混和溶液を用い、その１００μLに、ＨＳＡを含有する試料液５μLを加え、３７℃で５分間加温後、第２試薬として（１）で調製したＨＳＡ固定化担体粒子溶液１００μLを加えて攪拌した。その後１〜５分間の主波長３４０nm副波長８００nmにおける吸光度変化を感度として測定した。
【００４５】
（５）測定結果：
ＨＳＡ濃度（０，１０，２５，５０，１００，２５０μg／mL）の標準品を測定したときの感度から検量線を作成し図２に示した。
また、この検量線を用い、既知濃度のヒトアルブンを含有する尿検体について、アルブミン濃度を測定した。結果を表１に示した。
【００４６】
【表１】

【００４７】
比較例２
（１）抗ＨＳＡモノクローナル抗体溶液の調製：
実施例１−（２）で製造した抗ＨＳＡモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ）を１mg／mLの濃度になるように精製水で希釈した。次いで抗体濃度が３０μｇ／mLとなるように、２％のポリエチレングリコール２００００、０．１％ＢＳＡを含有する水溶液で希釈し、抗ＨＳＡモノクローナル抗体溶液を得た。
【００４８】
（２）感度測定方法：
第１試薬を（１）で調製したＨＳＡモノクローナル抗体溶液に変更した以外は実施例２と同様に行なった。
【００４９】
（３）測定結果：
ＨＳＡ濃度（０，１０，２５，５０，１００，２５０μg／mL）の標準品を測定したときの感度を図２に示した。
【００５０】
比較例３
（１）抗ＨＳＡモノクローナル抗体−ＲＦ混和溶液の調製：
実施例１−（２）で製造した抗ＨＳＡモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ）を１mg／mLの濃度になるように精製水で希釈した。次いで最終溶液中のＲＦ濃度が１IＵ／mLとなるようにヒトのリウマチ患者血清（インタージェン社製）を添加した、２％のポリエチレングリコール２００００、０．１％ＢＳＡを含有する水溶液で抗体濃度が３０μｇ／mLとなるように希釈し、抗ＨＳＡモノクローナル抗体−ＲＦ混和溶液を得た。
【００５１】
（２）感度測定方法：
第１試薬を（１）で調製した抗ＨＳＡモノクローナル抗体−ＲＦ混和溶液に変更した以外は実施例２と同様に行なった。
【００５２】
（３）測定結果：
ＨＳＡ濃度（０，１０，２５，５０，１００，２５０μg／mL）の標準品を測定したときの感度を図２に示した。
【００５３】
図２に示したように、実施例２においては、高感度かつＨＳＡ濃度に依存した感度変化により良好な検量線が得られ、これを用いて表１に示したように尿中のヒトアルブミンを測定することができた。これに対し、レセプターを用いない比較例２では、感度及び感度変化が小さいため検量線が得られなかった。また、凝集剤とてＲＦを用いた比較例３では、感度は得られたが、ＨＳＡ濃度に依存した感度変化が認められず検量線は得られなかった。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫学的凝集阻止反応を利用して、被検試料中の抗原を特異的に、簡便かつ迅速に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１及び比較例１において、ＨＳＡ含有試料を測定したときの感度変化を示す図である。
【図２】実施例１、比較例２及び３において、ＨＳＡ含有試料を測定したときの感度を示す図である。

Claims

測定対象である抗原を含む試料と、（Ａ）抗原を固定化した不溶性担体粒子、（Ｂ）前記抗原と反応する遊離状態の特異抗体、及び（Ｃ）前記特異抗体における抗原との結合部位以外の部位をリガンドとするモノクローナル抗体を混合し、試料中の遊離の測定対象抗原によって生じる免疫学的凝集阻止反応を、光学的に測定することを特徴とする免疫学的測定方法。
（Ｂ）の特異抗体が、モノクローナル抗体である請求項１記載の免疫学的測定方法。
（Ｂ）の特異抗体が、ポリクローナル抗体である請求項１記載の免疫学的測定方法。
不溶性担体粒子が、平均粒径１．６μｍ以下のものである請求項１〜３のいずれか１項記載の免疫学的測定方法。
試料中の遊離の測定対象抗原によって生じる免疫学的凝集阻止反応を測定するために試料と混合して用いる試薬であって、（Ａ）抗原を固定化した不溶性担体粒子、（Ｂ）前記抗原と反応する遊離状態の特異抗体、及び（Ｃ）前記特異抗体における抗原との結合部位以外の部位をリガンドとするモノクローナル抗体を含有することを特徴とする免疫学的測定用試薬。