JP4458622B2 - 免疫学的測定方法及び測定用試薬 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的粒子凝集阻止法を利用して、簡便、迅速かつ特異的に試料中の抗原を測定する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
病院、検査センター等においては、人員及び経費の削減に伴い、臨床検査の自動化、簡便化、測定時間の短縮化が図られている。ここで用いられる抗原抗体反応に基づく免疫学的測定法のうち、免疫比濁法と称される測定方法は、測定対象抗原を該抗原に対する特異抗体と反応させて生じる免疫学的凝集形成の度合いを光学的に測定する方法である。とりわけ不溶性担体粒子を利用して免疫学的粒子凝集又は凝集阻止反応を生起させ、被検物質を定性、定量する方法は、高感度化が可能な方法であり、またB/F分離が必要なELISA法やRIA法に比べて反応ステップが少なく、自動化に適しており、早くから種々の測定原理に基づいた専用の測定装置が商品化されている。また最近では、酵素反応などに基づく他の測定項目とともに、汎用の自動分析装置を利用して測定されるようになってきた。
【0003】
免疫学的粒子凝集法は、分析対象抗原に対する特異抗体を不溶性担体粒子に物理吸着又は共有結合により固定化し、これと血清や尿などの被検試料を混合し、対応する抗原との抗原−抗体反応に基づく免疫凝集反応を生起させることにより、被検試料中の抗原を測定する方法で、幅広い成分が測定対象として採用されるようになっている。しかしながら、これら測定対象成分のうち、炎症マーカーであるC反応性蛋白質(CRP)や血清アミロイドA、アレルギー症状の指標となるIgE、腎障害の指標となる尿中のアルブミン等の通常低濃度であるが異常時には非常に高濃度まで広く濃度範囲が変動するダイナミックレンジの広い成分の測定においては、被検試料中の測定対象抗原の濃度が試薬の測定濃度範囲を大きく上回っている場合、抗原過剰により凝集形成が抑制され、見かけ上の測定値が低くなり、その濃度が正常値の範囲内であるような誤った測定値を与えることがある。この現象はフック現象又はプロゾーン現象と称され、免疫学的粒子凝集法の原理を用いた測定系においては大きな問題になっている。
【0004】
一方、免疫比濁法のうち免疫学的粒子凝集阻止法として知られる測定方法は、被検試料と、測定対象抗原と同様の抗原を予め固定化した不溶性担体粒子及び該抗原に対する特異抗体とを混合し、被検試料中に存在する遊離状態の測定対象抗原が、不溶性担体粒子上の固定化抗原と該抗原に対する特異抗体との抗原抗体反応に競合し、免疫学的凝集の形成が阻害されることにより被検試料中の測定対象抗原を測定する方法である。免疫学的粒子凝集阻止法はその測定原理から、仮に被検試料中に含まれる測定対象抗原の濃度が測定上限濃度を大きく超過した場合でも凝集形成阻害が減弱されないため、高い抗原濃度が低値であるかのような誤った測定値を与えることがないという特徴を有している。
【0005】
また、被検試料中の遊離状態の測定対象抗原と担体粒子上に固定化された特異抗体との抗原抗体反応に基づく粒子凝集形成を測定の本質とする免疫学的粒子凝集法においては、測定対象抗原の種類によっては測定が不可能であり、さらに利用抗体に関しても様々な制約が存在するのに対し、免疫学的粒子凝集阻止法においては、それらは何ら障害とならずに適用することができる。すなわち、測定対象抗原がハプテンのような低分子の一価抗原の場合には、遊離状態のハプテンは抗体により架橋されないため凝集形成が不可能であり、被検試料中の抗原を抗体固定化担体粒子で凝集させる免疫学的粒子凝集法では測定ができない。また近年、より抗原特異性が高く均一な性能が得られるモノクローナル抗体が種々の免疫学的測定試薬に使用されているが、免疫学的粒子凝集法での利用に関しては、抗原上の一つの抗原決定基のみと結合するというモノクローナル抗体の性質上、特殊な抗原(分子上に同一の抗原決定基が複数存在する抗原、例えばCRP、フェリチン、Lp(a)等の多価抗原)を除いては1種類のモノクローナル抗体では凝集の形成が不可能で適用できないため、通常、ポリクローナル抗体との併用という補助的な意味合いでの利用や、多数の異種モノクローナル抗体の併用といった抗原特異性・均一性といったモノクローナル抗体本来の利点が失われる条件下での利用に留まっている。
【0006】
一方、粒子凝集形成を被検試料中に存在する遊離状態の測定対象抗原が阻止することにより、被検試料中の抗原を測定する免疫学的粒子凝集阻止法において、担体粒子の凝集形成は粒子表面上に均一に固定化された抗原と特異抗体との免疫反応により担体粒子間が架橋されることによって惹起され、測定法の本質である凝集阻止は被検試料中の測定対象抗原により固定化抗原と特異抗体との反応が阻止され、その結果凝集形成が減弱されるという原理に基づく。従って、測定対象となる抗原及び特異抗体の遊離状態での凝集形成能の有無は、免疫学的粒子凝集阻止法においては全く障害とならないため、ハプテンを含め抗原性を有している物質であれば測定対象としての適用が可能であり、また抗体の種類に対してもモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでも使用することができる。実際、血中の薬物等のハプテンの測定には、モノクローナル抗体を利用した免疫学的粒子凝集阻止法を原理とする測定法が汎用されている。
【0007】
以上の事実から、免疫学的粒子凝集阻止法を原理とする測定法は、広範なダイナミックレンジを有する抗原の測定に好適であるのみならず、様々な抗原に適用可能であり、またモノクローナル抗体単独の利用が容易であることから、より特異性に優れた有用な測定法である。
【0008】
しかして、免疫学的粒子凝集阻止法においては、測定適用への前提条件として、抗原固定化担体粒子と遊離状態の特異抗体を混和した際に、十分な粒子凝集が生起されなければならないという問題がある。この粒子凝集形成が不十分だと、測定に適用しても被検試料中の抗原による感度変化が小さいため、正確な測定値が得られない。特に、特異抗体にモノクローナル抗体を用いた場合、ポリクローナル抗体よりも凝集を生じ難いことから、この傾向はより顕著であり、大量の非特異的凝集剤を添加しなければならない。
【0009】
例えば、特開昭57-206859号公報には、ハプテン抗原の測定にRF、Clq、マウス血清又は腹水等の典型的な非特異的凝集剤を利用する粒子凝集阻止法が提案されている。ここで用いられている凝集剤は、遊離状態の抗原−抗体複合体との親和性が低いのに対し、抗原固定化担体粒子−抗体複合体の状態、すなわち担体粒子上に固定化抗原−抗体複合体が密に分布する状態にある場合に初めて親和性が顕在化し、凝集形成を促進するという特徴を有していることから、その作用は免疫学的凝集形成の促進ではなく、非特異的な作用であるといえる。このような非特異的凝集剤は、免疫学的凝集形成に相乗的に作用するため、凝集状態、非凝集状態の担体粒子の判別を容易にし、例えば非凝集状態の担体粒子の直接計数により測定対象抗原を測定するような方法においては利用が可能である。しかしながら、抗原−抗体反応に基づく免疫学的凝集形成の度合いから測定対象抗原を光学的に測定する免疫比濁法においては、誤った測定値を与える可能性が高く、このような非特異的凝集剤を利用することはできない。
【0010】
また、特開昭59-173760号公報には、特異抗体として用いる単一種のモノクローナル抗体を担体に担持して使用することにより、凝集形成を促進する測定方法が提案されている。しかしながら、特許第2840852号に示されるように、モノクローナル抗体を担体に担持する際には、抗体の抗原上の認識部位や担体への結合の方式によっては、立体障害などの理由から、該抗体が遊離状態で示す抗原に対する特異性や反応性が消失、変質する可能性があるという問題があり、簡便に利用することは困難である。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、免疫学的粒子凝集阻止法を原理とする測定法において、前記のような問題がなく、簡便、迅速かつ特異的に試料中の抗原を測定する方法を提供することにある。
【0012】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、免疫学的粒子凝集阻止法において、抗原を固定化した不溶性担体粒子と特異抗体との凝集形成の際に、特定のレセプターを用いれば、十分な凝集反応が起こり、試料中の抗原による感度変化が大きく、当該抗原を正確に測定できることを見出し、本発明を完成した。
【0013】
すなわち、本発明は、測定対象である抗原を含む試料と、
(A)抗原を固定化した不溶性担体粒子、
(B)前記抗原と反応する遊離状態の特異抗体、及び
(C)前記特異抗体における(A)との結合部位以外の部位をリガンドとするレセプター
を混合し、試料中の遊離の測定対象抗原によって生じる免疫学的凝集阻止反応を、光学的に測定することを特徴とする免疫学的測定方法を提供するものである。
【0014】
また、本発明は、試料中の遊離の測定対象抗原によって生じる免疫学的凝集阻止反応を測定するために試料と混合して用いる試薬であって、
(A)抗原を固定化した不溶性担体粒子、
(B)前記抗原と反応する遊離状態の特異抗体、及び
(C)前記特異抗体における(A)との結合部位以外の部位をリガンドとするレセプター
を含有することを特徴とする免疫学的測定用試薬を提供するものである。
【0015】
【発明の実施の形態】
本発明において、測定の対象となる抗原物質を含む試料としては、ヒト又は動物の体液、例えば血清、唾液、尿等が挙げられる。これらに含まれる抗原物質としては、抗原決定基の価数に限定されず、一価のハプテンの測定にも特に有用である。ハプテンとしては、例えばテオフィリン、バルビトン、フェニルヒダントイン、ジゴキシン、ジギトキシン、ゲンタマイシン等の薬物及び薬物代謝物;サイクリック−AMP、サイクリック−GMP、プロスタグランジン、プロスタグランジン代謝物等の細胞内伝達物質;向甲状腺ホルモン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ソマトスタチン、メラトニン、サブスタンス−P、脳下垂体ホルモン(オキシトシン、バゾプレッシン等)、甲状腺ホルモン(サイロキシン、トリヨードチロニン等)、消化管系ホルモン(ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、セロトニン等)、膵臓ホルモン(グルカゴン等)、ステロイドホルモン(エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、コルチゾール等)等のホルモン類;B12、葉酸、ビタミンD代謝物等のビタミン類;白血病ウイルスの糖脂質等の細菌又はウイルス起源のハプテンなどが挙げられる。また、広範なダイナミックレンジを有することから通常の免疫学的粒子凝集法では誤った測定値を与える可能性の高い抗原、例えばCRP、血清アミロイドA、IgE等の血清中成分;アルブミン等の尿中成分などの測定にも好適である。
【0016】
本発明で用いられる不溶性担体粒子の材質は特に制限されず、従来用いられている物質であればいずれでも良く、有機高分子物質、無機物質、細胞膜、血球、微生物等が挙げられる。有機高分子物質としては、ラテックス粒子が好ましく、特にアクリル酸重合体、スチレン重合体、メタクリル酸重合体等の樹脂の微粉末が1種又は2種以上均一に懸濁したラテックス粒子が好ましい。また、無機物質としては、シリカ、アルミナ等の微粒子が好ましい。
これらの不溶性担体粒子は、平均粒径が1.6μm以下のものが好ましく、特に平均粒径0.05〜1μm、更に0.05〜0.5μmのものが、免疫凝集体を直接光学的に測定する上で好ましい。
【0017】
このような不溶性担体粒子に予め固定化させる抗原としては、特異抗体に対して測定対象抗原と同質の抗原性を有するものであればいずれでも良く、例えば単離精製された抗原、遺伝子組換によって得られるリコンビナント抗原、抗原の断片又は構造が類似した物質等を使用することができる。これらの抗原を不溶性担体粒子に担持させる方法は特に制限されず、公知の物理吸着や化学結合法による方法等を用いることができ、特に化学結合法を用いるのが、より安定な試薬を得ることができるので好ましい。
【0018】
本発明で用いる(B)特異抗体は、(A)の抗原を固定化した不溶性担体粒子と免疫反応により凝集を形成するものである。かかる特異抗体としては、測定対象である抗原と特異的に結合し得るもので、遊離状態であればいずれでも良く、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等を、それぞれ単独又は組み合せて用いることができる。特に、モノクローナル抗体のみを用いるのであれば、1種類の使用でも良い。また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体いずれの場合にも、遊離状態の抗原と反応した際に免疫凝集物を形成しないものが好ましい。これらは、市販品を好適に使用することができる。
【0019】
本発明で用いられる(C)前記特異抗体における(A)との結合部位以外の部位をリガンドとするレセプターは、前記(A)及び(B)による凝集を促進させる作用を有するもので、(B)と特異的に結合するものである。かかるレセプターとしては、遊離状態のものであれば特に限定されないが、当該リガンドと反応して凝集を形成しないものが好ましく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、プロテインA、プロテインGが特に好ましい。これらのレセプターは市販品を用いることができ、またモノクローナル抗体は、常法により調製することができる(G. Kohler and C. Milstein, Nature, 1975, 256, Yarmush M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2899-, 1980)。
【0020】
すなわち、レセプターとして用いるモノクローナル抗体は、(1)抗原物質に対する抗体がポリクローナル抗体の場合には、ポリクローナル抗体由来の免疫動物のイムノグロブリンを免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞を融合したハイブリドーマから調製できる。(2)抗原物質に対する抗体がマウス由来のモノクローナル抗体の場合には、マウスイムノグロブリンを免疫したラット脾臓細胞とラットのミエローマ細胞を融合したハイブリドーマ、又はマウスイムノグロブリンを免疫したラット、ラビット等の異種動物の脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞を融合したヘテロハイブリドーマから調製できる。(3)抗原物質に対する抗体がラット、ラビット等のヘテロハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体の場合には、(1)と同様に調製できる。得られたハイブリドーマのうち、目的とする抗体を産生するものをクローニングし、細胞を樹立する。モノクローナル抗体の大量調製は、ハイブリドーマを培養した培養上清を回収して、あるいは動物の腹腔内にハイブリドーマを接種して増殖させた後、腹水を回収して、これに含まれるモノクローナル抗体を塩析法、吸着クロマトグラフィー法等により濃縮、精製することができる。なお、動物の腹腔内に接種する場合、ヘテロハイブリドーマではヌードマウス又はヌードラットを用いるのが好ましい。
【0021】
本発明において、不溶性担体の懸濁液、被検試料の希釈液等としては、特に制限されず、通常用いられる緩衝液、例えば酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グリシン、ホウ酸、炭酸、グッドの緩衝液等を使用することができ、反応におけるpHは5〜10、特にpH6〜9が好ましい。
【0022】
本発明の測定方法は、前記(A)、(B)及び(C)による凝集体の形成を、試料中の測定対象抗原が阻止することにより、試料中の抗原を測定できるものであり、その凝集の程度を、光学的に測定する。
凝集体を光学的に測定する方法は、通常行われている方法であれば特に制限されず、汎用の分光光度計、分光光度測定を測定原理とした生化学用自動分析装置、近赤外を測定波長とした装置、積分球濁度を測定原理とした装置、散乱光強度を測定する装置等の光学的測定機器などを用いることができる。
【0023】
本発明において、被検試料と特異抗体の反応は、抗原固定化担体粒子及びレセプターのいずれか、又は両者の共存下で行なっても良いし、抗原固定化担体粒子及びレセプター非共存下で反応させた後に両者を反応させても良い。
【0024】
本発明の測定試薬は、前記(A)、(B)及び(C)を含有するものである。試薬は2剤以上の構成にすることができ、(C)は(A)又は(B)のいずれに添加しておいても良い。
【0025】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制限されるものではない。
【0026】
実施例1
(1)ヒト血清アルブミン(以下、HSA)固定化担体粒子−プロテインA溶液の調製:
ポリスチレンラテックス(平均粒径0.2μm、セキスイ化学社製)200μLに、800μLの20mM MES緩衝液(pH6.5)を添加して希釈したのち、HSA(シグマ社製)を2.5mg/mLの濃度で上記MES緩衝液に溶解した溶液1mLを加え、4℃で2時間反応させた。次いで、2mg/mLのウシ血清アルブミン(以下、BSA)水溶液2mLを加え、4℃で1時間反応させた。この溶液に、1.5%のポリエチレングリコール20000、0.1%のBSAを含有する水溶液96mLを加えて攪拌し、HSA固定化担体粒子溶液を得た。この溶液にプロテインA(シグマ社製)を最終濃度10μg/mLとなるように添加し、HSA固定化担体粒子−プロテインA溶液を得た。
【0027】
(2)抗HSAモノクローナル抗体の製造:
(a)免疫;
マウスの免疫には1回当たり市販のHSA100μgを使用した。初回免疫はフロインドの完全アジュバントを用い、追加免疫ではフロインドの不完全アジュバントを使用した。具体的にはHSA100μLとフロインドのアジュバント100μLを混合し、得られたエマルジョン200μLを1回の免疫につき1匹のBALB/C雄性マウスの腹腔に注射し、免疫を2週間間隔で4回繰り返した。マウスの眼底静脈から採血し、抗体価をELISA法で測定して、抗体価の高いマウスを選んで細胞融合に使用した。
【0028】
(b)細胞融合;
4回目の免疫から2週間後に、生理食塩水200μLに希釈したHSA100μgをマウス腹腔に注射し、その3日後にマウスから脾臓を摘出した。摘出した脾臓をRPMI 1640培地中でピンセット及びスライドグラスの磨りの部分でよくほぐし、脾細胞を回収した。これを1500rpmで5分間遠心して脾細胞を集め、更に同培地で洗浄、遠心した。最終的に15%牛胎児血清(以下、FCS)を含む同培地2mLを加え、脾細胞懸濁液を調製した。生きた脾細胞数は、アクリジンオレンジ/臭化エチジュウム溶液(各0.1mgをPBS1mLに溶解)と懸濁液を1:1で混ぜ蛍光顕微鏡下でカウントした。生きた脾細胞108個と予め培養しておいた対数増殖期のマウス骨髄腫細胞(ミエローマ細胞)SP2/0−Ag14の107個を混合した後に1500rpmで5分遠心した。上清を除去し、細胞をよく解きほぐした後、GKN溶液(NaCl:8g,KCl:0.4g,グルコース:2g,Na2HPO4:1.41g,NaH2PO4・2H2O:0.78gを精製水1Lに溶解)にて懸濁し、1500rpmで5分間遠心を行い、細胞の洗浄を行なった。同洗浄を繰り返した後、50%(w/v)のポリエチレングリコール1540を含むGKN溶液0.5mLを徐々に加え、静かに1分間攪拌した。これにGKN溶液10mLを徐々に静かに加えて反応を停止させ、1500rpmで5分間遠心した。得られた細胞について、15%FCSを含むRPMI 1640培地30mLに浮遊させ、フィーダー細胞106個を含むHAT培地(10-4Mヒポキサンチン、4×10-7Mアミノプテリン、1.5×10-5Mチミジン及び15%FCS含有RPMI 1640培地)を予め1ウエル当たり200μL分注した96穴マイクロカルチャープレート3枚に1ウエル当たり100μLづつ分注して、37℃5%炭酸ガス培養器中で培養した。10日後に全てのウエルで融合細胞の増殖を確認した。
【0029】
(c)抗HSA抗体産生細胞の選択とクローン化;
培養上清中の抗HSA抗体の存在をELISA法で確認した。すなわち、HSA(2μg/mL)を固相化した96穴マイクロプレートを用いてスクリーニングを行なった。
具体的には、HSAを0.72%NaClを含む13mMリン酸緩衝液(以下、PBS pH7.4)で2μg/mLに希釈し、50μL/ウエルの割合で96穴マイクロプレートに分注し、4℃で一夜放置した。これを1%BSA、0.05%Tween20を含むPBS pH7.4(BSA−PBS)で3回洗浄した。対照とするプレートは1%BSA、0.05%Tween20を含むPBS pH7.4(BSA−PBS)で3回洗浄した。プレートの各ウエルに培養上清50μLを加え、37℃で1時間保温した。次いでPBSで3回洗浄後、BSA−PBSで1000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体(Fc部位に特異的,ヤギ由来:第一化学薬品社製)を50μL加え、37℃で1時間保温した。これをPBSで5回洗浄後、0.2%オルトフェニレンジアミン、0.02%過酸化水素水を含むクエン酸−リン酸緩衝液pH5.0を50μL/ウエル加えて室温で30分反応後、4.5M硫酸を50μL/ウエル加えて反応を停止させた。550nmの波長で測定し、対照のプレートと比較して吸光度の高いウエルを選択した。
単クローン化は限界希釈法で行なった。すなわち、フィーダー細胞としてBALB/Cマウスの胸腺細胞を1ウエル当たり106個/200μLづつ分注した96穴マイクロカルチャープレートに、特異抗体陽性ウエル中のハイブリドーマを10個/mLとなるように希釈したものを100μLづつ分注した。培地は初回にはHT培地を、2回目以降は15%FCSを含むRPMI 1640培地を用い、37℃5%炭酸ガス培養器中で10日間培養した。
ELISA法による特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈法による単クローン化操作を各3回繰り返して、抗HSAモノクローナル抗体産生細胞を得た。
【0030】
(d)抗HSAモノクローナル抗体の分離及び精製
前項の方法によって得た抗HSAモノクローナル抗体産生細胞を、マウス腹腔内で培養してモノクローナル抗体を作らせた。前処理として8週齢のBALB/Cマウスの腹腔内に0.5mLのプリスタン(2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン)を投与した。8日後、0.5mLのRPMI 1640培地に浮遊した細胞4〜15×105個をこのマウスの腹腔内に投与した。投与後9日目から腹水を繰り返し採取してプールした。集めた腹水は3,000rpmで10分間遠心分離を行い、細胞等の不溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸アンモニウム溶液を攪拌しながら加え、一夜4℃に放置して得られた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を20mMTris−HCl緩衝液(pH8.0)に溶解、透析した。同緩衝液で平衡化したDEAE−Sephacelカラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液中のNaCl 0〜0.3Mの濃度勾配で溶出させ、精製抗体を得た。
【0031】
(3)抗HSAモノクローナル抗体溶液の調製:
(2)で製造したHSAモノクローナル抗体(マウスIgG)を1mg/mLの濃度になるように精製水で希釈した。次いで抗体濃度が60μg/mLとなるように、1.5%のポリエチレングリコール20000、0.1%BSAを含有する水溶液で希釈し、抗HSAモノクローナル抗体溶液を得た。
【0032】
(4)感度測定方法:
汎用型の日立7170型自動分析装置を用いて感度を測定した。具体的には第1試薬として(3)で調製した抗HSAモノクローナル抗体溶液を用い、その100μLに、HSAを10、100又は250μg/mL含有する試料液5μLを加えて37℃で5分間加温後、第2試薬として(1)で調製したHSA固定化担体粒子−プロテインA溶液100μLを加えて攪拌した。その後1〜5分間の主波長340nm副波長800nmにおける吸光度変化を感度として測定した。
【0033】
(5)測定結果:
生理食塩水を試料として用いたときの感度をゼロとして、HSA含有試料を測定した際の感度変化を図1に示した。
【0034】
比較例1
(1)HSA固定化担体粒子溶液の調製:
プロテインAを添加しない以外は実施例1−(1)と同様にして、HSA固定化担体粒子溶液を得た。
【0035】
(2)感度測定方法:
第2試薬を(1)で調製したHSA固定化担体粒子溶液に変更した以外は実施例1と同様に行なった。
【0036】
(3)測定結果:
生理食塩水を試料として用いたときの感度をゼロとして、HSA含有試料を測定した際の感度変化を図1に示した。
【0037】
図1に示したように、プロテインAをレセプターとして使用した実施例1では、HSA濃度250μg/mLまでHSAの濃度に依存した十分な感度変化が認められた。これに対し、レセプターを用いない比較例1ではHSA含有試料測定による感度変化は小さくHSA濃度100μg/mLで頭打ちになった。
【0038】
実施例2
(1)HSA固定化担体粒子溶液の調製:
ポリスチレンラテックス(平均粒径0.1μm、セキスイ化学社製)200μLに、800μLの20mM MES緩衝液(pH6.5)を添加して希釈したのち、HSA(シグマ社製)を3mg/mLの濃度で上記MES緩衝液に溶解した溶液1.0mLを加え、4℃で2時間反応させた。次いで、2mg/mLのBSA水溶液2.0mLを加え、4℃で1時間反応させた。この溶液に2%のポリエチレングリコール20000、0.1%のBSAを含有する水溶液116mLを加えて攪拌し、HSA固定化担体粒子溶液を得た。
【0039】
(2)抗マウスIgGラットモノクローナル抗体の製造:
(a)免疫;
ラットへの免疫には1回当たり市販の正常マウスIgG100μgを使用した。初回免疫はフロインドの完全アジュバントを用い、追加免疫ではフロインドの不完全アジュバントを使用した。具体的には市販の正常マウスIgG100μLとフロインドのアジュバント100μLを混合し、得られたエマルジョン200μLを1回の免疫につき1匹のSD雄性ラットの腹腔に注射を行い、免疫を2週間間隔で4回繰り返した。ラットの尾静脈から採血し、抗体価をELISA法で測定して、抗体価の高いラットを選んで細胞融合に使用した。
【0040】
(b)細胞融合;
4回目の免疫から2週間後に、生理食塩水の200μLに希釈した正常マウスIgG100gをラット腹腔に注射し、その3日後にラットから脾臓を摘出した。摘出した脾臓をRPMI 1640培地中でピンセット及びスライドグラスの磨りの部分でよくほぐし、脾細胞を回収した。これを1500rpmで5分間遠心して脾細胞を集め、更に同培地で洗浄、遠心した。最終的に15%FCSを含む同培地2mLを加え、脾細胞懸濁液を調製した。生きた脾細胞数は、アクリジンオレンジ/臭化エチジュウム溶液(各0.1mgをPBS1mLに溶解)と懸濁液を1:1で混ぜ蛍光顕微鏡下でカウントした。生きた脾細胞108個と予め培養しておいた対数増殖期のマウス骨髄腫細胞(ミエローマ細胞)SP2/O−Ag14の107個を混合した後に1500rpmで5分遠心した。上清を除去し、細胞をよく解きほぐした後、GKN溶液(NaCl:8g,KCl:0.4g,グルコース:2g,Na2HPO4:1.41g,NaH2PO4・2H2O:0.78gを精製水1Lに溶解)にて懸濁し、1500rpmで5分間遠心を行い、細胞の洗浄を行なった。同洗浄を繰り返した後、50%(w/v)のポリエチレングリコール1540を含むGKN溶液0.5mLを徐々に加え静かに1分攪拌した。これにGKN溶液10mLを徐々に静かに加えて反応を停止させ、1500rpmで5分間遠心した。得られた細胞を15%FCSを含むRPMI 1640培地30mLに浮遊し、フィーダー細胞106個を含むHAT培地(10-4Mヒポキサンチン、4.0×10-7Mアミノプテリン、1.5×10-5Mチミジン及び15%FCS含有RPMI 1640培地)を予め1ウエル当たり200μL分注した96穴マイクロカルチャープレート3枚に1ウエル当たり100μLづつ分注して37℃5%炭酸ガス培養器中で培養した。10日後に全てのウエルで融合細胞の増殖を確認した。
【0041】
(c)抗マウスIgG抗体産生細胞の選択とクローン化;
培養上清中の抗マウスIgG抗体の存在をELISA法で確認した。すなわち、マウスIgG(2μg/mL)を固相化した96穴マイクロプレートを用いてスクリーニングを行なった。
具体的には、正常マウスIgGを0.72%NaClを含むPBS pH7.4で2μg/mLに希釈し、50μL/ウエルの割合で96穴マイクロプレートに分注し、4℃で一夜放置した。これらを1%BSA、0.05%Tween20を含むPBS pH7.4(BSA−PBS)で3回洗浄した。プレートの各ウエルに培養上清50μLを加え、37℃で1時間保温した。次いでPBSで3回洗浄後、BSA−PBSで1000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG抗体(Fc部位に特異的,ヤギ由来:バイオソース社製)を50μL加え、37℃で1時間保温した。これをPBSで5回洗浄後、0.2%オルトフェニレンジアミン、0.02%過酸化水素水を含むクエン酸−リン酸緩衝液pH5.0を50μL/ウエル加えて室温で30分反応後、4.5M硫酸を50μL/ウエル加えて反応を停止させた。550nmの波長で測定し、対照のプレートと比較して吸光度の高いウエルを選択した。
単クローン化は限界希釈法で行なった。すなわち、フィーダー細胞としてBALB/Cマウスの胸腺細胞を1ウエル当たり106個/200μLづつ分注した96穴マイクロカルチャープレートに、特異抗体陽性ウエル中のハイブリドーマを10個/mLとなるように希釈したものを100μLづつ分注した。培地は初回にはHT培地を、2回目以降は15%FCSを含むRPMI 1640培地を用い、37℃5%炭酸ガス培養器中で10日間培養した。
ELISA法による特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈法による単クローン化操作を各3回繰り返して、抗マウスIgGモノクローナル抗体産生細胞を得た。
【0042】
(d)抗マウスIgGモノクローナル抗体の分離及び精製;
前項の方法によって得た抗マウスIgGモノクローナル抗体産生細胞を、ヌードラット腹腔内で培養してモノクローナル抗体を作らせた。前処理として4週齢のヌードラット(F344/njcl-rnu)の腹腔内に2.5mLのプリスタン(2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン)を投与した。10日後、1.0mLのRPMI 1640培地に浮遊した細胞1×106個をこのヌードラットの腹腔内に投与した。投与後9日目から腹水を繰り返し採取してプールした。集めた腹水は3,000rpmで10分間遠心分離を行い、細胞等の不溶物を除去した。上清部分に等量の飽和硫酸アンモニウム溶液を攪拌しながら加え、一夜4℃に放置して得られた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を20mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)に溶解、透析した。同緩衝液で平衡化したDEAE−Sephacelカラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液中のNaCl 0〜0.3Mの濃度勾配で溶出させ、精製抗体を得た。
【0043】
(3)抗HSAモノクローナル抗体−抗マウスIgGモノクローナル抗体混和溶液の調製:
実施例1−(3)で製造した抗HSAモノクローナル抗体(マウスIgG)を1mg/mLの濃度になるように精製水で希釈した。次に(2)で調製した抗マウスIgGラットモノクローナル抗体を0.5mg/mLの濃度なるように精製水で希釈し、両者を液量1:1で混和した。その後、混和抗体濃度が45μg/mL(抗HSAモノクローナル抗体濃度30μg/mL、抗マウスIgGラットモノクローナル抗体濃度15μg/mL)となるように、0.1%のBSA、2%のポリエチレングリコール20000を含有する水溶液で希釈し、抗HSAモノクローナル抗体−抗マウスIgGラットモノクローナル抗体混和溶液を得た。
【0044】
(4)感度測定方法:
汎用型の日立7170型自動分析装置を用いて感度を測定した。具体的には第1試薬として(3)で調製した抗HSAモノクローナル抗体−抗マウスIgGモノクローナル抗体混和溶液を用い、その100μLに、HSAを含有する試料液5μLを加え、37℃で5分間加温後、第2試薬として(1)で調製したHSA固定化担体粒子溶液100μLを加えて攪拌した。その後1〜5分間の主波長340nm副波長800nmにおける吸光度変化を感度として測定した。
【0045】
(5)測定結果:
HSA濃度(0,10,25,50,100,250μg/mL)の標準品を測定したときの感度から検量線を作成し図2に示した。
また、この検量線を用い、既知濃度のヒトアルブンを含有する尿検体について、アルブミン濃度を測定した。結果を表1に示した。
【0046】
【表1】
【0047】
比較例2
(1)抗HSAモノクローナル抗体溶液の調製:
実施例1−(2)で製造した抗HSAモノクローナル抗体(マウスIgG)を1mg/mLの濃度になるように精製水で希釈した。次いで抗体濃度が30μg/mLとなるように、2%のポリエチレングリコール20000、0.1%BSAを含有する水溶液で希釈し、抗HSAモノクローナル抗体溶液を得た。
【0048】
(2)感度測定方法:
第1試薬を(1)で調製したHSAモノクローナル抗体溶液に変更した以外は実施例2と同様に行なった。
【0049】
(3)測定結果:
HSA濃度(0,10,25,50,100,250μg/mL)の標準品を測定したときの感度を図2に示した。
【0050】
比較例3
(1)抗HSAモノクローナル抗体−RF混和溶液の調製:
実施例1−(2)で製造した抗HSAモノクローナル抗体(マウスIgG)を1mg/mLの濃度になるように精製水で希釈した。次いで最終溶液中のRF濃度が1IU/mLとなるようにヒトのリウマチ患者血清(インタージェン社製)を添加した、2%のポリエチレングリコール20000、0.1%BSAを含有する水溶液で抗体濃度が30μg/mLとなるように希釈し、抗HSAモノクローナル抗体−RF混和溶液を得た。
【0051】
(2)感度測定方法:
第1試薬を(1)で調製した抗HSAモノクローナル抗体−RF混和溶液に変更した以外は実施例2と同様に行なった。
【0052】
(3)測定結果:
HSA濃度(0,10,25,50,100,250μg/mL)の標準品を測定したときの感度を図2に示した。
【0053】
図2に示したように、実施例2においては、高感度かつHSA濃度に依存した感度変化により良好な検量線が得られ、これを用いて表1に示したように尿中のヒトアルブミンを測定することができた。これに対し、レセプターを用いない比較例2では、感度及び感度変化が小さいため検量線が得られなかった。また、凝集剤とてRFを用いた比較例3では、感度は得られたが、HSA濃度に依存した感度変化が認められず検量線は得られなかった。
【0054】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫学的凝集阻止反応を利用して、被検試料中の抗原を特異的に、簡便かつ迅速に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1及び比較例1において、HSA含有試料を測定したときの感度変化を示す図である。
【図2】実施例1、比較例2及び3において、HSA含有試料を測定したときの感度を示す図である。
Claims (5)
- 測定対象である抗原を含む試料と、(A)抗原を固定化した不溶性担体粒子、(B)前記抗原と反応する遊離状態の特異抗体、及び(C)前記特異抗体における抗原との結合部位以外の部位をリガンドとするモノクローナル抗体を混合し、試料中の遊離の測定対象抗原によって生じる免疫学的凝集阻止反応を、光学的に測定することを特徴とする免疫学的測定方法。
- (B)の特異抗体が、モノクローナル抗体である請求項1記載の免疫学的測定方法。
- (B)の特異抗体が、ポリクローナル抗体である請求項1記載の免疫学的測定方法。
- 不溶性担体粒子が、平均粒径1.6μm以下のものである請求項1〜3のいずれか1項記載の免疫学的測定方法。
- 試料中の遊離の測定対象抗原によって生じる免疫学的凝集阻止反応を測定するために試料と混合して用いる試薬であって、(A)抗原を固定化した不溶性担体粒子、(B)前記抗原と反応する遊離状態の特異抗体、及び(C)前記特異抗体における抗原との結合部位以外の部位をリガンドとするモノクローナル抗体を含有することを特徴とする免疫学的測定用試薬。
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